專利名稱：通過(guò)不同基因的五個(gè)SNPs檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測(cè)用的試劑盒，尤其是一種檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒，通過(guò)同時(shí)檢測(cè)多 聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶家族成員1 (poly(ADP-ribose) polymerase family, member l,PARPl,又簡(jiǎn)寫(xiě)為ADPRT)、 細(xì)胞色素P4501A1酶基因(cytochrome P450, family 1， subfamily A， polypeptide 1, CYPlAl )、 X射線交錯(cuò) 互補(bǔ)修復(fù)基因1 (X-ray repair cross--complementing gene 1， XRCCO和切除修復(fù)復(fù)合物2 (Excision Repair Cross-complementing Rodent Repair Deficiency, Complementation Group 2, ERCC2)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) (SNP)來(lái)預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)肺癌的易感性。
背景技術(shù)：
原發(fā)性支氣管肺癌，簡(jiǎn)稱肺癌，為當(dāng)前世界各地最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是一種嚴(yán)重威脅人類健康和 生命的疾病。腫瘤細(xì)胞源于支氣管粘膜或腺體，常有區(qū)域性淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移，早期常有刺激性咳嗽、痰 中帶血等呼吸道癥狀，病情進(jìn)展速度與細(xì)胞的生物特性有關(guān)。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，世界各國(guó)肺癌的發(fā)病率和病死率都有明顯增高趨勢(shì)。世界衛(wèi)生組織(WHO)2000年報(bào)告 1997年全世界死于惡性腫瘤的共706.5萬(wàn)人，占死亡人數(shù)的12.6%,其中肺癌占惡性腫瘤死亡的19%,居 惡性腫瘤死因的第一位。我國(guó)1990 1992年的抽樣調(diào)査顯示，在城市人口的腫瘤死亡中，肺癌由原來(lái)的 第4位上升為第1位，農(nóng)村上升最快的也是肺癌。云南錫礦的肺癌發(fā)病率在1954 1959年間為28.02/10 萬(wàn)，1960 1969年間為197.87/10萬(wàn)，1970 1979年間上升到219.10/10萬(wàn)，這在全世界也是罕見(jiàn)的。英國(guó) 著名腫瘤學(xué)家R.Peto預(yù)言如果我國(guó)不及時(shí)控制吸煙和空氣污染，到2025年我國(guó)每年肺癌將超過(guò)100萬(wàn)， 成為世界第一肺癌大國(guó)。病因和發(fā)病機(jī)制迄今尚未明確。 一致認(rèn)為肺癌的發(fā)病與下列因素有關(guān)①吸煙(包括主動(dòng)吸煙和被動(dòng) 吸煙)；②職業(yè)致癌因子，己被確認(rèn)的致人類肺癌的職業(yè)因素包括石棉、無(wú)機(jī)砷化合物、二氯甲醚、鉻及 其化合物、鎳、氡、芥子氣、氯乙烯、煤煙、焦油和石油中的多環(huán)芳烴、煙草的加熱產(chǎn)物等；③空氣污染 (包括室內(nèi)小環(huán)境和室外大環(huán)境污染) 電離輻射⑤飲食與營(yíng)養(yǎng)，美國(guó)紐約和芝加哥開(kāi)展的前瞻性人群觀察的結(jié)果說(shuō)明，食物中天然維生素A類、e胡蘿卜素的攝入量與十幾年后癌癥的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，其中最突出的是肺癌；⑥其他，美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)將結(jié)核列為肺癌的發(fā)病因素之一。有結(jié)核病者患肺癌的危險(xiǎn)性是 正常人群的10倍。其主要組織學(xué)類型是腺癌。此外，病毒感染、真菌毒素(黃曲霉)、機(jī)體免疫功能低下、 內(nèi)分泌失調(diào)以及家族遺傳等因素，對(duì)肺癌的發(fā)生可能也起一定的綜合作用。近年研究表明，肺癌的發(fā)生與某些癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相關(guān)。己經(jīng)證明的幾個(gè)癌基因 家族包括引起突變的ras族、放大基因的myc族、C-erB2、機(jī)制不明的bcl-2、 Kit及由野生型變異的抗癌 基因p53、 p16和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小細(xì)胞肺癌中均有過(guò)度表達(dá)。 非小細(xì)胞肺癌中則?？梢?jiàn)ras族基因的過(guò)度表達(dá)。這些深入的研究將為基因預(yù)防和治療肺癌提供理論基礎(chǔ)。SNP(single nucleotide polymorphism),即單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，是一類基于單堿基變異引起的DNA 多態(tài)性，被遺傳學(xué)界稱為第三代遺傳標(biāo)記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性， 包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標(biāo)記，占 大約90%。