專利名稱：：納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因、蛋白及菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的編碼基因、蛋白及菌株，具體是納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶(GDH)編碼基因、蛋白及菌株。
背景技術(shù)：
：納豆芽孢桿菌(BacillusNatto)別名納豆菌，屬芽孢桿菌屬(Bacillus)，是枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)的一個(gè)亞種。1905年，日本人池村將產(chǎn)生納豆粘性物質(zhì)的一種菌作為獨(dú)立的納豆菌提出。從其生理生化等諸多性質(zhì)的研究來看，Smith等人認(rèn)為納豆菌與枯草桿菌是同物異名，因此在伯杰士的《細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》第六版中將納豆菌歸在枯草桿菌中。納豆菌主要從自然界的稻、谷上面分離得到，通常為(0.70.8)ymX(2.03.0)ym，呈革蘭氏陽性。生長(zhǎng)在葡萄糖瓊脂的細(xì)胞原生質(zhì)染色均勻。芽孢為橢圓形或柱狀，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不顯著，有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。生長(zhǎng)溫度最高為4555t:，最低為52(TC，孢子耐熱性強(qiáng)。納豆芽孢桿菌是日本納豆的發(fā)酵菌，發(fā)酵后能產(chǎn)生多種獨(dú)特的保健功效成份，例如納豆激酶、多聚谷氨酸、維生素1(2等，納豆已被證實(shí)具有溶解血栓、預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗菌、調(diào)節(jié)腸胃等生理預(yù)防和調(diào)節(jié)功能，除預(yù)防骨質(zhì)疏松與大豆本身含有的異黃酮有關(guān)外，其他功能主要取決于發(fā)酵后產(chǎn)生的新物質(zhì)。日本人將每年的7月10日定為納豆節(jié)，甚至將納豆稱為國寶，但納豆在中國市場(chǎng)卻難覓身影。究其原因，主要是發(fā)酵過程中產(chǎn)氨，氨在產(chǎn)品中累積使其風(fēng)味讓國人難以接受。然而，當(dāng)今世界，食療越來越受到人們的認(rèn)可和追捧，治未病的思想也開始成為各國政府對(duì)于國民健康的主導(dǎo)政策。因此作為一種功能性食品，如果能改良其風(fēng)味，納豆一定會(huì)有極大的市場(chǎng)需求。微生物氨基酸代謝產(chǎn)氨主要有脫羧作用、轉(zhuǎn)氨作用和聯(lián)合脫氨基作用。我們的前期研究表明，納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)氨的主要途徑不是脫羧作用，而是聯(lián)合脫氨基作用和轉(zhuǎn)氨作用。作為生物尿素循環(huán)、聯(lián)合脫氨的核心酶，谷氨酸脫氫酶為納豆菌代謝產(chǎn)氨途徑中的關(guān)鍵酶。MifiambresB.等在《JournalofBiologicalChemistry》(生物化學(xué)雜志)2000年第275巻第50期3952939542頁發(fā)表了題為《Anewclassofg1utamatedehydrogenases(GDH).Biochemica1andgeneticcharacterizationofthefirstmember,theAMP_requiringNAD-specificGDHofStr印tomycesclavuligerus》(一種新型的谷氨酸脫氫酶來源于棒狀鏈霉菌的，第一個(gè)需要AMP的、NAD特異的谷氨酸脫氫酶的生物化學(xué)和遺傳學(xué)性質(zhì))一文，文中對(duì)棒狀鏈霉菌(S.clavuligerusNRRL-3585,ATCC27064)谷氨酸脫氫酶的酶學(xué)特征進(jìn)行了研究，這對(duì)本專利中對(duì)谷氨酸脫氫酶酶活測(cè)定等提供了參考；HAYDENBronaghM.等在《FEMSmicrobiologyletters》(歐洲微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)快報(bào))2002年第211巻第1期3741頁發(fā)表了題為《GlutamatedehydrogenaseofHalobacteriumsalinarum-evidencethatthegenesequencecurrentlyassignedtotheNADP+_dependentenzymeisinfactthatoftheNAD+-d印endentglut咖atedehydrogenase》(極端嗜鹽菌Halobacteriumsalinarum的谷氨酸脫氫酶目前認(rèn)為是NADP+依賴型酶的基因序列實(shí)際上是編碼NAD+依賴型谷氨酸脫氫酶)一文，研究了嗜鹽菌Halobacteriumsalinarum(NRC36014)GDH的編碼序列；Kunst，F(xiàn).