專利名稱：一種用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，為一種新的非侵入性的檢測方法，在體外對鼻咽癌進行早期檢測和愈后監(jiān)控，其敏感性和特異性均達到80％以上。
背景技術(shù)：
鼻咽癌的發(fā)病率與死亡率在我國有上升的趨勢，以珠江三角洲及西江流域一帶最為高發(fā)。鼻咽癌的病因尚未了解，可能相關(guān)因素有EB病毒感染、化學(xué)致癌因素、遺傳因素等。目前鼻咽的臨床檢測方法主要有鏡檢、CT/MRI檢查、B超檢查、EB病毒抗體檢查和腫瘤活組織病理檢查，其中活組織病理檢查是唯一的定性手段，EB病毒抗體檢查可作為篩查、早期檢測的輔助手段。若能提高鼻咽的早期檢測準(zhǔn)確率，對鼻咽癌高發(fā)人群進行定期篩查，對愈后進行有效監(jiān)控，即可明顯提高鼻咽癌的總體治療效果。
蛋白質(zhì)組技術(shù)是繼基因組技術(shù)之后在國際上迅速興起的生物技術(shù)，其主要應(yīng)用領(lǐng)域之一是疾病檢測，蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)是目前國際上最先進的蛋白質(zhì)組技術(shù)之一，是繼DNA指紋圖譜技術(shù)后最有實用價值的指紋圖譜技術(shù)。癌癥在發(fā)生顯著的病理變化之前，組織細胞釋放到血液中的蛋白質(zhì)在組成和數(shù)量上都已經(jīng)有特異的變化。蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)就是利用生物質(zhì)譜技術(shù)檢測癌癥血清中蛋白質(zhì)的成分和數(shù)量，通過分析發(fā)現(xiàn)鼻咽癌發(fā)生時的變化，形成特征性的指紋圖譜，如果被檢測血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜具備相同的特征，即有極大的可能已經(jīng)發(fā)生鼻咽癌。蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)中使用的蛋白質(zhì)芯片和表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀是生物質(zhì)譜儀經(jīng)過二十余年的發(fā)展完善的最新成果，它具備高靈敏度、高精度和高通量的特點，可以直接分析血清等天然的蛋白樣本。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)經(jīng)典技術(shù)——二維電泳，雖然可以分析血清蛋白質(zhì)的成份，但每次只能分析一個血清樣品，電泳膠價格高，血清需經(jīng)過復(fù)雜的處理，分析耗時長，且難以分析分子量在20000道爾頓以下的蛋白質(zhì)，由于電泳結(jié)果受樣品處理和操作條件的影響大，重復(fù)性難以做到理想，難以建立有效的大型數(shù)據(jù)庫，無法從實驗室走入臨床應(yīng)用。另一個傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)——基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，無法直接分析天然蛋白質(zhì)樣品，需與蛋白質(zhì)原位酶切技術(shù)、高效液相色譜或毛細管電泳等技術(shù)連用，限制了它的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種用于鼻咽癌檢測的的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法，該方法取少量血清制備蛋白質(zhì)芯片，利用生物質(zhì)譜技術(shù)檢測制備的血清蛋白質(zhì)芯片生成樣本血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜，將大量鼻咽癌血清樣本的蛋白質(zhì)指紋圖譜構(gòu)成的數(shù)據(jù)庫，用生物統(tǒng)計學(xué)方法將臨床患者的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進行比較分析，得出患者發(fā)生鼻咽癌的可能性概率，從而直觀、準(zhǔn)確地判別病例血清的情況。
本發(fā)明提出的用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法，包括以下步驟(1)取鼻咽癌患者血清樣本，對照血清樣本，制備蛋白質(zhì)芯片，利用生物飛行時間質(zhì)譜技術(shù)測定蛋白質(zhì)芯片獲得血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，建立鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。
(2)取待檢患者少量血清，制備蛋白質(zhì)芯片，利用生物飛行時間質(zhì)譜技術(shù)測定蛋白質(zhì)芯片獲得血清蛋白質(zhì)指紋圖譜。
