專利名稱：一種異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異丙隆的分析方法及其試劑盒，更具體地說涉及一種異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法及其試劑盒。主要應(yīng)用于土壤、水、植物、糧食中殘留異丙隆的快速檢測，也可用于農(nóng)藥原藥和制劑中異丙隆的快速鑒定。
背景技術(shù)：
異丙隆(Isoproturon)化學(xué)名稱為3-(4-異丙基苯基)-1，1-二甲基脲，英文化學(xué)名稱為3-(4-isopropylphenyl)-1，1-dimethylurea，CAS登錄號為[34123-59-6]。
異丙隆是由Ciba-Geigy公司(現(xiàn)Syngenta公司)研制，德國赫斯特公司(現(xiàn)安萬特公司)開發(fā)的脲類除草劑。目前世界上至少有10家公司生產(chǎn)該品種。國內(nèi)由沈陽化工研究院于1973年研制成功。
異丙隆主要用于小麥、玉米、花生、棉花等農(nóng)田防除禾本科雜草及大多數(shù)闊葉雜草，防除效果好，毒性低。由于異丙隆廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，在環(huán)境中的殘留問題也日趨嚴(yán)重，對人們的健康構(gòu)成了潛在的威脅。目前，歐盟已經(jīng)限制使用異丙隆。因此，加強(qiáng)水、土壤和糧食中殘留異丙隆的監(jiān)測，對科學(xué)合理地使用異丙隆，保障農(nóng)作物的安全生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)的豐收具有重要意義。隨著人們對異丙隆的毒性與環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的日益關(guān)注，急需更科學(xué)、快捷和高效的檢測手段。
目前已報(bào)道的殘留異丙隆的檢測方法有衍生化氣相色譜法和高效液相色譜法等。理化測定需要昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室和訓(xùn)練有素的專門人才，衍生和固相萃取等樣品前處理過程復(fù)雜，速度慢，選擇性差，微量的目標(biāo)分析物難以檢出。因此，需要研究開發(fā)可以適應(yīng)大批量樣本快速檢測、特異性強(qiáng)的、靈敏度高的殘留異丙隆檢測新技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決了上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題和不足，提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、廉價(jià)高效、適合環(huán)境和生物樣本中殘留異丙隆快速檢測的直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法。
本發(fā)明同時還提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、廉價(jià)高效、適合環(huán)境和生物樣本中殘留異丙隆現(xiàn)場快速檢測的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其包含以下步驟
1)以1-(5一戊基羧基)-3-(4-異丙基苯基)-1-甲基脲和1-(3-丙基羧基)-3-(4-異丙基苯基)-1-甲基脲為半抗原，與不同蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)合成人工抗原和包被原；2)以人工抗原免疫動物獲得對異丙隆具有特異性親合力的抗體；3)加入酶標(biāo)記半抗原和抗體；4)用包被原或抗體包被聚苯乙烯微孔板，加入待測樣品或異丙隆標(biāo)樣與酶標(biāo)記物的混合液進(jìn)行競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)；5)洗滌去除游離物，加入酶的底物和顯色劑，終止反應(yīng)后即可得到待測樣品中的異丙隆含量。
