專利名稱：：一種蛋白質(zhì)印跡材料及其在人血清中白蛋白去除方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及人血清中高豐度蛋白質(zhì)的去除方法，具體地說是一種蛋白質(zhì)印跡材料及其在去除人血清中高豐度的白蛋白方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著人類基因組計劃的完成，探究基因組所蘊含的生物學意義，并闡明其功能，已經(jīng)成為生命科學的研究熱點。蛋白質(zhì)組學(proteomics)研究在這一前沿領(lǐng)域中具有舉足輕重的戰(zhàn)略地位，受到越來越多的關(guān)注。2001年10月，國際人類蛋白質(zhì)組組織(HumanProteomeOrganization,HUPO)在美國成立，并計劃啟動人類蛋白質(zhì)組計劃(HumanProteomeProject,HPP)。HPP是繼人類基因組計劃后又一個國際化的重大科學研究項目，其首批執(zhí)行計劃包括人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃(HumanLiverProteomeProject,HLPP)和人類血槳蛋白質(zhì)組計劃(HumanPlasmaProteomeProject,HUPOPPP)(Omenn,G.S.,Prot隱ics,2004，4(5):1235-1240;He,F.C.,Mol.Cell.Proteomics，2005,4(12):1841-1848.)。目前，血清或組織中蛋白質(zhì)濃度的動態(tài)分布范圍寬已成為蛋白質(zhì)組研究面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。例如，血清中蛋白的含量在60-80mg/mL。其中大約50種蛋白占到總量的99%，而其余至少10000種以上蛋白僅占到總量的1%。在這些數(shù)以萬計的低豐度蛋白中，包括諸多在生命過程中起到至關(guān)重要作用的蛋白，如功能調(diào)控蛋白、癌癥標記物和藥物作用的靶蛋白等(YazenJmeian，ZiadElRassi;J.ProteomeRes.2007,6，947-954)。由于蛋白組分析技術(shù)對上樣量的限制(通常大約10-100pL)，在所測數(shù)據(jù)中高豐度蛋白會掩蓋或干擾大量低豐度蛋白的檢測。目前，發(fā)展新型技術(shù)去除樣品中的高豐度蛋白已成為蛋白組學急需解決的難題。目前，用于去除高豐度蛋白的方法主要有抗體親和色譜法、染料親和色譜法和化學沉淀法等。但這些方法存在以下固有缺陷(1)親和配基多為高純度的單克隆抗體或其他生物來源的分子，如凝集素、輔酶等，其生產(chǎn)、純化過程復雜，制備成本很高。(2)生物親和配基的理化性質(zhì)受環(huán)境影響較大，容易失去活性，對運輸、保存及操作條件的要求苛刻。(3)染料配體容易從基質(zhì)脫落造成樣品污染。(4)在去除高豐度蛋白的同時帶走很多低豐度蛋白，而丟失許多重要蛋白質(zhì)信息。在人血清中白蛋白的含量占總蛋白量的50%，是血清中主要的高豐度蛋白。因此，發(fā)展人血清白蛋白的去除技術(shù)對于推動人類蛋白質(zhì)組計劃研究尤為重要。
發(fā)明內(nèi)容針對目前高豐度蛋白去除方法的不足和缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白質(zhì)印跡材料，并將其用于人血清中白蛋白的選擇性去除。在此過程中，本發(fā)明不僅要減少了低豐度蛋白的損失，而且還降低了材料的制備成本、簡化了操作過程，提高了樣品處理量。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種蛋白質(zhì)印跡材料，可按如下操作步驟制備；(1)將功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑、表面活性劑和模板蛋白質(zhì)在pH5-6的磷酸鹽緩沖液中混合；磷酸鹽緩沖液中所添加的各組分的最終重量濃度為模板蛋白0.20.6%,功能單體3.0~6.0%，交聯(lián)劑5.0~10.0%，致孔劑2.0~5.0%，表面活性劑0.20~0.40%;所述功能單體為丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺；所述模板蛋白為豬血清白蛋白或人血清白蛋白；所述磷酸鹽緩沖液中含有為乙腈成份，乙腈與磷酸鹽緩沖液的體積比為1:4~1:6;(2)將上述混合物混合均勻后，通入氮氣，然后向其中加入重量濃度分別為0.1~0.4%的引發(fā)劑和增速劑進行聚合反應(yīng)，聚合溫度控制在20~30°〇之間，反應(yīng)時間為524小時；所述引發(fā)劑為過硫酸銨；增速劑為N，N，N、,N、-四甲基乙二胺；(3)聚合反應(yīng)完成后，用含有重量濃度9-11%十二烷基磺酸鈉的體積濃度為9-11%乙酸混合液洗脫聚合物上的模板蛋白，然后依次用水、pH5-6磷酸鹽緩沖液沖洗聚合物，獲得分子印跡材料。所述功能單體中丙烯酰胺的重量濃度為3.06.0%，甲基丙烯酰胺的重量濃度為3.06.0%，其中還含有重量濃度為O.l~0.4%甲基丙烯酸；所述交聯(lián)劑為N，N、-亞甲基雙丙烯酰胺或哌嗪二丙烯酰胺；所述致孔劑為硫酸銨；所述表面活性劑為Tween-20。所述分子印跡材料在人血清中白蛋白去除中的應(yīng)用，(1)在0-4。C下，將分子印跡材料直接放入經(jīng)pH5.0~7.5磷酸鹽緩沖液稀釋5~100倍的人血清中吸附2~12小時；分子印跡材料與稀釋的人血清的重量體積比為20-30mg:lmL;(2)吸附完成后，離心取上清液得到去除白蛋白的人血清；印跡材料用磷酸鹽緩沖液洗滌2-3次，再用體積濃度為1%~3%三氟乙酸的水溶液洗脫特異性吸附的白蛋白。本發(fā)明的優(yōu)點為(l)利用人血清白蛋白與豬血清白蛋白同源性較高的特性，以豬血清白蛋白代替人血清白蛋白為模板分子；(2)利用分子印跡法針對白蛋白制備特意性識別材料，在材料上留有與白蛋白分子體積大小、結(jié)構(gòu)、極性相匹配的孔穴；(3)去除血清中白蛋白時，只有白蛋白分子能夠4進入孔穴，而其它的雜質(zhì)分子不能進入孔穴，使得材料主要吸附白蛋白，而對于其它蛋白吸附很少；(4)其用于血清中的白蛋白的去除中可以提高去除的選擇性，減少低豐度蛋白的損失；(5)該材料具有較強的物理、化學穩(wěn)定性;(6)與現(xiàn)有的去除人血清白蛋白方法相比，本發(fā)明材料生產(chǎn)成本低、操作過程簡便，容易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。圖1蛋白質(zhì)分子印跡材料對人血清中白蛋白去除效果的測定。列1:稀釋100倍人血清，列2:經(jīng)非印跡聚合物吸附后的的人血清，列3:經(jīng)印跡聚合物吸附后的的人血清。具體實施例方式一種蛋白質(zhì)印跡材料，可按如下步驟制備(1)將功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑、表面活性劑和模板蛋白質(zhì)在pH5-6的磷酸鹽緩沖液中混合；(2)將上述混合物混合均勻后，通入氮氣，然后向其中分別加入引發(fā)劑和增速劑進行聚合反應(yīng)，聚合溫度控制在203(TC之間，反應(yīng)時間為524小時；合成印跡材料的過程中各物質(zhì)的用量如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(3)按上述表中的量合成印跡材料后，用含有重量濃度9-11%十二垸基磺酸鈉的體積濃度為9-11%乙酸混合液洗脫聚合物上的模板蛋白。隨后依次用水和pH5-6磷酸鹽緩沖液沖洗聚合物，獲得分子印跡材料。在4。C下，將25mg分子印跡材料直接放入lmL經(jīng)pH5.0磷酸鹽緩沖液稀釋5-100倍的人血清中，吸附2-12小時。吸附完成后，離心取上清液得到去除白蛋白的人血清；印跡材料用磷酸鹽緩沖液洗滌2-3次，再用體積濃度為1%3%三氟乙酸的水溶液洗脫特異性吸附的白蛋白。作為對照，在聚合物合成過程中不加模板蛋白質(zhì)，合成了相應(yīng)的非印跡聚合物?？疾炝似鋵θ搜灏椎鞍椎奶禺愋晕侥芰Α１碇杏≯E聚合物4去除白蛋白的人血清經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后硝酸銀染色分析，結(jié)果見附圖1。從圖1中可以看出經(jīng)非印跡聚合物吸附后人血清中仍有大量的白蛋白存在，而經(jīng)過印跡聚合物吸附后人血清中的白蛋白幾乎不能檢測到。說明印跡聚合物對人血清白蛋白有較好的識別和選擇性去除效果。