專利名稱：家畜血吸蟲抗體金標(biāo)免疫快速檢測(cè)試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種寄生蟲病快速免疫診斷試劑盒，尤其涉及以可溶性日本血吸蟲蟲卵抗原為點(diǎn)樣抗原，采用膠體金標(biāo)記金色葡萄球菌A蛋白檢測(cè)家畜血吸蟲抗體的試劑盒及制備方法。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是發(fā)展中國家的主要寄生蟲病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)1993年估算，全世界有31億人口的74個(gè)國家和地區(qū)流行此病，流行區(qū)人口6億，其中2億人受感染，每年死于該病者達(dá)百萬人之多。我國血吸蟲病主要流行于長江流域及其以南的12個(gè)省、自治區(qū)、直轄市，流行地區(qū)多為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要基地，人口密集，嚴(yán)重地危害著人民群眾健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。WHO血吸蟲病專家委員會(huì)認(rèn)為全球控制血吸蟲病的總策略是減少疾病的危害，而不是消滅。我國目前實(shí)行大規(guī)模化療和大面積滅螺的防治措施，因此血吸蟲病診斷方法的改進(jìn)和創(chuàng)新，對(duì)化療對(duì)象的確立、減少浪費(fèi)和耐藥性的產(chǎn)生意義重大。相關(guān)流行病學(xué)資料表明，血吸蟲病的保蟲宿主除人外，尚有近40種哺乳動(dòng)物，特別是以耕牛、羊、豬為主要傳染源的家畜及其糞便，在江灘湖沼地區(qū)、山丘地區(qū)的血吸蟲病流行中起著舉足輕重的作用，因此針對(duì)家畜血吸蟲病所采取的診斷和治療措施顯得十分必要?，F(xiàn)有技術(shù)對(duì)家畜血吸蟲病的查病方法，主要是病原學(xué)查病和血清學(xué)查病，病原學(xué)方法主要采用糞便毛蚴孵化法檢查，其特異性高，可用于確診牛、羊等家畜，但操作費(fèi)時(shí)費(fèi)工，敏感性低，漏檢率高(可達(dá)81.8％)，不適于中低度流行區(qū)的家畜診斷。血清學(xué)方法具有較高的敏感性和特異性，可減少漏檢，彌補(bǔ)糞檢不足之處，包括環(huán)卵沉淀試驗(yàn)(COPT)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)、膠乳凝集試驗(yàn)(COPS)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、單克隆抗體斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，但上述方法操作較繁瑣，費(fèi)時(shí)較多，有的還需要一定儀器，使之在臨床快速診斷、動(dòng)物快速檢疫和血吸蟲病篩查方面應(yīng)用受限，難以推廣至基層單位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的主要是解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足，從而提供一種具有高敏感性和特異性，無需借助儀器即可快速診斷牛血吸蟲病的金標(biāo)免疫快速檢測(cè)試劑盒及制備方法。
本發(fā)明的上述技術(shù)問題主要是通過下述技術(shù)方案得以解決的家畜血吸蟲抗體金標(biāo)免疫快速檢測(cè)試劑盒，含有滲濾測(cè)定裝置，抗原點(diǎn)樣膜，標(biāo)記物，洗脫液，其特征在于所述的抗原點(diǎn)樣膜是點(diǎn)有日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的硝酸纖維素膜；所述的標(biāo)記物為膠體金標(biāo)記A蛋白結(jié)合物；所述的洗脫液是pH7.4 0.05MTris-HCl緩沖液；在所述的抗原和標(biāo)記物之間采用連接抗體搭橋。
本發(fā)明的技術(shù)方案還可以進(jìn)一步完善，作為優(yōu)選，所述的連接抗體是兔抗家畜血清球蛋白。采用連接抗體，有利于提高牛、羊、豬等家畜血清與膠體金的親和力。
