專利名稱：固定抗原糖類以支持病原微生物的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)和診斷領(lǐng)域，更具體地說涉及診斷目前和/或過去和/或無癥狀感染或診斷暴露于革蘭氏陰性菌(如腸桿菌或軍團(tuán)菌)的歷史。甚至更具體地說，本發(fā)明涉及篩查動物或動物制品是否存在不需要的/不希望的微生物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于篩查樣品是否存在針對不需要的/不希望的微生物的抗體的方法并且優(yōu)選地借助于生物傳感器實(shí)施這樣的方法。本發(fā)明還涉及用于將多糖固定到固體表面的方法。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了具有固定多糖的固體表面以及這樣的表面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
世界充滿革蘭氏陰性菌，其中許多是腸桿菌科家族的成員。這個家族的成員在動物的胃腸道中被發(fā)現(xiàn)，但許多還自由生活在土壤和水中。腸桿菌科家族的成員具有非常復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)。此外，它們包括被鑒別為K抗原、H抗原以及O抗原的多種抗原。K抗原是酸性多糖莢膜。該莢膜具有許多功能，包括回避感染宿主的免疫系統(tǒng)以及附著于宿主的上皮。H抗原位于鞭毛中。
在革蘭氏陰性菌中的細(xì)胞壁的外部主要由脂多糖(LPS)組成。LPS由埋藏在外膜中的脂質(zhì)A、短的糖核心以及可選地由重復(fù)單元構(gòu)成的多糖鏈組成。O抗原位于多糖上。脂質(zhì)A是LPS的毒性成分。當(dāng)細(xì)胞溶解時，LPS被釋放，導(dǎo)致發(fā)熱和補(bǔ)體消耗。它還干擾凝固作用并且在高濃度時最終導(dǎo)致休克狀態(tài)。
作為非限制性的實(shí)例，將詳細(xì)討論腸桿菌科的一個成員沙門氏菌。對于人類和動物來說，腸沙門氏菌屬的大量亞種是重要的病原菌。除動物進(jìn)入病理發(fā)作之外，動物可以是細(xì)菌的無癥狀載體。受到污染的動物可以是這些威脅公眾健康的病原體的來源，例如通過這些動物制造的食物。因?yàn)樵S多利害關(guān)系人(stakeholder)認(rèn)為食物攜帶沙門氏菌感染的數(shù)目是不可接受的，所以必須采取措施以控制在食物鏈中的這種病原體。
在人類的食物攜帶感染中，作為病原微生物，沙門氏菌具有重要意義，其引起輕度到嚴(yán)重的臨床效應(yīng)。在荷蘭，所有鑒別的胃腸炎病例的5％是沙門氏菌感染(Edel et al.，1993；HoogenboomVerdegaal et al.，1994)。這種感染的平均發(fā)生率的風(fēng)險為每年450例/100,000人，其類似于其它工業(yè)化國家的情況(Berends et al.，1998)。盡管到2001年在腸沙門氏菌種群中鑒別了2480種血清型(Popoff，2001)，但僅少量的血清型與人感染有關(guān)(Grimont et al.，2000)。在2002年送到在RIVM的荷蘭國家沙門氏菌中心的所有來自人源的沙門氏菌隔離群中，鼠傷寒沙門氏菌加上腸炎沙門氏菌占75％以上(Van Pelt et al.，2003)。這個百分比包括51％歸因于與雞產(chǎn)品的接觸(家禽15％；蛋類36％)(Van Pelt et al.，2003)。
檢測生物體液中的免疫球蛋白(血清特征)是可以用來建立動物和人類暴露于傳染劑的歷史的一種方式。由雞感染后1周可以檢測相對于沙門氏菌抗原的體液反應(yīng)并且持續(xù)至少10周，即使該禽類不再是培養(yǎng)物陽性(Holt，2000)。如上所述，沙門氏菌的抗原決定簇由菌體(O)抗原、鞭毛(H)抗原以及表面(Vi)抗原組成(Holt，2000)?？乖M成的變化與不同的沙門氏菌血清型有關(guān)。
通常，血清特征快于疾病成因生物體的培養(yǎng)物分型。快速和特異性檢測潛在的沙門氏菌陽性屬和群具有重要意義，以便在生產(chǎn)過程中采取適當(dāng)?shù)拇胧Ｒ虼?，在來自制造食物的動?報道動物源性病原體的存在)的血清和血液樣品中的抗體檢測具有重要意義。然后這樣的信息用作危險評估和合理屠殺潛在病原體污染的動物的輸入，以便能夠增加食物安全，而且還改善職業(yè)危險以及減少病原體在環(huán)境中的傳播。
許多血清特征試驗(yàn)已開發(fā)用于檢測侵襲性沙門氏菌種。在許多這樣的方法中，最通常使用凝集和ELISA(Barrow，2000)。凝集試驗(yàn)已成功用來從家禽群中根除雞瘟沙門氏菌。然而，該方法是麻煩的、費(fèi)力的并且根據(jù)現(xiàn)代標(biāo)準(zhǔn)不適用于大規(guī)模篩查計劃。因而若干ELISA方法(其被認(rèn)為是相對便宜和快速的)已開發(fā)用來在家禽血清中檢測抗腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌抗原反應(yīng)(Barrow et al.，1996；Thorns et al.，1996；de Vries et al.，1998；Barrow，2000；Yamaneet al.，2000)。
在這個分析領(lǐng)域，生物傳感器的使用還有希望是有效、便宜以及快速的。此外，該技術(shù)能夠在一次試驗(yàn)中檢測任何生物分子類型的多種分析物。生物傳感器定義為分析裝置，其包括(i)“自動檢測”分析物的可重復(fù)使用的固定的生物向心配合體，以及(ii)物理傳感器，其將這種現(xiàn)象轉(zhuǎn)換成電子信號。
在二十世紀(jì)六十年代初期首次認(rèn)識到表面等離子體共振(SPR)現(xiàn)象(Kretschmann and Raether，1968)并在二十世紀(jì)八十年代首次引入SPR生物傳感器(Liedberg et al.，1983)。經(jīng)過二十世紀(jì)八十年代后期和二十世紀(jì)九十年代早期，才在市場中出現(xiàn)第一臺商業(yè)上可獲得的基于SPR的生物傳感器設(shè)備。最初，這種類型的生物傳感器作為輔助工具從組合文庫選擇性地和敏感地體外篩選有希望的新藥物而吸引了藥物公司的興趣。它證明是經(jīng)典方法如ELISA方法的有價值的替換方法。此外，與終點(diǎn)確定相反，它提供結(jié)合事件的實(shí)時測量。許多其它生命科學(xué)學(xué)科也已經(jīng)認(rèn)識到這種分析方式的益處，包括食物科學(xué)(Ivnitski et al.，1999；Medina，1997)。到現(xiàn)在為止，僅少量的關(guān)于SPR生物檢測的出版物涉及病原微生物的檢測，例如使用固定的大腸桿菌O157:H7細(xì)胞來篩查抗大腸桿菌O157:H7抗體的性能(Medina et al.，1997)，以及使用這些抗體來檢測大腸桿菌O157:H7細(xì)胞(Fratamico et al.，1997)。
在Jongerius-Gortemaker et al.(2002)中，進(jìn)行了一項(xiàng)SPR光學(xué)生物傳感器檢測血清和血液中抗體的合適性的研究，研究表明對腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌血清型的侵襲的體液反應(yīng)。在此研究中，利用了固定的鞭毛抗原融合蛋白。在充分分析以后，得到下述結(jié)論這個系統(tǒng)的敏感性和/或耐久性不足并且尤其不適合用于例如在屠宰場的屠宰流水線上的高通量的篩查家禽，以每小時數(shù)千的速率處理動物。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供具有改善的敏感性和/或改善的耐久性的方法。通過開發(fā)具有固定菌體抗原或所謂的O抗原的載體已實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)。如所描述的，O抗原位于脂多糖上以及多糖的組成會變化并對應(yīng)于沙門氏菌(亞)種的血清變型。每種血清分型可以(除了其它許多東西之外)通過許多O抗原來描述并且通常標(biāo)記有數(shù)字，如O4、O6或O12。可以發(fā)現(xiàn)O抗原是作為在LPS的多糖部分上的重復(fù)單元。多糖的長度也會變化并且可以是在零(粗糙LPS)和50以上重復(fù)單元(平滑LPS)之間。
在腸沙門氏菌科內(nèi)，可以區(qū)分不同的血清群；每個血清群包括至少一種特異性O(shè)抗原。在表1中列出了在雞和豬中具有重要意義的沙門氏菌血清變型以及它們的O抗原外形(profile)。在丹麥、德國、希臘以及荷蘭，在屠宰場采樣的39.5％的所有沙門氏菌陽性豬被確定為鼠傷寒沙門氏菌。與國家有關(guān)，來自豬的其它重要的隔離群是德爾比沙門氏菌(17.1％)、嬰兒沙門氏菌(8.0％)、巴拿馬沙門氏菌(5.1％)、俄亥俄沙門氏菌(4.9％)、倫敦沙門氏菌(4.4％)、利文斯通沙門氏菌(3.1％)、魏爾肖氏沙門氏菌(2.7％)、布雷得尼沙門氏菌(2.1％)、姆班達(dá)卡沙門氏菌(1.1％)、勃蘭登堡沙門氏菌(1.0％)、黃金海岸沙門氏菌(0.8％)。
在雞的情況下，以2002年荷蘭的群體水平，14％的雞是沙門氏菌陽性的。在那種情況下主要的血清變型是乙型副傷寒沙門氏菌爪哇變種。以傳播水平，在荷蘭發(fā)現(xiàn)可比較的百分比(13.4％)。在14個EU成員國中分離自肉用仔雞的最常見的沙門氏菌血清變型是乙型副傷寒沙門氏菌爪哇變種(24.7％)、腸炎沙門氏菌(13.6)、嬰兒沙門氏菌(8.0％)、維爾肖氏沙門氏菌(6.7％)、利文斯通沙門氏菌(5.7％)、姆班達(dá)卡沙門氏菌(5.5％)、鼠傷寒沙門氏菌(5.3％)、森夫頓堡沙門氏菌(5.0％)、哈達(dá)爾沙門氏菌(3.7％)。乙型副傷寒沙門氏菌爪哇變種是主要的，但這完全基于荷蘭。
表1列出了被認(rèn)為是在肉用仔雞和在豬中重要的動物源性劑的某些沙門氏菌血清變型以及它們的O抗原外形(Popoff，2001) a通過噬菌體轉(zhuǎn)變確定的O抗原用下劃線表示 b可以存在或缺少的O抗原用方括號表示 c用噬菌體ε15[15]和用噬菌體ε34[15，34]溶原化 在第一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于將多糖固定在載體上的方法，該方法包括用包含至少兩個胺和/或酰胺基團(tuán)的氧化劑和聚合物接觸所述多糖以獲得多糖-聚合物復(fù)合物以及將所述多糖-聚合物復(fù)合物耦聯(lián)于所述載體。上述聚合物可以是任何包含至少兩個胺和/或酰胺基團(tuán)的聚合物。所述至少兩個胺和/或酰胺基團(tuán)優(yōu)選將所述聚合物交聯(lián)于所述多糖和所述載體。為了便于更有效耦聯(lián)，優(yōu)選的是，所述聚合物包含至少4個以及更優(yōu)選至少7個胺或酰胺基團(tuán)。聚合物包含至少10個結(jié)構(gòu)基元。聚合物的結(jié)構(gòu)基元共享特有的使聚合物可以延伸反應(yīng)基團(tuán)。優(yōu)選的結(jié)構(gòu)基元是氨基酸或其功能部分、衍生物和/或類似物。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述聚合物包括蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)包含至少一個包含至少10個氨基酸或其功能等效物的多肽鏈。蛋白質(zhì)至少包含具有游離胺和/或酰胺基團(tuán)的成分。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)還可以是多聚體，該多聚體包含至少兩個彼此共價或非共價連接多肽鏈。蛋白質(zhì)可以包含修飾，如生物系統(tǒng)常見的那些修飾，如翻譯后糖基化。蛋白質(zhì)還可以被人工修飾或提供有另一基團(tuán)，只要它具有所提及的胺和/或酰胺基團(tuán)。
在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多糖衍生自革蘭氏陰性菌。當(dāng)在載體上固定以前，脂多糖(O抗原)在有包含至少兩個胺和/或酰胺基團(tuán)，優(yōu)選蛋白質(zhì)的聚合物存在的情況下被氧化時，這樣制備的載體的敏感性會得到很大改善。雖然我們不希望受任何理論的限制，但目前認(rèn)為來自氧化多糖的醛基團(tuán)能夠和蛋白質(zhì)的氨基基團(tuán)反應(yīng)以形成取代的亞胺(希夫堿結(jié)合)。在(激活)載體(例如傳感器芯片)上注射以后，可獲得的醛基團(tuán)和酰肼反應(yīng)以形成腙。以下還原不僅穩(wěn)定載體(例如包含葡聚糖的載體)和多糖之間的共價結(jié)合而且穩(wěn)定蛋白質(zhì)和多糖之間的亞胺結(jié)合。如將在實(shí)驗(yàn)部分詳細(xì)說明的，不同沙門氏菌血清型的多糖(O抗原)已被固定在載體上。其后制備的載體進(jìn)行使用標(biāo)準(zhǔn)血清的SPR分析。獲得的血清反應(yīng)用作該方法成功的指示。當(dāng)進(jìn)行沒有氧化步驟的耦聯(lián)反應(yīng)時，檢測不到或幾乎檢測不到參考血清的明顯反應(yīng)。
優(yōu)選地，多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物到載體的固定/耦聯(lián)是這樣的，即獲得高敏感性和/或耐久性。盡管鞭毛抗原會變性并喪失它們對血清抗體的抗原性，同時傳感器芯片必須再生以用于下一個具有相對苛刻溶劑的分析循環(huán)，但發(fā)現(xiàn)菌體抗原對于這些再生溶劑是相當(dāng)穩(wěn)定的。事實(shí)上，認(rèn)為固定O抗原活性的喪失主要與固體表面的降解有關(guān)，即逐漸喪失附著于金膜的葡聚糖層(抗原結(jié)合于該層)。根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生了比現(xiàn)有技術(shù)的載體更耐久的載體。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種用于在載體上固定多糖的方法，該方法包括用氧化劑和蛋白質(zhì)接觸所述多糖以獲得多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，以及將所述多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物耦聯(lián)到所述載體，其中所述多糖衍生自革蘭氏陰性菌，并且甚至更優(yōu)選地其中所述多糖衍生自腸桿菌。甚至更優(yōu)選地，所述多糖衍生自人或獸醫(yī)或植物病原體的革蘭氏陰性菌。這樣的多糖的實(shí)例是衍生自沙門氏菌(亞)種的多糖。其它實(shí)例是衍生自大腸桿菌種(例如大腸桿菌O157)和表2列出的細(xì)菌類的多糖。
表2對人和/或動物致病的包含LPS的細(xì)菌的實(shí)例 如以后將詳細(xì)說明的，包含固定多糖(O抗原)的載體可特別用于診斷所提及的包含LPS的細(xì)菌。
術(shù)語“多糖”是指這樣的實(shí)體，其包含兩個或更多連接于單糖單元的糖苷，并且包括(除其它許多東西之外)寡糖(2-10個殘基)以及多糖(多于10個單糖)。結(jié)合可以產(chǎn)生直鏈或支鏈多糖。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于在載體上固定多糖的方法，該方法包括用氧化劑和蛋白質(zhì)接觸所述多糖以獲得多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，以及將所述多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物耦聯(lián)于所述載體，其中所述多糖是脂多糖(LPS)，即，包含脂質(zhì)A的多糖。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，所使用的(脂)多糖必須包含至少一個抗原結(jié)構(gòu)和一個可獲得/適用于在蛋白質(zhì)和多糖之間提供鍵合的基團(tuán)。關(guān)于最后一項(xiàng)(item)的更多細(xì)節(jié)將在以后提供。因此，只要(脂)多糖包含抗原結(jié)構(gòu)和適合于在蛋白質(zhì)和多糖之間提供鍵合的基團(tuán)，則本發(fā)明的固定方法可以用來獲得敏感的和/或耐久的載體。
LPS在細(xì)胞外部表達(dá)并且是細(xì)菌細(xì)胞壁的一部分。就連接的脂族鏈來說，LPS的表達(dá)并不受到直接的遺傳控制，使得LPS是具有脂質(zhì)A部分的不同組成的不同分子的池(集合，pool)。此外，細(xì)菌細(xì)胞可以合成沒有或有短糖鏈的粗糙LPS、或具有50個以上表達(dá)其抗原性的重復(fù)單元的成熟糖鏈的平滑LPS。除這種異質(zhì)性之外，在單個分子LPS內(nèi)，可以表達(dá)若干被有區(qū)別地編號的O抗原實(shí)體。然而，按定義O抗原外形是沙門氏菌血清群獨(dú)有的。沙門氏菌的完全血清分型還包括H-抗原以及Vi-抗原。
可以通過各種各樣的方法來獲得LPS并且實(shí)驗(yàn)部分詳細(xì)描述了按照Staub(1965)對三氯酸提取的使用(隨后可選地是乙醇提取和透析)。Wilkons(1996)描述了適宜的提取方法的其它實(shí)例，包括但不限于用二甘醇、二甲基亞砜、NaCl-乙醚(1∶2(v/v))、NaCl-丁-1-醇(1∶1(v/v))、含水EDTA、NaCl-檸檬酸鈉、含水苯酚或含水苯酚-氯仿石油(chloroform petroleum)進(jìn)行提取。
獲得的/使用的LPS批料的純度并不認(rèn)為是非常關(guān)鍵的。經(jīng)驗(yàn)說明，LPS并不必須是完全沒有污染物。特異性耦聯(lián)反應(yīng)提供了一定程度的選擇性。此外，如在實(shí)驗(yàn)部分所描述的，按照最佳反應(yīng)所需要的蛋白質(zhì)量對使用的/獲得的LPS(優(yōu)選LPS批料)進(jìn)行優(yōu)化。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，LPS優(yōu)選不包含較多的粗糙LPS。優(yōu)選的LPS批料基本上包含平滑LPS。
雖然我們不希望受到任何理論的限制，但目前認(rèn)為，在LPS分子的核心中存在的2-酮-3-脫氧辛酸(KDO)和/或甘油-甘露庚糖(Hep)和/或GlcNAc是共價耦聯(lián)所需要的。
雖然術(shù)語革蘭氏陰性菌表示許多不同的細(xì)菌，但認(rèn)為來自所有這些細(xì)菌的LPS適用于本發(fā)明，只要LPS包含至少一種具有非共軛或早期解離鄰羥基的成分，優(yōu)選在LPS分子的核心區(qū)。在沙門氏菌中，最可能的候選成分是KDO以及Hep和GlcNAc殘基。存在或缺少這樣的KDO和/或Hep和/或GlcNAc基團(tuán)是間接遺傳確定的。雖然構(gòu)建物種-血清型或甚至菌株特異性單糖所必須的遺傳信息存在于相應(yīng)的生物體中，但它取決于生長環(huán)境在核心區(qū)所述LPS是否包含醛可轉(zhuǎn)化的單糖。
當(dāng)然還有其它可利用的LPS來源，如商業(yè)上購得。