本發(fā)明中異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其所述的異丙隆半抗原1-(5-戊基羧基)-3-(4-異丙基苯基)-1-甲基脲是以N-甲基己內(nèi)酰胺為起始原料，水解制得中間產(chǎn)物N-甲基己酸，再與對異丙基苯異氰酸酯反應(yīng)合成的，分子結(jié)構(gòu)式為 其中n＝5；所述的異丙隆半抗原1-(3-丙基羧基)-3-(4-異丙基苯基)-1-甲基脲是以N-甲基吡咯環(huán)酮為起始原料，水解制得中間產(chǎn)物N-甲基丁酸，再與對異丙基苯異氰酸酯反應(yīng)合成的，其分子結(jié)構(gòu)式為 其中n＝3。
本發(fā)明的異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其所述的人工抗原與包被原是采用活性酯法或混合酸酐法將所述半抗原與不同蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)而成；所述的蛋白質(zhì)選自牛血清白蛋白和卵清蛋白；所述的抗體為人工抗原與弗氏佐劑混合乳化后免疫兔、羊或鼠制備的對異丙隆具有特異性親合力的多克隆抗體或采用雜交瘤技術(shù)制備的對異丙隆具有特異性親合力的單克隆抗體；所述步驟3)使用的是辣根過氧化物酶標(biāo)記半抗原和抗體，從而得到酶標(biāo)半抗原和酶標(biāo)記抗體；所述酶標(biāo)半抗原是采用混合酸酐法或活性酯法將所述半抗原與辣根過氧化物共價(jià)偶聯(lián)而成；所述酶標(biāo)記抗體是采用過碘酸鹽法將辣根過氧化物酶與所述抗體共價(jià)偶聯(lián)而成。
本發(fā)明的異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法中，所述的用包被原或抗體包被聚苯乙烯微孔板是以卵清蛋白、脫脂奶粉或明膠封閉微孔表面未吸附包被原或抗體的位點(diǎn)；所述酶的底物為過氧化脲或過氧化氫；所述顯色劑為3’，3’，5’，5’-四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺。本發(fā)明的用于異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法的試劑盒，包括盒體和置于盒體內(nèi)的可拆卸式聚苯乙烯微孔板，其特征在于還包括包被原或?qū)Ξ惐【咛禺愋杂H合力的抗體其中包被原為1-(3-丙基羧基)-3-(4-異丙基苯基)-1-甲基脲與蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)合成的、對異丙隆具特異性親合力的抗體為人工抗原與適量弗氏佐劑混合乳化后免動物制備的對異丙隆具有特異性親合力的多克隆抗體或采用雜交瘤技術(shù)制備的對異丙隆具有特異性親合力的單克隆抗體；碳酸鹽緩沖液0.1mol/L碳酸鈉溶液150mL與0.1mol/L碳酸氫鈉溶液350mL混勻，加2gNaN3溶解，定容至1000mL制成；磷酸鹽緩沖液2gNaN3溶于280mL 0.2mol/L NaH2PO4與720mL 0.2mol/L Na2HPO4的混合液；封閉液5.0g明膠、0.5gNaN3溶于0.01mol/L、pH7.2的碳酸鹽緩沖液并定容至1000mL，4℃保存；異丙隆標(biāo)樣異丙隆標(biāo)樣0.0100g，溶于100mL甲醇，4℃保存；酶標(biāo)半抗原采用混合酸酐法或活性酯法將異丙隆半抗原與辣根過氧化酶共價(jià)偶聯(lián)，透析去除游離的小分子化合物后保存于50％甘油中，4℃以下保存；酶標(biāo)抗體采用改良的過碘酸鹽法將辣根過氧化物酶與對異丙隆具特異性親合力的抗體共價(jià)偶聯(lián)，層析純化后保存于50％的甘油中，4℃以下保存；底物液0.6g過氧化脲溶于1000mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，4℃保存，所含底物可被標(biāo