這些基因組序列變異可以導(dǎo)致個(gè)體間表型的差異以及不同個(gè)體對(duì)疾病，特別是復(fù)雜疾病的易感 性和對(duì)環(huán)境因素、藥物反應(yīng)的差異。PARPl基因位于第l號(hào)染色體lq41"q42位置，全長(zhǎng)47,3kb， mRNA全長(zhǎng)3861bp,共有23個(gè)外顯子， 編碼1015氨基酸的多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶蛋白。這種酶通過(guò)聚ADP核糖基化反應(yīng)修正多種核蛋白。這種 修正以DNA為基礎(chǔ)，參與多種重要的細(xì)胞活動(dòng)，例如分化，增殖，腫瘤轉(zhuǎn)移等，同時(shí)也參與分子水平 的活動(dòng)，例如修復(fù)DNA受損的細(xì)胞等等。PARP1的主要功能通常被描述為3個(gè)方面1. DNA修復(fù)功能 (BER); 2.抑制受損DNA的轉(zhuǎn)錄；3.耗盡細(xì)胞中的能量，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；4.參與部分基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 這些功能可以修復(fù)細(xì)胞中受損的DNA,抑制破損DNA的轉(zhuǎn)錄，甚至殺死無(wú)法修復(fù)的細(xì)胞，達(dá)到抑制癌癥 發(fā)生的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PARP1功能缺失會(huì)提髙乳腺癌，肺癌等癌癥的發(fā)病率。
rel136410是位于第1號(hào)染色體上PARP1華但上的，個(gè)T/C多態(tài)，弓l起PARP1基因編碼的蛋白第762 個(gè)氨基酸由Val變?yōu)锳la。 NCBI公布的世界人fe中的該多態(tài)的頻率分布，T占0.808， C占0.192左右，雜 合度為0.311。分子生物學(xué)研究表明，PARP1上762號(hào)氨基酸由Val轉(zhuǎn)化為Ala,降低了瞎的活性，導(dǎo)致多 種癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高。大樣本的中國(guó)人群的關(guān)聯(lián)分析顯示，該位點(diǎn)的多態(tài)現(xiàn)象是中國(guó)人群中重要的肺癌影響因素之一。CYP1A1基因位于第15號(hào)染色體15q22-q24位置，全長(zhǎng)6.0kb, mRNA全長(zhǎng)2601bp，共有7個(gè)外顯子， 編碼513個(gè)氨基酸的細(xì)胞色素P450A1。 P4501A1是重要的活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要酶類，被激活的 CYP1A1能將多種環(huán)境中的有機(jī)物質(zhì)如PAH (polycyclic aromatic hydrocarbons)多環(huán)芬芳碳?xì)饣衔镛D(zhuǎn) 化為細(xì)胞毒素或其他致癌物質(zhì)，從而增加癌癥發(fā)生的危險(xiǎn)。國(guó)內(nèi)外的眾多研究顯示CYP1A1的多態(tài)與野生 型相比有更高的酶接觸反應(yīng)活性和可誘導(dǎo)性，從而增加肝癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、前列腺癌等疾病的 危險(xiǎn)度。細(xì)胞色素P450酶(CYP450)是細(xì)胞內(nèi)重要的I相代謝酶，在致癌物的活化和解毒過(guò)程中起著重 要的作用。P4501A1(CYP1A1)是活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要嗨類。CYP1A1作為一種微神經(jīng)元體細(xì)胞酶 與一些致癌物質(zhì)的生物激活有關(guān)，例如benzo[a]pyrene。同時(shí)，CYP1A1易于被TCDD和多環(huán)的芳香族化 合物所誘變，包括3-甲基膽葸等實(shí)驗(yàn)室用致癌物質(zhì)。目前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，CYP1A1的表達(dá)與芳基碳?xì)饣?合物受體(AhR)和Arnt (AhR Nuclear Translocator)的激動(dòng)劑，以及USF1 (Upstream Stimulatory Factor) 的拮抗劑有關(guān)。同時(shí)，CYP1A1通過(guò)C2羥基化作用參與雌激素的代謝活動(dòng)。rsl048943是位于CYP1A1基因上的一個(gè)A/G多態(tài)，位于第7外顯子462號(hào)教基酸由lie轉(zhuǎn)化為Val。 目前NCBI公布的世界人口頻率A:G為0.896:0.104,雜合度0.186。世界人群的關(guān)聯(lián)分析表明，CYP1Ale462Val位點(diǎn)ValVal和Vallle基因型在肺癌病例組中的頻率明顯高于對(duì)照組，在女性中風(fēng)險(xiǎn)度尤其突出。 基于多個(gè)中國(guó)人群肺癌發(fā)病與CYP1A1 Ik462Val位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析研究，上千例肺癌個(gè)體與健康對(duì)照個(gè)體的 分析，顯示CYPlAlHe462Val這種位于酶蛋白的血紅素結(jié)合區(qū)的變異，是中國(guó)人群中重要的肺癌遺傳易感 因素之一，在女性中尤為突出。