(3)將待測患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜與鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比較和統(tǒng)計分析，得出患者發(fā)生鼻咽癌的可能性概率。上述方法中，鼻咽癌血清樣本包括已確診的治療前未轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者血清樣本、治療前已發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者血清樣本、在治療中(化療、放射治療)的鼻咽癌患者血清樣本、治療后復(fù)發(fā)未發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者血清樣本、治療后復(fù)發(fā)并發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者血清樣本，對照血清樣本包括頭頸部非癌癥類疾病患者血清樣本、頭頸部非鼻咽癌癌癥患者血清樣本和健康人血清樣本。鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的規(guī)模，即數(shù)據(jù)庫中的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的種類和數(shù)量，是可以增加和擴充的。
上述方法中制備蛋白質(zhì)芯片的過程包括以下步驟(1)取血清3ul-10ul，用含9mol/l尿素、2％ CHAPS、1％ DTT緩沖液稀釋3倍，混勻，冰浴30分鐘，然后將稀釋后的血清用50mmol/l醋酸鈉緩沖液稀釋13倍。
(2)用50mmol/l醋酸鈉緩沖液，加至蛋白質(zhì)芯片表面，芯片上每點加200ul，將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩5分鐘，拋棄緩沖液，再次加50mmol/l醋酸鈉緩沖液，芯片上每點加200ul，將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩5分鐘，拋棄緩沖液。
(3)取稀釋后的血清溶液加至蛋白質(zhì)芯片表面，芯片上每點加100ul，將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩60分鐘，拋棄血清溶液，用50mmol/l醋酸鈉緩沖液洗滌2次，洗滌方法同上述制備蛋白質(zhì)芯片過程(2)，芯片每點用200ul水洗滌一次，風(fēng)干。
(4)蛋白質(zhì)芯片表面每點滴加1ul飽和芥子酸溶液，風(fēng)干。
本發(fā)明與其它非侵入性的鼻咽癌的檢測方法比較，具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明提供的用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法為早期用于鼻咽癌檢測的提供了新的途徑和方法，通過鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)的建立、擴充與完善，準(zhǔn)確性可以不斷得到提高，適應(yīng)臨床病例的復(fù)雜情況。(2)與以往的非侵入性方法比較具有極高的敏感性與特異性，其敏感性與特異性均達到80％以上，是一種在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上的檢測，為鼻咽癌的早期檢測和愈后監(jiān)測提供了新的方法和標(biāo)準(zhǔn)。(3)本發(fā)明的方法設(shè)計合理可行，方便快速，是為降低我國鼻咽癌的病死率、提高鼻咽癌的治愈率、對高危人群篩查鼻咽癌提供了一種新的方法。
本發(fā)明提供的用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法填補了鼻咽癌血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物檢查的空白領(lǐng)域，具備傳統(tǒng)的單一血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物檢查所不具備的高特異性、高靈敏度、全面性和可擴充性。


圖1是鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中的部分血清蛋白質(zhì)指紋圖譜。
圖2和圖3是鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中的部分圖譜的局部放大，上面五個圖譜是對照血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜，下面五個圖譜是鼻咽癌患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，方框框出了可目視看到的鼻咽癌患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜與對照血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的差異。
圖4是利用Biomarker Patterns Software軟件生成的鼻咽癌患者血清與對照血清的分類樹示意圖。
圖5是實例1中使用的Biomarker Patterns Software軟件生成的鼻咽癌患者血清與對照血清的分類樹。