)記的酶催化成有色產(chǎn)物，其中所述的1000mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液為5.2g檸檬酸、18.4g磷酸氫二鈉溶于蒸餾水并定容至1000mL；顯色劑0.44gTMB溶于3.2mL無水乙醇，用檸檬酸-磷酸鹽緩沖液定容至1000mL，充N2或減壓脫氣，4℃保存，其中所述的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液為5.2g檸檬酸、18.4g磷酸氫二鈉溶于蒸餾水并定容至1000mL；終止液100mL濃硫酸在攪拌下慢慢加入800mL蒸餾水中，冷卻，用于終止酶催化反應(yīng)。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明檢測方法及其試劑盒科學(xué)性強(qiáng)、技術(shù)先進(jìn)、應(yīng)用方法簡單。本發(fā)明的基本依據(jù)是小分子化合物免疫分析化學(xué)原理和技術(shù)。分子量小于5000道爾頓的化合物一般不具備免疫原性，將異丙隆分子特異性部分以半抗原的形式與不同蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)制備人工抗原和包被原，以人工抗原免疫動物產(chǎn)生對異丙隆具特異性親合力的抗體。小分子化合物雖然不具備免疫原性但具有反應(yīng)原性，能與對應(yīng)抗體在離體條件下發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)并符合質(zhì)量作用定律。以辣根過氧化物酶標(biāo)記對異丙隆具特異性親合力的抗體和異丙隆半抗原，用包被原或?qū)Ξ惐【咛禺愋杂H合力的抗體包被聚苯乙烯微孔板，加入待測樣品(或異丙隆標(biāo)樣)與酶標(biāo)記物的混合液，異丙隆、酶標(biāo)記物與包被在微孔表面的包被原或抗體發(fā)生競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)，洗滌去除未結(jié)合的游離物，加入酶的底物和顯色劑，酶促顯色反應(yīng)的強(qiáng)度與結(jié)合在包被原或抗體上的酶標(biāo)記物的量成正比，與樣品(或標(biāo)樣)中異丙隆的含量成反比，據(jù)此建立異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法。運(yùn)用該方法，在盒內(nèi)設(shè)置相關(guān)試劑與材料，制備異丙隆免疫檢測試劑盒，適合環(huán)境和生物樣本中殘留異丙隆的現(xiàn)場快速檢測。試劑盒對異丙隆檢測的線性濃度范圍是10-2～101μg/mL，檢測限2ng/mL。通過參看說明書，專業(yè)人員可以現(xiàn)場檢測操作，一般工作人員也可以進(jìn)行現(xiàn)場檢測分析，便于推廣使用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11)以N-甲基己內(nèi)酰胺為起始原料，水解制得中間產(chǎn)物N-甲基己酸，再與對異丙基苯異氰酸酯反應(yīng)合成半抗原1-(5-戊基羧基)-3-(4-異丙基苯基)-1-甲基脲(HAP4C)，具體步驟為在250mL燒瓶中加入110mL蒸餾水，10mL N-甲基吡咯烷酮，22.8g八水合氫氧化鋇。加熱回流3h，控制回流溫度為106℃。反應(yīng)結(jié)束后，把反應(yīng)液置錐形瓶中，用冰水冷卻。氫氧化鋇晶體析出后過濾。20mL冰水洗滌氫氧化鋇固體，合并洗液與濾液。向?yàn)V液中通入二氧化碳，至pH為6，過濾收集濾液，蒸餾除水得N-甲基丁酸粗品。用無水乙醇/乙醚(體積比1∶1)重結(jié)晶兩次得白色結(jié)晶狀固體5.0g，收率42％。熔點(diǎn)151-153℃。
取0.90g對異丙基苯基異氰酸酯，0.91g N-甲基丁酸及10.5mL 1mol/L氫氧化鈉，混合，在室溫下攪拌2h，過濾后，在濾液中滴加濃鹽酸直至pH值為2。溶液呈乳白色。靜置過夜，待有固體粗品析出后，用乙醇/水(體積比1∶2)重結(jié)晶兩次，得白色片狀晶體1.3g，熔點(diǎn)134-136℃?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)用薄層色譜、紅外和核磁鑒定。