酶動(dòng)力學(xué)研究表明，3種基因型表達(dá)的酶活性存在差異。Val/Val活化毒物 的能力最強(qiáng)，Ile/Val次之，而lle/Ile最弱。研究顯示，CYPlAlVal.Val基因型是中國(guó)人群中重要的肺癌遺 傳易感因素之一。XRCC1位于第19號(hào)染色體19913.2-13.3位置，全長(zhǎng)32.3kb， mRNA全長(zhǎng)2087bp,共有17個(gè)外顯子， 編碼634個(gè)氨基酸的蛋白。XRCC1編碼的蛋白對(duì)因電離輻射和垸基化物引起的DNA單鏈斷裂能起到有效 的修復(fù)作用。XRCCl編碼的蛋白與DNA連接瞎ffl、聚合酶e、多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶交互作用，參與DM 的堿基切除修復(fù)(Base Excision R印air, BER)通路。眾多研究顯示，XRCC1基因上部分位點(diǎn)的多態(tài)性，與 癌癥發(fā)生有密切的關(guān)系。與XRCC1相關(guān)的癌癥主要有乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、食管癌、胃癌、結(jié) 腸癌、胰腺癌、肺癌等。rs25487是位于第19號(hào)染色體XRCC1基因上的一個(gè)G/A多態(tài)，弓l起XRCC1基因編碼的蛋白第399 個(gè)氨基酸由Arg變?yōu)镚ln。 Ai^399Gln位于第10號(hào)外顯子，XRCC〗蛋白BCRTI區(qū)域。在世界人群中的該 多態(tài)的頻率分布，G占0.72， A占0.28左右。中國(guó)人群中的分布G為0.68， A為0.32。分子生物學(xué)研究表 明，XRCC1基因上第399號(hào)氨基酸A屯-Gln的替代加強(qiáng)XRCC1蛋白與DNA-致癌物加合物的結(jié)合能力， 從而影響個(gè)體的腫瘤易感性。通過(guò)大量對(duì)于大規(guī)模人群的肺癌病例對(duì)照研究，XRCC1的399氨基酸突變 位點(diǎn)在做單因素分析時(shí)與肺癌發(fā)生相關(guān)，但是分層分析后發(fā)現(xiàn)在大量吸煙的人群中，肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低。ERCC2,位于第19號(hào)染色體19ql3.3位置，共有23個(gè)外顯子，基因全長(zhǎng)19.0kb, mRNA全長(zhǎng)2355bp, 編碼含761個(gè)氨基酸的蛋白。由ERCC2編碼的蛋白參與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的核苷酸切除修復(fù)，它可識(shí)別與修復(fù)結(jié) 構(gòu)無(wú)關(guān)的大范圍的損傷，如大的加合物和胸腺嘧啶二聚體，并且是基本轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物BTF2/TFnH的一 個(gè)組成成分。該蛋白具有ATP依賴性的DNA解旋活性，屬于RAD3/XPD解旋酶亞家族。ERCC2的功能 缺失導(dǎo)致基本轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物不能正確識(shí)別DNA損傷位點(diǎn),從而使堿基切除修復(fù)無(wú)法正確進(jìn)行,導(dǎo)致DNA 上的致癌損傷積累。ERCC2基因的突變或者失活可能導(dǎo)致的疾病包括癌癥、著色性干皮病、毛發(fā)硫營(yíng)養(yǎng) 不良、柯凱因氏綜合癥。rsl3181是位于第19號(hào)染色體ERCC2基因第23號(hào)外顯子段Lys751Gln的T/G多態(tài)。世界人群中的頻 率約為T:G =0.798: 0.202，雜合度0.322，中國(guó)人群中的頻率約為T:G =0.91: 0.09。目前的多項(xiàng)研究表明， Lys751Gln的氨基酸替代位于ERCC2蛋白C-末端部，這個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與肺癌、膀胱癌、乳腺癌、皮膚 罹等疾病有關(guān)。ERCC2Lys751Gln位點(diǎn)的多態(tài)現(xiàn)象與肺癌特別是肺鱗痛的發(fā)生存在顯著關(guān)聯(lián)。rel799793是位于第19號(hào)染色體ERCC2基因第10號(hào)外顯子段Asp312Asn的G/A多態(tài)。世界人群中 的頻率約為G:A=0.778:0.222，中國(guó)人群中的頻率約為G:A=0.94:0.06。目前的多項(xiàng)研究表明，該位點(diǎn)的多 態(tài)會(huì)導(dǎo)致ERCC2參與構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的性能發(fā)生弱化，從而使得對(duì)DNA損傷修復(fù)的能力下降，轉(zhuǎn) 錄因子的能力也同時(shí)發(fā)生下降，導(dǎo)致一系列諸如肺癌，前列腺癌等疾病的發(fā)生。ERCC2Asp312Asn多態(tài)性 與肺癌特別是肺鱗癌發(fā)生有顯著關(guān)聯(lián)，該位點(diǎn)的多態(tài)現(xiàn)象被認(rèn)為是中國(guó)人群中肺癌遺傳易感因素之一。國(guó)內(nèi)外的大量的關(guān)聯(lián)分析表明，PARP1基因上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)基因型為C時(shí)肺癌的發(fā)生幾率 增加；CYP1A1基因上rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)基因型為G時(shí)肺癌的發(fā)生幾率增加；XRCC1基因上rs25487號(hào) SNP位點(diǎn)基因型為A時(shí)肺癌的發(fā)生幾率增加；ERCC2基因上rsl3181號(hào)SNP位點(diǎn)基因型為G時(shí)肺痛的發(fā)生 幾率增加；ERCC2基因上rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)基因型為A時(shí)肺癌的發(fā)生幾率增加。