專利名稱：谷氨酸脫氫酶診斷試劑盒及谷氨酸脫氫酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種谷氨酸脫氫酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測 定谷氨酸脫氫酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷氨酸脫氫酶是一種主要存在于細胞線粒體基質(zhì)中的酶，以肝臟含 量最高，其次為腎臟、胰腺、腦、小腸粘膜及心臟等器官。據(jù)報道，
肝臟中的谷氨酸脫氫酶濃度是心肌中的17倍，骨骼肌的80倍，胰腺 的28倍。由于谷氨酸脫氫酶的肝臟特異性，外周血中酶活性的改變在 一定程度上可反映肝臟功能的變化，故被認為是肝損害的一個敏感指 標。目前血清谷氨酸脫氫酶的測定主要采用連續(xù)監(jiān)測法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nrn波長處吸光度的變化，得以測定谷氨酸脫氫酶活性濃度的方 法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的谷氨酸脫氫酶診斷試劑 盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析 儀上進行谷氨酸脫氫酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高， 因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明谷氨酸脫氫酶活性濃度測定方法原理如下
氨離子+ 2-酮戊二酸酯+還原型輔酶 谷氨酸脫氫酶
L-谷氨酸+水+輔酶
這種方法應(yīng)用谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase ;EC 1.4.1.2; EC 1.4丄3)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。谷氨酸脫氫酶酶解酮戊二酸酯反應(yīng)， 同時將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm 處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的 速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算谷氨酸脫氫酶 的活性濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明谷氨酸脫氫
酶診斷試劑較為理想
緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
氯化氨 30 mmol/L
2-酮戊二酸酯 20 mmol/L
本發(fā)明的谷氨酸脫氫酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2-酮戊二酸酯、氯化氨。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。 試劑2
緩沖液、2-酮戊二酸酯、氯化氨。
還原型輔酶、2-酮戊二酸酯、氯化氨在試劑1或試劑2中的位置可 以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、。 試劑2
緩沖液、2-酮戊二酸酯。 試劑3
緩沖液、氯化氨。 還原型輔酶、2-酮戊二酸酯、氯化氨在試劑l、試劑2或試劑3中 的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定谷氨酸脫氫酶活性濃度的 方法，其還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的谷氨酸脫氫酶診斷試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
氯化氨 30 mmol/L
2-酮戊二酸酯 20 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測谷氨 酸脫氫酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反 應(yīng))，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值一 4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出谷氨酸 脫氫酶的活性濃度大小。 實施例二
本實施例的谷氨酸脫氫酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
2-酮戊二酸酯
100mmol/L 20 mmol/L 30 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37X:，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測谷氨 酸脫氫酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負反 應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理 論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出谷氨酸 脫氫酶的活性濃度大小。 實施例三
本實施例的谷氨酸脫氫酶診斷試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
100mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氯基甲烷一鹽酸緩沖液
100 mmol/L 50 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 2-酮戊二酸酯 10mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定谷氨酸脫氫酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度 37°C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7,測試主波長340nm， 測試副波長405nm,被測谷氨酸脫氫酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3 的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大 約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出谷氨酸 脫氫酶的活性濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng) 用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法技術(shù)的谷氨酸脫氫酶活性濃度測定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100968900002C1.gif" wi="131" he="15" top= "48" left = "36" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出谷氨酸脫氫酶的活性濃度大小結(jié)果。
2.氨離子+ 2-酮戊二酸酯+還原型輔g谷氨酸脫氫jL-谷氨酸+水+輔酶 將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出谷氨酸脫氫 酶的活性濃度大小結(jié)果。 -種谷氨酸脫氫酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——50mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L2-酮戊二酸酯1-1-50 mmol/L50 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸脫氫酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2-酮戊二酸酯、氯化氨組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸脫氫酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2-酮戊二酸酯、氯化氨組成雙劑 試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、2-酮戊二酸酯、氯化氨組成。還原型輔酶、2-酮戊二酸酯、 氯化氨在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸脫氫酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2-酮戊二酸酯、氯化氨組成多劑 試劑；試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶組成；試劑2，由 緩沖液、2-酮戊二酸'酯組成；試劑3，由緩沖液、氯化氨組成。還 原型輔酶、2-酮戊二酸酯、氯化氨在試劑l、試劑2或試劑3中的 位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸脫氫酶診斷試劑盒，其特征在于還 包括穩(wěn)定劑1—4000 mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法技術(shù)的谷氨酸脫氫酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定谷氨酸脫氫酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、2-酮戊二酸酯、氯化氨及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出谷氨酸脫氫酶的活性濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果。
文檔編號G01N21/78GK101169372SQ200610096890
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司