在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于在載體上固定多糖的方法，該方法包括用氧化劑和蛋白質(zhì)接觸所述多糖以獲得多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，以及將所述多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物耦聯(lián)于所述載體，其中所述蛋白質(zhì)是具有一定量(伯)胺的蛋白質(zhì)(例如血清蛋白)。優(yōu)選地，至少這些胺中的某些胺不會受到空間位阻和/或不參與非共價結(jié)合，如H-H橋接或偶極-偶極相互作用和/或未質(zhì)子化。這樣的蛋白質(zhì)優(yōu)選不具有或幾乎沒有任何免疫原性特性，因而盡可能多地避免交叉反應(yīng)抗體直接面對所使用蛋白質(zhì)。適宜的蛋白質(zhì)的實(shí)例是血紅蛋白(Hb)、卵清蛋白(Ob)、肌紅蛋白(Mb)以及血清白蛋白(SA)。確定了不同標(biāo)準(zhǔn)血清對固定的LPS(在有Hb或Ob或Mb或SA存在的情況下被氧化)的生物傳感器反應(yīng)。血清白蛋白、肌紅蛋白以及血紅蛋白給出最有希望的結(jié)果。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)是血紅蛋白或肌紅蛋白。
必要的蛋白質(zhì)可商業(yè)上獲得或通過在適宜的表達(dá)系統(tǒng)中(過表達(dá))或通過從適宜的來源分離它而獲得。例如已通過從血液分離獲得血紅蛋白。優(yōu)選地，所使用的蛋白質(zhì)批料要盡可能純，從而盡可能阻止交叉反應(yīng)。然而，經(jīng)驗(yàn)表明，不會危及所獲得的載體的敏感性和/或耐久性的少量的污染是允許的。
(脂)多糖與蛋白質(zhì)的比率取決于(除其它許多因素之外)所使用的蛋白質(zhì)。用Hb進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，15和50％(m/m)之間的濃度已獲得滿意的結(jié)果。當(dāng)使用牛血清白蛋白時，則使用低得多的比率在0.7和7％(m/m)之間。一些實(shí)例用于利文斯通沙門氏菌LPS的最佳Hb濃度是大約50％(m/m)而用于腸炎沙門氏菌LPS的最佳Hb濃度是15％(m/m)。
優(yōu)選在有蛋白質(zhì)存在的情況下并借助于氧化劑來氧化分離的LPS制劑。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于在載體上固定多糖的方法，該方法包括用氧化劑和蛋白質(zhì)接觸所述多糖以獲得多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，以及將所述多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物耦聯(lián)于所述載體，其中所述氧化劑能夠氧化鄰二醇。甚至更優(yōu)選地，氧化劑優(yōu)選至少在受控條件下氧化鄰二醇。鄰二醇的氧化是優(yōu)選的，因?yàn)檫@可以保證包含鄰二醇的多糖可靠耦聯(lián)于基質(zhì)。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方式中，待耦聯(lián)于基質(zhì)的多糖包含通過結(jié)合對的成員待識別的抗原。為了可識別，優(yōu)選的是，抗原未發(fā)生變化，至少在大多數(shù)待耦聯(lián)于載體的多糖中。這需要獲得有效耦聯(lián)于基質(zhì)的氧化水平()和用于聯(lián)合結(jié)合對成員的抗原的有效性之間進(jìn)行平衡。后者需要抗原基本上不受至少以足夠用于診斷裝置的量的氧化的影響。根據(jù)本發(fā)明，鄰二醇的氧化保證可獲得足夠的可識別形式的抗原，同時可以將多糖有效耦聯(lián)于載體。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述氧化劑包括(鈉)偏高碘酸鹽。其它高碘酸鹽如高碘酸鉀或它的其它鹽也是本發(fā)明的適宜的高碘酸鹽。根據(jù)本發(fā)明，高碘酸鹽氧化非常適用于能夠優(yōu)先氧化鄰二醇。在本發(fā)明的多糖中主要鄰二醇的氧化通常可以通過用所述高碘酸鹽(濃度為1和10mM之間的高碘酸鹽)培養(yǎng)所述多糖來實(shí)現(xiàn)。反應(yīng)的其它參數(shù)會影響主要進(jìn)行的反應(yīng)的速度和類型。一個實(shí)例是培養(yǎng)時間。當(dāng)采用非常短的培養(yǎng)時間時，則可以使用高于10mM的高碘酸鹽。高碘酸鹽優(yōu)選氧化鄰二醇，尤其是在多糖側(cè)鏈中的更敏感的鄰二醇。因此只要選用所謂的“溫和”反應(yīng)條件，優(yōu)選地鄰二醇將被氧化。當(dāng)所選擇的條件也允許其它氧化反應(yīng)更頻繁地發(fā)生時(例如由于鄰二醇底物的耗盡)，在多糖中存在的抗原將受到明顯影響。因此對于本發(fā)明來說，當(dāng)使用提及的優(yōu)選濃度時以及當(dāng)至少20％、優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少70％和最優(yōu)選大約90％的抗原在氧化以后為完整的時候，高碘酸鹽氧化被說成是溫和的。優(yōu)選借助于ELISA測定并利用標(biāo)準(zhǔn)化的抗體來測量抗原的有效性或完整性。再一次我們不希望受任何理論的限制，但目前認(rèn)為，高碘酸鹽將誘導(dǎo)尤其是在糖部分(如在甘露糖中)上的鄰二醇之間鍵合的氧化破壞，以產(chǎn)生醛官能度。這種反應(yīng)通常在黑暗中、在pH范圍在4.5和5.5之間的緩沖液中并利用(優(yōu)選)新鮮制備的在0.1M乙酸鈉中的1-100mM偏高碘酸鈉進(jìn)行。優(yōu)選地，在1到10mM偏高碘酸鹽之間的濃度下進(jìn)行反應(yīng)。在有如上所述的范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)存在的情況下進(jìn)行氧化。二醛化合物，如在LPS的多糖鏈中的氧化的單糖成分，可以和蛋白質(zhì)中的任何氨基進(jìn)行反應(yīng)并且可以形成產(chǎn)生取代的亞胺的希夫堿鍵。當(dāng)一個或兩個鄰羥基被縮合成共價糖鍵時，則喪失羥基功能并且不會發(fā)生氧化。在許多支鏈和/或線型連接的寡糖和多糖中就是這種情況。在沙門氏菌LPS的情況下，內(nèi)核結(jié)構(gòu)在大多數(shù)情況下攜帶可氧化的Gal、GlcNAc、Hep和/或KDO，但非還原的Hep和KDO成分最易于氧化，尤其是在濃度小于6mM偏高碘酸鹽的非常溫和的氧化條件下。因?yàn)楹诵膮^(qū)是來自不同腸桿菌科的LPS的相當(dāng)保守的部分，所以腸桿菌科的成員的(脂)多糖可以用于本發(fā)明的方法。
高碘酸鹽還將氧化(當(dāng)存在時)某些氨基乙醇衍生物如在膠原中的羥賴氨酸殘基、以及甲硫氨酸(氧化成其亞砜)和某些硫醇(通常氧化成二硫化物)。此外，通過高碘酸鹽可以選擇性地將肽和蛋白質(zhì)的N端絲氨酸和蘇氨酸殘基氧化成醛基。然而，這些反應(yīng)通常以低于鄰二醇的氧化速率發(fā)生，并且這樣的基團(tuán)的存在并不明顯地干擾根據(jù)本發(fā)明的方法。
本發(fā)明還提供了一種用于在載體上固定多糖的方法，該方法包括用氧化劑和蛋白質(zhì)接觸所述多糖以獲得多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，以及將所述多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物耦聯(lián)于所述載體，該方法進(jìn)一步包括引起結(jié)束/停止氧化過程的步驟，例如通過對所述多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行脫鹽。這是例如借助于NAP-5柱來完成。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，存在許多其它具有相同效果的方法，例如加入還原劑或容易氧化的分子如甘油。優(yōu)選地，中止氧化的方法是這樣的，即同時完成緩沖變化，例如HPLC、FPLC、透析、離子交換劑、凝膠電泳或超濾。
為了儲存目的，在實(shí)驗(yàn)部分還描述了在加入蛋白質(zhì)以后生產(chǎn)蒸發(fā)的等分部分。這導(dǎo)致存在大量的可重復(fù)的材料。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括獲得的中間體，即，在有蛋白質(zhì)存在的情況下，制備氧化的多糖，可選脫鹽的以及可選蒸發(fā)的。
優(yōu)選地，所使用的載體由惰性、非疏水物質(zhì)構(gòu)成并且LPS-蛋白質(zhì)復(fù)合物與所述載體的結(jié)合是共價的。甚至更優(yōu)選地，這樣的載體具有低蛋白質(zhì)結(jié)合或低生物分子結(jié)合。實(shí)例是玻璃載體或二氧化硅載體或非疏水塑料載體。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述載體具有小球體或小珠的形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得若干類型的小球體或小珠。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述小球體或小珠包括聚苯乙烯。小球體或小珠是特別優(yōu)選的，因?yàn)槔帽景l(fā)明的方法可以向它們提供不同的抗原。具有不同抗原的小球體或小珠可以相應(yīng)地用不同的顏色加以標(biāo)記。利用所述小球體或小珠的集合可以相對于抗原測試樣品是否存在抗體?，F(xiàn)在通過結(jié)合的小球體或小珠的有色標(biāo)記可以容易地檢測抗體與特定類型的抗原的結(jié)合。可以用不同的方法檢測抗體的結(jié)合。例如，包含結(jié)合的抗體的小球體或小珠可以從樣品提取并利用對抗體的恒定區(qū)特異的另一抗體加以測量。另一方面，可以直接分析樣品，即，在沒有進(jìn)一步操作的情況下通過標(biāo)記結(jié)合的抗體并同時檢測抗體的顏色和小球體或小珠的顏色。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得用于同時檢測兩種或更多種顏色的不同方法。在本發(fā)明中，顏色定義為任何類型可以加以檢測的電磁輻射，只要它是典型的，例如，通過光反射，顯示到由于熒光或磷光的結(jié)果而發(fā)射的光的顏色。
因此本發(fā)明進(jìn)一步提供了至少兩種小球體或小珠的集合作用，其中所述至少兩種小球體或小珠的至少兩種各自包括本發(fā)明的不同抗原。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗原包括沙門氏菌的O抗原。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用本發(fā)明的方法，所述抗原連接于所述小球體或小珠的載體。因此優(yōu)選地，至少所述小球體或小珠之一包括連接到多糖的多糖涂層，該多糖包括待檢測的借助于包含至少兩個胺和/或酰胺基團(tuán)的聚合物，優(yōu)選本發(fā)明的蛋白質(zhì)彼此連接的抗原，其中所述鍵合聚合物(蛋白質(zhì))連接于所述包含所述抗原的多糖，上述連接是借助于在所述聚合物上的胺和/或酰胺基團(tuán)以及在所述所述抗原的多糖上的高碘酸鹽氧化的鄰二醇。
在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于在載體上固定多糖的方法，該方法包括用氧化劑和蛋白質(zhì)接觸所述多糖以獲得多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，以及將所述多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物耦聯(lián)于所述載體，該方法進(jìn)一步包括活化所述載體的表面。在一種甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述載體包括涂布有金的玻璃表面，并且甚至更優(yōu)選地所述載體用羧基供體加以修飾。表面可以被活化。在此表面上需要羧酸(COOH)基團(tuán)(另外稱作羧基)。優(yōu)選地，由分子的穩(wěn)定的均勻?qū)?為此其可能已加以修飾)來提供這些COOH基團(tuán)。這些表面可以存在但不限于羧酸修飾的多糖、烷或烯，如聚乙烯，附著于例如金、聚苯乙烯或硅表面。優(yōu)選地，載體包含作為羧基供體的多糖。更優(yōu)選地，用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺氫氯化物和N-羥基琥珀酰亞胺來活化羧甲基化的葡聚糖層，其中所述多糖修飾的載體，優(yōu)選包括葡聚糖層。優(yōu)選地，活化作用隨后是制備碳酰肼(carbohydrazine)。在下一步驟中，將多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物加入活化的葡聚糖層?；钚匀┕倌芏茸园l(fā)地和酰肼起反應(yīng)而形成腙，其然后被還原以穩(wěn)定共價鍵。
在常規(guī)使用之前，利用參比多克隆凝集血清對芯片軛合的LPS結(jié)合抗腸桿菌(例如沙門氏菌)抗體的性能進(jìn)行評估。
取決于所提出的分析/診斷問題，決定是否使用一種或例如至少兩種不同的代表血清型的碳水化合物，優(yōu)選4種不同的代表血清型的碳水化合物。在想知道哪一種特定血清型存在的情況下，使用了多種(其量是不同的，取決于提出的特定問題以及取決于所使用的儀器)不同的代表血清型的碳水化合物，如果只想知道例如動物是否被或已經(jīng)被特定的血清群感染，則可以在有蛋白質(zhì)存在的情況下氧化單一代表血清型的碳水化合物并固定在載體上。至少兩種不同的代表血清型的碳水化合物的使用使載體可以用于多種血清群分析。更優(yōu)選地使用至少三種并且甚至更優(yōu)選地至少三種以上(例如四種)不同的多糖。可以在有一種類型的蛋白質(zhì)的情況下或在有不同類型的蛋白質(zhì)的情況下氧化這些多糖。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠制得任何合理的組合。例如，為了能夠檢測90％以上的所有沙門氏菌感染，應(yīng)表示出在雞中的血清群B、C和D以及在豬中的血清群B、C、D和E。
如果對一定類型的細(xì)菌是否存在或是否曾經(jīng)存在這樣的問題感興趣，則使用一種類型的代表血清型的碳水化合物是非常有用的。例如，如果想確定動物是否被或曾經(jīng)被任何革蘭氏陰性菌(例如腸桿菌)感染，則使用多種不同的代表血清型的碳水化合物是有用的。
在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于在載體上固定多糖的方法，該方法包括用氧化劑和蛋白質(zhì)接觸所述多糖以獲得多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，以及將所述多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物耦聯(lián)于所述載體，其中所述載體是生物傳感器芯片。這樣的生物傳感器芯片可商業(yè)上獲得(例如由Biacore制造的生物傳感器芯片)，因此將不提供進(jìn)一步的信息。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過上述方法獲得的載體或在其表面上包含固定的多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物的載體。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，本發(fā)明的載體包含借助于還原性胺化作用連接于另一多糖涂層的多糖涂層，其中所述另一多糖涂層包括蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通過在所述另一多糖-蛋白質(zhì)上的鄰二醇的氧化而耦聯(lián)于所述另一多糖涂層。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，實(shí)現(xiàn)所述還原性胺化作用。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種包括耦聯(lián)于多糖的多糖涂層的載體。
在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包括根據(jù)本發(fā)明的載體的生物傳感器。例如通過從所述載體提取多糖并確定共價連接的蛋白質(zhì)是否存在，則可以確定載體是否是通過根據(jù)本發(fā)明的方法而獲得。如上文已經(jīng)討論的，載體還可以包括不同的固定的多糖(例如O抗原)并且可能連同不同類型的蛋白質(zhì)。然而，在氧化不同的多糖時，同樣可以使用一種類型的蛋白質(zhì)。
是否采用本發(fā)明的載體和/或芯片可以例如借助于MALDI-MS并可能結(jié)合蛋白水解消化來確定。這樣的分析可提供關(guān)于所使用的蛋白質(zhì)和多糖的信息。借助于酸解，可以從載體釋放多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后在蛋白水解以前和以后上述獲得的混合物進(jìn)行LC-MS/MS分析。獲得的復(fù)合物還可以進(jìn)行單糖分析，例如在甲醇分解和/或史密斯降解以后的GC-MS，從其可以確定使用何種類型的蛋白質(zhì)。此外這種信息可用來確定KDO、Hep或其它糖類是否已被氧化。
本發(fā)明的載體可以用于不同的檢測系統(tǒng)，例如光、熱、聲、安培計、磁或化學(xué)檢測系統(tǒng)，并且本發(fā)明的載體可以用于任何生物分子相互作用測定(BIA)或任何親合力測定(AA)。作為一個非限制性的實(shí)例，詳細(xì)描述了借助于表面等離子體共振的光學(xué)檢測的使用。
本發(fā)明提供了包括如上所述的生物傳感器的表面等離子體共振檢測系統(tǒng)。在傳感器芯片中的金層產(chǎn)生表面等離子體共振(SPR)所需要的物理?xiàng)l件。SPR的原理將在Biacore儀器的范圍內(nèi)加以描述。它們結(jié)合SPR現(xiàn)象以“實(shí)時”監(jiān)測生物分子相互作用。在兩種不同折射率的透明介質(zhì)(如玻璃和水)之間的界面，來自較高折射率側(cè)的光被部分反射和部分折射。在一定臨界入射角以上，沒有光被折射穿過界面，因而在金屬膜-液體界面發(fā)生全內(nèi)反射(TIR)。正是在此處，光傳播通過光密介質(zhì)如玻璃，并且在具有較小光密介質(zhì)(如緩沖劑)的界面被反射回來并穿過上述光密介質(zhì)。雖然入射光被完全反射，但電磁場成分，稱作消散波，透入較小光密介質(zhì)大約一個波長的距離。在玻璃棱鏡(高折射率)和緩沖劑層(低折射率)之間的界面產(chǎn)生消散波。如果在較高和較低折射率的介質(zhì)之間的界面涂布有薄金屬膜(光波長的一部分)，那么消散波的傳播將和金屬層上的電子相互作用。金屬在其表面包含可以耦合一定角度的入射光的電子云。這些電子還稱作等離體子，并且消散波的通路穿過過金屬層引起等離子體共振，從而形成稱作表面等離子體振子的量子力學(xué)波。因此，當(dāng)表面等離子體振子發(fā)生共振時，來自入射光的能量耗費(fèi)在金屬膜上，從而導(dǎo)致反射光強(qiáng)度的下降。共振現(xiàn)象僅發(fā)生在入射光為銳角的角度。這個角度取決于靠近金屬膜表面的介質(zhì)的折射率。因此在離金屬膜表面大約300nm的距離緩沖溶液的折射率的變化(例如溶質(zhì)表面濃度的增加)將改變共振角。這種共振角的連續(xù)監(jiān)測使得可以量化靠近金屬膜表面的緩沖溶液的折射率的變化。在“實(shí)時”Biacore中，金屬膜性能、波長、以及玻璃(光密介質(zhì))的折射率均保持恒定，因而SPR可以用來監(jiān)測直接靠近金屬(金)層的含水層的折射率。在Biacore系統(tǒng)中，芯片由玻璃組成并具有4個通道，而有關(guān)的金層覆蓋有一層葡聚糖，其被化學(xué)修飾以促進(jìn)配體(如抗體或抗原)的固定。由于分析物和傳感器芯片上的固定抗體的結(jié)合引起的質(zhì)量的任何變化將引起SPR角的變化，其被“實(shí)時”監(jiān)測并被量化為傳感圖。大約1kRU(1,000RU)的質(zhì)量變化相當(dāng)于1ng/mm2的表面蛋白質(zhì)濃度的質(zhì)量變化。對蛋白質(zhì)表面結(jié)合的典型反應(yīng)為大約0.1-20kRU。