這五個(gè)SNPs位點(diǎn)的 多態(tài)性可用于評(píng)估個(gè)體對(duì)肺癌的易感性。發(fā)明內(nèi)容基于PARPl基因上的rsll36410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYP1A1基因上的rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)、XRCC1基因上 的rs25487號(hào)SNP位點(diǎn)、ERCC2基因上的rsl3181號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上的rsl7997 3號(hào)SNP位點(diǎn) 的多態(tài)性可用于評(píng)估個(gè)體對(duì)肺癌的易感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)PARP1基因上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、檢測(cè) CYP1A1基因上的rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、檢測(cè)XRCC1基因上的rs25487 號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、檢測(cè)ERCC2基因上的rs13181號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物 對(duì)及特異性熒光探針、檢測(cè)ERCC2基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、 Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)PARP1基因上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYP1A1基因上的 rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)、XRCC1基因上的rs25487號(hào)SNP位點(diǎn)、ERCC2基因上的rsl3181號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2 基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出耙位點(diǎn)的DNA片段。設(shè)計(jì)這類引物對(duì)是本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQIDNO: 1和2所示序列的引物對(duì)、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對(duì)、具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物對(duì)、具有SEQ ID NO: 7和8所示序列 的引物對(duì)以及具有SEQ ID NO: 9和10所示序列的引物對(duì)。特異性引物對(duì)可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。 本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這五對(duì)引物。本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對(duì)PARP1基因上的rsl 136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYPIAI基因上的 rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)、XRCC1基因上的rs25487號(hào)SNP位點(diǎn)、ERCC2基因上的rsl3181號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2 基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這五個(gè)SNPs '位點(diǎn)肺癌易 感基因型的探針。設(shè)計(jì)這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 11、 12、 13、 14和15所示序列的Taqnian探針。特異性熒光探針可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的 技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光探針不限于這五條探針，所有可用于熒光定量PCR檢測(cè)PARPl基 因上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYPIAI基因上的rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)、XRCCl基因上的rs25487號(hào)SNP 位點(diǎn)、ERCC2基因上的rsl3181號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)的探針均在本發(fā)明 范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括lpl 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液，0. lpl 25niM dNTP混合液，0. 5nl 25mM MgCl2溶液，0.02nl (5units/jil) Taq DNA聚合酶，20(xM特異性引物對(duì)(十條)各0.225nl，10fiM特異性熒光探針(五條)各0.25nl，
