專(zhuān)利名稱(chēng)：心血管疾病診斷和預(yù)測(cè)多指標(biāo)蛋白芯片檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于體外臨床檢驗(yàn)和生物芯片技術(shù)領(lǐng)域，確切地說(shuō)，是一種適于心血管疾病的診斷，預(yù)測(cè)和預(yù)后的八項(xiàng)指標(biāo)(CRP，Myoglobin，cTnI，cTnT，NT-proBNP，CK-MB，F(xiàn)ABP和GPBB)集成檢測(cè)的反應(yīng)板和試劑盒背景技術(shù)心血管疾病包括心臟和血管系統(tǒng)疾病。20世紀(jì)以來(lái)，隨著人類(lèi)社會(huì)文明的進(jìn)步，醫(yī)學(xué)技術(shù)得到大幅度發(fā)展，感染性疾病逐步得到控制。而經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平和生活方式的改變，使人類(lèi)疾病譜也發(fā)生了顯著變化，即轉(zhuǎn)向慢性非傳染性疾病為主向的改變。其中心血管疾病在西方國(guó)家已逐步成為引起死亡的主要病因，由心血管疾病引起的死亡人數(shù)約占世界總死亡人數(shù)的1/4，被稱(chēng)為人類(lèi)健康的“頭號(hào)殺手”，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命和生活質(zhì)量，造成巨大的人力和經(jīng)濟(jì)資源的浪費(fèi)。因此建立一套可以準(zhǔn)確、快速、方便地預(yù)測(cè)和診斷心血管疾病的檢測(cè)系統(tǒng)已迫在眉睫。
目前最常見(jiàn)的心血管疾病是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病簡(jiǎn)稱(chēng)為冠心病，是由冠狀動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的管腔阻塞所引起，并進(jìn)一步導(dǎo)致心肌缺血、缺氧所引起的心臟組織壞死以及冠狀動(dòng)脈功能性改變。
大量的研究表明冠狀動(dòng)脈粥樣硬化本身是一個(gè)炎癥的過(guò)程，持續(xù)的低水平的炎癥預(yù)示著心血管疾病發(fā)生的可能性。目前在炎癥指標(biāo)中，C-反應(yīng)蛋白(high sensitivity-CRP(hs-CRP))對(duì)心血管，腦血管以及外周血管疾病有著最好的預(yù)測(cè)及預(yù)后效果。
當(dāng)冠心病發(fā)作時(shí)，心肌的缺血缺氧所導(dǎo)致的心肌損傷，會(huì)使得一些心肌細(xì)胞蛋白被釋放入血，這些指示蛋白對(duì)冠心病的診斷有著及其重要的意義。目前，醫(yī)院檢測(cè)冠心病最為常用的指標(biāo)是CK-MB，但它的地位正被cTnI和cTnT這兩個(gè)同時(shí)具有高靈敏度和高特異性的“金指標(biāo)”所取代。但這兩個(gè)指標(biāo)釋放入血的時(shí)間相對(duì)較晚，因此還需要Myoglobin，F(xiàn)ABP和GPBB這三個(gè)指標(biāo)的配合來(lái)進(jìn)行早期的診斷。
除了冠心病以外，充血性心力衰竭也是一種常見(jiàn)的心血管疾病，NT-proBNP是診斷這種疾病的最靈敏和有效的指標(biāo)。
目前對(duì)心血管疾病的診斷和預(yù)測(cè)主要是對(duì)單個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本實(shí)用新型通過(guò)對(duì)八個(gè)指標(biāo)的快速檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)行全面的預(yù)測(cè)，診斷及預(yù)后，對(duì)心血管疾病的預(yù)防和治療有著重要的指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的是提供一種可同時(shí)對(duì)心血管疾病進(jìn)行預(yù)測(cè)，診斷和預(yù)后判斷的方法。我們的試劑盒通過(guò)檢測(cè)血清或血漿中的CRP，Myoglobin，cTnI，cTnT，NT-proBNP，CK-MB，F(xiàn)ABP和GPBB這八項(xiàng)指標(biāo)，來(lái)達(dá)到這一目的。
在本實(shí)用新型的第一方面，提供了一種心血管疾病的診斷和預(yù)測(cè)八項(xiàng)指標(biāo)集成檢測(cè)反應(yīng)板，反應(yīng)孔板包括基板和位于基板上的反應(yīng)孔，所述的反應(yīng)孔包括12-200個(gè)樣本孔，5-8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，其中，其特征在于每一反應(yīng)孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著抗CRP，抗Myoglobin，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體的微點(diǎn)陣。在每一反應(yīng)孔內(nèi)還設(shè)有一定位基準(zhǔn)點(diǎn)。
在一優(yōu)選例中，所述的固相載體是NC膜、或PDVF膜。
在另一優(yōu)選例中，所述樣本孔的數(shù)量為4-195個(gè)。