不需用熒光或放射性標(biāo)記物來標(biāo)記分子，所以避免了標(biāo)記可能損害活性的可能性，并且此外無需困難的或昂貴的化學(xué)作用用于標(biāo)記。
獲得的載體可以用于不同類型的分析，如細(xì)菌學(xué)(直接測定)或血清特征(間接測定)。
血清特征測定的一個實(shí)例是一種用于確定針對樣品中的革蘭氏陰性菌的抗原的抗體存在的方法，該方法包括用如上所述的載體或生物傳感器接觸所述樣品并確定載體是否已結(jié)合任何抗體(圖1)。
這樣的方法是例如非常適用于確定針對O抗原的抗體的存在，因而間接確定是否存在感染或最近是否發(fā)生感染。這樣的方法可以例如用來篩查被屠宰動物的沙門氏菌或用來在出口前篩查動物的沙門氏菌。此外，該方法還用于從活的(例如飼養(yǎng)場或動物園)動物獲得的樣品。
在這樣的方法中可以使用的樣品實(shí)例是組織樣品、體液、分泌物或排泄物，而更詳細(xì)的實(shí)例是血液、源于血液的樣品、組織、肉汁、奶、蛋、來自眼的液體、唾液或糞便。如已經(jīng)概述的，樣品可以獲自死的以及活的動物。
根據(jù)本發(fā)明的方法并不限于一定的免疫球蛋白(亞)型，而是在原理上可以是每一種(同種)型免疫球蛋白如(s)IgA1、(s)IgA2、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgY。此外，它還可以是任何其它抗原結(jié)合物質(zhì)。優(yōu)選地，這樣的抗原結(jié)合物質(zhì)是感染(歷史)的生物標(biāo)記。
這樣的血清特征測定例如針對一種特定的代表血清群的碳水化合物或針對不同的(即多種分析物)代表血清群的碳水化合物，因而這樣的方法例如用來確定某些沙門氏菌(亞)型的存在或不存在。
細(xì)菌學(xué)測定的一個實(shí)例是一種用于確定樣品中革蘭氏陰性菌存在的方法，該方法包括用預(yù)定量的針對所述細(xì)菌的抗原的抗體接觸所述樣品，以及借助于如上所述的載體或生物傳感器確定未結(jié)合于所述細(xì)菌的抗體量。
優(yōu)選地，抗原是代表血清群的碳水化合物。
該方法可選地進(jìn)一步包括，通過例如洗滌或免疫磁性分離法、離心或過濾，從接觸的樣品除去非結(jié)合的抗體以及除去預(yù)定量的抗體。
對于這種類型的分析，可以使用每種類型的樣品，如動物飼料、肥料、羽毛、土壤、消耗用水或污水、肉、橙汁、巧克力、皮膚、植物等。動物樣品可以獲自活的以及死的動物。
在這種細(xì)菌學(xué)測定中，使用了單一類型的抗體以及至少兩種不同類型的抗體(針對不同的抗原，例如兩種不同的代表血清群的碳水化合物)的混合物。
優(yōu)選地，這樣進(jìn)行上述血清特征和細(xì)菌學(xué)測定，以便通過等離子體振子表面共振或熒光小球體或小珠計數(shù)器來確定與所述載體或所述生物傳感器的結(jié)合。
如上所述，樣品的來源不受限制并且可以例如獲自人或動物。適宜動物的實(shí)例是(賽)馬、豬、家禽(例如雞、火雞、鵪鶉、鴨、以及鵝)、反芻動物(例如小?；蚰膛！⑸窖?、綿羊)。動物可以是畜牧場動物、動物園動物以及自由生活動物。此外，來自這些動物的樣品可以獲自活的以及死的動物。
在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于確定樣品中存在革蘭氏陰性菌的方法，該方法包括 -用靶細(xì)菌特異性噬菌體接觸所述樣品并使噬菌體可以感染所述樣品 -除去導(dǎo)致噬菌體感染的樣品的非結(jié)合和/或非侵入噬菌體 -使噬菌體感染的樣品與對所用噬菌體敏感的指示生物接觸 -在至少一個噬菌體增殖循環(huán)期間進(jìn)行培養(yǎng) -回收噬菌體以獲得包含噬菌體的樣品 -用如上所述的載體或生物傳感器分析所述包含噬菌體的樣品。
大多數(shù)分析方法需要在特定培養(yǎng)基中的先前富集和生長以檢測細(xì)菌，包括沙門氏菌。通常，相對于總分析時間，樣品制備是非常費(fèi)時的。在可以證實(shí)例如沙門氏菌的存在以前，通常需要3至5天。在許多情況下，這種分析時間是不可接受的以及妨礙貿(mào)易并且間接威脅公眾健康。
本發(fā)明的這個部分的目的是開發(fā)一種快速(優(yōu)選在24小時內(nèi))和/或低成本和/或特異性的和/或敏感的診斷方法，用于確定微生物的存在。為此，本發(fā)明的目的是開發(fā)一種生物分子相互作用測定(BIA)，其利用屬特異性和/或血清變型特異性噬菌體在它們的“受害者”細(xì)菌中增加的能力。靶病原體特異性噬菌體的數(shù)目增加不僅表明靶生物的存在而且是試驗(yàn)樣品中靶細(xì)菌含量的(半)定量測量。
在圖2中描述了所提出的BIA方法的示意性概述。例如利用拍打式均漿器(Stomacher)對顆粒樣品進(jìn)行均化。通過劇烈搖動來混合液體樣品。然后通過任何適當(dāng)?shù)姆椒▉硖崛』蚋患治鑫锛?xì)胞，并且上述方法可以包括選擇性生長、離心、過濾和/或免疫磁性分離(IMS)、或其組合。用靶細(xì)菌特異性噬菌體強(qiáng)化富集的細(xì)胞并培養(yǎng)幾分鐘同時混合。在噬菌體的增殖循環(huán)完成之前，洗滌細(xì)胞以盡可能完全地除去任何非結(jié)合和非侵入噬菌體。在噬菌體增殖循環(huán)以后，使樣品與對所用噬菌體敏感(即，在對噬菌體侵入和細(xì)胞內(nèi)增殖敏感的生命期)的指示生物接觸，優(yōu)選在最高可能的濃度(例如濃縮的過夜培養(yǎng)物)。培養(yǎng)噬菌體-細(xì)菌懸浮液至少一個噬菌體增殖循環(huán)。然后離心或過濾噬菌體感染的懸浮液以沉淀/除去細(xì)胞物質(zhì)以及回收增殖的噬菌體。將包含噬菌體的樣品注射在LPS軛合的生物傳感器芯片(根據(jù)本發(fā)明)上以將這些顆粒保持在檢測器中，用于產(chǎn)生分析物特異性生物傳感器應(yīng)答。
為了獲得盡可能多的時間，可以將指示生物保持為在實(shí)驗(yàn)室中的連續(xù)培養(yǎng)物并且具有通常為109CFU/ml的細(xì)胞密度。這樣的懸浮液可以被濃縮成1010CFU/ml，因?yàn)楦叩募?xì)胞密度將增加所提出方法的敏感性。
此方法可以用來確定單一類型的血清變型，但為了在一次運(yùn)行中檢測多種血清變型，則必須使用不同噬菌體的混合物以及可能不同的指示細(xì)菌的混合物。
在現(xiàn)有技術(shù)中描述了靶細(xì)菌特異性噬菌體并且在實(shí)驗(yàn)部分提供了實(shí)例，例如抗腸炎沙門氏菌噬菌體。
已描述了，噬菌體附著于LPS，包括在實(shí)驗(yàn)部分描述的用于沙門氏菌檢測的噬菌體。適宜的載體/芯片是具有LPS或具有固定的細(xì)菌表面分子的載體/芯片(因而包括膜蛋白和其它生物分子或其組合)。細(xì)胞膜物質(zhì)的LPS的使用將阻止產(chǎn)生多克隆抗體或單克隆抗體。如果在BIA中噬菌體附著于細(xì)菌生物分子(LPS)并不滿意，則在成功的BIA中必須使用生物傳感器芯片固定的抗噬菌體抗體以從探測的(probed)樣品捕捉噬菌體。
此外本發(fā)明提供了一種具有適用于任何所描述的應(yīng)用的多種成分的試劑盒。取決于用戶的要求，這樣的試劑盒包括隨時可以使用的通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的載體/芯片。當(dāng)用戶想自己制備載體時，試劑盒將至少包括預(yù)定量的用蛋白質(zhì)(例如血紅蛋白或血清白蛋白)增強(qiáng)/富集的(脂)多糖、一定量的氧化劑(例如高碘酸鹽)、適宜的緩沖劑。可選地，這樣的試劑盒包括用于脫鹽的裝置，例如脫鹽柱。當(dāng)用戶想自己混合(脂)多糖和蛋白質(zhì)時，則會分別遞送這些成分并連同說明手冊。可選地，這樣的試劑盒可以另外包括陽性和/或陰性參比血清、樣品稀釋緩沖液以及任何必要的說明手冊。
如上所述的方法特別適用于大規(guī)模篩查樣品。在較早(緩慢)的裝置之一中，在33分鐘內(nèi)檢查96個樣品。在具有相對緩慢生物傳感器設(shè)備的大規(guī)模裝置中，在3個月內(nèi)篩查15,000個樣品。此數(shù)目可能會高得多，但遺憾的是，屠宰場之一停止了參與。



圖1.根據(jù)本發(fā)明的方法的一種實(shí)施方式的示意性表達(dá)。
圖2.利用噬菌體作為指示生物來檢測細(xì)菌的BIA的示意性概要。指示生物可以培養(yǎng)過夜或更短時間。
圖3.分離自鼠傷寒沙門氏菌(批料St2003.2)的Hb加強(qiáng)的氧化LPS和凝集血清的反應(yīng)性，以相對任意生物傳感器應(yīng)答(RU)為單位。在氧化期間LPS的Hb加強(qiáng)水平描述在該圖中。凝集血清的預(yù)期結(jié)合列在表3中。
圖4.來自實(shí)施例2、實(shí)驗(yàn)1的ROC曲線。TPF真陽性率；FPF假陽性率。
圖5.來自實(shí)施例2、實(shí)驗(yàn)2的ROC曲線。TPF真陽性率；FPF假陽性率。
圖6。制備由LPS涂布的小珠的分析，其中LPS來自腸炎沙門氏菌(反映血清群D)、黃金海岸沙門氏菌(反映血清群C2)、利文斯通沙門氏菌(反映血清群C1)、火雞沙門氏菌(反映血清群E)以及鼠傷寒沙門氏菌(反映血清群B)。用商業(yè)上可獲得的相對于O4(血清群B)、O5(血清群B)、O7(血清群C1)、O8(血清群C2)以及O9(血清群D)的單克隆抗血清試驗(yàn)涂層的成功和LPS的特異性。應(yīng)答以任意單位表示為在Y軸上的中間熒光指數(shù)(MFI)，而X軸指出單個小珠所軛合的LPS的類型。
圖7.用反映血清群B、C1、C2以及D的LPS涂布的小珠的分析。用相對于O4(血清群B)、O5(血清群B)、O7(血清群C1)、O8(血清群C2)以及O9(血清群D)的單克隆抗血清試驗(yàn)了涂層的活性。類似于圖6，只是移向更低應(yīng)答。注意，抗O5的應(yīng)答是不完整的。詳情參見圖6的圖標(biāo)。
圖8.比較用兩種不同氧化批料的氧化LPS涂布的小珠，其中LPS來自腸炎沙門氏菌(反映血清群D)和黃金海岸沙門氏菌(反映血清群C2)、利文斯通沙門氏菌(反映血清群C1)和鼠傷寒沙門氏菌(反映血清群B)。用相對于O5(血清群B)、O7(血清群C1)、O8(血清群C2)以及O9(血清群D)的商業(yè)上可獲得的單克隆抗血清對涂層進(jìn)行了試驗(yàn)。
圖9.來自雞的肉滲出物(meat drip)和血清的分析。商業(yè)上可獲得的抗血清用來強(qiáng)化肉滲出物和血清。Drip，收集自雞的肌肉組織的液體提取物，利用標(biāo)準(zhǔn)ISO方法其被測試為無沙門氏菌；Drip+CH-SPF，用收集自無特異性病原體(SPF)雞的血清強(qiáng)化的滲出物(drip)；CH-SPF，獲得自無特異性病原體(SPF)雞的血清；DripSPA-PG，用和雞瘟沙門氏菌和雞沙門氏菌具有反應(yīng)性的抗血清強(qiáng)化的滲出物；SPA-PG，抗雞瘟沙門氏菌和抗雞沙門氏菌抗血清；DripCHSi，用在血清特征上對于嬰兒沙門氏菌感染為陽性的雞血清強(qiáng)化的滲出物；CH-Si，血清特征上對于嬰兒沙門氏菌為陽性的雞血清。X軸表示單個小珠的LPS共軛的類型。詳情參見圖6、圖7以及圖8。
圖10.用商業(yè)上可獲得的抗鼠傷寒沙門氏菌(黃色線條)和抗利文斯通沙門氏菌(藍(lán)綠色線條)強(qiáng)化的豬血清的分析。此外，在涂布有LPS(代表血清群B、C1、C2以及D)的小珠上分析了在緩沖液中的小珠(藍(lán)色線條)和在陰性豬血清中的小珠(紫色線條)。
圖11.噬菌體FO1和Biacore SPR生物傳感器上的固定LPS的結(jié)合，其中LPS來自鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、黃金海岸沙門氏菌以及利文斯通沙門氏菌。PFU，噬斑形成單元。
圖12.在用1.2×109PFU噬菌體FO1培養(yǎng)鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、黃金海岸沙門氏菌、利文斯通沙門氏菌以后，噬菌體FO1和涂布有鼠傷寒沙門氏菌LPS的SPR生物傳感器芯片的結(jié)合。
虛線表示截留值。
圖13.在有沙門氏菌spp.特異性噬菌體FO1存在的情況下，培養(yǎng)不同的食物病原體和腐敗菌。在生長期間，監(jiān)測在λ600nm處的光密度，作為細(xì)菌生長的度量。b1+FO1，沒有細(xì)菌的空白培養(yǎng)基，僅補(bǔ)充有噬菌體。
圖14.在有沙門氏菌spp.特異性噬菌體FO1存在的情況下，培養(yǎng)不同的沙門氏菌血清變型。詳情參見圖13的圖標(biāo)。
圖15.在有沙門氏菌spp.特異性噬菌體FO1存在的情況下，培養(yǎng)不同的食物病原體和腐敗菌。在培養(yǎng)5小時后確定噬斑形成單元(PFU)的數(shù)目。b1+FO1，沒有細(xì)菌的空白培養(yǎng)基，僅補(bǔ)充有噬菌體。
圖16.在有沙門氏菌spp.特異性噬菌體FO1存在的情況下，培養(yǎng)不同的沙門氏菌血清變型。詳情參見圖13的圖標(biāo)。沒有培養(yǎng)FO1原液。
圖17.在濃縮和透析病毒以后，在不同沙門氏菌血清變型中增殖的噬菌體FO1的SPR生物傳感器分析。連續(xù)稀釋懸浮液并分析；濃縮/稀釋噬菌體的最終濃度表示在X軸上。
圖18.碳水化合物部分的氧化。R’和R分別表示在糖鏈中的遠(yuǎn)側(cè)和近側(cè)位置。
圖19.共軛于包含多胺的分子(R″)，如蛋白質(zhì)。
圖20.固定到熒光小珠并穩(wěn)定化學(xué)鍵。
圖21.LPS耦合于小珠和血清分析的步驟的示意說明。
圖22a.彎曲桿菌感染噬菌體的實(shí)例。
圖22b.利斯特菌感染噬菌體的實(shí)例。
圖22c.沙門氏菌感染噬菌體的實(shí)例。
圖23.計數(shù)室和計數(shù)技術(shù)。
圖24.總面積為1mm2的Bürker-Türk計數(shù)室(A)，其中B表示總面積的十六分之一面積。
圖25.高碘酸鹽濃度對在SPR生物傳感器芯片上固定腸炎沙門氏菌LPS的影響。
圖26.高碘酸鹽濃度對固定的腸炎沙門氏菌LPS(批料Se2002.1)的抗原活性的影響。將LPS固定到生物傳感器芯片并用SPR生物傳感器進(jìn)行分析(圖25)。試驗(yàn)范圍是0.2mM至1.8mM高碘酸鈉。O9、O12、O多A-S、S.typh、SE生物傳感器應(yīng)答，分別來自抗O9抗血清、抗O12抗血清、相對于血清群A至S的多克隆抗體、對于鼠傷寒沙門氏菌為陽性的雞血清以及對于腸炎沙門氏菌為陽性的雞血清。
圖27.高碘酸鹽濃度對固定的腸炎沙門氏菌LPS(批料Se2002.1)的抗原活性的影響。試驗(yàn)范圍是1.8mM至48.6mM高碘酸鈉。詳情參見圖26。
圖28.高碘酸鹽濃度對在SPR生物傳感器芯片上固定黃金海岸沙門氏菌LPS的影響。
圖29.高碘酸鹽濃度對固定的黃金海岸沙門氏菌LPS(批料Sg2002.1)的抗原活性的影響。將LPS固定到生物傳感器芯片并用SPR生物傳感器進(jìn)行分析(圖28)。試驗(yàn)范圍是0.2mM至5.4nM高碘酸鈉。O6，7、O8、O多A-S、利文斯通沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌生物傳感器應(yīng)答；分別來自抗O6/7抗血清、抗O8抗血清、相對于血清群A至S的多克隆抗體、對于利文斯通沙門氏菌為陽性的豬血清以及對于嬰兒沙門氏菌為陽性的雞血清。
圖30.高碘酸鹽濃度對在SPR生物傳感器芯片上固定利文斯通沙門氏菌LPS的影響。
圖31.高碘酸鹽濃度對固定的黃金海岸沙門氏菌LPS(批料Sg2002.1)的抗原活性的影響。將LPS固定到生物傳感器芯片并用SPR生物傳感器進(jìn)行分析(圖30)。試驗(yàn)范圍是0.2mM至5.4mM高碘酸鈉。O6，7、O8、O多A-S、利文斯通沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌生物傳感器應(yīng)答；分別來自抗O6/7抗血清、抗O8抗血清、相對于血清群A至S的多克隆抗體、對于利文斯通沙門氏菌為陽性的豬血清以及對于嬰兒沙門氏菌為陽性的雞血清。
圖32.LPS提取過程的質(zhì)量表。
圖33.步驟的示意性說明。
圖34.LPS固定到生物傳感器表面以及穩(wěn)定化學(xué)鍵。
圖35.在COM 1上的Biacore 3000控制軟件。
圖36.固定向?qū)А?br> 圖37.固定測試向?qū)А?br> 圖38.數(shù)據(jù)記錄。
圖39.固定氧化的LPS的典型的傳感器圖。報道點(diǎn)1基線；2活化EDC/NHS；3碳酰肼；4乙醇胺；5固定LPS Se。
圖40.在包含LPS的CM5芯片上分析的抗沙門氏菌O多A-S的傳感器圖。
圖41.在固定有黃金海岸沙門氏菌LPS-血紅蛋白的CM5生物傳感器芯片上，凝集血清和型特異性沙門氏菌抗血清的典型血清特征應(yīng)答。
圖42.在固定有黃金海岸沙門氏菌LPS-血紅蛋白的CM5生物傳感器芯片上，禽類參比血清(SPF-CH、EIA St、EIA Se、SPA-PG以及CH-Si血清)和豬參比血清(SW血清)的典型血清特征應(yīng)答。
圖43.固定有黃金海岸沙門氏菌LPS-血紅蛋白的CM5生物傳感器芯片的典型的基線應(yīng)答。

具體實(shí)施例方式 在以下的描述中將更詳細(xì)地說明本發(fā)明，其并不是對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1 材料和方法 1.1材料 1.1.1化學(xué)藥品 胺耦聯(lián)試劑盒購自Biacore AB(Uppsala，Sweden)，其還提供隨時可以使用的10mM甘氨酸和50mM氫氧化鈉，上述胺耦聯(lián)試劑盒包括N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDC)和乙醇胺氫氯化物-氫氧化鈉(pH 8.5)以及流動緩沖液(HBS-EP)，該流動緩沖液包含10mM HEPES、150mM氫氯化鈉、3mM EDTA以及0.005％(v/v)表面活性劑P20(pH 7.4)。乙醇、乙二醇、氯化鈉、氫氧化鈉以及三氯乙酸(TCA)購自Merck(Darmstadt，Germany)。羧甲基化葡聚糖鈉鹽、氰基硼氫鈉以及碳酰肼獲自Fluka Chemie GmbH(Buchs，Switzerland)。CHAPS(Plus one)由Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)供給。三水合乙酸鈉和乙酸由J.T.Baker(Deventer，荷蘭)供給。鹽酸胍獲自Calbiochem(San Diego，CA，美國)。豬血紅蛋白(Hb)和肌紅蛋白(Mb)、雞卵清蛋白(Ob；98％V級)、牛血清白蛋白(BSA；96％級分V)、高碘酸鈉、吐溫20、吐溫80以及Triton X-100獲自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO，美國)。水獲自Milli Q水純化裝置(Millipore，Bedford，MA，美國)。
1.1.2材料 NAP-5柱(0.5ml；Sephadex G-25)購自Amersham Biosciences(Rosendaal，荷蘭)并且如制造商所描述的加以使用。CM5生物傳感器芯片購自Biacore AB。截留為1kDa的透析袋(Spectra/Por)獲自Spectrum Laboratories Inc.(Rancho Dominguez，CA，美國)。