等在《Nature》(自然)1997年第390巻第6657期249256頁發(fā)表了題為《Thecompletegenomesequenceofthegram-positivebacteri咖Bacillussubtilis》(革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌的全基因序列)一文，報(bào)道了枯草芽孢桿菌編碼4100個(gè)蛋白的編碼基因共4，214，810個(gè)堿基對(duì)的全基因序列。上述文獻(xiàn)報(bào)道為納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶基因克隆的引物設(shè)計(jì)及基因測(cè)序后的同源性比較提供了依據(jù)，但納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶基因序列至今未見報(bào)道。中國科學(xué)院過程工程研究所于2002.06.14已經(jīng)申請(qǐng)了名稱為納豆芽孢桿菌及其在制備具有血栓溶解性保健食品中的應(yīng)用，專利號(hào)為ZL02121352.6。該專利描述了納豆芽孢桿菌，已于2002年3月8日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCCNO.0724;而且對(duì)該納豆芽孢桿菌的性質(zhì)特征進(jìn)行了說明菌株NLSSE為革蘭氏陽性，不抗酸桿菌；好氧，有芽孢，芽孢中生、不膨大，在一個(gè)孢子囊細(xì)胞中，芽孢不多于一個(gè)，細(xì)胞壁化學(xué)組分中含有meso-DAP(內(nèi)消旋二氨基庚二酸)，無特征性糖；菌株NLSSe為桿狀，直或近直形，O.60.8x1.52.0urn，能運(yùn)動(dòng)，鞭毛周生；在五種天然有機(jī)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，利用黃豆餅粉培養(yǎng)基形成較厚菌膜，菌落乳脂色，邊緣光滑。但該菌株并沒有表現(xiàn)出谷氨酸脫氫酶的活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因、蛋白及菌株。本發(fā)明確定了納豆芽孢桿菌的谷氨酸脫氫酶編碼序列，即RocG基因，為將來研究酶的活性位點(diǎn)和通過定點(diǎn)突變改變發(fā)酵菌株GDH酶活從而生產(chǎn)出低氨納豆奠定了基礎(chǔ)，RocG基因缺失菌株的氨產(chǎn)量可降低50%左右；同時(shí)提供了該基因編碼的蛋白以及含有該基因的一種納豆芽孢桿菌株。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明涉及一種納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因，其序列如SEQIDN0:1所示。所述基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明還涉及一種納豆芽孢桿菌(BacillusNatto)SJTU1-4CGMCCN0.2801。本發(fā)明首先進(jìn)行納豆芽孢桿菌的篩選和鑒定，然后提取篩選出的納豆芽孢桿菌DNA，之后進(jìn)行納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因的克隆，最后得到基因功能，并對(duì)該基因進(jìn)行表達(dá)和蛋白功能的驗(yàn)證。本發(fā)明具有如下的有益效果GDH是納豆芽孢桿菌產(chǎn)氨途徑中的關(guān)鍵酶，發(fā)酵18個(gè)小時(shí)后，納豆中的氨含量可高達(dá)360mg/100g納豆。本發(fā)明確定了納豆芽孢桿菌的谷氨酸脫氫酶編碼序列，即RocG基因，為將來研究酶的活性位點(diǎn)和通過定點(diǎn)突變改變發(fā)酵菌株GDH酶活從而生產(chǎn)出低氨納豆奠定了基礎(chǔ)，RocG基因缺失菌株的氨產(chǎn)量可降低50%;同時(shí)提供了該基因編碼的蛋白以及含有該基因的一種納豆芽孢桿菌株。4本發(fā)明所涉及的納豆芽孢桿菌(BacillusNatto)SJTU1-4，已于2008年12月9日提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏編號(hào)為CGMCCNO.2801，保藏期限為30年，保藏地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所。圖1為不同引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；圖2為菌落PCR的方法篩選重組子實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖3為RocG基因在E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例步驟一，納豆芽孢桿菌的篩選和鑒定1、納豆芽孢桿菌的篩選從日本料理店和上海浦東八百伴超市購買三種商品納豆極小粒納豆，丸美屋株式會(huì)社生產(chǎn)；旭松納豆一番，珠海西尾食品公司生產(chǎn)；水戶O納豆，才一寸卜株式會(huì)社生產(chǎn)(水戶牌納豆，佐藤股份有限公司)。取納豆10g，置于裝有100ml滅菌的生理鹽水的三角瓶中，輕輕搖晃10min后，取1ml懸濁液放于裝有LB培養(yǎng)基25ml的250ml三角瓶中，于37。C下培養(yǎng)18小時(shí)，按10倍稀釋法取樣涂布于平板上，從平板上挑選出單菌落進(jìn)行納豆激酶活性的測(cè)定。