圖6是實例2中使用的Biomarker Patterns Software軟件生成的鼻咽癌患者血清與對照血清的分類樹。
具體實施例方式
本發(fā)明提出一種用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法，首先取已經(jīng)確診的鼻咽癌血清樣本包括治療前未轉(zhuǎn)移和已發(fā)生轉(zhuǎn)移的血清樣本60例、在治療中(化療、放射治療)的血清樣本20例、治療后復(fù)發(fā)未發(fā)生轉(zhuǎn)移的血清樣本16例、治療后復(fù)發(fā)并發(fā)生轉(zhuǎn)移的血清樣本20例，對照血清樣本包括頭頸部非癌癥疾病患者血清樣本20例、頭頸部非鼻咽癌癌癥患者血清樣本20例和正常人血清樣本60例?；颊吣挲g20到75歲之間，男性占75％左右，符合鼻咽癌發(fā)生的男女比例，對照組人群來源地區(qū)、年齡范圍和性別比例與鼻咽癌組基本匹配，所有疾病樣本均具有病歷資料。
將鼻咽癌和對照兩組血清從負80冰箱中取出，溶解后置冰浴，取血清3ul-5ul，用含9mol/l尿素、2％CHAPS、1％DTT緩沖液稀釋3倍，混勻后冰浴30分鐘，再用50mmol/l醋酸鈉緩沖液稀釋13倍。取WCX2蛋白質(zhì)芯片，用50mmol/l醋酸鈉緩沖液，加至蛋白質(zhì)芯片表面，芯片上每點加200ul，將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩5分鐘，拋棄緩沖液，再次加50mmol/l醋酸鈉緩沖液，芯片上每點加200ul，將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩5分鐘，拋棄緩沖液。取稀釋后的血清溶液加至蛋白質(zhì)芯片表面，芯片上每點加100ul，將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩60分鐘，拋棄血清溶液，用50mmol/l醋酸鈉緩沖液洗滌2次，芯片每點用200ul水洗滌一次，風(fēng)干。蛋白質(zhì)芯片表面每點滴加1ul飽和芥子酸溶液，風(fēng)干。檢測中所使用的水和試劑均來源于SIGMA公司。
將制備完成的蛋白質(zhì)芯片裝入表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀芯片倉，設(shè)定測試條件，進行測試，測得蛋白質(zhì)芯片捕捉到的各種血清蛋白質(zhì)的分子量和相對強度，即可描繪出血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，將此數(shù)據(jù)存入鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫中的部分血清蛋白質(zhì)指紋圖譜如圖1、圖2和圖3所展示。
用Proteinchip Software將鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中儲存的蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)打開，對分子量和相對強度進行校正，使所有數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)保持一致，使用Biomarker Wizard軟件篩選信噪比大于3的蛋白質(zhì)信號，導(dǎo)出這些信號的分子量和強度信息，形成“CSV”格式電子表格文件。
用Biomarker Patterns Software軟件導(dǎo)入“CSV”格式電子表格文件，對蛋白質(zhì)信號的信息進行分類運算，生成鼻咽癌組血清與對照組血清的分類樹，此樹中的分類依據(jù)是若干個蛋白質(zhì)信號的強度在兩組血清中的差異，即不同組血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的特征，圖4是分類樹的示意圖。
取臨床待檢患者靜脈血3ml，不加任何抗凝劑和促凝劑，室溫下凝血后立即離心收集血清，取血清3ul-5ul，用含9mol/l尿素、2％CHAPS、1％DTT緩沖液稀釋3倍，混勻后冰浴30分鐘，再用50mmol/l醋酸鈉緩沖液稀釋13倍。取WCX2蛋白質(zhì)芯片，用50mmol/l醋酸鈉緩沖液，加至蛋白質(zhì)芯片表面，芯片上每點加200ul，將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩5分鐘，拋棄緩沖液，再次加50mmol/l醋酸鈉緩沖液，芯片上每點加200ul，將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩5分鐘，拋棄緩沖液。取稀釋后的血清溶液加至蛋白質(zhì)芯片表面，芯片上每點加100ul，將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩60分鐘，拋棄血清溶液，用50mmol/l醋酸鈉緩沖液洗滌2次，芯片每點用200ul水洗滌一次，風(fēng)干。蛋白質(zhì)芯片表面每點滴加1ul飽和芥子酸溶液，風(fēng)干。檢測中所使用的水和試劑均來源于SIGMA公司。剩余血清使用液氮或者負80攝氏度冰箱速凍后，儲存于負20攝氏度至負80攝氏度冰箱內(nèi)。