產(chǎn)物HAP4C的鑒定取上述合成的產(chǎn)物分別經(jīng)薄層色譜、紅外光譜和核磁共振鑒定結(jié)構(gòu)。在薄層色譜板上只有一個斑點(diǎn)(紫外燈，254nm)，比移值Rf＝0.23。紅外光譜(KBr壓片)譜圖解析3341cm-1(s，NH)，1715cm-1(vs，COOH)，1636cm-1(vs，amide C＝O)，1537cm-1(vs，amide II)，1231cm-1(m，C-O)。核磁共振(1HNMR，DMSO-d6)譜圖解析δ12.1(1H，OH)，8.1(s，1H，NH)，7.34(d，2H，ArH-2，6)，7.08(d，2H，ArH-3，5)，3.29(t，2H，CH2-4)，2.91(s，3H，NCH3)，2.81(heptet，1H，CH)，2.22(t，CH2-2)，1.72(2H，CH2-3)，1.17(d，6H，2CH3)。
以N-甲基吡咯環(huán)酮為起始原料，水解制得中間產(chǎn)物N-甲基丁酸，再與對異丙基苯異氰酸酯反應(yīng)合成半抗原1-(3-丙基羧基)-3-(4-異丙基苯基)-1-甲基脲(HAP6C)，具體為在250mL燒瓶中加入117mL水，13g濃硫酸和13gN-甲基己內(nèi)酰胺，加熱回流10h。趁熱向溶液中加入氫氧化鋇，攪拌，直到pH值達(dá)到10。靜置24h后過濾除去大部份白色硫酸鋇沉淀。用20mL水清洗白色沉淀，合并洗液與濾液。向?yàn)V液中通入二氧化碳，至pH為6。過濾收集濾液，蒸餾濾液得到黃色油狀物，靜置，析出粗品。用無水乙醇/乙醚(體積比1∶1)重結(jié)晶兩次得白色結(jié)晶狀固體8.0g，收率52％。熔點(diǎn)66-68℃。
取0.36g對異丙基苯基異氰酸酯，0.36g N-甲基己酸(二水合物)及4.2mL 1mol/L氫氧化鈉，混合，在室溫下攪拌2h，過濾后，在濾液中滴加濃鹽酸使pH為2。靜置過夜，待有固體粗品析出后，用乙醇/水(體積比1∶2)重結(jié)晶兩次，得白色片狀晶體0.60g，熔點(diǎn)95-96℃?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)用薄層色譜、紅外和核磁鑒定。
產(chǎn)物HAP6C的鑒定產(chǎn)物在薄層色譜板上只有一個斑點(diǎn)(紫外燈，254nm)，比移值Rf＝0.33。紅外光譜(KBr壓片)譜圖解析3378cm-1(s，NH)，1715cm-1(vs，COOH)，1646cm-1(vs，amide C＝O)，1525cm-1(vs，amide II)，1243cm-1(m，C-O)。核磁共振(1HNMR，DMSO-d3)譜圖解析δ12.0(1H，OH)，8.08(s，1H，NH)，7.32(d，2H，ArH-a，b)，7.05(d，2H，ArH-c，d)，3.25(t，2H，CH2-6)，2.89(s，3H，NCH3)，2.79(heptet，1H，CH)，2.18(t，CH2-2)，1.5(m，4H，CH2-3，5)，1.25(m，2H，CH2-4)，1.15(d，6H，2CH3)。
2)將半抗原與牛血清白蛋白和卵清蛋白共價(jià)偶聯(lián)合成人工抗原和包被原；人工抗原的合成免疫原的制備免疫原的合成用碳二亞胺法。將0.2mmol半抗原(HAP6C)，溶解在1mL的DMF中，然后在該溶液中加入等摩爾的DCC和NHS，室溫下反應(yīng)4h，繼續(xù)在4℃下反應(yīng)12h。然后離心(6min，1400r/min)，除去脲沉淀，取上清液800μL至BSA溶液(在4℃下攪拌16h)。裝入透析袋，于0.2mol/L PBS(含0.9％(w/v)NaCl)溶液中透析4天。透析后的溶液用紫外掃描計(jì)算結(jié)合比。最后分裝保存于-20℃的冰箱中。