2、納豆激酶活性的測(cè)定(1)溶液配制瓊脂糖溶于0.1M磷酸鹽緩沖液中，濃度為1%，沸水浴30min;纖維蛋白原溶于0.1M磷酸鹽緩沖液中，濃度為1.25mg/ml，置于55。C恒溫水浴中；凝血酶按15BP/ml的濃度溶于上述緩沖液中。(2)平板制作瓊脂糖與纖維蛋白原等量混合，每平皿中加入0.5ml凝血酶溶液，然后加入瓊脂糖_纖維蛋白原混合液20ml，置于平面冷凝。再將平皿置于85t:烘箱中烘30min，冷卻，用微量進(jìn)樣器在平皿上打孔。(3)酶活測(cè)定取尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品適量，用0.Olmol/L的PBS(pH值7.5)將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品配制為115，230，345，460，690(IU/ml)5個(gè)濃度梯度，將這5個(gè)濃度的尿激酶溶液和發(fā)酵收集的樣品液，用微量進(jìn)樣器注入平板孔內(nèi)，10yl/孔，37t:孵育18h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量每個(gè)溶圈的直徑，計(jì)算出溶圈的面積，以尿激酶活力單位數(shù)為橫坐標(biāo)，溶圈面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品溶圈面積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出相當(dāng)于尿激酶的活力單位數(shù)。3、菌種鑒定方法5預(yù)檢試驗(yàn)取納豆激酶活性最高的菌種1-4進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)，挑取單菌落，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢。此菌株的單菌落形態(tài)為中間隆起，邊緣及表面光滑的乳白色菌落；革蘭氏檢驗(yàn)為陽性菌；鏡檢觀察其形態(tài)為桿狀。菌種鑒定使用生物梅里埃(BioMerieux)公司生產(chǎn)的API50CH鑒定試劑盒。API50CH試劑盒檢測(cè)選取初步鑒定過的單個(gè)菌落，在LB平板上恒溫培養(yǎng)，平板數(shù)為34個(gè)，培養(yǎng)條件為37°C，18h。將所有培養(yǎng)平板上的菌落和菌苔用滅菌棉簽全部轉(zhuǎn)移到lml無菌生理鹽水中，制成濃的菌懸液。吸取濃的菌懸液滴加到5ml無菌生理鹽水中，調(diào)整濁度到麥?zhǔn)蠞岫?McFarland)2，記錄滴數(shù)n，打開一只API50CH培養(yǎng)基，向其中滴加2n滴濃的菌懸液，搖勻，制成用于接種API50CH試劑條的菌液。將菌液依次加入API50CH試劑條的試劑杯中，加培養(yǎng)基至杯口的下沿，排除其中的氣泡，放入已加有蒸餾水的盛放試劑條的盒子中，37t:下培養(yǎng)48h。其中24h觀察一次結(jié)果，48h再觀察一次結(jié)果。通過兩次觀察的結(jié)果在API50CH的數(shù)據(jù)庫中查詢菌種的鑒定結(jié)果，具體見表l。通過API50CH數(shù)據(jù)庫對(duì)鑒定結(jié)果的檢索，菌種l-4為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，即納豆芽孢桿菌(BacillusNatto)SJTU1-4CGMCCNO.2801。表1菌種API50CH鑒定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>%ID衡量為此菌種的可能性；T衡量菌種變異的指表，T值越接近1說明變異的程度越小。步驟二，納豆芽孢桿菌DNA提取取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的納豆芽孢桿菌細(xì)胞1.5ml，室溫下12，000r/min離心0.5min，棄去上清液。再在同一離心管中加上述細(xì)胞1.5ml，室溫12，000r/min離心0.5min，棄去上清液。用等體積的無菌蒸餾水洗滌一次，12，000r/min離心0.5min，棄去上清液。加入446iiLTE(10mMTris-HCllmMEDTApH=8.0)，24iiL溶菌酶(20mg/ml)，37。C放置lh。再添加27.5mlSDS(10%)和2.5yL的蛋白酶K(20mg/ml)，培養(yǎng)至完全澄清(55。C，lh)。加入500iiL的l:1苯酚一氯仿異戊醇(24:l)，顛倒混勻，靜置，離心12，000r/min離心5min。取上清液，加入500iiL的氯仿-異丙醇(24:1)，顛倒混勻后，于12000g離心5min，隨后輕輕將上層水相移入另一支1.5ml小離心管中。加入2倍體積的冷無水乙醇，-20。C放置2小時(shí)，沉淀DNA。用70%冷乙醇洗滌1次，于12000g離心5min，棄上清，風(fēng)干。將DNA懸于無菌水或50iUTE緩沖液中溶解，-2(rC保存待用。步驟三，納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因的克隆1、引物設(shè)計(jì)對(duì)不同來源GDH—級(jí)結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，盡管GDH有不同類型，但共生梭菌、枯草芽孢桿菌和冰島熱棒菌等細(xì)菌GDH活性中心的氨基酸序列非常保守。