使用表面增強激光解吸電離分析時間質(zhì)譜儀測定蛋白質(zhì)芯片獲得血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，用Proteinchip Software對分子量和相對強度進行校正，使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)與數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)一致，使用Biomarker Wizard軟件篩選信噪比大于3的蛋白質(zhì)信號，導(dǎo)出這些信號的分子量和強度信息形成“CSV”格式電子表格文件，用Biomarker Patterns Software軟件導(dǎo)入此電子表格文件，再導(dǎo)入由數(shù)據(jù)庫生成的“CSV”電子表格文件，進行統(tǒng)計分析，給出被檢測血清蛋白質(zhì)指紋圖譜特征符合分類樹中的結(jié)點位置，判斷其蛋白質(zhì)指紋圖譜特征所符合的血清組類型并計算出概率。
實施方式一樣品收集待檢測的患者慢性鼻咽炎，EB病毒抗體檢查呈陽性，CT見右鼻咽側(cè)壁改變。取靜脈血3毫升，不加抗凝劑和促凝劑，室溫存放1小時待血液完全凝固，每分鐘3000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取血清，血清每分鐘5000轉(zhuǎn)離心30秒沉淀少量懸浮的紅細胞，取得血清約1ml，取出20ul待測，其余置負80攝氏度冰箱保存。
蛋白質(zhì)芯片制備取患者血清3ul，加入6ul含9mol/l尿素、2％CHAPS、1％DTT緩沖液稀釋，混勻，冰浴30分鐘，然后加入108ul 50mmol/l醋酸鈉緩沖液稀釋。取弱陽離子交換芯片(WCX2)，在芯片A點上加入200ul 50mmol/l醋酸鈉緩沖液，室溫下將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩5分鐘，棄掉醋酸鈉緩沖液，重復(fù)此項操作一次。在A點滴加100ul血清稀釋液，室溫下將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩1小時，棄掉稀釋液。用200ul50mmol/l醋酸納洗滌芯片A點2次，每次將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩5分鐘，然后用200ul HPLC級水洗滌芯片A點1次，芯片風(fēng)干，A點表面加1ul飽和芥子酸溶液，風(fēng)干。
蛋白質(zhì)指紋圖譜測定制備完成的蛋白質(zhì)芯片裝入PBSIIc型表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀芯片倉，質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)采集條件設(shè)置如下激光強度185，預(yù)熱激光強度190，檢測器靈敏度8，過濾器設(shè)1000道爾頓，優(yōu)化分子質(zhì)量范圍2500道爾頓至30000道爾頓，聚焦7000道爾頓，最高分子量80000道爾頓，A點激光掃描范圍20-80(全范圍0-100)，每步進4，每步收集數(shù)據(jù)7次。采集數(shù)據(jù)后保存至檢測血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。
蛋白質(zhì)指紋圖譜分析用Proteinchip Software軟件打開已測的蛋白質(zhì)指紋圖譜，進行MassNormalize和Total Ion Current Normalize校正分子量和相對強度，使其數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)與鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫一致。使用Biomarker Wizard軟件篩選信號，信噪比設(shè)為3，分子量誤差允許范圍3％，篩選得到342個有效信號，導(dǎo)出為“CSV”格式電子表格文件。用BiomarkerPatterns Software導(dǎo)入此電子表格文件，與鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫生成的電子表格文件進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)此例血清蛋白質(zhì)指紋圖譜位于分類樹(圖5)終端結(jié)點1(TerminalNodel)，屬于分類1(對照組)，血清蛋白質(zhì)指紋圖譜特征符合對照組特征，屬非鼻咽癌概率大于93％，屬鼻咽癌概率小于8％。
實施方式二樣品收集待檢測的患者鼻咽癌放療后1年，發(fā)現(xiàn)左頸腫物2月，CT見右鼻咽側(cè)壁改變，取靜脈血3毫升，不加抗凝劑和促凝劑。室溫存放1小時待血液完全凝固，每分鐘3000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取血清，每分鐘4500轉(zhuǎn)離心30秒沉淀少量懸浮的紅細胞，取得血清約900ul，取出20ul待測，其余液氮速凍后置負20攝氏度冰箱保存。