去離子水2.88fil。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例l.檢測(cè)試劑盒的使用 步驟l: DM模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)使用可檢測(cè)肺癌易感性的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其中，含有下列引物對(duì)和熒光探針:有義引物l:5，-TTTGCCATTCACTGTGTTGG -3，(SEQIDNO:1)Tm值為58'C反義引物l:5，-ATCCTTGCTGCTATCATCA -3，(SEQIDNO:2)Tin值為54°C有義引物2:5'-GTGTTMGTGAGMGGTGAT -3，(SEQIDNO:3)Tm值為56'C反義引物2:5，-AGGATAGCCAGGMGAGAAA -3'(SEQIDNO:4)Tm值為58T)有義引物3:5，-TAACTGGCATCTTCACTTCT -3'(SEQIDNO:5)Tm值為56'C反義引物3:5,-TCCAGATTCCTGGCATTGC -3'(SEQIDNO:6)Tm值為58'C有義引物4:5，-ACTCAGGAGTCACCAGGAA _3'(SEQIDNO:7)Tm值為58'C反義引物4:5，-TCTGTTCTCTGCAGGAGGA -3,(SEQIDNO:8)Tm值為58'C有義引物5:5，-ATCAAAGAGACAGACGAGCA -3，(SEQIDNO:9)Tm值為58°C反義引物5:5，-TCAGGMGCCCAGGAAAT -3'(SEQIDNO:10)Tm值為54'C熒光探針1:5，-CAGGCCMGGCGGAAATGCT -3,(SEQIDNO:11)Tm值為64'C熒光探針2:5，-TATCGGTGAGACCGTTGCCC -3，(SEQIDNO:12)Tm值為64'C熒光探針3:5，-CGGCTGCCCTCCCAGAGG -3'(SEQIDNO:13)Tm值為64'C熒光探針4:5'- MTCTGCTCTATCCTCTGCAGC -3,(SEQIDNO:14)Tm值為66'C熒光探針5:5,-TGCCCMCGMGTGCTGCAG -3，(SEQIDNO:15)Tm值為64'C有義引物1，反義引物1和熒光探針1特異地針對(duì)檢測(cè)PARP1基因上的rsl 136410號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性； 有義引物2，反義引物2和熒光探針2特異地針對(duì)檢測(cè)CYPlAl基因上的rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；有 義引物3，反義引物3和熒光探針3特異地針對(duì)檢測(cè)XRCCl基因上rs25487號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；有義引物 4，反義引物4和熒光探針4特異地針對(duì)檢測(cè)ERCC2基因上的rsl3181號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；有義引物5, 反義引物5和熒光探針5特異地針對(duì)檢測(cè)ERCC2基因上的rel799793號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性。熒光定量PCR反應(yīng)體系為總體積lO(il，包含濃度為20ng/nl的DM模板2^1、 ljil 10 X熒光定量PCR 反應(yīng)緩沖液、0. ljd 25mM dNTP混合液、0.5^1 25mM MgCl2溶液、0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM的有義引物l、 2 、 3 、 4和5各0.225nl、 20fiM的反義引物l、 2 、 3、 4和5各0.225pl、 10nM的 熒光探針l、 2 、 3、 4和5各0.25^1,去離子水2.88nl。在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50'C、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的 95r、 30秒，60C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟3: SNP基因型分析 將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常對(duì)照相對(duì)比，熒光探針1最終的熒光信號(hào)明顯髙于 正常對(duì)照，說(shuō)明被檢測(cè)DM的PARPl基因上的rsll36410號(hào)SNP位點(diǎn)基因型攜帶有C型，為肺癌易感型； 熒光探針2最終的熒光信號(hào)明顯高于正常對(duì)照，說(shuō)明被檢測(cè)DM的CYP1A1基因上rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn) 基因型攜帶有G型，為肺癌易感型;熒光探針3最終的熒光信號(hào)明顯高于正常對(duì)照，說(shuō)明被檢測(cè)DNA的XRCC1 基因上rs25487號(hào)SNP位點(diǎn)基因型攜帶有A型，為肺癌易感型；熒光探針4最終的熒光信號(hào)明顯高于正常 對(duì)照，說(shuō)明被檢測(cè)DM的ERCC2基因上的rs13181號(hào)SNP位點(diǎn)基因型攜帶有G型，為肺癌易感型；熒光 探針5最終的熒光信號(hào)明顯高于正常對(duì)照，說(shuō)明被檢測(cè)DNA的ERCC2基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)基 因型攜帶有A型，為肺癌易感型。