查詢NCBI網(wǎng)站GenBank中枯草芽孢桿菌的GDH編碼基因(RocG)序列，利用PrimerPremier5.0引物設(shè)計(jì)軟件以下特異性引物，交由上海生工生物工程公司合成。引物1:(Senseprimer)5'TCGCCTGCAAGAGTATGGTAAG3'Tm:52.7°C，GC%50%3，(305)AGCGGACGTTCTCATACCATTC(326)5，(Anti-senseprimer)5'AGGTTTGATGCGTCGGGTAA3'Tm:53.0°C，GC%55%3，(2069)TCCAAACTACGCAGCCCATT(2050)5，引物2:(Senseprimer)5'GCCTGCAAGAGTATGGTAAG3'Tm:60.07°C°C，GC%50%3'(307)CGGACGTTCTCATACCATTC(326)5'(Anti-senseprimer)5'GATAGTCCACAAGGTCCTCC3'Tm:60.4°C，GC%50%3'(1971)CTATCAGGTGTTCCAGGAGG(1952)5'引物3:(Senseprimer)5'TATCGCCTGCAAGAGTATGG3'Tm:56.4°C，GC%50%(Anti-senseprimer)5'AATGGGCTGCGTAGTTTG3'Tm:54.6°C，GC%50%預(yù)計(jì)引物1的擴(kuò)增片斷為1750bp，引物2的擴(kuò)增片斷為1680bp，引物3的擴(kuò)增片斷為1680bp。2、引物有效性鑒定設(shè)置不同的PCR條件，分別加入引物1、引物2、引物3，根據(jù)擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳所得片斷大小判斷引物1、引物2、引物3的擴(kuò)增有效性。反應(yīng)體系如表2所示。PCR參數(shù)設(shè)置94"下加熱5分鐘后，94"變性1分鐘，57"退火1分鐘，72"延伸1分鐘，循環(huán)35輪，進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72t:下保溫10分鐘，將混合物在使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果。不同引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。圖中電泳泳道13的擴(kuò)增引物分別為1，2，3時(shí)PCR產(chǎn)物的電泳圖，M為200bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示引物1的擴(kuò)增片斷為1750bp，引物2的擴(kuò)增片斷為1680bp，目標(biāo)DNA得到有效擴(kuò)增。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>10Xbuffer2.5u1dNTP(2.OmM)1.On1上下游引物(各10uM)2.On1TaqDNA聚合酶(2.5U)0.5u1模板(約lng)1.5u1補(bǔ)無菌水至25u13、最佳模板DNA濃度摸索將提取的DNA用TE分別稀釋20倍和50倍，利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)算其核酸濃度，查閱相關(guān)文獻(xiàn)得到PCR擴(kuò)增反應(yīng)最佳DNA模板濃度參考值，以此為依據(jù)稀釋DNA，以得到最佳PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果。4、質(zhì)粒DNA的連接、轉(zhuǎn)化和篩選在微量離心管中加入pMD19-TSimpleVector1yl，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物2iil，加dH20至5ii1。加入5iil(等量)的SolutionI，在16。C反應(yīng)30min。全量(lOyl)加入至100illJM109感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min，然后于42t:加熱45s后，再在冰中放置lmin。加入890y1SOC培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)60min。經(jīng)轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后的產(chǎn)物在Amp-LB平板上過夜生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化子形成白色單菌落。任意挑選白色單菌落，在引物2作用下PCR，擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶片斷大小鑒定重組子。菌落PCR的方法篩選重組子實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。圖中泳道l為大腸桿菌轉(zhuǎn)化后挑選出的81號(hào)轉(zhuǎn)化子在引物2條件下的擴(kuò)增結(jié)果，泳道2為95號(hào)轉(zhuǎn)化子在引物2條件下的擴(kuò)增結(jié)果，M為200bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。