蛋白質(zhì)芯片制備取患者血清3ul，加入6ul含9mol/l尿素、2％ CHAPS、1％ DTT緩沖液稀釋，混勻，冰浴30分鐘，然后加入108ul 50mmol/l醋酸鈉緩沖液稀釋。取弱陽離子交換芯片(WCX2)，在芯片D點上加入200ul 50mmol/l醋酸鈉緩沖液，室溫下將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩5分鐘，棄掉醋酸鈉緩沖液，重復(fù)此項操作一次。在D點滴加100ul血清稀釋液，室溫下將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩1小時，棄掉稀釋液。用200ul50mmol/l醋酸納洗滌芯片D點2次，每次將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩5分鐘，然后用200ul HPLC級水洗滌芯片D點1次，芯片風(fēng)干，D點表面加1ul飽和芥子酸溶液，風(fēng)干。
蛋白質(zhì)指紋圖譜測定制備完成的蛋白質(zhì)芯片裝入PBS IIc型表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀芯片倉，質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)采集條件設(shè)置如下激光強度185，預(yù)熱激光強度190，檢測器靈敏度8，過濾器設(shè)1000道爾頓，優(yōu)化分子質(zhì)量范圍2500道爾頓至30000道爾頓，聚焦7000道爾頓，最高分子量80000道爾頓，A點激光掃描范圍20-80(全范圍0-100)，每步進4，每步收集數(shù)據(jù)7次。采集數(shù)據(jù)后保存至檢測血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。
蛋白質(zhì)指紋圖譜分析用Proteinchip Software軟件打開已測的的蛋白質(zhì)指紋圖譜，進行Mass Normalize和Total Ion Current Normalize校正分子量和相對強度，使其數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)與鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫一致。使用Biomarker Wizard軟件篩選信號，信噪比設(shè)為3，分子量誤差允許范圍3％，篩選得到355個有效信號，導(dǎo)出為“CSV”格式電子表格文件。用Biomarker Patterns Software導(dǎo)入電子表格文件，與鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫生成的電子表格文件進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)此例血清蛋白質(zhì)指紋圖譜位于分類樹(圖6)終端結(jié)點4(Terminal Node4)，屬于分類0(鼻咽癌組)，血清蛋白質(zhì)指紋圖譜特征符合鼻咽癌特征，屬鼻咽癌概率大于82％，屬非鼻咽癌概率小于18％。
權(quán)利要求
1.一種用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法，其特征是(1)取鼻咽癌患者血清樣本，對照血清樣本，制備蛋白質(zhì)芯片，利用生物飛行時間質(zhì)譜技術(shù)測定蛋白質(zhì)芯片獲得血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，建立鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫；(2)取待檢患者少量血清，制備蛋白質(zhì)芯片，利用生物飛行時間質(zhì)譜技術(shù)測定蛋白質(zhì)芯片獲得血清蛋白質(zhì)指紋圖譜；(3)將待檢患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜與鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比較和統(tǒng)計分析，得出患者發(fā)生鼻咽癌的可能性概率。
2.如權(quán)利1要求所述的用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法，其特征是鼻咽癌血清樣本包括已確診的治療前未轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者血清樣本、治療前已發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者血清樣本、在治療中(化療、放射治療)的鼻咽癌患者血清樣本、治療后復(fù)發(fā)未發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者血清樣本、治療后復(fù)發(fā)并發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者血清樣本，對照血清樣本包括頭頸部非癌癥類疾病患者血清樣本、頭頸部非鼻咽癌癌癥患者血清樣本和健康人血清樣本。