人工抗原結(jié)合比測定采用紫外可見分光光度計(jì)對半抗原、偶聯(lián)物及蛋白進(jìn)行紫外全波長掃描。HAP6C-BSA偶合物的紫外吸收圖譜與BSA、Hapten6C相比，吸收曲線發(fā)生了改變，HAPC-BSA偶合物在HAP6C的最大吸收波長245nm處吸光值有所增加，表明免疫半抗原與蛋白的偶聯(lián)是成功的。經(jīng)計(jì)算人工抗原結(jié)合比為46∶1。
3)人工抗原與弗氏佐劑混合乳化后免疫兔制備對異丙隆具有特異性親合力的多克隆抗體；抗體的制備①免疫兔子制備抗血清以HAP6C-BSA作為免疫原，選取三只1.2、1.4和1.5kg的純種新西蘭大白兔作為試驗(yàn)動物，試驗(yàn)前一周采集陰性血清(1mL/只)做陰性對照。具體免疫程序如下首免采用每只1mg免疫原與等體積弗氏完全佐劑混和，乳化成油包水結(jié)構(gòu)后進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射(40點(diǎn)左右)。三周后用同樣劑量的免疫原與等體積不完全弗氏佐劑進(jìn)行加強(qiáng)。此后每隔兩周加強(qiáng)一次。從第二次加強(qiáng)開始，每次加強(qiáng)后第7天，從兔子耳緣靜脈采血，測定效價(jià)。待免疫血清效價(jià)上去以后，就可以進(jìn)行采血。本實(shí)驗(yàn)采用心臟采血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，先待收集在三角燒瓶中的血液凝固后，用接種針沿三角燒瓶邊緣將血塊與玻璃脫離，放置于37℃溫箱中0.5h，再放到4℃冰箱中3h，待血塊收縮后，用毛細(xì)管將血清吸入試管中，以3000rpm離心15min，分離出血清。在血清中添加終濃度為0.02％(W/V)的疊氮鈉，分裝后于-20℃凍存。
抗血清效價(jià)測定用免疫原免疫三只兔子。從第二次加強(qiáng)免疫開始，每次加強(qiáng)后第7天，從兔子耳緣靜脈采血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后用間接ELISA測定效價(jià)。待第四次加強(qiáng)免疫后，兔子獲得了高效價(jià)的抗體，抗血清的效價(jià)分別為1.6×105、8.0×104、2×104(指OD450nm值大于1.0)。
②抗體的純化和鑒定采用飽和硫酸銨沉淀法純化抗體取30mL抗血清與等體積的PBS混合，攪拌下逐滴加入10mL飽和硫酸銨，4℃過夜，使免疫球蛋白充分沉淀。3000g離心20min，棄去上清液。用10mLPBS溶解沉淀，再逐滴加入5mL飽和硫酸銨溶液，4℃過夜。重復(fù)上述過程1次。用10mLPBS溶解沉淀物裝入透析袋。4℃透析三天充分除鹽(每天換液4次)。蛋白質(zhì)冷凍干燥后于-20℃保存。
注意事項(xiàng)提取免疫球蛋白時，最好在2-4℃條件下進(jìn)行，假如時間不長，也可在室溫下進(jìn)行，全部材料使用前均應(yīng)冷卻。
③抗體的特異性用具有多種抗原決定簇的免疫原(蛋白質(zhì)或多肽)制備的抗血清，其中含的分子往往是混合體。當(dāng)有甲、乙兩種抗原，其分子結(jié)構(gòu)中具有相同或部分相同的抗原決定簇時，甲抗原可以與乙抗原的抗血清反應(yīng)，而乙抗原可以與甲抗原的抗血清反應(yīng)，稱為交叉反應(yīng)。抗血清的特異性就是指它同特異性抗原結(jié)合的能力與同該抗原類似物結(jié)合能力的比較。常用交叉反應(yīng)活性作為評價(jià)的重要標(biāo)準(zhǔn)。交叉反應(yīng)越小，抗血清的特異性越好。
將特異性抗原及其類似物作系列稀釋，分別與同一種抗血清，按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在曲線上找出抑制率50％的劑量和類似物抑制率50％的用量，然后計(jì)算出各類似物的交叉反應(yīng)率。

經(jīng)測定與異丙隆結(jié)構(gòu)相似的氯溴隆、氟草隆、綠谷隆的交叉反應(yīng)率分別為0.16％、0.35％、0.51％，與丁噻隆、噻苯隆和環(huán)草隆的交叉反應(yīng)率都小于0.01％。由于半抗原HAP6C與蛋白質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)能夠很好地突出農(nóng)藥的活性位置，從而抗HAP6C-BSA抗體對各農(nóng)藥類似物的交叉反應(yīng)均較小，所制備的抗體的特異性較強(qiáng)。