從圖中顯示的結(jié)果可看出目標(biāo)片段已經(jīng)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌。5、納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因測(cè)序納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因的測(cè)序由上海桑尼生物科技有限公司完成，得到基因的序列，全長(zhǎng)為1275bp。將測(cè)序得到的序列使用NCBI的BLASTn工具進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)納豆枯草芽胞桿菌的谷氨酸脫氫酶編碼基因與BacillusSubtilis168菌株的RocG基因的相似度為98%，與其他芽孢桿菌家族的RocG基因的相似度也在8094%，因此可以確定已克隆的這段基因中含有納豆枯草芽孢桿菌RocG基因。經(jīng)ORFFinder和BLASTp工具分析，得到一段長(zhǎng)達(dá)422個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列，該序列與BacillusSubtilis168菌株的GDH的相似度亦為98%，與其他芽孢桿菌的GDH的相似度在50%以上，所以可以確定已克隆出納豆芽孢桿菌中表達(dá)GDH的RocG基因。表3為本發(fā)明的納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶與枯草芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因的堿基序列的同源比較(FASTA)表。表398%Identityin954overlapsAAATCG60AAATCATACGAASbjet194680Query12019473961TACGAAGACGGTSbjet194620Query180194679121GACGGTACGAAASbjet194560Query240194619181ACGAAAGCGCTTSbjet194503Query291194559TCAGTAAAGATTTTCACAGGATATCGT—GC-GCACAATGACTCTGTCGGTCCA241GGCGGGATACGTTTTCACCCGAATGTAACAG-AAAA-A—-G_A—-GGTGAAGGCGCTTAAAGGCSbjct194502194443Query292351AAAGGCAGAGGGSbjct194442194383Query352411AGAGGGGATGTASbjet194323Query471194382412GATGTAGAATTTSbjet194263Query531194322472GAATTTAGAGAA[O川]Sbjet194203Query591194262532AGAGAAGGCATCSbjet194143Query651194202592GGCATCTTGGCASbjet194083Query711194142652TTGGCAGGACTTSbjet194023Query771194082712GGACTTSbjet193963Query194022772GGTACCGGTACCTGTGATTGTGATATTCGGATCCGGATTCTTATTCTTACAGTTACAGTTGTAGAAGTAGAAAACAAC831193903891193843951Sbjct193842193783Query9521011Sbjct193782193723Query101210711936631131193603119111ACAACAAGCTSbjet193543Query12511936021192AAGCTSbjet193483Query1935421252TCGCGTTTTAGAGGCTGGATATAA1275Sbjct193482TCGCGTTTTAGAGGCTGGATATAA193459Query:納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶的核酸序列Sbjct:枯草芽孢桿菌168谷氨酸脫氫酶的核酸序列表4為本發(fā)明的納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶與枯草芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。表498%Identityin427aaoverlapsQuery1DDG60DGDDG60GKG117LSI麗SLKCGIIDLPYGGGKGSbjct61SVKIFTGYRA-HNDSVGPTKGGIRFHPNVTEKEVKAVKALSI麗SLKCGIIDLPYGGSbjct1MAADRNTGHTEGDKLDVLKSTQTVIHKALEKLGYPEEVYELLKEPMRLLTVKIPVRMMAADRNTGHTEDKLDVLKSTQTVIHKALEKLGYPEEVYELLKEPMRLLTVKIPVRMDMAADRNTGHTEEDKLDVLKSTQTVIHKALEKLGYPEEVYELLKEPMRLLTVKIPVRMQuery61SVKIFTGYRARHNDSVGPTKGGIRFHPNVTEKEVKA—-LSI麗SLKCGIIDLPYGGSVKIFTGYRAHNDSVGPTKGGIRFHPNVTEKEVKAGKG119DEF177DEFDEF179YLA237Query118GIVCDPRDMSFRELERLSRGYVRAISQIVGPTKDVPAPDVFTNSQIMA麗DEYSRIGIVCDPRDMSFRELERLSRGYVRAISQIVGPTKDVPAPDVFTNSQIMA麗DEYSRISbjct120GIVCDPRDMSFRELERLSRGYVRAISQIVGPTKDVPAPDVFTNSQIMA麗DEYSRIQuery178NSPGFITGKPLVLGGSHGRESATAGVTICIKEAAKKRGIDIKGARVVVQGFGNAGS12YLASbjct180YLA239Query238DCD297LLDRRDSFGTVTKLFNDTITNQELLELDCDSbjct240KFMHDAGAKVVGISDAYGGLYDPEGL+IDDCD299VTV357VTVVTV359AEA417AEAAEA419Query298Sbjct300Query358SYFEWVQNNQGFYWSEEEVEEKLEK匪VKSFNNIYEMANNRRIDMRLAA預(yù)VGVRKMSYFEWVQNNQGFYWSEEEVEEKLEK匪VKSFNNIYEMANNRRIDMRLAA預(yù)VGVRKMSbjct360SYFEWVQNNQGFYWSEEEVEEKLEK匪VKSFNNIYEMANNRRIDMRLAA預(yù)VGVRKMQuery418SRFRGWI424SRFRGWISbjct420SRFRGWI426Query:納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶的氨基酸序列Sbjct:枯草芽孢桿菌168谷氨酸脫氫酶的氨基酸序列步驟四，基因功能的鑒定1、構(gòu)建表達(dá)載體設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)(EcoRI、NheI)，合成引物(加接頭引物CGTACGG)。F-CGTACGGCTAGCATGGCGGCCGATCGAAAC-nhe1R-CGCTAGGAATTCCGATTGGCATTTCACTTT-EC0RI接頭PCR擴(kuò)增后，將產(chǎn)物純化。將目的基因和載體雙酶切后，純化酶切產(chǎn)物。將上述雙酶切產(chǎn)物用T4連接酶與載體連接，轉(zhuǎn)入DH5a，菌落PCR檢測(cè)后，挑選陽性轉(zhuǎn)化子送去測(cè)序。2、誘導(dǎo)表達(dá)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.ColiBL21(DE3)，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含Kan50iig/ml)，次日按1%比例轉(zhuǎn)接入新鮮的Kan-LB，37。C搖床培養(yǎng)3小時(shí)后，取菌液1ml在37t:繼續(xù)培養(yǎng)做非誘導(dǎo)表達(dá)9小時(shí)，其余菌液加IPTG至終濃度為0.4mM，28t:培養(yǎng)9小時(shí)。3、表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析誘導(dǎo)表達(dá)和非誘導(dǎo)表達(dá)的菌液各lml，12000rpm離心lmin，去上清，加50水重懸后，加入40ill的2XSDS上樣緩沖液，混勻，再加入10ill的DTT，99。C干浴5min，取15ill進(jìn)行SDS-PAGE電泳。濃縮膠和分離膠分別為5%和12%，濃縮膠電壓為80V，分離膠電壓為120V。電泳凝膠經(jīng)考馬斯亮蘭快速染色液染色2小時(shí)，置脫色搖床上進(jìn)行脫色。10ml12%的分離膠H203.2ml，30%丙烯酰胺混合液4.Oml，1.5mo1/1Tris(pH8.8)2.6ml，10%SDS0.lml，10%過硫酸銨0.lml，TEMED0.004ml。2ml5%的積層膠H201.4ml，30%丙烯酰胺混合液0.33ml，1.Omo1/lTris(p朋.8)0.25ml，10%SDS0.02ml，10%過硫酸銨0.02ml，TEMED0.002ml。5XTris甘氨酸電泳緩沖液Tris15.lg，甘氨酸94.Og，10%SDS50ml，定容至1000ml。脫色液125ml乙醇，40ml冰醋酸，加水至500ml。4、GDH純化(l)超聲破菌誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)菌在4t:以10000rpm離心5min，收集菌體，PBS洗一遍，再用PBS重懸，置于冰浴中，超聲破菌(350W，持續(xù)5s，間隔10s，共20次)，10000rpm離心10min，分別保留上清和沉淀，12%SDS-PAGE的分析結(jié)果見圖3。圖中泳道1:0.2mMIPTG，誘導(dǎo)2h，上清;泳道2:0.2mMIPTG，誘導(dǎo)2h，沉淀；泳道3:0.2mMIPTG，i秀導(dǎo)4h，上清;泳道4:0.2mMIPTG，i秀導(dǎo)4h，沉淀;泳道5:0.4mMIPTG，i秀導(dǎo)2h，上清;泳道6:0.4mMIPTG，i秀導(dǎo)2h，沉淀;泳道7:0.4mMIPTG，i秀導(dǎo)4h，上清;泳道8:0.4mMIPTG，誘導(dǎo)4h，沉淀。圖中結(jié)果顯示，超聲破菌后，重組蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中。