本發(fā)明以豬血清白蛋白為模板，通過功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑、表面活性劑和模板蛋白質(zhì)的原位聚合反應(yīng)制備蛋白質(zhì)印跡材料，并利用人血清白蛋白與豬血清白蛋白同源性較高的特性，將該材料成功地應(yīng)用于人血清中白蛋白的去除。采用該方法，既可以解決以人源蛋白質(zhì)為印跡模板時蛋白質(zhì)來源困難的問題，同時利用制備的分子印跡材料可實現(xiàn)人血清中白蛋白的選擇性去除。為蛋白質(zhì)組學研究提供一種高豐度蛋白質(zhì)去除的新方法。權(quán)利要求1.一種蛋白質(zhì)印跡材料，其特征在于可按如下步驟制備，(1)將功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑、表面活性劑和模板蛋白質(zhì)在pH5-6的磷酸鹽緩沖液中混合；磷酸鹽緩沖液中所添加的各組分的最終重量濃度為模板蛋白0.2～0.6％，功能單體3.0～6.0％，交聯(lián)劑5.0～10.0％，致孔劑2.0～5.0％，表面活性劑0.20～0.40％；所述功能單體為丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺；所述模板蛋白為豬血清白蛋白或人血清白蛋白；所述磷酸鹽緩沖液中含有為乙腈成份，乙腈與磷酸鹽緩沖液的體積比為14～16；(2)將上述混合物混合均勻后，通入氮氣，然后向其中分別加入重量濃度為0.1～0.4％的引發(fā)劑和增速劑進行聚合反應(yīng)，聚合溫度控制在20～30℃之間，反應(yīng)時間為5～24小時；所述引發(fā)劑為過硫酸銨；增速劑為N，N，N`，N`-四甲基乙二胺；(3)聚合反應(yīng)完成后，用含有重量濃度9-11％十二烷基磺酸鈉的體積濃度為9-11％乙酸混合液洗脫聚合物上的模板蛋白，然后依次用水、pH5-6磷酸鹽緩沖液沖洗聚合物，獲得分子印跡材料。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述分子印跡材料，其特征在于所述功能單體中丙烯酰胺的重量濃度為3.0~6.0%，甲基丙烯酰胺的重量濃度為3.0~6.0%，其中還含有重量濃度為0.1~0.4%甲基丙烯酸。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述分子印跡材料，其特征在于所述交聯(lián)劑為N,N、-亞甲基雙丙烯酰胺或重量濃度5.010.0%的哌嗪二丙烯酰胺。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述分子印跡材料，其特征在于所述致孔劑為硫酸銨；所述表面活性劑為Tween-20。5.—種權(quán)利要求1所述分子印跡材料在人血清中白蛋白去除中的應(yīng)用，其特征在于(1)在0-4"下，將分子印跡材料直接放入經(jīng)pH5.0~7.5磷酸鹽緩沖液稀釋5~100倍的人血清中吸附2~12小時；分子印跡材料與稀釋的人血清的重量體積比為20-30mg:lmL;(2)吸附完成后，離心取上清液得到去除白蛋白的人血清；印跡材料用磷酸鹽緩沖液洗滌2-3次，再用體積濃度為1%~3%三氟乙酸的水溶液洗脫特異性吸附的白蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及豬血清白蛋白分子印跡材料的制備方法及其在選擇性去除人血清中白蛋白方面的應(yīng)用。該方法以豬血清白蛋白為模板，通過功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑、表面活性劑和模板蛋白質(zhì)的原位聚合反應(yīng)制備蛋白質(zhì)印跡材料，并利用人血清白蛋白與豬血清白蛋白同源性較高的特性，將該材料成功地應(yīng)用于人血清中白蛋白的去除。采用該方法，既可以解決以人源蛋白質(zhì)為印跡模板時蛋白質(zhì)來源困難的問題，同時利用制備的分子印跡材料可實現(xiàn)人血清中白蛋白的選擇性去除。為蛋白質(zhì)組學研究提供一種高豐度蛋白質(zhì)去除的新方法。文檔編號C08F20/00GK101463105SQ200710159109公開日2009年6月24日申請日期2007年12月21日優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日發(fā)明者劉晉湘,張麗華,張玉奎,振梁,鄧啟良,馬俊峰申請人:中國科學院大連化學物理研究所