作為優(yōu)選，所述的膠體金標(biāo)記A蛋白結(jié)合物為膠體金溶膠，加一定量金色葡萄球菌A蛋白，加體積比為1％的小牛血清白蛋白，并在每毫升標(biāo)記物中加0.2-0.5mg聚乙二醇；優(yōu)選為0.5mg聚乙二醇。
作為優(yōu)選，所述的洗脫液是pH7.4，克分子濃度為0.05M的Tris-HCl緩沖液，加體積比為1.0％的Triton X-100，加質(zhì)量體積比為0.1-0.5％的疊氮納。所述的Triton X-100即聚乙二醇辛基本基醚。
家畜血吸蟲抗體金標(biāo)免疫快速檢測(cè)試劑盒的制備方法A抗原膜制備a.日本血吸蟲可溶性蟲蟲卵抗原的制備健康家兔經(jīng)膚人工感染日本血吸蟲尾蚴，42天后，取兔肝經(jīng)各目篩子凈化蟲卵，丙酮脫脂干燥后研成粉末，用生理鹽水配制成質(zhì)量體積比為1％溶液，然后反復(fù)凍融，超聲處理，低溫高速離心，取上清液；b.抗原膜制備取孔徑為0.45μm的硝酸纖維素膜，劃成1cm×1cm的小方格，在小方格中央點(diǎn)1μl質(zhì)量體積比為1％的日本血吸蟲可溶性蟲蟲卵抗原，室溫涼干后密封，于4℃保存?zhèn)溆?；B連接抗體制備a.健康家畜血清球蛋白提取分別采用飽和硫酸銨鹽析法提純家畜血清中的IgG；b.高免兔抗家畜抗血清的制備采用等量多點(diǎn)免疫法免疫家兔，以健康家畜血清球蛋白作為抗原，每次2mg，加等量福氏完全佐劑，采用足墊內(nèi)及皮內(nèi)多點(diǎn)注射，先后免疫三次，當(dāng)免疫血清雙擴(kuò)散試驗(yàn)效價(jià)達(dá)1∶32以上時(shí)從免疫兔心臟采血，分離血清，低溫保存?zhèn)溆?；C.膠體金標(biāo)記A蛋白結(jié)合物的制備膠體金溶膠的制備采用鞣酸-枸椽酸納還原法；a.膠體金標(biāo)記金色葡萄球菌A蛋白-SPA探針的制備用克分子濃度0.1M K2CO3，將膠體金溶膠的pH值調(diào)至9.0，然后進(jìn)行最適蛋白穩(wěn)定量的測(cè)定，標(biāo)記時(shí)采用最小蛋白用量來達(dá)到與膠體金的充分結(jié)合，然后加0.2-0.5mg聚乙二醇，優(yōu)選為0.5mg，高速離心，取沉淀濃縮即成。
斑點(diǎn)金免疫滲濾法(DIGFA)采用膠體金代替沿用已久的辣根過氧化物酶標(biāo)記技術(shù)，排除了諸多干擾抗原-抗體反應(yīng)的客觀因素，抗原、抗體通過固相膜的滲濾作用發(fā)生反應(yīng)，以親和層析原理為基礎(chǔ)，利用膠體金顆粒具有高電子密度特性，放大免疫反應(yīng)系統(tǒng)，使其在相應(yīng)配體處大量聚集而形成肉眼可見的紅色斑點(diǎn)，從而達(dá)到簡易、快速準(zhǔn)確的目的；采用金葡萄球菌A蛋白(SPA)代替羊或兔抗人IgG，用于血吸蟲抗體檢測(cè)，有利于減少非特異性反應(yīng)，穩(wěn)定檢測(cè)試劑的質(zhì)量；用Tris-HCl加Triton X-100緩沖液代替pH7.4含1％BSA、0.5％Tween-20的PBS緩沖液，完全能達(dá)到封閉、洗滌的效果，有利于節(jié)省小牛血清白蛋白；膠體金標(biāo)記物性能穩(wěn)定，在25℃可保存6個(gè)月以上，便于運(yùn)送；DIGFA操作過程中省去底物反應(yīng)步驟，不僅節(jié)省時(shí)間，而且膠體金對(duì)人體無害，操作安全；DIGFA操作過程簡便，基層工作人員無需專業(yè)培訓(xùn)即可操作。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明將血吸蟲病診斷與膠體金標(biāo)記蛋白技術(shù)相結(jié)合，建立一種新型、高效快速檢測(cè)家畜日本血吸蟲病的方法-斑點(diǎn)金免疫滲濾法，依此方法所研制的家畜血吸蟲病診斷試劑盒，其結(jié)果敏感性高，特異性強(qiáng)，判斷快速、準(zhǔn)確，操作簡潔、方便，不需要特殊儀器設(shè)備僅用肉眼即可鑒別，便于基層單位和檢疫部門使用。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體說明。
實(shí)施例膠體金溶膠制備采用鞣酸-枸椽酸納還原法，具體為1.配置A液 1％枸椽酸納溶液1ml，加雙蒸水79ml，混勻后置磁力加熱攪拌器上預(yù)熱至60℃；2.配置.B液 1％枸椽酸納4ml，加1％鞣酸0.7ml，加0.1M碳酸鉀溶液0.2ml，雙蒸水15.1ml混勻后放置水浴中預(yù)熱至60℃；在磁力攪拌下迅速將B液倒入A液中繼續(xù)加熱至60℃，攪拌至溶液呈亮紅色，用0.1M碳酸鉀溶液調(diào)pH至9.0即可。