4)采用活性酯法將半抗原與辣根過氧化物酶共價(jià)偶聯(lián)制備酶標(biāo)半抗原，采用過碘酸鹽法將辣根過氧化物酶與抗體共價(jià)偶聯(lián)制備酶標(biāo)抗體；5)再用包被原包被聚苯乙烯微孔板，以明膠封閉微孔板表面未吸附包被原位點(diǎn)；6)在包被好包被原的微孔板的孔中加入異丙隆標(biāo)樣與酶標(biāo)記物的混合液，異丙隆、酶標(biāo)記物與包被在微孔表面的包被原發(fā)生競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)，洗滌去除未結(jié)合的游離物；7)加入酶的底物過氧化脲和顯色劑TMB的混合液，在水平振搖器上振搖1分鐘，顯色20分鐘后終止，酶促顯色反應(yīng)的強(qiáng)度與結(jié)合在包被原上的酶標(biāo)抗體或結(jié)合在抗體上的酶標(biāo)半抗原的量成正比，與樣品(或標(biāo)樣)中異丙隆的含量成反比。
實(shí)施例2 異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒2.1微孔板的包被將包被原用碳酸鹽緩沖液稀釋成適當(dāng)濃度或?qū)⒖贵w用磷酸鹽緩沖液溶解成適當(dāng)濃度，加入微孔板的孔中，100μL/孔，4℃吸附過夜。去除孔中的溶液，拍干，加入封閉液，150μL/孔，4℃封閉過夜或37℃封閉2小時，去除多余的封閉液，拍干，用磷酸鹽緩沖液洗3次，拍干，4℃條件下自然干燥，加干燥劑密封包裝，4℃以下保存?zhèn)溆谩Ｒ部蓪辉蚩贵w、緩沖液、封閉液分別裝入指定容器，置試劑盒內(nèi)，由用戶在使用前按使用說明自行包被。
2.2碳酸鹽緩沖液的配制0.1mol/L碳酸鈉溶液150mL與0.1mol/L碳酸氫鈉溶液350mL混勻，加2gNaN3溶解，定容至1000mL。
2.3異丙隆標(biāo)樣溶液的配制準(zhǔn)確稱取異丙隆標(biāo)樣0.0100g，溶于100mL甲醇，4℃保存。
2.4酶標(biāo)半抗原的制備采用混合酸酐法或活性酯法將異丙隆半抗原與辣根過氧化酶共價(jià)偶聯(lián)，透析去除游離的小分子化合物后保存于50％甘油中，包被抗體直接結(jié)合法測定酶標(biāo)半抗原效價(jià)，制備試劑盒時將酶標(biāo)半抗原用50％甘油稀釋至使用濃度的100倍，4℃以下保存。
2.5酶標(biāo)抗體的制備采用改良的過碘酸鹽法將辣根過氧化物酶與對異丙隆具特異性親合力的抗體共價(jià)偶聯(lián)，Sephadex G200柱層析純化后保存于50％的甘油中，包被原包被直接結(jié)合法測定酶標(biāo)抗體效價(jià)，制備試劑盒時將酶標(biāo)抗體用50％甘油稀釋至使用濃度的100倍，4℃以下保存。
2.6碳酸鹽緩沖液的配制2gNaN3溶于280mL 0.2mol/L NaH2PO4與720mL 0.2mol/L Na2HPO4的混合液。
2.7封閉液的配制5.0g明膠、0.5gNaN3溶于0.01mol/L、pH7.2的碳酸鹽緩沖液并定容至1000mL，4℃保存。
2.8底物液的配制0.6g過氧化脲溶于1000mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(5.2g檸檬酸、18.4g磷酸氫二鈉溶于蒸餾水并定容至1000mL)，4℃保存。
2.9顯色劑的配制0.44gTMB溶于3.2mL無水乙醇，用檸檬酸-磷酸鹽緩沖液定容至1000mL，充N2或減壓脫氣，4℃保存。
2.10終止液的配制100mL濃硫酸在攪拌下慢慢加入800mL蒸餾水中，冷卻。
2.11試劑分裝各種試劑按要求配制，測定合格后無菌分裝。包被原(或?qū)Ξ惐【咛禺愋杂H合力的抗體)適量/瓶、異丙隆標(biāo)樣0.1mL/瓶、酶標(biāo)抗體0.1mL/瓶、酶標(biāo)半抗原0.1mL/瓶、碳酸鹽緩沖液12mL/瓶、封閉液16mL/瓶、磷酸緩沖液10mL/瓶、底物液6mL/瓶、顯色劑6mL/瓶、終止液6mL/瓶。分裝后貼標(biāo)簽，注明批號和有效期，4℃存放。
