專利名稱：硒診斷/測(cè)定試劑盒及硒濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硒診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定硒濃度的 方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
硒的生物學(xué)意義最早由克山病的病理生理研究所確立，這種疾病首先在
中國(guó)的15歲以下兒童和妊娠婦女被發(fā)現(xiàn)，屬于地方性硒缺乏病。硒的這種 缺乏使紅細(xì)胞的谷胱甘肽過(guò)氧化酶活性降低，出現(xiàn)溶血增加和形成甲基血 紅蛋白。由于硒補(bǔ)充不足，引起了骨骼和心肌的肌纖維功能失調(diào)。
紅細(xì)胞谷胱甘肽超氧化物酶的活性是反映體內(nèi)硒儲(chǔ)藏的指標(biāo)，由于硒不 能與年老的紅細(xì)胞結(jié)合，只有血流中的年輕紅細(xì)胞可結(jié)硒，達(dá)到激活谷胱 甘肽氧化酶的水平。因此，紅細(xì)胞的谷胱甘肽氧化酶至少在補(bǔ)充硒四周后 才能被用于監(jiān)測(cè)治療效果，而血漿中的谷胱甘肽氧化酶活性在數(shù)天內(nèi)即可 升高。
懷疑硒攝入不足，尤其是在完全胃腸外營(yíng)養(yǎng)者，臨床癥狀包括肌無(wú)力、 心肌病以及懷疑慢性腎功能不全。急性中毒癥狀包括眼睛和氣道的刺激與 皮炎；慢性中毒的癥狀包括持續(xù)性的呼氣或汗液中出現(xiàn)大蒜味，頭痛、上 氣道刺激、胃腸道癥狀和神經(jīng)衰弱。
目前的檢測(cè)方法僅有熒光測(cè)定法及原子吸收分光光度測(cè)定法可采用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原 型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定硒 濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的硒診斷/測(cè)定試劑盒， 采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行 硒濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明硒濃度測(cè)定方法原理如下
谷胱甘肽二硫+ 2水谷胱甘肽過(guò)氧化物酶/Se24 2谷胱甘肽
+過(guò)氧化氫
過(guò)氧化氫+還原型輔酶 NADH過(guò)氧化物酶輔酶+ 2水 這種方法應(yīng)用需要硒離子激活的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase ; EC 1.11.1.9)酶(偶)聯(lián)NADH過(guò)氧化物酶(NADH peroxidase ; EC1.11丄1; EC1.11丄2)酶促反應(yīng)速率比色法。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶酶解 谷胱甘肽二硫反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，再通過(guò)NADH過(guò)氧化物酶的作用，最終 將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸 收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過(guò)測(cè) 量340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算硒的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明硒診斷/測(cè)定試劑盒較 為理想
攀沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
谷胱甘肽二硫 6 mmol/L
谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 6000 U/L
NADH過(guò)氧化物酶 12000 U/L
本發(fā)明的硒診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽過(guò)氧化物 酶、NADH過(guò)氧化物酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷胱甘肽二硫。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、NADH過(guò)氧化物酶。 還原型輔酶、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、NADH過(guò)氧化物酶
在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前
加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試齊U l
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。
試劑2
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、NADH過(guò)氧化物酶。 還原型輔酶、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、NADH過(guò)氧化物酶 在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定硒濃度的方法，其還原型輔酶 可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一
本實(shí)施例的硒診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 谷胱甘肽二硫 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 NADH過(guò)氧化物酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37r，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7,測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)硒樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘
50 mmol/L 0.25 mmol/L 6 mmol/L 6000 U/L
左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出硒的濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)旛例的硒診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
谷胱甘肽二硫
50 mmol/L 0.25 mmol/L 8 mmol/L
試劑2
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
谷胱甘肽過(guò)氧化物l NADH過(guò)氧化物酶
50 mmol/L 9000U/L 15000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光
度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)硒樣品與試劑1、
試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大
約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣晶和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析
儀下，檢溯主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出硒的濃度大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的硒診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括:
試劑1
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 還原型輔酶
50 mmol/L 0.25 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100 mmol/L
谷胱甘肽二硫
15 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 NADH過(guò)氧化物酶
100 mmol/L 50 mmol/L 18000U/L 24000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定硒濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37i:，反應(yīng)時(shí)間10 分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被 測(cè)硒樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù) 反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出硒的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色
原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，
不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀 器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的硒濃度測(cè)定方法，其方法原理如下谷胱甘肽二硫+2水 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶/Se2+ 2谷胱甘肽 +過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型輔酶 NADH過(guò)氧化物酶 輔酶+2水將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出硒的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種硒診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括: 緩沖液 20--500 mmol/L 穩(wěn)定劑 1-50 mmol/L 還原型輔酶0.1-0.35 mmol/L 谷胱甘肽二硫 1-50 mmol/L 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 1000——80000 U/LNADH過(guò)氧化物酶1000-80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硒診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、NADH過(guò)氧化物酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)稱要求2所述硒診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、NADH過(guò)氧化物酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型 輔酶、谷胱甘肽二硫組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷胱甘肽過(guò)氧 化物酶、NADH過(guò)氧化物酶組成。還原型輔酶、谷胱甘肽二硫、谷胱甘 肽過(guò)氧化物酶、NADH過(guò)氧化物酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硒診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、 NADH過(guò)氧化物酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型 輔酶組成；試劑2，由緩沖液、谷胱甘肽二硫組成；試劑3，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、NADH過(guò)氧化物酶組成。還原型輔酶、 谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、NADH過(guò)氧化物酶在試劑1、試 劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硒診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的硒診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定硒濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、NADH過(guò)氧化物酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速度，從而測(cè)算出硒的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過(guò)紫外/可見光分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N33/84GK101173948SQ200610097330
公開日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司