膠體金標(biāo)記金色葡萄球菌A蛋白-SPA探針的制備
1.膠體金與蛋白結(jié)合的最適穩(wěn)定量測(cè)定，具體方法如下表所示，測(cè)定時(shí)將A蛋白的濃度用2mM pH9.0，硼砂-鹽酸緩沖液稀釋至1mg/ml。

結(jié)果觀察藍(lán)色 微藍(lán)色 淺紅 紅 紅 紅注膠體金溶膠與A蛋白混溶后在25℃靜止5分鐘表，與10％NaCl混合后靜止2小時(shí)觀察結(jié)果。
選擇蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的一管，即保持紅色不變這一管，上述第4管為穩(wěn)定1毫升膠體金的最佳蛋白量，在此基礎(chǔ)上再加10％即為標(biāo)記時(shí)的實(shí)際蛋白用量。
2.膠體金與蛋白質(zhì)連接按上述方法確定A蛋白含量與膠金溶液的比例后，根據(jù)需要制備一定量的膠體金標(biāo)記物。
例如上述第4管表明使1毫升膠體金穩(wěn)定需要6μg蛋白作為最佳比例，在此基礎(chǔ)上再加10％，即6.6μg/1ml，假若需配制10ml金標(biāo)結(jié)合物，步驟如下取10ml金溶膠于三角燒瓶中，在磁力攪拌下，加入66μg蛋白，10分鐘后，加5％BSA溶液2ml，使其最終BSA濃度為1％，然后高速離心30分鐘，去上清，取沉淀，至10倍濃縮即成。
洗脫液的制備Tris 12.lg，NaCl 17.5g，雙蒸水1500ml，混勻溶解后用濃鹽酸調(diào)至pH7.4，再加雙蒸水至2000ml，加體積比為1.0％的Triton X-100，加質(zhì)量體積比為0.01-0.05％的疊氮納。
本發(fā)明的試劑盒，有盒蓋和盒底二部分，盒蓋中央有一圓形小孔，下面四角各有一個(gè)小柱，與盒底上相對(duì)應(yīng)處的凹孔扣合連接，盒底放置吸水填料，在吸水填料上面、與盒蓋中央小孔相對(duì)應(yīng)的位置上，覆蓋點(diǎn)有可溶性日本血吸蟲蟲卵抗原的硝酸纖維素膜。具體測(cè)試方法是取反應(yīng)盒1個(gè)，加洗脫液100μl待滲入，加待檢血清25μl待滲入，再加洗脫液100μl待滲入，加連接抗體25μl待滲入，加金標(biāo)SPA探針50μl待滲入，最后加洗脫液100μl，洗去非特異性結(jié)合物，2分鐘后肉眼觀察結(jié)果，結(jié)果判斷在硝酸纖維素膜中央顯示紅色斑點(diǎn)為陽性反應(yīng)，僅留白色背景為陰性反應(yīng)。
敏感性、特異性試驗(yàn)用本試劑盒檢測(cè)糞檢蟲卵陽性牛血清30份，結(jié)果血吸蟲抗體呈陽性反應(yīng)的28例，陽性檢測(cè)率為93.3％，50份健康牛血清經(jīng)測(cè)試，有49例呈陰性反應(yīng)，陰性符合率達(dá)98％。
重復(fù)性試驗(yàn)取10例血吸蟲病病牛血清和10例健康牛血清，用本法反復(fù)檢測(cè)10次，結(jié)果陽性病牛血清均呈陽性反應(yīng)，而10例陰性血清全部呈陰性反應(yīng)。
穩(wěn)定性試驗(yàn)將本試劑盒存放于4℃冰箱中，每隔1個(gè)月取出檢測(cè)一次，連續(xù)檢測(cè)一年，結(jié)果陽性病牛血清呈陽性反應(yīng)，健康牛血清全部呈陰性反應(yīng)。
本試劑盒經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其敏感性為93.3％，特異性達(dá)98.0％，約登指數(shù)＝0.913。
權(quán)利要求
1.一種家畜血吸蟲抗體金標(biāo)免疫快速檢測(cè)試劑盒，含有滲濾測(cè)定裝置，抗原點(diǎn)樣膜，標(biāo)記物，洗脫液，其特征在于所述的抗原點(diǎn)樣膜是點(diǎn)有日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的硝酸纖維素膜；所述的標(biāo)記物為膠體金標(biāo)記A蛋白結(jié)合物；所述的洗脫液是pH7.4 0.05M Tris-HCl緩沖液；在所述的抗原和標(biāo)記物之間采用連接抗體搭橋。