實(shí)施例2.指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防肺癌的服務(wù)目前在上海主健生物工程有限公司己經(jīng)開(kāi)展了這項(xiàng)服務(wù)。 步驟l: DNA提取對(duì)被檢測(cè)者進(jìn)行服務(wù)前咨詢，由被檢測(cè)者簽署知情同意書(shū)，填寫(xiě)生活飲食習(xí)慣問(wèn)巻調(diào)査表。依照取樣 盒中的指示使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提。 步驟2:基因分型檢測(cè)使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)被檢測(cè)者DNA的PARP1基因上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYP1A1基因上 rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)、XRCC1基因上rs25487號(hào)SNP位點(diǎn)、ERCC2基因上的rsl3181號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2 基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，確定這五個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。步驟3:指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防肺癌通過(guò)對(duì)被檢測(cè)者SNPs基因型的分析，出具基因分型檢測(cè)報(bào)告和被檢測(cè)者個(gè)體化健康指導(dǎo)報(bào)告。基因 檢測(cè)報(bào)告詳細(xì)說(shuō)明了被檢測(cè)者肺癌易感程度的高低以及患病的概率大小。個(gè)體化健康指導(dǎo)報(bào)告以被檢測(cè)者 的基因分型檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習(xí)慣問(wèn)巻調(diào)査結(jié)果，評(píng)估被檢測(cè)者肺癌遺傳易感的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。 同時(shí)制定出針對(duì)于被檢測(cè)者的個(gè)性化健康行動(dòng)方案，方案包括在飲食習(xí)慣、生活方式上的改進(jìn)建議等，并 為被檢測(cè)者普及預(yù)防肺癌的健康知識(shí)。
序列表〈110〉上海主健生物工程有限公司〈120>通過(guò)不同基因的五個(gè)SNPs檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒<160> 15<210〉 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列<220><223>引物 〈400〉 1tttgccattc actgtgttgg〈210〉 2 <211> 19 <212> ■ 〈213〉人工序列<220>〈223〉引物 <■> 2atccttgctg ctatcatca<210> 3 〈211〉 20 <212> DNA 〈213〉人工序列〈220〉<223>引物 <400> 3gtgttaagtg ag8aggtg8t201920 <210〉 4 <211〉 20 <212〉 ■ 〈213〉人工序列<220><223>引物 <柳〉4鵬3tagcca ggaagaga肪〈210〉 5 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列<220〉<223>引物 < 5taactggcat cttcacttct<210> 6 <211> 19 <212> DNA <213〉人工序列<220〉<223>引物 < 6tccagattcc tggcattgc<210> 7 <211> 19 <212〉DNA〈213>人工序列<220><223>引物
actcaggagt caccaggaa〈210> 8 <211> 19 <212> ■ <213>人工序列<220>〈223〉引物 〈400> 8tctgttctct gcaggagga<210〉 9 <211> 20 <212〉 DNA <213>人工序列<220>〈223〉引物 < 93tC3a8g8g8 Cag8CgagC3<210> 10 <211> 18 <212> DNA 〈213〉人工序列〈220><223>引物 <400> 10tcaggaagcc caggaaat<210〉 11 <211〉 20 〈212> DNA說(shuō)明書(shū)第8/10頁(yè)191920<213〉人工序列 <220>〈223〉探針 <400> 11caggccsagg cggsaatgct 20<210> <211〉 〈212〉 〈213〉12 20 DNA人工序列<220〉<223>探針 <400> 12tatcggtgag accgttgccc 20<210〉 <211> <212> <213〉13 18 DNA人工序列<220><223>探針 ■> 13cggctgccct cccagagg 18<210> <211> <212> <213>1422 腿人工序列<220>〈223>探針 <400> 14aatctgctct atcctctgca gc 22<formula>formula see original document page 12</formula>