1.1.3抗沙門氏菌抗血清 使用了以下沙門氏菌單價“O”菌體免抗血清抗O4、抗O5、抗O6，7、抗O8、抗O9、抗O10、抗O12、O Poly E(抗O3、抗O10、抗O15、抗O19、抗O34)。此外，也使用沙門氏菌多價“O”菌體(Poly A-S)免抗血清(抗O2、抗O3、抗O4、抗O5、抗O6，7、抗O8、抗O9、抗O10、抗O11、抗O12、抗O13、抗O15、抗O16、抗O17、抗O 18、抗O19、抗O20、抗O21、抗O22、抗O23、抗O28、抗O30、抗O34、抗O35、抗O38、抗O40、抗O41)。血清購自Pro-Lab diagnostics(Salmonella Reference Section of the GeneralVeterinary Laboratory，Weybridge，英國)。血清群特異性鼠抗B(抗O4、O5以及O27)、抗C(抗O7、O8)、抗D(抗O9、Vi)以及抗E(抗O3、O19)單克隆抗體購自SIFIN(Berlin，德國)。
血清以1∶20(v/v)稀釋在HBS-EP中，其中HBS-EP包含1.0M氯化鈉、1％(m/v)羧甲基化葡聚糖以及0.05％(v/v)吐溫80，只是以1∶200(v/v)稀釋抗O5血清并且抗血清群特異性制劑以1∶100(v/v)稀釋在相同溶劑中。
1.1.4參比禽類和豬的血清 所有參比血清獲自荷蘭動物健康服務(wù)機(jī)構(gòu)(Deventer，荷蘭)。獲得的禽類參比血清對腸炎沙門氏菌(血清群D1)、鼠傷寒沙門氏菌(血清群B)、雞瘟/雞沙門氏菌(血清群D1)以及嬰兒沙門氏菌(血清群C1)是活性的，并且另外分別稱作C-Se、C-St、C-Spg以及C-Si。這些雞血清最初制備作為陽性參比用于ELISA分析。此外，購得沒有特異性病原體的雞血清(還稱作C-SPF)作為陰性對照參比樣品。通過加入制造商指定容積的水，由凍干材料重建這些血清。C-Se、C-Spg以及C-Si以1∶200(v/v)稀釋在HBS-EP中，其中HBS-EP包含1.0M氯化鈉、1.0％(m/v)羧甲基化葡聚糖以及0.05％(v/v)吐溫80，而C-SPF和C-St以1∶50(v/v)稀釋在相同溶液中。同樣，來自受到鼠傷寒沙門氏菌和利文斯通沙門氏菌(血清群C1)攻擊的動物的豬血清分別稱作P-St和P-SI。此外，在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)用作對照的大葉性肺炎放線桿菌血清型2-反應(yīng)豬血清在沙門氏菌生物傳感器測定中用作豬血清的陰性對照。豬血清以1∶20(v/v)稀釋在HBS-EP中，其中HBS-EP包含1.0M氯化鈉、1％(m/v)羧甲基化葡聚糖以及0.05％(v/v)吐溫80(作為最終濃度)。
1.1.5沙門氏菌原種(stock) 細(xì)菌黃金海岸沙門氏菌(Sg；血清群C2)、利文斯通沙門氏菌(SI)以及火雞沙門氏菌(Sm；血清型E1)獲自內(nèi)部收集，而腸炎沙門氏菌#23噬菌體型Pt4(Se)、以及鼠傷寒沙門氏菌X-193噬菌體型507(St)是F.G van Zijderveld(Animal Sciences Group，Lelystad，荷蘭)所贈。細(xì)菌在營養(yǎng)肉湯#2(Oxoid，Basingstroke，英國)的培養(yǎng)物中生長過夜。從形態(tài)學(xué)上和生物化學(xué)上證實(shí)了沙門氏菌菌株的原種為沙門氏菌，并且還通過在玻璃板上細(xì)胞與特異性標(biāo)準(zhǔn)抗O-抗原抗血清(Pro-Lab diagnostics)的凝集反應(yīng)證實(shí)了正確的、預(yù)期的O抗原的存在(如表3所指出的)。在加入具有甘油(Merck)最初容積的一半以后，原種分成若干份儲存于-80℃。
表3用于LPS生產(chǎn)的沙門氏菌血清變型的O抗原鑒定。給出用于通過凝集鑒定的抗血清的預(yù)期反應(yīng)。
aα-O4與編號為O4的抗原結(jié)構(gòu)反應(yīng)的抗體；以類似方式表示相對于O5、O6，7、O9、O10以及O12的抗體。
b對于沙門氏菌血清變型特異的O抗原指示在括號中。
1.2方法 1.2.1LPS的提取 通過在包含腦心浸液瓊脂(BHIa，Oxoid)的120個板的每一個板上施加100μl的它們的相應(yīng)的原種來制備沙門氏菌的過夜培養(yǎng)物。每當(dāng)產(chǎn)生新的原種懸浮液時總是通過常規(guī)選擇性生長、生物和免疫化學(xué)分類來證實(shí)所預(yù)期的沙門氏菌血清變型的存在。利用trigalski刮勺從板的表面采集細(xì)菌并放入1ml的9g/l NaCl(鹽水)溶液/瓊脂板。用2ml鹽水溶液洗滌每個板兩次。細(xì)菌收集在6個離心管中。每個管補(bǔ)充100ml鹽水并在10,000g和4℃下離心以前混合15分鐘，然后棄去上清液。每次試驗(yàn)中，通過將細(xì)胞懸浮在75ml鹽水洗滌溶液/管中重復(fù)離心步驟兩次。在保持在冰上的同時，以一定容積比(其是細(xì)菌重量的5倍)將小顆粒細(xì)菌懸浮在水中。加入等容積的0.250M(Se)或0.500M(Sg，S1，Sm和St)TCA，以分別產(chǎn)生0.12M和0.25M的最終濃度，接著在4℃下連續(xù)攪拌3小時。然后在20,000g和4℃下離心30分鐘以后獲得包含脂多糖(LPS)的上清液。用5M氫氧化鈉并當(dāng)接近目標(biāo)pH時用0.10M氫氧化鈉將上清液的pH調(diào)節(jié)至pH 6.5。在儲存于-180℃30分鐘以前，確定含LPS溶液的最終容積。用雙倍容積的冰冷無水乙醇(來自-180℃儲存處)對溶液進(jìn)行稀釋，然后在封閉的具有循環(huán)冷乙二醇/水(1∶4，v/v)的室內(nèi)裝置中，在-4℃下無攪拌連續(xù)培養(yǎng)過夜。在20,000g和-4℃下離心30分鐘以后獲得包含LPS的小顆粒。將顆粒物質(zhì)懸浮于0.5m1水/克最初細(xì)菌質(zhì)量(在提取過程開始時稱量)。在4℃下相對于水在1-kDa透析袋中透析懸浮液兩天，其間定期更新水。在20,000g和4℃下離心透析袋內(nèi)含物30分鐘，然后凍干上清液。稱量凍干物以確定LPS的回收率。將LPS在水中重組以形成5mg/ml的最終濃度。取決于LPS和批料的類型(還參見部分1.2.2)，將一定容積的1mg/ml的豬血紅蛋白(Hb)加至如文中所指定的濃度。每一批料分成0.5mg的LPS部分，利用真空蒸發(fā)器對其進(jìn)行干燥，然后在5-8℃下儲存。
1.2.2最佳血紅蛋白含量 在化學(xué)改性和固定到傳感器芯片之前，將蛋白質(zhì)加入LPS制劑，以獲得高涂層水平和高血清應(yīng)答抗原。利用一組陽性和陰性參比血清并通過比較固定LPS(其用不同水平的Hb增強(qiáng))的應(yīng)答，確定在每一LPS批料中的最佳Hb含量。
1.2.3LPS的氧化 將0.5mg的血紅蛋白增強(qiáng)的LPS溶解在500μl的100mM乙酸鈉(pH 5.5)中。在加入20μl的50mM高碘酸鈉以后，在冰上及避光條件下培養(yǎng)溶液40分鐘。對LPS的氧化進(jìn)行驟冷，然后借助于重力流動使500μl的反應(yīng)混合物通過NAP-5柱體從而對溶液進(jìn)行脫鹽。用1ml的10mM乙酸鈉(pH 4.0)洗脫修飾的LPS。在使用之前，用3ml的10mM乙酸鈉(pH 4.0)調(diào)節(jié)柱體三次。
1.2.4LPS的固定 為了將抗原固定于傳感器芯片，在由Biacore 3000控制軟件(版本3.1.1；Biacore)控制的Biacore 3000儀器中以5μl/分鐘的流速進(jìn)行下述處理。通過執(zhí)行在BIAapplications Handbook，version AB(1998)中描述的醛耦聯(lián)步驟，實(shí)現(xiàn)了氧化LPD的固定。簡單地說，用EDC/NHS的混合物(可獲自胺耦聯(lián)試劑盒)的7分鐘脈沖活化生物傳感器芯片上的葡聚糖層。緊接著活化作用以后是注射5mM含水碳酰肼7分鐘。
然后借助于7分鐘的1M乙醇胺脈沖對過量的活性基團(tuán)進(jìn)行去活化。在固定抗原以前，LPS以一定比率(取決于沙門氏菌血清變型)稀釋于乙酸鈉(pH 4.0)中(參見本文)，然后固定32分鐘。然后通過以2μl/分鐘的流速注射溶解在10mM乙酸鈉(pH 4)中的100mM氰基硼氫鈉20分鐘來穩(wěn)定葡聚糖基質(zhì)和抗原之間的鍵合。為成功的LPS固定步驟的征兆的相對應(yīng)答對于包含15％(m/m)蛋白質(zhì)的6.25μg/ml LPS溶液是2kRU，以及對于包含50％(m/m)蛋白質(zhì)的250μg/ml LPS溶液是9kRU。
1.2.5SPR生物傳感器測定 在由如上所述的相同軟件控制的Biacore 3000SPR生物傳感器平臺上進(jìn)行光學(xué)SPR生物傳感器測定。在注射以前，以1∶50(v/v)或在不同的情況下如本文所指定的比率將血清稀釋于HBS-EP緩沖液，其包含1％(m/v)羧甲基化葡聚糖鈉鹽、1.0M氯化鈉以及0.05％(m/v)吐溫80。在環(huán)境溫度下培養(yǎng)混合物至少2分鐘。以40μl/分鐘注射豬血清2分鐘，而以5μl/分鐘或20μl/分鐘(如指定的)注射禽類血清2分鐘。
用15秒脈沖的6mM甘氨酸(pH 2)，其包含6M鹽酸胍、0.1％(m/v)CHAPS、以及均為0.1％(v/v)的吐溫20、吐溫80和Triton-100，來再生芯片，以恢復(fù)傳感器表面的抗原活性。接著以100μl/分鐘流動富集有0.05％(m/v)CHAPS(最終濃度)的HBS-EP緩沖液12秒以進(jìn)行第二再生步驟。
1.2.6單糖分析 通過甲醇分解(1.0M甲醇HCl，24小時，85℃)接著通過再-N-乙?；饔煤腿坠柰榛饔?，從聚糖樣品制得三甲硅烷基化的(甲酯)甲基糖苷，然后通過氣相色譜法/質(zhì)譜法進(jìn)行分析，如[Kamerling JP，Vliegenthart JFG(1989)]所描述的。通過氣相色譜法以及火焰離子化檢測進(jìn)行定量分析，其中氣相色譜法是在毛細(xì)管EC-1柱(30m×0.32mm，Alltech)上并利用Chrompack CP 9002氣相色譜儀進(jìn)行，上述氣相色譜儀是以4℃/分鐘進(jìn)行操作并且溫度范圍是140℃至240℃。單糖衍生物的鑒定是通過在裝備有AT-l柱(30m×0.25mm，Alltech)的Fisons Instruments GC 8060/MD 800系統(tǒng)(Interscience)上的氣相色譜法/質(zhì)譜法加以證實(shí)。
結(jié)果 LPS分離 為了生產(chǎn)LPS，針對沙門氏菌的瓊脂板培養(yǎng)和在液體培養(yǎng)基中的生長比較了細(xì)菌細(xì)胞以及LPS的產(chǎn)量(表4)。由于實(shí)驗(yàn)室技術(shù)原因，決定從瓊脂板采集細(xì)菌，而不是從培養(yǎng)瓶分離細(xì)胞。從Se、Sg、Sl、Sm以及St分離LPS的結(jié)果分別總結(jié)在表5至表9中。嚴(yán)格定義的LPS的標(biāo)準(zhǔn)化分離對于成功和耐久血清特征測定具有決定作用。為了確保測定性能，批料之間的差異應(yīng)保持最小。為此，產(chǎn)生了若干批提取自每一種Se、Sg、Sl、Sm以及St的LPS。LPS的回收率很大程度上依賴于在提取LPS期間在混合物中的最終TCA濃度(參見表6和表8)，雖然對于從St提取LPS來說這種關(guān)系并不完全清楚(表9)。確實(shí)，通過廣泛TCA濃度范圍的試驗(yàn)，并不能針對每種LPS類型確定準(zhǔn)確的最佳TCA濃度。在這里，最佳TCA應(yīng)產(chǎn)生最高的LPS量，給出最高特異性血清特征和最低非特異性生物傳感器應(yīng)答。在本研究中，對于從不同沙門氏菌血清型的LPS提取來說，選擇作為“最佳”的TCA濃度是基于透析后的最終LPS產(chǎn)量，并且對于Se、Sg、Sl、Sm以及St分別是0.12M、0.25M、0.25M、0.25M以及0.25M作為最終濃度。
表4.從腸炎沙門氏菌細(xì)胞回收LPS，其中腸炎沙門氏菌細(xì)胞生長為在包含所謂營養(yǎng)肉湯#2(液體培養(yǎng)基)的生物反應(yīng)器中的懸浮液或生長在BHI瓊脂板(瓊脂)上。利用指定的TCA最終濃度分離LPS。相對于分離細(xì)胞量的LPS產(chǎn)率列在最后一列。
*含TCA混合物的pH是無關(guān)的 **在樣品混合聚集過程中某些物質(zhì)丟失。
表5.生長在BHIa板上的腸炎沙門氏菌細(xì)胞的回收。利用0.12M TCA最終濃度分離LPS(參見表4)。
表6.生長在BHIa板上的黃金海岸沙門氏菌細(xì)胞的回收。利用如指定的TCA最終濃度提取LPS。
aTCA在提取混合物中最終濃度。
b在混合聚集期間失去大約三分之一產(chǎn)量。
表7.生長在BHIa板上的利文斯通沙門氏菌細(xì)胞的回收。利用0.250M TCA最終濃度提取LPS。
表8.生長在BHIa板上的火雞沙門氏菌細(xì)胞的回收。利用如指定的TCA最終濃度分離LPS。
aTCA在提取混合物中的最終濃度。
b批料Sm2003.1至2003.2混合成稱作Sm2003.1的單一批料。
表9.生長在BHIa板上的鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞的回收。利用0.250M TCA最終濃度分離LPS。
aTCA在提取混合物中的最終濃度。
b批料St2003.2至St2003.4b混合成稱作St2003.2的單一批料。
分析了分離的LPS制劑的單糖組成，以揭示用于來自不同沙門氏菌生長的LPS的分離和純化步驟的一致性。必須注意到，對這樣的LPS制劑進(jìn)行分析，其隨時可以氧化并且為此用一定水平的Hb加以增強(qiáng)，其中所述水平被確定為對于所試驗(yàn)的LPS批料來說是最佳的(參見下文)。為此，在Hb增強(qiáng)的LPS制劑的甲醇分解以后分析了GC-FID和GC-MS(表10至表14)。這些結(jié)果表明，在最終LPS制劑中Hb并不提供明顯量的碳水化合物。BHIa的分析表明存在排他的半乳糖(Gal)和葡萄糖(Glc)。這些單糖的含量是5.6μg/mg干BHIa。沙門氏菌LPS制劑的分析表明，根據(jù)它們的碳水化合物結(jié)構(gòu)，存在Gal、Glc、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、甘油-甘露糖-庚糖(Hep)、2-酮基-3-脫氧-辛酸(KDO)、甘露糖(Man)以及鼠李糖(Rha；6-脫氧-甘露糖)。它們的相對存在表示為相對于1.0Man(作為PS區(qū)的一部分)的摩爾比率或相對于3.0Hep(作為核心區(qū)的一部分)的摩爾比率。然而，應(yīng)當(dāng)注意到，核心區(qū)包含2個或3個Hep殘基。此外，GlcNAc可以源自GLcNAc(如在Sl LPS的重復(fù)單元中)，或源自葡糖胺(GlcN)，其作為雙糖出現(xiàn)在脂質(zhì)A部分，作為用于附著脂質(zhì)的主鏈。Gal存在于核心區(qū)，其在所有腸沙門氏菌血清變型中是保守的，以及存在于Se、Sg、St以及Sm的PS區(qū)。在這些情況下，Gal的摩爾比率預(yù)期超過1.0Man，除Sg之外，其中每個重復(fù)單元包含2個Man殘基。單糖分析并不包括檢測O-乙?；?、磷?；?乙醇胺化或磷酸化成分，也不包括檢測阿比可糖(Abe；3，6-雙脫氧-木己糖)或泰成糖(Tyv；3，6-雙脫氧-阿拉伯糖)，其存在于多糖以及分離的LPS類型的核心區(qū)。
Se LPS的分析表明，在批料Se2003.1中以1.4、1.0以及1.2的摩爾比率分別存在Gal、Man以及Rha，而在批料Se2003.4中此比率分別為1.1、1.0以及0.9(表5)。此比率與重復(fù)單元如[Tyv-]Man-Rha-Gal的組成具有良好的一致性，只是在批料Se2003.1中Rha比率明顯太高。在批料Se2003.4中，基于確定的單糖計算的碳水化合物含量明顯更高，即，和批料Se2003.1的123μg相比為241μg?？紤]到在脂質(zhì)A中存在兩個GlcN殘基、在核心區(qū)存在單個GlcNAc殘基以及在每個重復(fù)單元中存在單個Man殘基，所以在批料Se2003.1和Se2003.4中重復(fù)單元的數(shù)目估計分別為19和20。
氧化Se2003.1的單糖分析清楚地表明和非氧化相同批料的明顯差異(表10)。與兩個GlcN殘基相反，預(yù)計非還原末端GlcNAc殘基的更大部分被氧化。采用的單糖分析未檢測糖醇衍生物并且未確定GlcNAc-醇的相應(yīng)量。因?yàn)樵谥貜?fù)單元中的Gal和Man對過碘酸氧化作用不敏感，所以在氧化批料中的Man的摩爾比率標(biāo)準(zhǔn)化到在非氧化批料中的Man的摩爾比率。應(yīng)當(dāng)注意到，在核心區(qū)中的兩個Gal殘基對氧化作用敏感，因此總Gal比率受到影響。Se LPS分子結(jié)構(gòu)的檢查提示，除末端GlcNAc和核心Gal之外，末端KDOII-KDOIII雙糖、共軛HepI以及末端HepIII也對過碘酸氧化作用敏感。確實(shí)，這些單糖殘基的摩爾比率提示喪失了一個Hep殘基以及大約1.6個KDO殘基。應(yīng)當(dāng)注意到，當(dāng)KDOII與磷?；?乙醇胺基團(tuán)軛合時，KDOII可能不被完全氧化。
表10.腸炎沙門氏菌LPS和氧化腸炎沙門氏菌LPS的單糖分析。用15％(m/m)的Hb增強(qiáng)LPS?；诖嬖谟诤诵膮^(qū)和脂質(zhì)A區(qū)(稱作CORE)的兩個GlcN殘基和一個GlcNAc殘基(檢測為三個GlcNAc殘基)和基于在重復(fù)單元(稱作UNIT)中的一個Man殘基，確定了摩爾比率。標(biāo)準(zhǔn)化的GlcNAc和Man殘基用下劃線表示。在0.5mg LPS制劑中確定了碳水化合物含量，只是對125mg氧化物質(zhì)進(jìn)行單糖分析。
a不包括Tyv殘基的貢獻(xiàn)； b所分析的含LPS物質(zhì)的量未準(zhǔn)確確定。
和Se LPS比較，Sg LPS的單糖分析提示，當(dāng)重復(fù)單元的數(shù)目明顯較少時，LPS結(jié)構(gòu)會較小(表11)。為此，核心Gal對PS Gal的相對貢獻(xiàn)較大并且總摩爾比率為1.5。以類似的方式，發(fā)現(xiàn)Glc的摩爾比率為1.3(批料Sg2003.2)和1.5(批料Sg2003.3)，而Rha的摩爾比率適合于預(yù)期的結(jié)構(gòu)。然而，批料Sg2003.2似乎包含較少的末端HepIII和末端KDOIII，因而提供較小的固定于傳感器芯片的可能性。
表11.分離自黃金海岸沙門氏菌并用50％(m/m)的Hb增強(qiáng)的LPS的單糖分析?；诖嬖谟诤诵膮^(qū)和脂質(zhì)A區(qū)(稱作CORE)的兩個GlcN殘基和一個GlcNAc殘基(檢測為三個GlcNAc殘基)和基于在重復(fù)單元(稱作UNIT)中的兩個Man殘基，確定了摩爾比率。標(biāo)準(zhǔn)化的GlcNAc和Man殘基用下劃線表示。在0.5mg LPS制劑中確定了碳水化合物含量。
a不包括Abe殘基的貢獻(xiàn)。
在PS的重復(fù)單元中GlcNAc的存在妨礙了對核心殘基的數(shù)目(來自Sl LPS的單糖分析結(jié)果，表12)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。當(dāng)Hep殘基的數(shù)目被設(shè)定為3.0時，則產(chǎn)生KDO殘基數(shù)目的不可接受的估計過高。為此，Hep的數(shù)目被設(shè)定為2.0，但可能需要加以改變，以便KDO的數(shù)目接近3.0。當(dāng)在每個重復(fù)單元中Man殘基的數(shù)目為四時，按照4.0Man殘基對摩爾比率進(jìn)行校正。基于在PS區(qū)中Man/GlcNAc的4∶1摩爾比率，重復(fù)單元的數(shù)目的計算是基于剩余的核心GlcNAc殘基和脂質(zhì)A GlcN殘基。該計算揭示了，在Sl中的重復(fù)單元的數(shù)目同樣相對較小，即在批料Sl2003.1和批料2003.2中分別為8和10個單元。