3.如權(quán)利1要求所述的用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法，其特征是鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的規(guī)模，即數(shù)據(jù)庫中的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的種類和數(shù)量，是可以增加和擴充的。
4.如權(quán)利1要求所述的用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法，其特征是血清采集方法如下取患者靜脈血液3ml，不加任何抗凝劑和促凝劑，室溫下凝血后立即離心收集血清，制備蛋白質(zhì)芯片，剩余血清使用液氮或者負80攝氏度冰箱速凍后，儲存于負20攝氏度至負80攝氏度冰箱內(nèi)。
5.如權(quán)利1要求所述的用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法，其特征是蛋白質(zhì)芯片是美國Ciphergen公司生產(chǎn)的基于離子交換表面基團的弱陽離子交換型芯片WCX2Proteinchip。
6.如權(quán)利1要求所述的用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法，其特征是蛋白質(zhì)芯片制備方法如下(1)取血清3ul-10ul，用含9mol/l尿素、2％CHAPS、1％DTT緩沖液稀釋3倍，混勻，冰浴30分鐘，然后將稀釋后的血清用50mmol/l醋酸鈉緩沖液稀釋13倍；(2)用50mmol/l醋酸鈉緩沖液，加至蛋白質(zhì)芯片表面，芯片上每點加200ul，將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩5分鐘，拋棄緩沖液，再次加50mmol/l醋酸鈉緩沖液，芯片上每點加200ul，將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩5分鐘，拋棄緩沖液；(3)取稀釋后的血清溶液加至蛋白質(zhì)芯片表面，芯片上每點加100ul，將蛋白質(zhì)芯片置于振蕩器上130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩60分鐘，拋棄血清溶液，用50mmol/l醋酸鈉緩沖液洗滌2次，洗滌方法同上述制備蛋白質(zhì)芯片方法(2)，芯片每點用200ul水洗滌一次，風(fēng)干(4)蛋白質(zhì)芯片表面每點滴加1ul飽和芥子酸溶液，風(fēng)干。
7.如權(quán)利1要求所述的用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法，其特征是血清蛋白質(zhì)芯片的測定使用美國Ciphergen公司生產(chǎn)的表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀。
8.如權(quán)利1要求所述的用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法，其特征是血清蛋白質(zhì)指紋圖譜與鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的比較和統(tǒng)計分析采用生物統(tǒng)計學(xué)軟件Biomarker Patterns Software，基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法。
9.如權(quán)利1要求所述的用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法，其特征是該方法可用于鼻咽癌的早期檢測、高危人群篩查和鼻咽癌的愈后監(jiān)控。
全文摘要
本發(fā)明一種用于鼻咽癌檢測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜方法?，F(xiàn)有的鼻咽癌檢測方法敏感性與特異性較低。為此本發(fā)明取少量血清制備蛋白質(zhì)芯片，利用生物質(zhì)譜技術(shù)檢測制備的血清蛋白質(zhì)芯片生成血清的蛋白質(zhì)指紋圖譜，用大量鼻咽癌血清樣本和對照血清樣本的蛋白質(zhì)指紋圖譜構(gòu)成鼻咽癌血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，采用生物統(tǒng)計學(xué)方法將待檢患者的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中的圖譜進行比較分析，幫助醫(yī)務(wù)人員判斷患者發(fā)生鼻咽癌的可能性。本發(fā)明是一種在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上的檢測方法。具有取血方便、取血量少、無侵害的優(yōu)點，且數(shù)據(jù)庫具備良好的可擴充性，其敏感性與特異性均達到80％以上。適用于鼻咽癌的早期檢測、愈后監(jiān)測和高危人群的篩查中。
文檔編號G01N30/00GK1841069SQ20051003388
公開日2006年10月4日 申請日期2005年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月1日
發(fā)明者葉志海, 夏魯全 申請人:珠海百源生物信息科技有限公司