在另一優(yōu)選例中，所述的抗CRP，抗Myo，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體在固相載體上各有2個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)。
在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)孔每孔設(shè)有一個(gè)定位基準(zhǔn)點(diǎn)。
在本實(shí)用新型的第二方面，提供了一種心血管疾病的診斷和預(yù)測(cè)八項(xiàng)指標(biāo)集成檢測(cè)試劑盒，它包括本實(shí)用新型上述的心血管疾病的診斷和預(yù)測(cè)六項(xiàng)指標(biāo)集成檢測(cè)反應(yīng)板。
在另一優(yōu)選例中，還包括酶標(biāo)工作液、檢測(cè)液和標(biāo)準(zhǔn)品。
在另一優(yōu)選例中，所述的酶標(biāo)工作液由HRP標(biāo)記的相應(yīng)抗原或單克隆抗體組成，所述的檢測(cè)液由發(fā)光物和過(guò)氧化氫二種試劑組成，使用前混合。
在另一優(yōu)選例中，所述的發(fā)光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物。


圖1是本實(shí)用新型一種固相載體上心血管疾病檢測(cè)的八項(xiàng)指標(biāo)的點(diǎn)樣示意圖圖2是本實(shí)用新型的反應(yīng)孔中進(jìn)行的各抗原——抗體反應(yīng)的示意圖具體實(shí)施方式
心血管疾病八項(xiàng)指標(biāo)集成檢測(cè)的關(guān)鍵是要使八項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)的靈敏度和特異性均達(dá)到要求以保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，而相應(yīng)的難點(diǎn)是如何將濃度差高達(dá)10000倍的各檢測(cè)指標(biāo)整合到一個(gè)孔里來(lái)檢測(cè)。經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，本實(shí)用新型采用兩種不同的反應(yīng)方式進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)反應(yīng)板作了改進(jìn)，同時(shí)本實(shí)用新型采用的微點(diǎn)陣檢測(cè)技術(shù)，酶免疫間接法和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，大大提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性，從而解決了上述問(wèn)題。
具體而言，為提高心血管疾病八項(xiàng)指標(biāo)(CRP，Myoglobin，cTnI，cTnT，NT-proBNP，CK-MB，F(xiàn)ABP和GPBB)的檢測(cè)效率，本實(shí)用新型應(yīng)用微點(diǎn)陣檢測(cè)技術(shù)，結(jié)合酶免疫間接法和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)設(shè)計(jì)了一種心血管疾病八項(xiàng)指標(biāo)集成檢測(cè)反應(yīng)板，反應(yīng)孔板包括基板和位于基板上的反應(yīng)孔，所述的反應(yīng)孔包括12-200個(gè)樣本孔，5-8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，其中，其特征在于每一反應(yīng)孔的底部平面上有固相載體，且在固相載體上包被著抗CRP，抗Myoglobin，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體的微點(diǎn)陣。
各反應(yīng)孔的數(shù)量沒(méi)有特別限制，通常樣本孔為12-200個(gè)，較佳地5-50個(gè)。標(biāo)準(zhǔn)品孔3-10個(gè)，較佳地5-8個(gè)。
在本實(shí)用新型中，反應(yīng)孔的形狀和大小沒(méi)有特別限制，可以是圓形、方形、六角形、橢圓形、或其他形狀。大小通常為直徑0.5-5cm，深度為0.5-2cm。
在本實(shí)用新型中，反應(yīng)板基板的材料可以選用本領(lǐng)域常用的各種材料，較佳的基板材料包括玻璃、塑料、陶瓷等。
在本實(shí)用新型中，包被心血管疾病抗體的固相載體可以選用本領(lǐng)域常用的各種固相載體，包括(但并不限于)玻璃片、塑料、硝酸纖維(NC)膜、PDVF膜等，較佳的固相載體包括NC膜、PDVF膜。
在固相載體上，各有抗CR，抗Myoglobin，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體1-3個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)，較佳地2個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)。此外，較佳地在固相載體上還包括一個(gè)定位點(diǎn)(見(jiàn)圖1)。各點(diǎn)樣點(diǎn)之間的距離通常為0.1-5mm。