表12.分離自利文斯通沙門氏菌并用50％(m/m)的Hb增強(qiáng)的LPS的單糖分析?；诖嬖谟诤诵?稱作CORE)的兩個Hep殘基和基于在重復(fù)單元(稱作UNIT)中的四個Man殘基，確定了摩爾比率。標(biāo)準(zhǔn)化的GlcNAc和Man殘基用下劃線表示。在0.5mg LPS制劑中確定了碳水化合物含量。
表13.火雞沙門氏菌LPS的單糖分析。用50％(m/m)的Hb增強(qiáng)批料Sm2003.1和Sm2003.3。基于存在于核心區(qū)和脂質(zhì)A區(qū)(稱作CORE)的兩個GlcN殘基和一個GlcNAc殘基(檢測為三個GlcNAc殘基)和基于在重復(fù)單元(稱作UNIT)中的一個Man殘基，確定了摩爾比率。標(biāo)準(zhǔn)化的GlcNAc和Man殘基用下劃線表示。在0.5mg LPS制劑中確定了碳水化合物含量。
a不包括O-乙?；呢暙I(xiàn)，其可以附著于重復(fù)Gal殘基。
Sm LPS的單糖分析(表13)表明，按照其分子結(jié)構(gòu)，和Sl LPS完全不同的組成包含Man-Rha-Gal重復(fù)單元。如上文所描述的，在重復(fù)單元中Gal的摩爾比率大于預(yù)期的1.0，這部分地是由于在核心區(qū)中的Gal殘基的貢獻(xiàn)。
同樣，當(dāng)Glc、Man、Rha以及Gal在St LPS中形成重復(fù)單元時，預(yù)期這些殘基具有等摩爾比率(表14)。在這里應(yīng)當(dāng)注意到，阿比可糖也是重復(fù)單元的一部分，但不在所進(jìn)行的分析中。然而，批料St2003.2包含較少的可氧化Hep和KDO，其可以影響來自這種制劑的LPS的固定功效。另一方面，批料St2003.2比批料St2003.1包含多得多的碳水化合物，即在0.5mg LPS中分別為249μg和154μg。
表14.鼠傷寒沙門氏菌LPS的單糖分析。用15％(m/m)和25％(m/m)的Hb分別增強(qiáng)批料St2003.1和St2003.2?；诖嬖谟诤诵膮^(qū)和脂質(zhì)A區(qū)(稱作CORE)的兩個GlcN殘基和一個GlcNAc殘基(檢測為三個GlcNAc殘基)和基于在重復(fù)單元(稱作UNIT)中的一個Man殘基，確定了摩爾比率。標(biāo)準(zhǔn)化的GlcNAc和Man殘基用下劃線表示。在0.5mg LPS制劑中確定了碳水化合物含量。
a不包括(O-乙?；?Abe殘基的貢獻(xiàn)。
LPS的蛋白質(zhì)支撐的固定 意想不到地，完整的LPS通過其KDO-羧酸官能團(tuán)不充分地耦聯(lián)于EDC/NHS-活化的羧甲基化葡聚糖，并且沒有觀測到參比血清的明顯應(yīng)答。為了改善LPS于傳感器芯片的固定，利用高碘酸鈉氧化LPS以在其碳水化合物成分中產(chǎn)生活性醛基，其將允許所謂的醛耦聯(lián)步驟，即，醛和酰肼官能團(tuán)縮合成腙鍵合，接著還原成酰肼產(chǎn)物。在沒有氧化作用的情況下，LPS確實(shí)幾乎沒有固定于CM5芯片表面(涂布有碳酰肼)的能力(結(jié)果未示出)。
然而，氧化LPS的耦聯(lián)產(chǎn)生使人失望的與參比血清的反應(yīng)作用，其可能是由于抗原的固定不足。商業(yè)上可獲得的苯酚提取的LPS，完整的或去毒的(即脂質(zhì)A的裂解)(來自腸炎沙門氏菌)，當(dāng)在氧化作用以后被固定時產(chǎn)生低應(yīng)答，即分別為187RU和167RU。然而，必須注意到，除不良耦聯(lián)之外，氧化作用還可以破壞-部分抗原結(jié)構(gòu)，其可以產(chǎn)生不良的血清特征應(yīng)答。通過Se LPS的單糖分析研究了氧化程度(表10)。該分析揭示了，KDO、Hep以及GlcNAc(其是核心區(qū)而不是PS部分中的重復(fù)抗原單元的成分)的相對量和非氧化Se LPS相比明顯減少。重要地，在所施加的溫和氧化條件下，PS的單糖殘基部分，以及這樣的抗原結(jié)構(gòu)，明顯地保持完全。
表15.固定以后的生物傳感器應(yīng)答和流經(jīng)芯片表面的參比抗血清的應(yīng)答，其中芯片表面是在有15％(m/m)豬Hb存在的情況下用氧化和非氧化的Se或St LPS加以制備。
a試驗(yàn)了相對于指定O抗原的抗血清。
表16.固定以后的生物傳感器應(yīng)答和流經(jīng)芯片表面的參比抗血清的應(yīng)答，其中芯片表面是在有7％(m/m)的指定蛋白質(zhì)存在的情況下用氧化St LPS(批料St2003.1)加以制備。
a固定水平 bBSA被加入氧化和脫鹽的LPS； c對于進(jìn)一步參比血清分析來說，LPS的固定被認(rèn)為太低。
為了優(yōu)化LPS的結(jié)合，并因此改善從血清檢測結(jié)合抗體，然后在有蛋白質(zhì)存在的情況下氧化LPS以便通過蛋白質(zhì)胺和LPS的醛官能團(tuán)之間的希夫堿反應(yīng)可以形成蛋白質(zhì)-LPS復(fù)合物。確實(shí)，和苯酚提取的和離子交換色譜法純化的Se LPS(208RU)相比，商業(yè)上可獲得的TCA提取的Se LPS(包含大量的細(xì)菌蛋白)產(chǎn)生改善的固定(562RU)。
LPS的氧化是必要的，因?yàn)榘茄趸疞PS和蛋白質(zhì)的混合物顯示出相對較高的固定水平但無價值的特異性應(yīng)答(表15)。此外，僅在LPS氧化以前加入蛋白質(zhì)是有益的，因?yàn)锽SA加入氧化和脫鹽的St LPS會產(chǎn)生可接受的固定水平但沒有預(yù)期的血清特征應(yīng)答(表16)。如所預(yù)期的，以類似的方式，Hb產(chǎn)生相對較高的固定水平但沒有血清特征應(yīng)答(結(jié)果未示出)。
為了改進(jìn)方法，選擇了在恒溫脊椎動物物種之間一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)具有相對高度同源性并存在于血清特征適宜基質(zhì)中的蛋白質(zhì)用于進(jìn)一步研究。為此，比較了雞卵清蛋白、豬血紅蛋白、牛血清白蛋白或豬肌紅蛋白增強(qiáng)(7％，m/m)的St LPS的性能(表16)。血紅蛋白清楚地給出最好的改善的固定水平以及最好的預(yù)期的抗原-抗體反應(yīng)性概括(profile)。尤其是在有Hb存在的情況下，O12、多O A-S以及C-St參比血清產(chǎn)生更好的應(yīng)答。
在加入表17至20中指定水平的BSA、Hb以及Mb的情況下并使用批料Se2005.1、Sg2005.1、Sl2005.1以及St2005.1重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。這一次，如所預(yù)期的，O4和O5結(jié)合于固定的St LPS(表20)?？偨Y(jié)在表16至20中的這些結(jié)果的評估揭示了，當(dāng)同時考慮到每種LPS類型的所有預(yù)期應(yīng)答時，和加入BSA和Mb相比，加入Hb產(chǎn)生了最高特異性應(yīng)答。此外，在大多數(shù)情況下，在Hb作為支撐蛋白質(zhì)的情況下發(fā)生的標(biāo)準(zhǔn)差比加入BSA和Mb的標(biāo)準(zhǔn)差更有利。因此，選擇血紅蛋白用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
觀察到，O多A-S抗血清可能包含低抗血清群C1和C2效價，因?yàn)樵谠囼?yàn)固定的Sg LPS(表18)和Sl LPS(表19)的情況下，發(fā)現(xiàn)相對較低的應(yīng)答。
表17.固定以后的生物傳感器在應(yīng)答單位(RU)中應(yīng)答并且應(yīng)答流經(jīng)芯片表面的參比抗血清，其中芯片表面是用在有15％(m/m)的指定蛋白質(zhì)存在的情況下氧化的Se LPS加以制備。相對于也列出的C-SPF應(yīng)答對數(shù)值進(jìn)行校正。標(biāo)準(zhǔn)差表示在括號中(N＝5，除了雞和豬血清N＝4)。
a固定的水平 表18.固定以后的生物傳感器在應(yīng)答單位(RU)中應(yīng)答和應(yīng)答流經(jīng)芯片表面的參比抗血清，其中芯片表面是用在有50％(m/m)的指定蛋白質(zhì)存在的情況下氧化的Sg LPS加以制備。相對于也列出的C-SPF應(yīng)答對數(shù)值進(jìn)行校正。標(biāo)準(zhǔn)差表示在括號中(N＝5，除了雞和豬血清N＝4)。
a固定的水平 表19.固定以后的生物傳感器在應(yīng)答單位(RU)中應(yīng)答和應(yīng)答流經(jīng)芯片表面的參比抗血清，其中芯片表面是用在有50％(m/m)的指定蛋白質(zhì)存在的情況下氧化的SI LPS加以制備。相對于也列出的C-SPF應(yīng)答對數(shù)值進(jìn)行校正。標(biāo)準(zhǔn)差表示在括號中(N＝5，除了雞和豬血清N＝4)。
a固定的水平 表20.固定以后的生物傳感器在應(yīng)答單位(RU)中應(yīng)答和應(yīng)答流經(jīng)芯片表面的參比抗血清，其中芯片表面是用在有15％(m/m)的指定蛋白質(zhì)存在的情況下氧化的St LPS加以制備。相對于也列出的C-SPF應(yīng)答對數(shù)值進(jìn)行校正。標(biāo)準(zhǔn)差表示在括號中(N＝5，除了雞和豬血清N＝4)。
a固定的水平 固定水平和凝集血清與腸炎沙門氏菌LPS(批料Se2003.1)、黃金海岸沙門氏菌(批料Sg2003.2)、利文斯通沙門氏菌(批料Sl2003.1)、鼠傷寒沙門氏菌(批料St2003.1)以及火雞沙門氏菌(批料Sm2003.1)的預(yù)期反應(yīng)性揭示了和氧化以前加入的Hb相對量的相關(guān)性(參見例如圖3)。還發(fā)現(xiàn)，對于沙門氏菌血清變型特異性LPS類型，最佳Hb濃度也依賴于生產(chǎn)批料。
在預(yù)期抗原全貌的最大應(yīng)答的指導(dǎo)下并利用一組標(biāo)準(zhǔn)和參比對照血清以及在來自禽類SPF參比血清的低應(yīng)答的指導(dǎo)下，對每種類型和對LPS的每個批料確定了最佳Hb濃度(表21)。在本文中，氧化的、包含血紅蛋白的LPS制劑被進(jìn)一步稱作LPSox-Hb制劑。
應(yīng)當(dāng)注意到，在任何實(shí)驗(yàn)中，固定水平并不與血清特征應(yīng)答有關(guān)而是與加入的Hb量有關(guān)。
表21.血紅蛋白和LPS濃度對來源于腸炎沙門氏菌(Se)和鼠傷寒沙門氏菌(St)的LPS的最終固定水平的影響。
a相對于LPS的Hb濃度 b在分開的傳感器通道上制備。
研究了，分別在有10％(m/m)或15％(m/m)Hb(相對于LPS)存在的情況下，氧化以前稀釋Se LPS和St LPS的影響(表21)。這些結(jié)果并沒有清楚地揭示出LPS濃度和耦聯(lián)水平之間的相關(guān)性。
表22.LPSox-Hb的固定水平和O抗原抗血清以及禽類對照血清的血清特征應(yīng)答之間的關(guān)系。所預(yù)期的血清特征應(yīng)答的場(fields)涂有綠色并且在場內(nèi)的數(shù)值被下劃線。對照血清被稀釋在HBS-EP中，其包含0.5M氯化鈉和0.5％(m/v)羧甲基化葡聚糖。
LPS穩(wěn)定性和固定的耐久性 試驗(yàn)了LPS固定和參比血清的特異性應(yīng)答的再現(xiàn)性和重復(fù)性。在有相應(yīng)的最佳Hb濃度存在的情況下，對Se、Sg、Sl以及St LPS制劑進(jìn)行氧化，脫鹽，然后儲存在避光的4℃溶液中。在相同的條件下，但考慮到針對在生物傳感器表面上固定分子所一般觀察到的變化性，經(jīng)過兩個月的儲存，氧化LPS的固定水平在Sl(5％RSD)和St(8％RSD)批料的情況下是類似的或在Se(13％RSD)和Sg(8％RSD)批料的情況下傾向于增加(表23至表26)。還在制得的生物傳感器芯片上探測了參比血清的應(yīng)答。對這些結(jié)果的檢查并沒有揭示固定水平和特異性應(yīng)答之間的相關(guān)性。例如，Se LPS和Sg LPS的固定水平可以傾向于隨時間增加；這種增加并不反映在血清抗體結(jié)合于固定抗原的應(yīng)答中。相對標(biāo)準(zhǔn)差在12％和38％之間變化。當(dāng)考慮最初的3個測量日(第0天、第7或10天、以及第14或17天)時，差異從3.5％到23％大大地降低(結(jié)果未示出)。表27至30總結(jié)了在12個月內(nèi)該方法在若干月的重復(fù)性。在每個分析時點(diǎn)，對Hb增強(qiáng)的LPS的新鮮等分試樣進(jìn)行氧化、固定以及分析，因此反映了若干步驟的變化性的總和。
表23.凝集和參比抗血清對在第0天制備并儲存于5-8℃的LPSox-Hb Se2003.1的應(yīng)答。固定LPS制劑并在指定日期氧化以后進(jìn)行試驗(yàn)。
表24.凝集和參比抗血清對在第0天制備并儲存于5-8℃的LPSox-Hb Sg2003.2的應(yīng)答。固定LPS制劑并在指定日期氧化以后進(jìn)行試驗(yàn)。
表25.凝集和參比抗血清對在第0天制備并儲存于5-8℃的LPSox-Hb Sl2003.1的應(yīng)答。固定LPS制劑并在指定日期氧化以后進(jìn)行試驗(yàn)。
表26.凝集和參比抗血清對在第0天制備并儲存于5-8℃的LPSox-Hb St2003.1的應(yīng)答。固定LPS制劑并在指定日期氧化以后進(jìn)行試驗(yàn)。
表27.在指定時點(diǎn)(以月為單位)新鮮氧化的Se LPS(批料Se2003.1)的應(yīng)答。從細(xì)菌細(xì)胞分離LPS，用15％(m/m)Hb增強(qiáng)，干燥然后儲存于4-7℃，直到氧化、固定和分析的日期。
a血清被稀釋1∶50(v/v) b血清被稀釋1∶100(v/v) c按照另一容積比LPS被稀釋 表28.在指定時點(diǎn)(以月為單位)新鮮氧化的Sg LPS(批料Sg2003.2)的應(yīng)答。從細(xì)菌細(xì)胞分離LPS，用50％(m/m)Hb增強(qiáng)，干燥然后儲存于4-7℃，直到氧化、固定和分析的日期。
表29.在指定時點(diǎn)(以月為單位)新鮮氧化的Sl LPS(批料Sl2003.1)的應(yīng)答。從細(xì)菌細(xì)胞分離LPS，用50％(m/m)Hb增強(qiáng)，干燥然后儲存于4-7℃，直到氧化、固定和分析的日期。
表30.在指定時點(diǎn)(以月為單位)新鮮氧化的St LPS(批料St2003.1)的應(yīng)答。從細(xì)菌細(xì)胞分離LPS，用15％(m/m)Hb增強(qiáng)，干燥然后儲存于4-7℃，直到氧化、固定和分析的日期。
a血清被稀釋1∶100(v/v)； b在氧化作用以后，包含LPS的溶液被稀釋兩次而不是一次。
實(shí)施例2 引言 用于檢測卵黃抗體的SPR生物傳感器，其中卵黃抗體反映腸炎沙門氏菌感染[AAB4] 沙門氏菌是人類的細(xì)菌性胃腸炎的主要原因之一(Fischer，2004；van Duynhoven et al.，2005)。在荷蘭，在1994-1998之間，腸炎沙門氏菌血清變型(S.e.)是最經(jīng)常被分離的血清變型(Pelt et al.，1999)。在此血清變型內(nèi)，卵和卵產(chǎn)物是最重要的感染源。盡管采取的若干控制措施，但每年仍然有大約9％的荷蘭產(chǎn)卵期母雞群受到感染。因?yàn)槁盐廴居猩抽T氏菌仍然是對公眾健康的威脅，所以重要的是，通過適當(dāng)?shù)谋O(jiān)視計劃盡快地檢測母雞群的感染。
目前荷蘭在產(chǎn)卵期長成母雞方面的監(jiān)測系統(tǒng)是基于血清特征(Bokkers，2002)。目的是降低S.e.和鼠傷寒沙門氏菌在產(chǎn)卵雞部分的患病率。然而，采樣僅進(jìn)行兩次在產(chǎn)卵期以前和在產(chǎn)卵期結(jié)束時。因此，目前的監(jiān)視計劃不能在產(chǎn)卵期檢測所有的群體，并且農(nóng)場主不能“保證”它們的產(chǎn)品來自沒有沙門氏菌的產(chǎn)卵期母雞。
因此，應(yīng)當(dāng)改進(jìn)監(jiān)視計劃。作為目前血清特征的替換方法，可以試驗(yàn)卵的抗體。蛋采樣具有其可以在蛋包裝工廠進(jìn)行，以較高的采樣頻率并且具有較大的樣本量的優(yōu)點(diǎn)。
以前已開發(fā)并使用了檢測卵中抗體的試驗(yàn)。現(xiàn)有的試驗(yàn)經(jīng)常是基于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，其中利用沙門氏菌spp.的不同(組合)的抗原成分(參見例如，Refs.Gast et al，2000和1997；Skov et al，2002；Holt et al，2000；Desmidt et al.，1996；Sachesenweger et al.，1994；Van Ziiderveld et al.，1992)。最近，已認(rèn)識到生物傳感器可能適用于檢測體液應(yīng)答(Bergwerff and van Knapen，2006，已接受出版；Bergwerff and van Knapen，2003；Jongerius-Gertemaker，2002；Pyrohova et al.，2002；Vetcha et al.，2002；Li et al.，2002；Liu et al.，2001；Uttenthaler et al.，1998)。生物傳感器包括“自動檢測”分析物的可重復(fù)使用的固定生物向心配合體，以及物理傳感器，其將這種現(xiàn)象轉(zhuǎn)換成電子信號(Jongerius-Gortemaker et al.，2002)。生物傳感器的應(yīng)用使得有可能進(jìn)行高通量分析，并且在一次試驗(yàn)中檢測一類傳染病介質(zhì)(或相對于這些介質(zhì)的抗體)的多個血清變型或血清群。這使得有可能改善監(jiān)視計劃，因?yàn)樵诋a(chǎn)卵期可以以更高頻率試驗(yàn)更多的樣品。
本實(shí)施例評估了表面等離子體共振(SPR)生物傳感器(biacore3000)抗體檢測試驗(yàn)(在卵黃中進(jìn)行，并基于腸炎沙門氏菌血清變型的脂多糖(LPS))的敏感性、特異性以及鑒別能力，并通過產(chǎn)生和分析接收機(jī)工作特性(ROC)曲線對這些結(jié)果和那些用基于g，m鞭毛蛋白的商用ELISA試驗(yàn)試劑盒和基于LPS的商用ELISA試驗(yàn)試劑盒(用于檢測卵抗體)所獲得的結(jié)果進(jìn)行了比較。
2.材料和方法 2.1SPR生物傳感器方法 我們采用了血清抗體的表面等離子體共振(biacore 3000，制造商是Biacore AB，Uppsala，瑞典)檢測方法，其中血清抗體是相對于腸炎沙門氏菌并使用了如由Bergwerff等(在制備中)開發(fā)的LPS抗原(針對卵黃)。在樣品制備中對本方法進(jìn)行第一次調(diào)節(jié)。在分離卵黃和卵白以后，將卵黃以1∶5(v/v)稀釋在10mM HEPES緩沖液(pH 7.4)中，該緩沖液包含3mM EDTA、0.15M氫氯化鈉、0.005％(v/v)表面活性劑P20(Biacore AB，瑞典)、另外的0.85M氯化鈉(Merck，Darmstadt，德國)、1％(m/v)羧甲基化葡聚糖(Fluka Chemie，Buchs，德國)以及0.05％(v/v)吐溫80(Merck，德國)。與玻璃珠混合，在15,000g和環(huán)境溫度下離心25分鐘，然后用0.45μm過濾器(Schleicher & Schuell，Dassel，德國)過濾上清液。
第二次調(diào)節(jié)是清洗傳感器芯片。在分析每個系列的15個卵黃樣品以后，注射包含0.5％(w/v)十二烷基硫酸鈉(Biacore AB，瑞典)的溶劑，以除去沉積的卵黃成分。