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家畜血吸蟲抗體金標(biāo)免疫快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的連接抗體是兔抗家畜血清球蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家畜血吸蟲抗體金標(biāo)免疫快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的膠體金標(biāo)記A蛋白結(jié)合物為膠體金溶膠加一定量金色葡萄球菌A蛋白加體積比為1％的小牛血清白蛋白，并在每毫升標(biāo)記物中加0.2-0.5mg聚乙二醇；優(yōu)選為0.5mg聚乙二醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家畜血吸蟲抗體金標(biāo)免疫快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的洗脫液是pH7.4，克分子濃度為0.05M的Tris-HCl緩沖液，加Triton X-100，加疊氮納。
5.一種家畜血吸蟲抗體金標(biāo)免疫快速檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于A.抗原點(diǎn)樣膜制備a.日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的制備健康家兔經(jīng)膚人工感染日本血吸蟲尾蚴，42天后，取兔肝經(jīng)各目篩子凈化蟲卵，丙酮脫脂干燥后研成粉末，用生理鹽水配制成質(zhì)量體積比為1％溶液，然后反復(fù)凍融，超聲處理，低溫高速離心，取上清液；b.抗原膜制備取孔徑為0.45μm的硝酸纖維素膜，劃成1cm×1cm的小方格，在小方格中央點(diǎn)1μl質(zhì)量體積比為1％的日本血吸蟲可溶性蟲蟲卵抗原，室溫涼干后密封，于4℃保存?zhèn)溆?；B.連接抗體制備a.健康家畜血清球蛋白提取分別采用飽和硫酸銨鹽析法提純家畜血清中的IgG；b.高免兔抗家畜抗血清的制備采用等量多點(diǎn)免疫法免疫家兔，以健康家畜血清球蛋白作為抗原，每次2mg，加等量福氏完全佐劑，采用足墊內(nèi)及皮內(nèi)多點(diǎn)注射，先后免疫三次，當(dāng)免疫血清雙擴(kuò)散試驗(yàn)效價(jià)達(dá)1∶32以上時(shí)從免疫兔心臟采血，分離血清，低溫保存；C.膠體金標(biāo)記A蛋白結(jié)合物的制備a.膠體金溶膠的制備采用鞣酸-枸椽酸納還原法；b.膠體金標(biāo)記金色葡萄球菌A蛋白-SPA探針的制備用克分子濃度0.1M K2CO3，將膠體金溶膠的pH值調(diào)至9.0，然后進(jìn)行最適蛋白穩(wěn)定量的測(cè)定，標(biāo)記時(shí)采用最小蛋白用量來達(dá)到與膠體金的充分結(jié)合，然后加適量聚乙二醇高速離心，取沉淀濃縮。
全文摘要
本發(fā)明涉及以可溶性日本血吸蟲蟲卵抗原為點(diǎn)樣抗原，采用膠體金標(biāo)記金色葡萄球菌A蛋白，檢測(cè)家畜血吸蟲抗體的試劑盒及制備方法。本發(fā)明將血吸蟲病診斷與納米金標(biāo)記蛋白技術(shù)相結(jié)合，建立一種新型、高效快速檢測(cè)家畜日本血吸蟲病的方法—斑點(diǎn)金免疫滲濾法，依此方法所研制的家畜血吸蟲病診斷試劑盒，其結(jié)果敏感性強(qiáng)，特異性高，判斷快速、準(zhǔn)確，操作簡潔、方便，不需要特殊儀器設(shè)備僅用肉眼即可鑒別，便于基層單位和檢疫部門使用。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該方法檢測(cè)牛血吸蟲病敏感性達(dá)93.3％，特異性達(dá)98.0％，約登指數(shù)＝0.913。
文檔編號(hào)G01N33/548GK1664585SQ20051004909
公開日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2005年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月7日
發(fā)明者沈麗英, 聞禮永, 丁建祖, 張劍鋒, 陳軍虎, 俞麗玲 申請(qǐng)人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院