另一方面，本實(shí)用新型還提供了一種心血管疾病八項(xiàng)指標(biāo)集成檢測(cè)蛋白芯片試劑盒，該試劑盒可實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)并行化、微型化、高通量檢測(cè)。它包括本實(shí)用新型的反應(yīng)孔板、洗滌液、酶標(biāo)工作液、檢測(cè)液(A、B)、標(biāo)準(zhǔn)品等。其中，酶標(biāo)工作液由HRP標(biāo)記的相應(yīng)抗原或單克隆抗體組成，檢測(cè)液由發(fā)光物和過(guò)氧化氫二種試劑組成，發(fā)光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物，使用前混合。
在本實(shí)用新型中，各指標(biāo)的檢測(cè)采用酶免夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法，檢測(cè)原理如圖2夾心法和圖3競(jìng)爭(zhēng)法所示。詳細(xì)敘述如下1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。封閉，除去未結(jié)合的位點(diǎn)。
2)加受檢血清和酶標(biāo)溶液，酶標(biāo)溶液包含八項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的相應(yīng)的酶標(biāo)抗體(夾心法)或酶標(biāo)抗原(競(jìng)爭(zhēng)法)。對(duì)于采用夾心法檢測(cè)的指標(biāo)，特異的酶標(biāo)抗體(圖示為 與血清中的抗原(圖示為 形成復(fù)合物，并進(jìn)一步與固相抗體(圖示為 形成雙抗夾心復(fù)合物。對(duì)于采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)的指標(biāo)，特異的酶標(biāo)抗原(圖示為 與血清中的抗原(圖示為 競(jìng)爭(zhēng)性地與固相抗體(圖示為 結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物。
3)洗滌除去未結(jié)合的抗體，抗原及雜質(zhì)。
4)加底物固相上的酶催化底物，化學(xué)發(fā)光，CCD檢測(cè)，光強(qiáng)度與標(biāo)本中受檢抗原的量呈正相關(guān)(夾心法)或負(fù)相關(guān)(競(jìng)爭(zhēng)法)。
本實(shí)用新型巧妙地綜合利用了蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣檢測(cè)技術(shù)，酶免疫夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法，以及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了心血管疾病八項(xiàng)指標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本實(shí)用新型。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本實(shí)用新型而不用于限制本實(shí)用新型的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1檢測(cè)反應(yīng)板的制備取48孔板，設(shè)置42個(gè)樣本孔，6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔。在每個(gè)反應(yīng)孔的底部放置一固相載體(NC膜或PDVF膜)，且在固相載體上包被著抗CRP，抗Myoglobin，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體的蛋白質(zhì)微列陣(圖1)。
實(shí)施例2試劑盒制備制備含一心血管疾病八項(xiàng)指標(biāo)集成檢測(cè)的試劑盒，它含有實(shí)施例1的反應(yīng)孔板一塊(24-48人份)，洗滌濃縮液1瓶，酶標(biāo)工作液1瓶，檢測(cè)液A一瓶，檢測(cè)液B一瓶，標(biāo)準(zhǔn)品瓶。
洗滌濃縮液、酶標(biāo)工作液、檢測(cè)液A、檢測(cè)液B實(shí)施例3心血管疾病八項(xiàng)指標(biāo)集成檢測(cè)按以下方法對(duì)各測(cè)試血請(qǐng)樣品進(jìn)行檢測(cè)1.加檢測(cè)血請(qǐng)或標(biāo)準(zhǔn)品于相應(yīng)反應(yīng)孔內(nèi)，75ul/孔。
2.加酶標(biāo)工作液，75ul/孔。
3.37℃保溫振蕩反應(yīng)60分鐘。
4.用洗液洗滌4-6次，每次2分鐘，振動(dòng)。
5.加檢測(cè)液20ul/孔，使檢測(cè)液均勻分布于孔的底部。
6.CCD檢測(cè)，視發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度曝光30-60秒。
結(jié)果判定依據(jù)不同指標(biāo)的CutOff值，參考標(biāo)準(zhǔn)品梯度曲線，判定樣品血清的陰陽(yáng)性。