2.2參比血清和卵黃 在各種試驗(yàn)中血清用作參比，這是由于不能利用嚴(yán)格定義的參比卵黃的樣品原液。從動物健康服務(wù)有限公司(Deventer，荷蘭)獲得凍干的、已知成分SPF和參比血清，其源自感染有a)腸炎沙門氏菌、b)鼠傷寒沙門氏菌、c)嬰兒沙門氏菌、或d)雞瘟沙門氏菌的雞。這些血清制備自混合的血清。在使用以前，將凍干的血清在1ml Milli-Q中重組。另外，使用了單克隆小鼠抗沙門氏菌抗體抗組B、組C、組D以及組E(Sifin，Berlin，德國)。
內(nèi)部對照卵黃用來確定生物傳感器測定的分析敏感性和重復(fù)性。它們包括沒有特異性病原體(SPF)的卵黃樣品(動物健康服務(wù)有限公司，荷蘭)以及高度免疫應(yīng)答的排卵前卵泡樣品，其源自實(shí)驗(yàn)2(參見下面的2.4節(jié))。
2.3ELISA 利用夾層酶免疫測定技術(shù)對樣品進(jìn)行測定。使用了兩種商業(yè)上可獲得的S.e.抗體檢測試劑盒Flockscreen S.e.Guildhay(Guildford，英國)和FlockChek S.e.IDEXX(Westbrook，Maine，美國)。按照公司的操作步驟對樣品進(jìn)行分析。
Guildhay S.e.間接ELISA是基于LPS作為抗原。微量滴定板的孔涂布以LPS，并只(in mono)加入1∶500稀釋度的樣品。試驗(yàn)結(jié)果表示為S/P比率，其是按照以下公式 S/P＝(樣品光密度-陰性對照光密度)/(陽性對照光密度-陰性對照光密度) (1) 利用以下準(zhǔn)則對S/P比率進(jìn)行說明卵黃S/P≤0.08＝免疫陰性；0.08＜S/P＜0.25＝免疫可疑的；S/P≥0.25＝免疫陽性。
IDEXX S.e.競爭性ELISA是基于g，m鞭毛抗原。微量滴定板的孔涂布以g，m鞭毛抗原，并單份加入1∶2稀釋度的樣品。結(jié)果表示為S/N比率，具體如下 S/N＝樣品光密度/陰性對照光密度(2) 利用以下準(zhǔn)則對S/N比率進(jìn)行說明卵黃S/N≥0.75＝免疫陰性；0.59＜S/N＜0.75＝免疫可疑的；S/N≤0.59＝免疫陽性。
2.4實(shí)驗(yàn) 在本研究中使用的卵樣品源自兩個感染實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)1.將15只一周齡產(chǎn)卵期母雞(Isa Brown)安放在負(fù)壓高效率特殊空氣濾過裝置(HEPA)隔離間中，該隔離間具有1.3m3的容積并裝備有1.2m2的金屬絲地板，并施加12小時光照和12小時黑暗的光周期節(jié)律。以大約30m3/小時的速率對隔離間進(jìn)行通風(fēng)。在生長期，從底層不能培養(yǎng)沙門氏菌。不限量地向雞提供不含藥的飼料和水。在荷蘭動物健康服務(wù)有限公司的動物實(shí)驗(yàn)委員會認(rèn)可以后并按照荷蘭實(shí)驗(yàn)動物法規(guī)對它們進(jìn)行安放、管理和處理。在實(shí)驗(yàn)的第20周利用腸炎沙門氏菌CL344(動物健康服務(wù)有限公司，Deventer，荷蘭)對所有母雞口服接種一次1×108CFU/只。在接種前后，每天收集蛋，但不單獨(dú)標(biāo)記并且不注明日期。蛋儲存在環(huán)境溫度下4周，其后儲存于4℃。在第22周結(jié)束實(shí)驗(yàn)并產(chǎn)生147個“陽性”和71個“陰性”樣品。
實(shí)驗(yàn)2.Van Eerden等(2005，在準(zhǔn)備中)詳細(xì)描述了本實(shí)驗(yàn)。簡言之，將128只15周齡的產(chǎn)卵期母雞(Lohmann，16只，重復(fù)8組)分成兩組(每組8只母雞)并單獨(dú)安放在相同房間內(nèi)的兩個人工氣候試驗(yàn)室(用作隔離間)，其中光周期節(jié)律為9小時光照和15小時黑暗。在直到接種的生長期間，沒有從糞便培養(yǎng)沙門氏菌。不限量地向它們提供不含藥的飼料和水。按照Wageningen大學(xué)的動物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)并得到倫理委員會的認(rèn)可(參考號2003219)。在實(shí)驗(yàn)開始一周后，64只母雞(16只，重復(fù)4組)均口服接種1×108CFU耐萘啶酸的S.e.(ASG，Lelystad，荷蘭)一次。其它64只母雞被看作是未感染對照。在接種后的第21天和第28天收集蛋。從一個人工氣候試驗(yàn)室收集蛋十二次，然后在敲碎蛋殼以后加以混合(參見以下的2.5節(jié))。4個混合的蛋樣品取自“未感染的”人工氣候試驗(yàn)室。除收集混合的蛋樣品以外，還從10只單個的母雞獲得10個蛋樣品，其中7個是未感染的?；旌下腰S和卵白并儲存于-20℃。在接種后4周結(jié)束實(shí)驗(yàn)。然后從8只未感染和5只感染的個體母雞采集排卵前卵泡。
2.5蛋樣品的制備 以下述方式對來自實(shí)驗(yàn)1的蛋進(jìn)行準(zhǔn)備。為了方便無菌制備，用70％(v/v)含水乙醇對蛋殼進(jìn)行消毒。其后，將蛋敲碎，并將內(nèi)含物收集在無菌培養(yǎng)皿中。利用無菌一次性注射器收集1ml卵黃并分成每份為200μl的若干部分。用適用于SPR生物傳感器或ELISA分析的緩沖液稀釋每個部分，然后儲存于-20℃。
同樣，將獲自實(shí)驗(yàn)2的混合的卵黃和卵白以及排卵前卵泡分成若干部分，稀釋然后儲存于-20℃。
2.6SPR生物傳感器方法的評估 2.6.1分析敏感度和特異性 為了建立測定的檢測限度，用SPR生物傳感器分析(重復(fù)三次)了8次1∶2(v/v)連續(xù)稀釋的高度免疫應(yīng)答的卵黃樣品和SPF陰性對照樣品。利用SPSS(用于視窗的SPSS，標(biāo)準(zhǔn)版，1999)進(jìn)行了方差分析(ANOVA)，以評估在注射連續(xù)稀釋對照樣品以后獲得的SPR生物傳感器應(yīng)答的差異。
參比血清用來強(qiáng)化(spike)SPF卵黃以試驗(yàn)SPR生物傳感器測定的特異性。為此，用1)腸炎沙門氏菌-(血清群D)反應(yīng)性抗血清、2)嬰兒沙門氏菌-(血清群C)反應(yīng)性抗血清、3)雞瘟沙門氏菌-(血清群D)反應(yīng)性抗血清、以及4)鼠傷寒沙門氏菌-(血清群B)反應(yīng)性抗血清來強(qiáng)化卵黃。按它們的容積計算，以1∶100(1、2以及3)或以1∶50(4)的比率稀釋這些樣品。通過用1∶100(v/v)稀釋的小鼠單克隆抗體(和沙門氏菌血清群B、C、D以及E反應(yīng))強(qiáng)化SPF卵黃，來進(jìn)行進(jìn)一步的特異性試驗(yàn)。
2.6.2重復(fù)性 通過一天兩次和連續(xù)三天(以三倍體(in triplo))試驗(yàn)高度免疫應(yīng)答卵黃樣品和SPF陰性對照卵黃樣品，評估了SPR生物傳感器測定的重復(fù)性。用Excel 2000(微軟軟件包)計算了平均值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)以及百分比變異系數(shù)(％CV)值。
2.6.3ROC曲線 利用來自SPR生物傳感器和ELISA分析的結(jié)果，產(chǎn)生了接收機(jī)工作特性(ROC)曲線，以估計每種測定的試驗(yàn)性能(Zweig andCampbell，1993)。利用SPSS，并根據(jù)綜合的曲線下面積(AUC)、相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)以及真正的AUC為0.5的零假設(shè)的概率，計算了每種測定的總準(zhǔn)確性。通過使用非參數(shù)ROC分析(Metz et al.，1998)，相對于S.e.的抗體的SPR生物傳感器測定檢測的準(zhǔn)確性與兩種ELISA的準(zhǔn)確性進(jìn)行了比較。金標(biāo)準(zhǔn)(目前最佳標(biāo)準(zhǔn)(goldstandard))是實(shí)驗(yàn)組的感染狀況。
2.6.4診斷敏感度和特異性 在ROC曲線中，真的正速率(敏感度)作成假的正速率(100特異性)對于參數(shù)的不同截留點(diǎn)的函數(shù)圖。在ROC曲線上的每個點(diǎn)代表敏感度/特異性對，其相當(dāng)于特定的判定閾值。因此，利用SPSS，計算了SPR生物傳感器測定和兩種ELISA在最高診斷特異性處的最大診斷敏感度。對于使用來自實(shí)驗(yàn)1的樣品的SPR生物傳感器試驗(yàn)，還計算了在最高診斷敏感度處的最大診斷特異性以及最佳組合的診斷敏感度和特異性。
3.結(jié)果 3.1分析敏感度和特異性 高度免疫應(yīng)答的卵黃樣品的1∶600(v/v)稀釋度是(在50RU時)所試驗(yàn)的最高稀釋度，其明顯地不同于(P＜0.001)陰性對照。
用腸炎沙門氏菌-(1∶100，145RU)陽性血清、雞瘟沙門氏菌-(1∶100，1012RU)陽性血清或鼠傷寒沙門氏菌-(1∶50，58RU)陽性血清強(qiáng)化的SPF卵黃的試驗(yàn)信號是高于52RU的優(yōu)化截留值(參見以下的3.4.1節(jié))并認(rèn)為是陽性的，如同用小鼠抗沙門氏菌組D(1∶100，130RU)強(qiáng)化的SPF卵黃被認(rèn)為是陽性的那樣。研究發(fā)現(xiàn)，非強(qiáng)化的SPF卵黃是陰性的，即，平均應(yīng)答為30RU。用嬰兒沙門氏菌-(1∶100，24RU)陽性血清和小鼠抗血清(相對于沙門氏菌血清群B(1∶100，27RU)、C(1∶100，16RU)、以及E(1∶100，15RU))強(qiáng)化的卵黃也低于截留值。
3.2重復(fù)性 對于高度免疫應(yīng)答的卵黃樣品來說在一天內(nèi)的變異系數(shù)為1％，而對于陰性樣品則為13％。在三天期間，對于陽性樣品來說兩天間的變異系數(shù)為2％，而對于陽性樣品則為17％。
3.3閾值確定 3.3.1ROC分析 對實(shí)驗(yàn)1的分別來自未感染和感染的雞的71個和135個卵黃樣品的測定結(jié)果進(jìn)行了ROC分析(對來自感染的雞的12個樣品并沒有進(jìn)行所有試驗(yàn))。綜合的ROC曲線下面積，對于SPR生物傳感器測定來說，是0.892(SE 0.024，P＜0.001)；對于IDEXX ELISA來說，是0.432(SE 0.039，P＝0.103)；以及對于Guildhay ELISA來說，是0.430(SE 0.039，P＝0.096)(表31)。ROC曲線描繪在圖4中。SPR生物傳感器測定的綜合的面積(AUC)，因而總準(zhǔn)確性，明顯大于IDEXX(Z＝11.5，P＜0.0O 1)和Guildhay ELISA(Z＝10.5，P＜0.001)的綜合的面積。
還對實(shí)驗(yàn)2的4個混合的卵白和卵黃樣品和15個卵黃樣品(來自未感染的雞)、以及8個混合的卵白和卵黃樣品和8個卵黃樣品(來自感染的雞)進(jìn)行了ROC分析。綜合的ROC曲線下面積，對于SPR生物傳感器測定來說，是0.811(SE 0.082，P＝0.002)；對于IDEXX ELISA來說，是0.615(SE 0.098，P＝0.098)；以及對于Guildhay ELISA來說，是0.870(SE 0.064，P＜0.001)(表32和圖5)。SPR生物傳感器測定的AUC明顯(Z＝1.9，P＝0.055)大于IDEXXELISA的AUC，但并不是不同于Guildhay ELISA的AUC(Z＝-1.0，P＝0.322)。
3.4性能評價 3.4.1診斷敏感度和特異性評價 就獲自實(shí)驗(yàn)1的樣品的結(jié)果而論，來自未感染群體的樣品給出6至50RU的生物傳感器應(yīng)答。來自感染群體的樣品的應(yīng)答為11至3584RU。在52RU的截留值，135個樣品中的24個樣品不得不被認(rèn)為是免疫陰性的。
對于SPR生物傳感器測定試驗(yàn)來說，52RU的截留值產(chǎn)生100％的最高可能的診斷特異性估計(具有95％準(zhǔn)確置信區(qū)間(CI)95-100％)以及82％的診斷敏感度估計(95％CI76-98％)。10RU的截留值產(chǎn)生100％的最高可能的診斷敏感度估計(95％準(zhǔn)確CI97-100％)以及1％的診斷特異性估計(95％CI0-4％)。42RU的截留值產(chǎn)生最佳組合的診斷敏感度和診斷特異性分別為84(95％CI77-90％)和99％(95％CI96-100％)。
當(dāng)截止值為OD550nm 0.11時，IDEXX ELISA具有100％的診斷特異性和1％的診斷敏感度(95％CI0-3％)。來自未感染群體的樣品的OD550nm為0.174至1.377，即，超過0.11的截留值。在陽性群體中，在選定的截留值，即相應(yīng)的OD550nm為0.042至1.572，147個樣品中的145個樣品不得不被認(rèn)為是免疫陰性的。當(dāng)截留值為OD650nm 0.12時，Guildhay ELISA具有100％的診斷特異性和16％的診斷敏感度(95％CI10-22％)。沒有來自未感染群體的樣品顯示出超過0.12(0.051至0.093)的OD650nm值。在陽性群體的情況下，147個樣品中的124個樣品必須被認(rèn)為是免疫陰性的。這些樣品的OD650nm為0.048至1.471。
在實(shí)驗(yàn)2的情況下，對于SPR生物傳感器測定試驗(yàn)，542RU的截留值產(chǎn)生100％的最高可能的診斷特異性估計(95％準(zhǔn)確CI82-100％)以及63％的診斷敏感度估計(95％CI39-86％)。來自未感染群體的樣品具有101-448的RU值。感染群體的數(shù)值為117-3012，并且16個樣品中的6個樣品具有陰性試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)截留值為OD550nm 0.49時，IDEXX ELISA具有100％的診斷特異性和19％的診斷敏感度(95％CI0-38％)。沒有來自未感染群體的樣品具有小于0.49的OD550nm值。數(shù)值范圍是0.537-1.621。在陽性群體中，在選定的截留值，16個樣品中的13個樣品具有陰性試驗(yàn)結(jié)果。數(shù)值范圍是0.134-1.630。當(dāng)截留值為OD650nm 0.14時，Guildhay ELISA具有100％的診斷特異性和67％的診斷敏感度(95％CI43-91％)。沒有來自未感染群體的樣品具有大于0.14的OD650nm值。數(shù)值范圍是0.072-0.140。在陽性群體中，15個樣品中的5個樣品具有陰性試驗(yàn)結(jié)果(不能對一個樣品進(jìn)行試驗(yàn))。數(shù)值范圍是0.086-2.144。
4.討論 本研究的目的是量化SPR生物傳感器用于檢測卵中S.e.抗體的試驗(yàn)特性。結(jié)果表明，對于來自實(shí)驗(yàn)1的樣品，SPR生物傳感器測定明顯好于兩種商業(yè)上可獲得的ELISA。SPR生物傳感器的組合的最佳診斷敏感度和診斷特異性分別為84％(77-90％)和99％(96-100％)。利用此試板，基于g，m鞭毛蛋白的IDEXX ELISA和基于LPS的Guildhay ELISA均不能在更高組合診斷敏感度和特異性的情況下檢測S.e.感染。本研究表明，通過卵中抗體檢測，SPR生物傳感器測定可以是用于監(jiān)測產(chǎn)蛋母雞群中腸炎沙門氏菌血清變型感染的新的和有力的工具。
SPR生物傳感器測定提供了以快速和可靠方式檢測感染的可能性。試驗(yàn)的高質(zhì)量和蛋收集的技術(shù)和動物安寧的優(yōu)點(diǎn)是探索其用于篩查群體的良好原因。此外，所使用的來自Biacore的SPR生物傳感器的構(gòu)造使得可以在相同傳感器芯片上的單個傳感器通道或分開的傳感器通道中用一次試驗(yàn)來同時檢測多個沙門氏菌血清變型的抗體(結(jié)果未示出)。這可能是重要的，因?yàn)楸娝苤?，血清變型隨國家和時間而不同(參見例如Refs.Guerin et al.，2005；vanDuijnkeren et al.，2002)。
利用來自兩個實(shí)驗(yàn)的卵進(jìn)行了試驗(yàn)評價，其中所述實(shí)驗(yàn)并不是特別為了此實(shí)驗(yàn)評價而進(jìn)行，所以可能會影響試驗(yàn)性能。大概在暴露的雞中正發(fā)展體液應(yīng)答的時間點(diǎn)收集“陽性”卵。這些“早熟”卵被分析，因而它們的假陰性結(jié)果會干擾測定的評價。如果可以排除卵直到感染后兩周，則可以改善每種試驗(yàn)(ELISA或SPR生物傳感器)的診斷敏感度。
在血清中的抗體檢測比在卵中的抗體檢測更敏感，因?yàn)樵诼阎谐霈F(xiàn)抗體之前一周就在血清中出現(xiàn)抗體(Gast and Beard，1991；Sunwoo et al.，1996；Skov et al.，2002)。然而，通過采用更多樣品(當(dāng)使用蛋時其更容易)，可以改善卵中抗體試驗(yàn)的群體敏感度。
生物傳感器性能(AUC 0.892)和兩種商用ELISA(IDEXX AUC0.432、Guildhay AUC 0.430)的性能進(jìn)行了比較。據(jù)我們所知，針對卵，IDEXX ELISA并未獲得證實(shí)，但存在關(guān)于試驗(yàn)性能(與其它試驗(yàn)相比)的定量數(shù)據(jù)Van Zijderveld等(1992)評估了用于在實(shí)驗(yàn)感染的雞中診斷S.e.感染的四種不同的ELISA。他們報道了，對于來自感染S.e.后13天和40天之間所下蛋的127個卵黃具有100％的特異性和95％的敏感度。在我們的評估中，IDEXX試驗(yàn)不如1992年的評估好。一種解釋可能是不同的樣品選擇，因?yàn)槲覀兊臉悠吩醋愿腥緦?shí)驗(yàn)，其在接種后2和4周中止，因而具有較少的時間來發(fā)展體液應(yīng)答。
已經(jīng)知道，在沙門氏菌血清變型B和D的成員之間共有的O抗原會限制利用脂多糖抗原檢測S.e.的特異性(de Vries et al.，1998；Baay and Huis in’t Veld，1993；Hassan et al.，1990)。這通過我們的結(jié)果獲得證實(shí)測定不能區(qū)分腸炎沙門氏菌血清變型、雞沙門氏菌血清變型以及鼠傷寒沙門氏菌血清變型(共有O9和O12)的感染。因?yàn)槿N(鼠傷寒沙門氏菌加上腸炎沙門氏菌)動物源性血清變型占由國家參比實(shí)驗(yàn)室(在1998-2003年之間參與Enter-net監(jiān)視網(wǎng)絡(luò))鑒定的隔離群的80％(Fischer et al.，2004)，所以對人群來說此發(fā)現(xiàn)具有有限的臨床適用性。該測定確實(shí)可以區(qū)分用小鼠抗沙門氏菌組B(1∶100，27RU)的D(1∶100，130RU)強(qiáng)化的SPF卵黃。這并不是意外的，因?yàn)槟c炎沙門氏菌的LPS具有O1、O9以及O12作為菌體抗原，同時型特異性試驗(yàn)試劑包含以下單克隆抗體抗沙門氏菌組B抗O4、O5、O27；抗沙門氏菌組D抗O9。
來自實(shí)驗(yàn)2的截留值比來自實(shí)驗(yàn)1的截留值高得多，可能因?yàn)槲覀儤悠返囊徊糠职寻缀吐腰S而不僅僅是卵黃。
對于不同的用途，不同的截留值可能是最佳的。在確定截留值時，相對成本或不希望出現(xiàn)誤差(假陽性/假陰性分類)以及感染和未感染母雞的預(yù)期相對比例是重要的參數(shù)，其中截留值會影響測定的診斷值。我們建議使假陽性結(jié)果的數(shù)目最小化的截留值，并論證了如果測定用于產(chǎn)蛋母雞種群的監(jiān)視計劃則必須經(jīng)常采樣和試驗(yàn)，從而產(chǎn)生S.e.的相對較低的流行率。
SPR生物傳感器技術(shù)已成功檢測卵抗體以確定雞中的實(shí)驗(yàn)感染。在未來篩查計劃中，SPR生物傳感器可以同時檢測不同的分析物。