2.12試劑盒組裝分別將可拆卸式微孔板1塊，包被原或?qū)Ξ惐【咛禺愋杂H合力的抗體、異丙隆標(biāo)樣溶液、酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)半抗原、碳酸鹽緩沖液、封閉液、磷酸鹽緩沖液(也可事先將包被原或抗體包被在微孔板上并封閉，置試劑盒內(nèi)指定位置)、底物液、顯色劑、終止液各1瓶，使用說明書1份置試劑盒內(nèi)指定位置。試劑盒檢驗(yàn)合格后封裝，4℃保存。
權(quán)利要求
1.一種異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于包含以下步驟1)以1-(5-戊基羧基)-3-(4-異丙基苯基)-1-甲基脲和1-(3-丙基羧基)-3-(4-異丙基苯基)-1-甲基脲為半抗原，與不同蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)合成人工抗原和包被原；2)以人工抗原免疫動物獲得對異丙隆具有特異性親合力的抗體；3)加入酶標(biāo)記半抗原和抗體；4)用包被原或抗體包被聚苯乙烯微孔板，加入待測樣品或異丙隆標(biāo)樣與酶標(biāo)記物的混合液進(jìn)行競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)；5)洗滌去除游離物，加入酶的底物和顯色劑，終止反應(yīng)后即可得到待測樣品中的異丙隆含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于所述的異丙隆半抗原1-(5-戊基羧基)-3-(4-異丙基苯基)-1-甲基脲是以N-甲基己內(nèi)酰胺為起始原料，水解制得中間產(chǎn)物N-甲基己酸，再與對異丙基苯異氰酸酯反應(yīng)合成的，分子結(jié)構(gòu)式為 其中n＝5；所述的異丙隆半抗原1-(3-丙基羧基)-3-(4-異丙基苯基)-1-甲基脲是以N-甲基吡咯環(huán)酮為起始原料，水解制得中間產(chǎn)物N-甲基丁酸，再與對異丙基苯異氰酸酯反應(yīng)合成的，其分子結(jié)構(gòu)式為 其中n＝3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于所述的人工抗原與包被原是采用活性酯法或混合酸酐法將所述半抗原與不同蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于所述的蛋白質(zhì)選自牛血清白蛋白和卵清蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于所述的抗體為人工抗原與弗氏佐劑混合乳化后免疫兔、羊或鼠制備的對異丙隆具有特異性親合力的多克隆抗體或采用雜交瘤技術(shù)制備的對異丙隆具有特異性親合力的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于所述步驟3)使用的是辣根過氧化物酶標(biāo)記半抗原和抗體，從而得到酶標(biāo)半抗原和酶標(biāo)記抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于所述酶標(biāo)半抗原是采用混合酸酐法或活性酯法將所述半抗原與辣根過氧化物共價(jià)偶聯(lián)而成；所述酶標(biāo)記抗體是采用過碘酸鹽法將辣根過氧化物酶與所述抗體共價(jià)偶聯(lián)而成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于所述的用包被原或抗體包被聚苯乙烯微孔板是以卵清蛋白、脫脂奶粉或明膠封閉微孔表面未吸附包被原或抗體的位點(diǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于所述酶的底物為過氧化脲或過氧化氫；所述顯色劑為3’，3’，5’，5’-四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺。