與此同時(shí)，用常規(guī)方法對(duì)測(cè)試的血清樣品進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。結(jié)果表明，用本實(shí)用新型的試劑盒得出的測(cè)試結(jié)果與常規(guī)方法相同。
在本實(shí)用新型提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本實(shí)用新型的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本實(shí)用新型作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)力要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求1.一種心血管疾病的診斷和預(yù)測(cè)八項(xiàng)指標(biāo)集成檢測(cè)反應(yīng)板，其特征在于，反應(yīng)孔板包括基板和位于基板上的反應(yīng)孔，所述的反應(yīng)孔包括12-200個(gè)樣本孔，5-8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，其中，其特征在于每一反應(yīng)孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著抗CRP，抗Myo，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體的微點(diǎn)陣。在每一反應(yīng)孔內(nèi)還設(shè)有一定位基準(zhǔn)點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)板，其特征在于，所述的固相載體是NC膜、或PDVF膜。
3.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)板，其特征在于，所述樣本孔的數(shù)量為4-195個(gè)。
4.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)板，其特征在于，所述的抗CRP，抗CRP，抗Myo，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體在固相載體上各有2個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)。
5.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)板，其特征在于，在每一反應(yīng)孔內(nèi)還設(shè)有一定位基準(zhǔn)點(diǎn)。
6.一種心血管疾病的診斷和預(yù)測(cè)八項(xiàng)指標(biāo)集成檢測(cè)蛋白芯片試劑盒，其特征在于，它包括權(quán)利要求1所述的心血管疾病的診斷和預(yù)測(cè)八項(xiàng)指標(biāo)集成檢測(cè)反應(yīng)板。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括酶標(biāo)工作液，檢測(cè)液和標(biāo)準(zhǔn)品。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶標(biāo)工作液由HRP標(biāo)記的相應(yīng)抗原或單克隆抗體組成，所述的檢測(cè)液由發(fā)光物和過(guò)氧化氫二種試劑組成，使用前混合。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的發(fā)光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物。
專(zhuān)利摘要本實(shí)用新型涉及心血管疾病的診斷和預(yù)測(cè)的八項(xiàng)指標(biāo)集成檢測(cè)反應(yīng)板和蛋白芯片試劑盒。所述的反應(yīng)孔板包括基板和位于基板上的反應(yīng)孔，所述的反應(yīng)孔包括12－200個(gè)樣本孔，5－8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，其中，每一反應(yīng)孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著抗CRP(C－反應(yīng)蛋白)，抗Myoglobin(肌紅蛋白)，抗cTnI(心肌肌鈣蛋白I)，抗cTnT(心肌肌鈣蛋白T)，抗NT－proBNP(N－末端腦利鈉肽)，抗CK－MB(肌酸激酶同工酶－MB)，抗H－FABP(心型脂肪酸結(jié)合蛋白)和抗GPBB(糖原磷酸化酶同工酶BB)等八種抗體的微點(diǎn)陣。本實(shí)用新型的反應(yīng)板和試劑盒可簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)多個(gè)人份的心血管疾病的診斷和預(yù)測(cè)八項(xiàng)指標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/531GK2783324SQ20052004121
公開(kāi)日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2005年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月28日
發(fā)明者穆海東 申請(qǐng)人:穆海東