表31.通過SPR生物傳感器、IDEXX ELISA和Guildhay ELISA的源自實(shí)驗(yàn)1的樣品的結(jié)果ROC分析。
a費(fèi)希爾精確檢驗(yàn) 表32.通過SPR生物傳感器、IDEXX ELISA和Guildhay ELISA的源自實(shí)驗(yàn)2的樣品的結(jié)果ROC分析。
a費(fèi)希爾精確檢驗(yàn) 實(shí)施例3 引言 利用涂布LPS的小珠并通過監(jiān)測噬菌體感染來直接檢測彎曲桿菌spp.。
在發(fā)達(dá)國家，彎曲桿菌是最常見的食物攜帶的病原體，其引起胃腸炎，特征在于水樣腹瀉和/或血性腹瀉。彎曲桿菌與吉-巴綜合征(GBS)、賴特爾綜合征和溶血性尿毒癥綜合征(HUS)以及反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎有關(guān)(FSAI，2002；Lake et al.，2003；Tauxe，2000)。在最近的20年中，在許多發(fā)達(dá)國家，彎曲桿菌的感染速率仍然在增加，或許是由于檢測和報道的改進(jìn)。在美國，每年報道有彎曲桿菌病的2,400,000個病例，其相當(dāng)于大約1％的美國人口(Tauxe，2000)。
野鳥和家畜是彎曲桿菌的貯主并向環(huán)境散發(fā)細(xì)菌。家禽是人類彎曲桿菌感染的重要載體。確實(shí)，分離自雞的菌株也可以分離自患者(Coker，2000)。
流行病學(xué)研究表明，消費(fèi)和處理家禽肉應(yīng)被認(rèn)為是人感染空腸彎曲桿菌或結(jié)腸彎曲桿菌主要危險(FSAI，2002)。在美國、新西蘭以及歐洲的最相符的危險因素是消費(fèi)或接觸生的或半生不熟的家禽，占10％至50％的所有彎曲桿菌病病例(Tauxe，2000)?？漳c彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌以及紅嘴鷗彎曲桿菌相當(dāng)于人彎曲桿菌病的大約90％(Stern and Line，2000)。彎曲桿菌的感染量被認(rèn)為較低，為500-10,000個細(xì)胞(FSAI，2002)。
彎曲桿菌是革蘭氏陰性的、彎曲、S形、或螺旋形桿菌，其在極之一具有一個或兩個鞭毛并且高度能動的(Christensen et al.，2001)。彎曲桿菌在30.5℃和45℃之間生長，最佳溫度為42℃。最佳生長的條件為10％二氧化碳、5-6％氧氣、以及85％氮?dú)?FSAI，2002)。
傳統(tǒng)的用于確定彎曲桿菌的表型方法需要4至5天并且涉及預(yù)富集、接著是從選擇性瓊脂分離以及通過生化試驗(yàn)證實(shí)。由于食物的易腐爛特性以及分析食物所需要的速度，所以需要更快速、敏感以及特異性方法來低成本檢測彎曲桿菌。
Waller和Ogata(2000)、Che等(2001)、Yu等(2001)使用了免疫磁分離法(IMS)步驟以從家禽肉濃縮空腸彎曲桿菌而沒有預(yù)富集細(xì)胞培養(yǎng)步驟。當(dāng)用原子力顯微鏡術(shù)和熒光顯微術(shù)檢測時，這種方式可以在家禽肉中收回104個菌落形成單位(cfu)/g(Yu et al.，2001)。IMS可以潛在地減少彎曲桿菌的預(yù)富集時間并且可以克服來自食物源的抑制劑(如PCR抑制劑)問題(Benoit and Donahue，2003)。因此，IMS的使用可以加速分析物的富集。
本實(shí)施例描述了下游檢測方法，該方法利用彎曲桿菌特異性噬菌體，即，小病毒生物，其附著于或感染活彎曲桿菌細(xì)菌。它們的附著或感染依賴于細(xì)菌生命周期的階段。結(jié)合于或感染彎曲桿菌可以發(fā)生在細(xì)菌的穩(wěn)定期、對數(shù)期或延遲期并且也依賴于噬菌體物種。細(xì)菌的感染通常導(dǎo)致噬菌體的大量拷貝。因此記錄噬菌體的這種增加用作分析儀器以追蹤在最初樣品中彎曲桿菌的存在。
本研究的目的是說明，噬菌體可用作特異的和敏感的分析工具來檢測動物產(chǎn)物(如糞便和(家禽肉))中的彎曲桿菌。
材料和方法 實(shí)驗(yàn)裝置 在勻一化作用以后，例如通過消化(stomachering)來促進(jìn)，IMS將用來從污染的樣品(如肉和糞便)純化和濃縮彎曲桿菌。在第二步驟中，用適當(dāng)?shù)氖删w菌株培養(yǎng)IMS分離的細(xì)菌。利用相同的IMS步驟從細(xì)胞分離物洗去非附著的噬菌體。然后將感染的和/或攜帶噬菌體的IMS固定的彎曲桿菌引入?yún)⒈葟澢鷹U菌(其處于穩(wěn)定期)的新鮮和純的培養(yǎng)物中。該細(xì)胞培養(yǎng)物用作外源宿主以加強(qiáng)噬菌體的增殖。在短期培養(yǎng)以使細(xì)菌達(dá)到它們的對數(shù)期以后，通過離心作用采集噬菌體。用涂布有LPS的熒光珠培養(yǎng)包含噬菌體的上清液。在這里，如在實(shí)施例中所描述的用分離自彎曲桿菌(用作宿主生物)的LPS對小珠進(jìn)行涂布。將以兩種方式對結(jié)合于熒光珠的噬菌體的存在進(jìn)行試驗(yàn)。在加入抗噬菌體抗體(用熒光標(biāo)記加以標(biāo)記)并用上述抗噬菌體抗體培養(yǎng)以后，熒光量將對應(yīng)于噬菌體的濃度并且間接地對應(yīng)于最初樣品中彎曲桿菌的濃度。在一種可替換的方式中，包含熒光標(biāo)記的抗LPS抗體將和噬菌體競爭結(jié)合位點(diǎn)。因此，和沒有彎曲桿菌的樣品相比，記錄到的熒光降低將表明彎曲桿菌陽性樣品。
將針對在不同基質(zhì)(包括來自豬和雞的糞便、皮膚以及肉)中的空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌以及紅嘴鷗彎曲桿菌并按照選擇性和敏感度對試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。緊密相關(guān)生物，如弓形菌物種，將用來試驗(yàn)方法的特異性。
細(xì)菌和病毒株以及培養(yǎng)條件 空腸彎曲桿菌(ATCC 3291)和結(jié)腸彎曲桿菌(ATCC 33559)將購自Microbiologics(St.Cloud，美國)。細(xì)菌將在42℃和微需氧的氣氛下在大豆胰蛋白胨肉湯(TSB)(Oxoid，CM 129，Hampshire，英國)中生長24小時，其中微需氧氣氛是利用氣體包裝(BBL，Becton Dickinson，Sparks，美國)來產(chǎn)生。然后將彎曲桿菌平皿接種在炭-頭孢哌酮-脫氧膽酸瓊脂(mCCDA)(彎曲桿菌無血選擇性瓊脂基[Oxoid，CM 739]，具有CCDA選擇性補(bǔ)充物[Oxoid，SR155]、頭孢哌酮32μg/ml以及兩性霉素B 10μg/ml)上，并在42℃和微需氧氣氛下培養(yǎng)24至48小時。然后將純彎曲桿菌的一個菌落轉(zhuǎn)移到胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)(Oxoid，CM131)并在42℃和微需氧氣氛下培養(yǎng)24至48小時，然后放置在4℃的冷凍箱中直到使用。感染彎曲桿菌的噬菌體NTCC12669、NTCC12670、NTCC12671、NTCC12672、NTCC12673、NTCC12674、NTCC12675、NTCC12676、NTCC12677、NTCC12678、NTCC12679、NTCC12680、NTCC12681、NTCC 12682、NTCC 12683、NTCC 12684是獲自National Type CultureCollection(London，英國)。
樣品制備 在TSB中對儲存在4℃的純彎曲桿菌培養(yǎng)物進(jìn)行傳代培養(yǎng)并在42℃和微需氧氣氛下培養(yǎng)24小時。這是用于噬菌體指數(shù)生長的宿主。
將25克磨細(xì)的雞肉片懸浮于放置在消化袋(stomacherbag)中的225ml的Preston液體培養(yǎng)基中(第二號營養(yǎng)肉湯[Oxoid，CM 67]、5％(v/v)溶解的馬血[Oxoid，SR48]、彎曲桿菌生長補(bǔ)充物[Oxoid，SR232]以及改進(jìn)的Preston彎曲桿菌選擇性補(bǔ)充物[Oxoid，SR204])。按照制造商的指導(dǎo)制備Preston液體培養(yǎng)基。在消化器(stomacher)(Interscience，St.Nom，法國)中充分均化包含樣品的消化袋90秒。然后在42℃和微需氧氣氛下培養(yǎng)整個懸浮液適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時間以使彎曲桿菌可以生長。
免疫磁分離法 在用Preston液體培養(yǎng)基富集以后，將包含樣品的消化袋放入IMS裝置(PathatrixTM，Microscience，Cambridgeshire，英國)的培養(yǎng)罐中。然后按照制造商的指導(dǎo)操作該裝置。簡短地說，將50μl的抗彎曲桿菌磁珠(Microscience)加入樣品，然后在37℃下對其再循環(huán)30分鐘。釋放磁固定小珠，用100ml的預(yù)加熱緩沖蛋白胨水(蛋白胨[Becton Dickinson]10mg/ml、氯化鈉[Merck，Darmstadt，德國]5mg/ml、磷酸氫二鈉二水合物[Merck]4.5mg/ml、磷酸二氫鉀[Merck]1.5mg/ml，調(diào)節(jié)到pH 7.2)洗滌，然后再次接近磁體。除去洗滌溶液，留下200μl懸浮液，用于選擇性生長和噬菌體分析。
噬菌體的檢測 攜帶彎曲桿菌的IMS小珠和少量的細(xì)菌特異性噬菌體接觸。在短期培養(yǎng)以使噬菌體特異性附著于靶細(xì)菌的表面以后，洗滌IMS小珠并采樣，以設(shè)置在最后分析步驟中的參比點(diǎn)。懸浮液的其余部分和新鮮彎曲桿菌物種的懸浮液混合以作為生長噬菌體的宿主。在42℃下培養(yǎng)以后，離心懸浮液然后上清液補(bǔ)充以一定容積的彎曲桿菌LPS涂布的熒光珠。然后在加入熒光標(biāo)記的抗噬菌體抗體或熒光標(biāo)記的抗彎曲桿菌抗體以后，評估了噬菌體的增殖。在培養(yǎng)15分鐘以后，利用例如BioPlex裝置(Bio-Rad)對小珠進(jìn)行分析，以篩查由于特異性結(jié)合反應(yīng)而固定在小珠上的熒光。
實(shí)施例4 引言 利用熒光珠對豬血清和雞的肉汁中的抗沙門氏菌抗體進(jìn)行檢測 微生物包括各種類型的細(xì)菌、霉菌(真菌)、寄生物以及病毒。病原微生物已吸引了公眾(作為污染食物和水的消費(fèi)者)的更多關(guān)注，其中污染食物和水會導(dǎo)致在家庭或社區(qū)內(nèi)流行。因此，媒體和政治家在增加消費(fèi)者認(rèn)識方面已發(fā)揮了他們的作用并且新法規(guī)正在準(zhǔn)備中或已經(jīng)實(shí)施。
關(guān)于病原微生物，特別注意許多動物源性疾病，即，可從動物傳播到人的微生物，這是由于以下原因1)大多數(shù)食物和水傳播的人疾病的特性是動物源性的；2)許多動物源性因子具有它們的通過環(huán)境的傳播途徑；以及3)食物/水和環(huán)境的污染均被(生物)恐怖分子用來在社會中獲得最大影響。
微生物危害可以在任何環(huán)節(jié)進(jìn)入食物鏈?zhǔn)斋@前、生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、零售、家庭儲存或膳食制備。從它們引入飼料或食物，可以出現(xiàn)高度復(fù)雜的環(huán)境，其中微生物可以逃避檢測和滅活。有效的國際銷售系統(tǒng)和消費(fèi)者偏愛的快速變化可以促進(jìn)病原體迅速侵入較大的人群，從而大大地縮短公眾健康機(jī)構(gòu)可獲得的反應(yīng)時間。
當(dāng)局和食物生產(chǎn)商確信，對于環(huán)境、飼料以及食物監(jiān)測來說，需要快速、通用以及選擇性的(診斷)測定，以便適當(dāng)?shù)貙κ澄镦溨械奈廴经h(huán)節(jié)作出反應(yīng)。所采用監(jiān)測技術(shù)的較大部分涉及使用親合力測定技術(shù)，其包括生物傳感器平臺。
[AAB5]原則上，可以以兩種方式檢測微生物的存在直接或間接。在直接測定中，通常用和(亞)種特異性抗原結(jié)構(gòu)和/或株特異性抗原結(jié)構(gòu)起反應(yīng)的抗體來檢測生物本身。免疫化學(xué)分析涉及費(fèi)時的樣品制備以及在選擇性生長培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在寄生物感染的情況下，這是不可能的并且直接檢測涉及樣品的微觀檢查。在間接測定中，通過檢測感染宿主的免疫應(yīng)答的體液產(chǎn)物(免疫球蛋白)或細(xì)胞產(chǎn)物(例如細(xì)胞因子)來提示微生物的存在。在大多數(shù)研究中，定義明確的抗原用來捕獲在任何體液中的宿主免疫球蛋白(血清特征)。于是觀測到的結(jié)合可揭示病原體的侵入性感染的特性。
間接和直接病原體檢測的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)是清楚的i)個體并不總是對感染作出免疫應(yīng)答，即，在低或高免疫應(yīng)答者之間存在差異；ii)體液應(yīng)答會延遲若干天或甚至數(shù)周，從而可能導(dǎo)致未注意到最近的感染；iii)在沒有檢測到致病生物的地方，可以發(fā)現(xiàn)血清抗體，這是因?yàn)樗旧硪驯慌懦饣蛲丝s在某些(未采樣的)組織中；iv)血清特征研究是非?？焖俚牟⑶冶戎苯訖z測更可能實(shí)現(xiàn)高通量操作；以及v)血清或血漿的血清特征分析可以比直接抗原分析(即，經(jīng)典的選擇性細(xì)菌培養(yǎng))更好地預(yù)測種群(flock)或畜群的沙門氏菌感染狀況。
事實(shí)上，血清特征勝過直接的、并且在大多數(shù)情況下不敏感組織寄生蟲的檢測，其僅可以通過組織化學(xué)或消化技術(shù)以及鏡檢術(shù)來實(shí)施。在樣品收集和制備方面也存在明顯差異由于細(xì)菌、真菌以及病毒不得不培養(yǎng)在基質(zhì)中以便于在富集溶液中對它們進(jìn)行檢測，用于分析的血液相對容易收集和制備。然而這里應(yīng)當(dāng)注意，抗體不僅可以收集自血液、血漿或血清，而且可以收集自肌肉(肉汁)、乳狀物、韌乳、腦脊液以及蛋。尤其是，蛋、肉汁和/或乳狀物的采樣比血液、血漿、血清或腦脊液的采樣更容易并且成本更低。
因此，基于含抗體的生物物質(zhì)的血清特征分析的診斷方法在動物的所謂運(yùn)送(logistic)屠宰中是支持的。在本發(fā)明的處理方式中，基于證據(jù)的和可靠的決定是基于在農(nóng)場水平連續(xù)和廣泛監(jiān)測是否動物被允許進(jìn)入沒有沙門氏菌或沙門氏菌污染的加工設(shè)施。
在沙門氏菌屬的抗原結(jié)構(gòu)的成分中，菌體抗原是重要的，其可以作為一種方法來追蹤在這種生物侵入性感染以后動物的免疫應(yīng)答。菌體抗原位于脂多糖的(LPS)的多糖部分上，其是細(xì)菌細(xì)胞壁的成分。用小心選擇的LPS檢測體液應(yīng)答，則可以推斷感染沙門氏菌的血清群的類別。
在丹麥、德國、希臘以及荷蘭，在屠宰場采樣的所有沙門氏菌陽性豬的39.5％被確定為鼠傷寒沙門氏菌。與國家有關(guān)，來自豬的其它重要的分離菌是德爾比沙門氏菌(17.1％)、嬰兒沙門氏菌(8.0％)、巴拿馬沙門氏菌(5.1％)、俄亥俄沙門氏菌(4.9％)、倫敦沙門氏菌(4.4％)、利文斯通沙門氏菌(3.1％)、維爾肖氏沙門氏菌(2.7％)、布雷得尼沙門氏菌(2.1％)、姆班達(dá)卡沙門氏菌(1.1％)、勃蘭登堡沙門氏菌(1.0％)、黃金海岸沙門氏菌(0.8％)。
在雞的情況下，在2002年的荷蘭，在種群水平，14％的雞是沙門氏菌陽性的。在上述情況下，主要的血清變型是乙型副傷寒沙門氏菌爪哇變種。在荷蘭發(fā)現(xiàn)零售水平為可比較的百分率(13.4％)。在14個EU成員國中從肉用仔雞中分離的最常見的沙門氏菌血清變型是乙型副傷寒沙門氏菌爪哇變種(24.7％)、腸炎沙門氏菌(13.6％)、嬰兒沙門氏菌(8.0％)、維爾肖氏沙門氏菌(6.7％)、利文斯通沙門氏菌(5.7％)、姆班達(dá)卡沙門氏菌(5.5％)、鼠傷寒沙門氏菌(5.3％)、森夫頓堡沙門氏菌(5.0％)、哈達(dá)爾沙門氏菌(3.7％)。乙型副傷寒沙門氏菌爪哇變種是主要的，但這完全歸因于荷蘭。
在制造食物的雞和豬中，這種流行發(fā)生的沙門氏菌血清變型屬于組B、C以及D，而在豬的情況下還屬于組E。
在本研究中，新的分析親合力測定平臺用于豬和雞中沙門氏菌感染的間接檢測。這種技術(shù)平臺(來自luminex)分析內(nèi)部編碼的小珠，其可以在單次試驗(yàn)中涂布以不同的抗原。僅當(dāng)小珠的熒光和結(jié)合的分析物均通過檢測器時，才記錄應(yīng)答。這種方式用來檢測在血清和肉滲出物中的抗沙門氏菌抗體。
材料和方法 化學(xué)藥品 胺耦聯(lián)試劑盒購自Biacore AB(Uppsala，瑞典)，其包括N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDC)和乙醇胺氫氯化物-氫氧化鈉(pH 8.5)。乙醇和三氯乙酸(TCA)購自Merck(Darmstadt，德國)。氰基硼氫鈉和碳酰肼獲自Fluka Chemie GmbH(Buchs，瑞士)。豬血紅蛋白(Hb)獲自SigmaChemical Company(St.Louis，MO，美國)。水獲自Milli Q水純化裝置(Millipore，Bedford，MA，美國)。
材料 NAP-5柱(0.5ml；Sephadex G-25)購自Amersham Biosciences并且如制造商所描述的加以使用。CM5生物傳感器芯片購自Biacore AB。截留為1kDa的透析袋(Spectra/Por)獲自SpectrumLaboratories Inc.(Rancho Dominguez，CA，美國)。Alexa532來自Molecular Probes(Leiden，荷蘭)。山羊抗-豬IgG(H+L)定購自Jackson Immunoresearch(West Grove，PA，美國)。利用標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記步驟將該抗體軛合于Alexa532。
抗沙門氏菌抗血清 相對于O4、O5、O61、O7、O8、O9、O10的沙門氏菌單價“O”體細(xì)胞單克隆抗血清購自Sifin(Berlin，德國)。將抗體溶液稀釋在50mM PBS中直到它們的工作濃度。
參比禽類和豬血清 所有參比血清獲自荷蘭動物健康服務(wù)機(jī)構(gòu)(Deventer，荷蘭)。獲得的禽類參比血清對于下述沙門氏菌是活性的腸炎沙門氏菌(血清群D1)、鼠傷寒沙門氏菌(血清群B)、雞白痢沙門氏菌/雞沙門氏菌(Spg；血清群D1)以及嬰兒沙門氏菌(血清群C1)，并且其另外分別稱作CH-Se、CH-St、CH-Spg以及CH-Si。這些雞血清最初制備用于ELISA分析(作為陽性對照)。此外，沒有特異性病原體的雞血清(另外稱作CH-SPF)購自此機(jī)構(gòu)，作為陽性對照參比樣品。通過加入制造商所指定容積的水，從凍干材料重組這些血清。同樣，來自受到鼠傷寒沙門氏菌和利文斯通沙門氏菌攻擊的動物的豬血清(血清群C1)獲自GD并且分別稱作P-St和P-Sl。此外，在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中用作對照的大葉性肺炎放線桿菌血清型2-反應(yīng)性豬血清(GD)，在沙門氏菌生物傳感器測定中用作豬血清的陰性對照。
