專利名稱：二乙基對硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒及二乙基對硝基苯磷酸酯酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種二乙基對硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，同時本發(fā) 明還涉及測定二乙基對硝基苯磷酸酯酶活性的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測 定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血清中的二乙基對硝基苯磷酸酯酶，主要在肝臟表達，其作用是水 解組織中磷酸酯。血清中的二乙基對硝基苯磷酸酯酶與人體中的高、 低密度脂蛋白代謝有關(guān)。二乙基對硝基苯磷酸酯酶可以保護低密度脂 蛋白，避免氧化修飾，所以，可以認為，二乙基對硝基苯磷酸酯酶是 一種具有抗動脈粥樣硬化以及抗炎作用的酶。血漿二乙基對硝基苯磷 酸酯酶活性的增加，使血漿中抗氧化修飾型低密度脂蛋白的自身抗體
水平降低18.8%，而高密度脂蛋白上二乙基對硝基苯磷酸酯酶活性的 增加，使高密度脂蛋白水平升高9.1%。
吸煙者體內(nèi)的二乙基對硝基苯磷酸酯酶的活性濃度較之非吸煙者 或戒煙者的活性濃度低，因而抗氧化作用也隨之降低，導(dǎo)致血管中產(chǎn) 生較多膽固醇沉積，而多余的膽固醇可以導(dǎo)致血管堵塞，最終導(dǎo)致心 臟病或中風(fēng)發(fā)生。除吸煙之外，糖尿病和衰老也與二乙基對硝基苯磷 酸酯酶水平降低有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)
監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化， 得以測定二乙基對硝基苯磷酸酯酶活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還 將給出用以實現(xiàn)該方法的二乙基對硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，采用 該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進 行二乙基對硝基苯磷酸酯酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度 高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明二乙基對硝基苯磷酸酯酶活性濃度測定方法原理如下 芳基二烷磷酸+水二乙基對硝基苯磷酸酯酶二烷基磷酸
+芳基醇
芳基醇+輔酶芳基醇脫氫酶芳基醛+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用二乙基對硝基苯磷酸酯酶(Paraoxonase ; EC3丄1.2) 酶(偶)聯(lián)芳基醇脫氫酶(Arylalcohol dehydrogenase ; EC 1.1.1.90 ; EC 1.1.1.91)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。二乙基對硝基苯磷酸酯酶酶解芳基二 烷磷酸反應(yīng)產(chǎn)生芳基醇，再通過(偶)聯(lián)合芳基醇脫氫酶的作用，最 終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速 度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算二乙基對硝基苯 磷酸酯酶酶的活性濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明二乙基對硝
基苯磷酸酯酶診斷試劑較為理想
緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
芳基醇脫氫酶 14000 U/L
芳基二垸磷酸 14mmol/L
本發(fā)明的二乙基對硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、芳基二垸磷酸、芳基醇脫氫酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、芳基二垸磷酸。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、芳基醇脫氫酶。
輔酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可 以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、芳基二烷磷酸。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、芳基醇脫氫酶。
輔酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑3中 的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑或三劑，本發(fā)明測定二乙基對硝基苯磷酸酯酶活 性濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一
本實施例的二乙基對硝基苯磷酸酯酶診斷試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
芳基醇脫氫酶 14000 U/L
芳基二烷磷酸 14mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測二乙基對硝基苯磷酸酯酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)
(上升反應(yīng))，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論 K值4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出二乙基 對硝基苯磷酸酯酶的活性濃度大小。
實施例二
本實施例的二乙基對硝基苯磷酸酯酶診斷試劑為雙試劑，包括
試劑1
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑
芳基二垸磷酸
50 mmol/L 3 mmol/L 10 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
50 mmol/L
16000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測二乙基 對硝基苯磷酸酯酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方 向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出二乙基 對硝基苯磷酸酯酶的活性濃度大小。
實施例三
本實施例的二乙基對硝基苯磷酸酯酶診斷試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L :U 穩(wěn)定劑50 mmol/L 輔酶3mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑50mmol/L 芳基二烷磷酸18 mmol/L
試劑3
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑50 mmol/L
芳基醇脫氫酶10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定二乙基對硝基苯磷酸酯酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上 設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長 340rnn，測試副波長405nm，被測二乙基對硝基苯磷酸酯酶樣品與試
劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上 升反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K 值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出二乙基 對硝基苯磷酸酯酶的活性濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng) 用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的二乙基對硝基苯磷酸酯酶活性濃度測定方法，其方法原理如下芳基二烷磷酸+水 二乙基對硝基苯磷酸酯酶 二烷基磷酸 +芳基醇芳基醇+輔酶 芳基醇脫氫酶 芳基醛+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出二乙基對硝基苯磷酸酯酶的活性濃度大小測定結(jié)果。
2. —種二乙基對硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，主要成分包括-緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1"——50mmol/L輔酶 1- 6 mmol/L芳基醇脫氫酶 1000——80000 U/L芳基二烷磷酸 1——50 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述二乙基對硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述二乙基對硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、芳基二垸磷酸、芳基醇脫氫酶組成雙劑 試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、芳基二烷磷酸組成；試 劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、芳基醇脫氫酶組成。輔酶、芳基二烷磷 酸、芳基醇脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述二乙基對硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，其特 征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脫氫酶組成多劑 試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、組成；試劑2，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、芳基二垸磷酸組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、芳 基醇脫氫酶組成。輔酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脫氫酶在試劑l、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述二乙基對硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，其特 征在于還包括穩(wěn)定劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所 述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol).丙二 醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至 少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的二乙基對硝基苯磷酸酯酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定二乙基對硝基苯磷酸酯酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、芳基二烷磷酸、芳基醇脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出二乙基對硝基苯磷酸酯酶的活性濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果。
文檔編號G01N21/78GK101173895SQ20061009730
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司