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒，包括同時(shí)檢測(cè)PARP1基因上的rs1136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYP1A1基因上的rs1048943號(hào)SNP位點(diǎn)、XRCC1基因上的rs25487號(hào)SNP位點(diǎn)、ERCC2基因上的rs13181號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上的rs1799793號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)PARPl基因上的 rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYPlAl基因上的rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)、XRCCl基因上的rs25487號(hào)SNP位點(diǎn)、 ERCC2基因上的rsl3181號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出 包含PARPl基因上的rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYPlAl基因上的rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)、XRCCl基因上的 rs25487號(hào)SNP位點(diǎn)、ERCC2基因上的rsl3181號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)的 引物對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對(duì)PARPl基因上的 rsl136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYPlAl基因上的rsl048943號(hào)SNP位點(diǎn)、XRCCl基因上的rs25487號(hào)SNP位點(diǎn)、 ERCC2基因上的rsl3181號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上的rsl799793號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定量 PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這五個(gè)SNPs位點(diǎn)肺癌易感基因型的探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對(duì)選自具有SEQ ID NO: l和2所 示序列的引物對(duì)、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對(duì)、具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物對(duì)、 具有SEQ ID NO: 7和8所示序列的引物對(duì)以及具有SEQ ID NO: 9和10所示序列的引物對(duì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQIDNO: 11、 12、 13、 14和15所示序列的Taqman探針。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括ljil IOX熒光定量PCR反 應(yīng)緩沖液，O.lnl 25mM dNTP混合液，0.5^1 25mM MgCl2溶液,0,1 (5units/fd) Taq DNA聚合酶， 20nM特異性引物對(duì)(十條)各0.225nl， 10jiM特異性熒光探針(五條)各0.25pl，去離子水2.88nl。本 試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括同時(shí)檢測(cè)PARP1基因上的rs1136410號(hào)SNP位點(diǎn)、CYP1A1基因上的rs1048943號(hào)SNP位點(diǎn)、XRCC1基因上的rs25487號(hào)SNP位點(diǎn)、ERCC2基因上的rs13181號(hào)SNP位點(diǎn)和ERCC2基因上的rs1799793號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測(cè)的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)同時(shí)檢測(cè)分析個(gè)體的PARP1基因、CYP1A1基因、XRCC1基因和ERCC2基因上的SNPs位點(diǎn)基因攜帶型來(lái)預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)肺癌的易感性。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101153846SQ200610116669
公開(kāi)日2008年4月2日 申請(qǐng)日期2006年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司