(2)包涵體的變性、純化、復(fù)性取100mL經(jīng)適宜濃度IPTG誘導(dǎo)6h后的細(xì)菌培養(yǎng)物，8000Xg離心5min，收集菌體，以PBS(pH=7.2)洗滌菌體一次；然后將菌體重懸于1/10體積的PBS中，超聲波破碎至溶液不再粘稠(須冰上操作)；5，OOOg離心15分鐘，包涵體和細(xì)胞碎片位于沉淀中。其他可溶蛋白部分位于上清中；移去上清，每100ml培養(yǎng)物的沉淀重懸于10ml1X結(jié)合緩沖液(含6M尿素)；冰浴孵育1小時(shí)，徹底溶解包涵體。離心去除不溶成分；將lml50%Ni-NTAHis*Bind樹脂懸液加到4ml細(xì)胞裂解液中，輕柔混勻(如旋轉(zhuǎn)混合器200rpm)，室溫結(jié)合1560min;將裂解液與Ni-NTAHisBind樹脂的混合物小心加入下端封閉的空色譜柱中；除去柱下端封閉蓋子，收集流出液(穿過峰)，用于SDS-PAGE分析；以4mlbufferC(8M尿素，0.1MNaH2P04，0.01MTris-CI，p朋.3)漂洗雜蛋白2次。保存漂洗組分用于SDS-PAGE分析；以0.5mlbufferD(8M尿素，0.1MNaH2P04，0.01MTris_CI，pH5.9)洗脫目的蛋白4次，再以0.5mlbufferE(8M尿素，0.1MNaH2P04，0.01MTris-Cl，pH4.5)洗4次，收集組分，并用SDS-PAGE分析。蛋白單體通常用bufferD即可洗脫，而多聚體、聚合物和含兩個(gè)HisTag標(biāo)簽的蛋白通常由bufferE洗脫；收集的蛋白洗脫液中，加105iiL20X的PEG4000、210iiL50mmol/L的氧化型谷胱甘肽和210L10Ommol/L的還原型谷胱甘肽，室溫靜置約2h;轉(zhuǎn)至處理好的透析袋中，用TE(pH=7.2)透析23天，每天換液57次。5、蛋白濃度及GDH酶活測(cè)定在25°C，取酶液與酶活測(cè)定液各1.5ml測(cè)定GDH催化輔酶NADP+還原所引起的光吸收值在340nm波長(zhǎng)處的變化。GDH活力測(cè)定反應(yīng)液中含O.lmTris/HCl緩沖液(pH9.0)，350mML-谷氨酸，2mMNADP+，終體積為lml;定義每分鐘催化liimolNADP+還原所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。對(duì)照為不含GDH的緩沖液。結(jié)果如表5所示。酶活=A0D34。X2/0.0618蛋白濃度=1.45X0D28。_0.74X0D260表5純化前后GDH酶活比較<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>序列表〈110〉上海交通大學(xué)〈120〉納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因、蛋白及菌株〈160>2〈170>PatentInVersion3.5〈210>1〈211>1275〈212>DNA〈213〉納豆芽孢桿菌(BacillusNatto)〈400〉1ttatatccagcctcteaaacgcgaagcttcagccattttgcgaacgccgaccatetetgc60agcgagcctcatgtcaattcttcggttgttagccatttcateaatettgtteaatgattt120gaccatcattttttcteatttttcttctecctcttcttcactccagtegaagccttggtt180attctgaacccattcaaaataagaaactgttecgccaccggcacttgccagcacgtctgg240tecaagcagaatgtcccggtctgaaagaatctttgttccttcaagcgttgttggtccgtt300cgctgcttcattcaatcgcaggtetcgttggatetteaggtgcccccgca朋cgacacgcggteac3ccagcctgteateagccatgattaatttggctgatcccttggagcattttaaa朋朋cgtetcg朋朋tcttecggctctttttettecggtt〈210>2〈211>424〈212>PRT〈213〉納豆芽孢桿菌(Bacillus〈400>2AlaAlaAspArgAsnThracgacaattttegcccgaatattetgggcattttcttctgteatttgatt360gC3gg皿Cg3atccagctccagcagctcttggttggt皿t420ttecggteccg皿gctgtcgcgtcggtcga■ccttccggatcateaagtccgccatecgcatctgagatgccgacaacttt540tcatgcateaattttgccaaategcttcccgcgtttccgaagccttggac600gcaccttteatetcgatgcctctcttcttegccgcttcttteatecagat660tttgctgtcgcagattctctcccgtgagatccgccaagcacaagcggttt720皿tccaggcgatcaattcttgaatectcatccatcatcca780tgtgagtttgcggtgccggcacgtcttttgtcgggccgac840atcgctctgacateccctctgctcagacgctccagctctcte^cgacat■ttccgccttt3ccaccgcc3tetgg皿gatcaattetgcc960ctcatccaaattga皿gcgccttcacctctttttctgttecattcgggtg1020ccgcctttcgttggaccgacagagtcattgtgccgcgcacgatetcctgt1080actgaaccgtcgtccatecg皿caggtettttteccgtteateatctcat1140aacaattcgtatecctcttcgggatatcccaatttttccagagccttatg1200tgggtcgatttteatecatcaagtttgtccccttctgtetgaccggtgtt1260gccat1275Met1AspLysMetSerValGluGlyCysValLeuLysTyrLeuLeuArgValGlyLyslieAspGlyLeuLysProlieThrGluVallieProAspArg5Ser20Pro35Thr50Phe65Lys80Lys95Leu110AspNatto)GlyThrGinThrThrHisGluGlyAspLysLeu1015VallieHisLysAlaLeuGlu2530GluGluValTyrGluLeuLeuLysGluPro4045ValLyslieProValArgMetAspAspGly5560ThrGlyTyrArgAlaArgHisAsnAspSer7075GlyGlylieArgPheHisProAsnValThr8590AlaLeuSerlieTrpMetSerLeuLysCys100105ProTyrGlyGlyGlyLysGlyGlylieVal115120MetSerPheArgGluLeuGluArgLeuSerArgAspTrpGlyArgAlaValGlyValGlyArglieProlieLeuProGluVallieAlaTyrProMetMetPheGluAlaGinlieSerLysGlyHisAspAlaTyrAspLeuArgThrAlaArgGluAspTrpGluTyrTyrAsnAlaAlaGlyValValGluGluValAlaAspThrAlaLysPheGlyAspSerGinlieLysThrLeuGinLysMetMetVal125Arg140Pro155Glu170Gly185Thr200Arg215Gly230Ala245Pro260Phe275Glu290Glu305lie320Lys335Ala350Asn365Leu380Ala395Gly410AlaLysGluGlyAsnValSerAsnlieSerGinValPheThrAspTyrSerArglieLysProLeuValAlaAsnGlyAspGlyValGlyAsnlieAlaValGlyThrGinValAlaGinVallieSerGlyLeuAsnValLeuLeuGlulieGluThrLeuThrAlalieLeuSerAspGlyGlyGlyPheGluLysMetMetAsnAsnArgValArgLysArgMet130lie145Asn160Asp175Leu190Thr205Lys220Tyr235lie250lie265Lys280Asp295Glu310Ala325Arg340Val355Tyr370Val385lie400Ala415ValSerGluGlylieGlyLeuSerAspLeuCysGluAsnAspThrTrpLysAspGluGlyGinPheGlyCysAlaAlaAspCysPheAspAsnSerSerProThrlieMetAsnSerSerHislieArgLysAlaLysValPheTyrLeuLeuAsnAsplieAlaLeuHisGlyProThrlieLeuLeuValSerGluPheTyrGluAsnMetArgLeuAlaSerArg135Lys150Ala165Pro180Gly195Glu210Val225Met240Gly255Asp270Thr285Val300Asn315Thr330Val345Phe360Glu375Asn390Ala405Phe420ArgGlyTrplie42權(quán)利要求一種納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因，其特征在于，其序列如SEQIDNO1所示。2.如權(quán)利要求1所述的納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.—種納豆芽孢桿菌(BacillusNatto)SJTU1-4CGMCCNO.2801。全文摘要本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶(GDH)編碼基因、蛋白及菌株。納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因具有如SEQIDNO1所示的堿基序列；該基因編碼的蛋白質(zhì)具有如SEQIDNO2所示的氨基酸序列；本發(fā)明還提供了一種納豆芽孢桿菌(BacillusNatto)SJTU1-4CGMCCNO.2801。本發(fā)明確定了納豆芽孢桿菌的谷氨酸脫氫酶編碼序列，即RocG基因，為將來研究酶的活性位點(diǎn)和通過定點(diǎn)突變改變發(fā)酵菌株GDH酶活從而生產(chǎn)出低氨納豆奠定了基礎(chǔ)，RocG基因缺失菌株的氨產(chǎn)量可降低50％。文檔編號(hào)C12N15/53GK101705238SQ20091019627公開日2010年5月12日申請(qǐng)日期2009年9月24日優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日發(fā)明者于湘莉,劉斌,張建華,陳麗麗申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)