10.一種用于異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法的試劑盒，包括盒體和置于盒體內(nèi)的可拆卸式聚苯乙烯微孔板，其特征在于還包括包被原或?qū)Ξ惐【咛禺愋杂H合力的抗體其中包被原為1-(3-丙基羧基)-3-(4-異丙基苯基)-1-甲基脲與蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)合成的、對異丙隆具特異性親合力的抗體為人工抗原與適量弗氏佐劑混合乳化后免動物制備的對異丙隆具有特異性親合力的多克隆抗體或采用雜交瘤技術(shù)制備的對異丙隆具有特異性親合力的單克隆抗體；碳酸鹽緩沖液0.1mol/L碳酸鈉溶液150mL與0.1mol/L碳酸氫鈉溶液350mL混勻，加2gNaN3溶解，定容至1000mL制成；磷酸鹽緩沖液2gNaN3溶于280mL 0.2mol/L NaH2PO4與720mL 0.2mol/L Na2HPO4的混合液；封閉液5.0g明膠、0.5gNaN3溶于0.01mol/L、pH7.2的碳酸鹽緩沖液并定容至1000mL，4℃保存；異丙隆標(biāo)樣異丙隆標(biāo)樣0.0100g，溶于100mL甲醇，4℃保存；酶標(biāo)半抗原采用混合酸酐法或活性酯法將異丙隆半抗原與辣根過氧化酶共價(jià)偶聯(lián)，透析去除游離的小分子化合物后保存于50％甘油中，4℃以下保存；酶標(biāo)抗體采用改良的過碘酸鹽法將辣根過氧化物酶與對異丙隆具特異性親合力的抗體共價(jià)偶聯(lián)，層析純化后保存于50％的甘油中，4℃以下保存；底物液0.6g過氧化脲溶于1000mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，4℃保存，所含底物可被標(biāo)記的酶催化成有色產(chǎn)物，其中所述的1000mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液為5.2g檸檬酸、18.4g磷酸氫二鈉溶于蒸餾水并定容至1000mL；顯色劑0.44gTMB溶于3.2mL無水乙醇，用檸檬酸-磷酸鹽緩沖液定容至1000mL，充N2或減壓脫氣，4℃保存，其中所述的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液為5.2g檸檬酸、18.4g磷酸氫二鈉溶于蒸餾水并定容至1000mL；終止液100mL濃硫酸在攪拌下慢慢加入800mL蒸餾水中，冷卻，用于終止酶催化反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種異丙隆直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法及其試劑盒，本發(fā)明分析方法及其試劑盒科學(xué)性強(qiáng)、技術(shù)先進(jìn)、應(yīng)用方法簡單。本發(fā)明的方法包括以下步驟(1)以1－(5－戊基羧基)－3－(4－異丙基苯基)－1－甲基脲和1－(3－丙基羧基)－3－(4－異丙基苯基)－1－甲基脲為半抗原，與不同蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)合成人工抗原和包被原；2)以人工抗原免疫動物獲得對異丙隆具有特異性親合力的抗體；3)加入酶標(biāo)記半抗原和抗體；4)用包被原或抗體包被聚苯乙烯微孔板，加入待測樣品或異丙隆標(biāo)樣與酶標(biāo)記物的混合液進(jìn)行競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)；5)洗滌去除游離物，加入酶的底物和顯色劑，終止反應(yīng)后即可得到待測樣品中的異丙隆含量。
文檔編號G01N33/577GK1971277SQ20061009823
公開日2007年5月30日 申請日期2006年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月6日
發(fā)明者李方實(shí), 孫峰 申請人:南京工業(yè)大學(xué)