方法 LPS的提取[AAB6] 通過在包含腦心浸液瓊脂(BHIa，Oxoid)的120個板的每一個板上施加100μl的它們的相應(yīng)的原種來制備沙門氏菌的過夜培養(yǎng)物。利用trigalski刮勺從板的表面采集細(xì)菌并放入1ml的9g/l NaCl(鹽水)溶液/瓊脂板。用2ml鹽水溶液洗滌每個板兩次。在10,000g和4℃下離心在6個管中的混合細(xì)菌15分鐘，然后棄去上清液。每次試驗(yàn)中，用75ml鹽水洗滌溶液/管重復(fù)離心步驟兩次。在保持在冰上的同時，以一定容積比(其是細(xì)菌重量的5倍)將小顆粒細(xì)菌懸浮在水中。加入等容積的0.250M(Se)或0.500M(Sg，Sl，Sm和St)TCA，以分別產(chǎn)生0.12M和0.25M的最終濃度，接著在4℃下連續(xù)攪拌3小時。然后在20,000g和4℃下離心30分鐘以后獲得包含脂多糖(LPS)的上清液。用5M氫氧化鈉并當(dāng)接近目標(biāo)pH時用0.10M氫氧化鈉將上清液的pH調(diào)節(jié)至pH 6.5。在儲存于-18℃下30分鐘以前，確定含LPS溶液的最終容積。用雙倍容積的冰冷無水乙醇(來自-18℃儲存處)對溶液進(jìn)行稀釋，然后在封閉的具有循環(huán)冷乙二醇/水(1∶4，v/v)的室內(nèi)(house-build)裝置中并在-4℃下連續(xù)培養(yǎng)過夜而沒有攪拌。在20,000g和-4℃下離心30分鐘以后獲得包含LPS的沉淀物(pellet)。將顆粒物質(zhì)懸浮于一定容積的0.5ml水/克最初細(xì)菌質(zhì)量(在提取過程開始時稱量)。在4℃下相對于水在1-kDa透析袋中透析懸浮液兩天，其間定期更新水。在20,000g和4℃下離心透析袋內(nèi)含物30分鐘，然后凍干上清液。稱量凍干物以確定LPS的回收率。將LPS在水中重組以形成5mg/ml的最終濃度。取決于LPS類型和批號，將一定容積的1mg/ml的豬血紅蛋白(Hb)加至如文中所指定的濃度。每一批料分成0.5mg LPS部分，利用真空蒸發(fā)器對其進(jìn)行干燥，然后在5-8℃下儲存。
LPS的氧化[AAB7] 將0.5mg的血紅蛋白增強(qiáng)的LPS溶解在500μl的100mM乙酸鈉(pH 5.5)中。在加入20μl的50mM高碘酸鈉(Sigma)以后，在冰上及避光條件下培養(yǎng)溶液40分鐘。對LPS的氧化進(jìn)行驟冷，然后借助于重力流動使500μl的反應(yīng)混合物通過NAP-5柱體從而對溶液進(jìn)行脫鹽。用1ml的10mM乙酸鈉(pH 4.0)洗脫修飾的LPS。在使用之前，用3ml的10mM乙酸鈉(pH 4.0)調(diào)節(jié)柱體三次。
LPS的固定[AAB8] 為了將氧化的LPS抗原固定于小珠，在旋轉(zhuǎn)振動器上，用可獲自胺耦聯(lián)試劑盒的EDC/NHS混合物活化在小珠表面的羧基20分鐘。在離心和除去上清液以后，活化作用以后是和5mM含水碳酰肼反應(yīng)20分鐘。再次壓制(pelleted)具有改性表面的小珠并在加入1M乙醇胺以前棄去上部液體，然后培養(yǎng)`20分鐘。在14,000g時再次進(jìn)行離心步驟5分鐘以后，加入溶解在乙酸鈉(pH 4.0)中的氧化LPS，以允許固定90分鐘。在除去上清液(通過離心作用獲得)以后，利用溶解在10mM乙酸鈉(pH 4)中的100mM氰基硼氫鈉來穩(wěn)定小珠表面和抗原之間的鍵合。
BioPlex測定 在加熱小珠計數(shù)裝置以后，利用BioPlex校正試劑盒(BioRad)并按照生產(chǎn)商的說明對BioPlex(BioRad，Veenendaal，荷蘭)進(jìn)行校正。在微量滴定板的孔中，將樣品稀釋在50mM PBS中，并補(bǔ)充以50μL的5000個小珠/mL涂布有LPS的小珠。在微量滴定板振蕩器(以200rpm進(jìn)行操作)上允許抗原-抗體結(jié)合30分鐘。然后加入用Alexa532熒光標(biāo)簽標(biāo)記的10μL山羊抗-豬IgG(H+L)(在50mM PBS中稀釋8次)并在振蕩器中連續(xù)培養(yǎng)15分鐘。然后在BioPlex裝置上，分析小珠的熒光外形30秒。
結(jié)果和討論 制備熒光珠，用于涂布以LPS，該LPS來自不同特異性沙門氏菌血清變型來源，其代表血清群B、C以及D，而它們與來自雞和豬的食物中的人獸互通病有關(guān)。應(yīng)當(dāng)注意到，在這里并沒有研究與豬肉產(chǎn)品有關(guān)的血清群E。在每種類型的LPS固定于單個小珠(其被內(nèi)部編碼)以后，利用商業(yè)上可獲得的相對于菌體抗原O4、O5、O7以及O9的單克隆抗血清對涂布的成果進(jìn)行評估。然而，雖然抗O5給出6398單位的應(yīng)答，抗O9給出145單位的應(yīng)答，而非匹配抗原-抗體的背景信號在所有情況下均小于91單位(圖6)。以類似的方式，抗O4和抗O7分別給出305單位和174單位的應(yīng)答(圖7)。在商業(yè)上可獲得的抗血清制劑之間的這些應(yīng)答差異和利用表面等離子體共振(SPR)生物傳感器觀測到的那些應(yīng)答差異具有非常好的一致性，并且反映了抗體滴度的差異。
以類似的方式，利用一組類似的商用抗血清對在不同日期氧化的相同LPS批料的活性進(jìn)行了試驗(yàn)(表8)。和其它氧化批料相比，應(yīng)答范圍在57％和148％之間，其易于改進(jìn)。
分析了肉滲出物的不同制劑，即在冷凍和融化循環(huán)以后從肌肉組織獲得的肉汁，以及來自雞的血清(表9)。記錄的活性是如所預(yù)期的。來自沒有沙門氏菌的雞的肉滲出物、血清以及肉滲出物和血清的混合物給出較低豐富的熒光軛合小珠。相反，抗雞瘟沙門氏菌和抗雞沙門氏菌應(yīng)當(dāng)對于血清群B和D產(chǎn)生應(yīng)答，因?yàn)樗乖璒1和O12，其適合于肉滲出物和血清。嬰兒沙門氏菌包含抗原O6，其由C1和C2共有。確實(shí)，在肉滲出物和血清中觀測到這種活性[AAB9]。
除雞血清之外，還對制備的豬血清進(jìn)行了試驗(yàn)(圖10)。來自沒有沙門氏菌的豬的血清產(chǎn)生MFI應(yīng)答，其范圍為110單位(血清群C2)至137單位(血清群B)并且接近僅用緩沖液培養(yǎng)的小珠的應(yīng)答，即94單位(血清群D)至129單位(血清群C2)。如所預(yù)料的，當(dāng)用抗鼠傷寒沙門氏菌和利文斯通沙門氏菌抗血清強(qiáng)化血清時，則記錄到明顯的信號，即對于血清群B為969單位以及對于血清群C1為207單位。強(qiáng)化的血清并不和非對應(yīng)的抗原起反應(yīng)，從而產(chǎn)生104MFI單位和131MFI單位之間的應(yīng)答。
實(shí)施例5 利用SPR生物傳感器確定在外來禽類物種中的抗沙門氏菌抗體[AAB10] 研究目的 本研究的目的是探索開發(fā)的SPR生物傳感器技術(shù)(其基于使用固定的選擇的沙門氏菌LPS來間接檢測生產(chǎn)食物的動物中的沙門氏菌感染)是否能夠檢測在外來動物物種中的沙門氏菌感染。
材料 來自tocotoucans(Rhamphastos toco)和尖尾松雞(Tympanuchusphasianellus)的血漿，其感染有不同噬菌體型的鼠傷寒沙門氏菌，是由Dr.W.Schaftenaar and Ing.M.de Boer(Veterinary Department，Rotterdam Zoo，荷蘭)友好地提供。這些動物的疾病歷如下。
從Tocotoucan的糞便(1994年3月24日采樣)，分離了鼠傷寒沙門氏菌噬菌體型292。從相同禽類的另一糞便樣品，在1994年6月28日分離了鼠傷寒沙門氏菌噬菌體型352。1994年8月24日，從該動物收集血漿，用于本研究中的SPR分析。
在1997年10月28日，從患病的尖尾松雞收集血液。從這種血液制備的血漿用于本研究中的分析。此動物第二天死去。從死去的禽類中分離了鼠傷寒沙門氏菌噬菌體型507。
方法 如先前所述，操作包括傳感器芯片的SPR生物傳感器(Biacore3000)，其中傳感器芯片的流動通道涂布有來自腸炎沙門氏菌、利文斯通沙門氏菌、黃金海岸沙門氏菌以及鼠傷寒沙門氏菌的LPS。如在實(shí)施例1和實(shí)施例2中針對血清所描述的，稀釋血漿樣品，然后分析。
結(jié)果和討論 本發(fā)明首先開發(fā)用于食物鏈以保證動物源食物的安全(就沙門氏菌污染而論)。盡管如此，用收集自兩個外來禽類物種的血漿試驗(yàn)了可應(yīng)用范圍，其中上述兩個外來禽類物種是巨嘴妥空(tocotoucan(P.toco))和尖尾松雞(T.phasianellus)，如經(jīng)典微生物診斷學(xué)所揭示的，其感染有鼠傷寒沙門氏菌(和M.de Boer，Blijdorp Zoo，Rotterdam的個人通信)。
研究發(fā)現(xiàn)，在采集血液前五和兩個月，巨嘴妥空的糞便是陽性的，并且經(jīng)過相對較長的時期可以發(fā)展體液應(yīng)答。確實(shí)，生物傳感器應(yīng)答較高(表33)。和來自SPF雞的空白血清以及和標(biāo)準(zhǔn)抗血清(抗血清群A至S)相比，和鼠傷寒沙門氏菌LPS的反應(yīng)性非常高(4185應(yīng)答單位(RU))。在腸炎沙門氏菌的通道上也觀測到應(yīng)答(1220RU)，對于來自僅僅高度感染鼠傷寒沙門氏菌的雞的血清也觀測到，并且與在兩種血清變型、因而在血清群B和D中菌體抗原O12的存在相一致(參見表1和表3)。意想不到地，在黃金海岸沙門氏菌通道也觀測到相對較高的應(yīng)答。在這里不可能排除這樣的情況這種禽類同時或順序地感染有多種沙門氏菌血清變型，其中鼠傷寒沙門氏菌作為最后的感染，其包括C2感染。
尖尾松雞的血漿對于不同的LPS類型并不是非?；钚缘模谒星闆r下反應(yīng)性高于空白血清的反應(yīng)性，并且對于Sl和St LPS，反應(yīng)性高于參比抗血清的反應(yīng)性(表33)。因?yàn)樵撉蓊惪焖偎烙诟腥荆韵鄬τ谒x擇抗原的明顯的體液應(yīng)答很可能未完全發(fā)展并且生物傳感器未檢測到。應(yīng)當(dāng)注意，因而血清特征并不非常適合于在個體水平上的診斷。如Swaneburg所證明的(Utrecht Thesis，Utrecht University，2000)，血清特征尤其適用于在群體水平上估計沙門氏菌狀況。
表33.收集自巨嘴妥空和尖尾松雞(其感染有鼠傷寒沙門氏菌)的血漿的分析結(jié)果。結(jié)果表示為相對應(yīng)答單位。分析樣品三次。
a來自沒有特異性病原體的雞的血清，即空白血清 b商業(yè)上可獲得的和沙門氏菌血清群B起反應(yīng)的單克隆抗體。
實(shí)施例6 通過噬菌體Felix O1(FO1)與固定在SPR生物傳感器芯片表面上的沙門氏菌LPS的結(jié)合來檢測噬菌體Felix O1 目的 為了確定噬菌體FO1結(jié)合到固定于生物傳感器表面 方式 為了證實(shí)噬菌體Felix O1(FO1，F(xiàn)élix d’Hérelle ReferenceCentre for Bacterial Viruses，Laval，加拿大)和沙門氏菌LPS的結(jié)合，將該噬菌體稀釋在HBSEP中以獲得濃度系列。將這些樣品注射在生物傳感器上兩分鐘以允許結(jié)合于來自鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、黃金海岸沙門氏菌以及利文斯通沙門氏菌的LPS，其各自分開固定在傳感器芯片的單個流動通道上。
結(jié)果 結(jié)果總結(jié)在圖11中。
雖然需要相對較高濃度的噬菌體以獲得明顯的應(yīng)答，但從本實(shí)驗(yàn)可以明顯看到，109PFU的FO1/噬菌體/mL以及更高的結(jié)合于耦聯(lián)到芯片表面的LPS。
實(shí)施例7 在噬菌體FO1和鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、黃金海岸沙門氏菌以及利文斯通沙門氏菌培養(yǎng)以后，通過噬菌體FO1和固定在SPR生物傳感器上的鼠傷寒沙門氏菌LPS的結(jié)合來檢測噬菌體FO1 目的 為了確定噬菌體FO1和HBSEP中沙門氏菌spp.的活培養(yǎng)物的結(jié)合。
方式 鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、黃金海岸沙門氏菌、利文斯通沙門氏菌以及空白培養(yǎng)基的不同濃度的培養(yǎng)物和1.2×109PFU噬菌體FO1混合5分鐘。培養(yǎng)以后，離心細(xì)菌并在Biacore上分析上清液，其中生物傳感器芯片包含固定的來自鼠傷寒沙門氏菌的LPS。
結(jié)果 為了確定明顯應(yīng)答，通過空白培養(yǎng)基(不包含沙門氏菌但包含1.2×109PFU噬菌體)的平均讀數(shù)減去3倍標(biāo)準(zhǔn)差而規(guī)定了截留值。應(yīng)用這種截留值揭示了，鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、黃金海岸沙門氏菌以及利文斯通沙門氏菌的濃度應(yīng)至少分別為6×108CFU/mL、3×106CFU/mL、4×107CFU/mL以及3×104CFU/mL，以產(chǎn)生明顯的應(yīng)答(圖12)。
討論 噬菌體FO1對沙門氏菌spp.的吸附速率很可能依賴于在核心區(qū)(FO1的結(jié)合位點(diǎn))N-乙酰葡糖胺的可達(dá)性(Lindberg，1997；Lindberg and Holme，1969[AAB11])。因此，在靶向沙門氏菌的LPS的多糖區(qū)存在的許多長O側(cè)鏈可以損害FO1與分析物的結(jié)合。因此預(yù)期，游離的噬菌體對于沙門氏菌菌株將具有不同的結(jié)合能力并且病毒的繁殖將大大地依賴于所暴露的LPS的分子外形。
如本發(fā)明中所描述的，當(dāng)將LPS-蛋白質(zhì)復(fù)合物固定于用于診斷方法的固體載體的表面時，則可以形成配體的致密網(wǎng)絡(luò)。在所介紹的Biacore分析中，復(fù)合物的密度和蛋白質(zhì)的阻礙可以在所觀測到的噬菌體結(jié)合于四種LPS類型的差異方面發(fā)揮作用。
在這里應(yīng)當(dāng)注意到，如在本發(fā)明中所討論的，期望在核心區(qū)會發(fā)生單糖成分的氧化，包括N-乙酰葡糖胺的氧化。因此，用于噬菌體的配體會受到影響并且這可能會影響試驗(yàn)的敏感度。
實(shí)施例[AAB12]8 在沙門氏菌spp.和非沙門氏菌菌株中噬菌體FO1的繁殖 目的 FO1的繁殖并不是唯一在沙門氏菌spp.中，但也可能在非沙門氏菌菌株中(3)。本研究探討了噬菌體FO1增殖的選擇性。為此，許多重要的食物非沙門氏菌病原體暴露于FO1噬菌體。
方法 在胰化蛋白胨大豆液體培養(yǎng)基(Oxoid CM129)中生長7種非沙門氏菌菌株(單核細(xì)胞增多利斯特菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、蠟樣桿菌、檸檬酸桿菌屬、糞腸球菌、以及金黃色葡萄球菌)和7種沙門氏菌菌株(豬霍亂沙門氏菌、貝塔沙門氏菌、火雞沙門氏菌、阿哥拉沙門氏菌、雞瘟沙門氏菌、維爾肖氏沙門氏菌以及腸炎沙門氏菌)。
在0小時時，將1.2×108PFU的FO1(最終濃度1×106PFU/mL)加入到所有培養(yǎng)物。每小時取樣，并確定在λ600nm處的吸光度(圖13和圖14)、噬斑形成單位/mL(圖15和圖16)、以及在濃縮和緩沖液交換以后在Biacore生物傳感器中和固定在傳感器芯片表面上的固定的St-LPS的結(jié)合(圖17)。
在5小時的培養(yǎng)中，某些非沙門氏菌細(xì)菌(包括單核細(xì)胞增多利斯特菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌以及金黃色葡萄球菌)并未顯示生長(圖13)。這些細(xì)菌明顯未受到噬菌體FO1的載入或感染，因?yàn)槭删w的濃度并沒有隨時間升高并且穩(wěn)定在1×106PFU/ml(圖15)。
相反，所有沙門氏菌血清變型，除維爾肖氏沙門氏菌之外，在5小時的培養(yǎng)中生長(圖14)。這種維爾肖氏沙門氏菌菌株很可能被增殖的噬菌體完全溶解，因?yàn)榭梢钥吹绞删w濃度的明顯增加從1×106PFU/ml到1×1010PFU/ml(圖16)。以類似的方式，貝塔沙門氏菌和火雞沙門氏菌細(xì)菌顯示噬菌體濃度的增加。然而，這些細(xì)菌，尤其是貝塔沙門氏菌顯示良好的生長(圖14)。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，繁殖的噬菌體和傳感器表面的結(jié)合是最重要的。為此，在SPR生物傳感器分析以前，對在沙門氏菌中繁殖的噬菌體進(jìn)行濃縮、透析以及連續(xù)稀釋(圖17)。意料不到地，類似的噬菌體濃度產(chǎn)生明顯不同的生物傳感器應(yīng)答。在樣品制備期間，尤其在濃縮和透析步驟期間，很可能噬菌體丟失。盡管如此，噬菌體的制劑，其已顯示出繁殖(參見圖16)，產(chǎn)生比空白樣品明顯更高的應(yīng)答，其中空白樣品僅包含初始濃度的噬菌體。
結(jié)論 這些實(shí)驗(yàn)表明，噬菌體可以用作分析工具來檢測樣品中沙門氏菌的存在，以及固定于固體表面的沙門氏菌LPS可以用來探測噬菌體的增加，是由于在短期培養(yǎng)以后病毒在宿主細(xì)菌中的繁殖的結(jié)果。
實(shí)施例9 將源自沙門氏菌的LPS固定到熒光珠(luminex)上并對報道不同生物樣品[AAB 13]中的目前或過去沙門氏菌感染的抗體進(jìn)行檢測 0.警告和安全措施 脂多糖是有力的免疫原，在攝取或吸入以后其可以使敏感的人出現(xiàn)敗血性休克。應(yīng)采取預(yù)防措施以防止和這種生物試劑接觸。
高碘酸鈉是一種氧化劑并且當(dāng)與強(qiáng)氧化劑接觸時可能會引起爆炸。
該步驟使用了氰基硼氫鈉。因此進(jìn)行此步驟時應(yīng)采取預(yù)防措施，例如使用手套和防護(hù)罩。僅在化學(xué)通風(fēng)櫥中使用這種化學(xué)物質(zhì)。這種物質(zhì)對于水生生物是非常有毒的并且可以在水生環(huán)境中引起長期有害效應(yīng)。應(yīng)作為危險廢物處理該物質(zhì)和溶液廢棄物。
1.引言 在沙門氏菌屬的抗原結(jié)構(gòu)的成分中，菌體抗原是重要的，其可以作為一種方法來追蹤在這種微生物侵入性感染以后動物的免疫應(yīng)答。菌體抗原位于脂多糖(LPS)的多糖部分上，其是細(xì)菌細(xì)胞壁的成分。在從小心選擇的沙門氏菌血清變型提取和分離LPS以后(參見SOP CHEMIE/A21[AAB14])，包含抗原的LPS共價耦聯(lián)于小珠，其由熒光材料的特殊混合物加以內(nèi)部編碼。使用的來自Luminex的技術(shù)平臺可以在一次試驗(yàn)中鑒定多達(dá)100種不同內(nèi)部編碼的小珠?？梢杂肔PS的混合物(反映不同的血清群)來固定單一種類的小珠，或可以用LPS(反映病原微生物的單一特異性血清群或血清變型)來各自固定不同種類的小珠。用源于身體的材料如血液、血漿、血清、肉滲出物/肉汁、卵黃、乳狀物等來培養(yǎng)含LPS的小珠，以使抗沙門氏菌抗體-抗原結(jié)合成為可能。在一種裝置中用熒光標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體第二次培養(yǎng)以后檢測特異性結(jié)合，其中所述裝置同時分析激發(fā)小珠的發(fā)射波長和標(biāo)記的抗體。僅當(dāng)同時檢測到小珠和抗體的兩種熒光時，才記錄對特定小珠種類的應(yīng)答。
這種SOP描述了氧化、LPS固定于小珠(Luminex)上以及測定的方法，以評估所產(chǎn)生的質(zhì)量。
2.應(yīng)用的范圍和領(lǐng)域 為了分析生物液體(如來自雞和豬的血清樣品)是否存在抗沙門氏菌抗體，這些抗體和O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10以及O12菌體抗原起反應(yīng)，其中所述菌體抗原反映了來自血清群B、C、D以及E的沙門氏菌感染歷史或目前的感染。
3.參比 從沙門氏菌spp.提取和分離脂多糖；將源自沙門氏菌的LPS固定到生物傳感器芯片(biacore)上并對報道目前或過去沙門氏菌感染的血清抗體進(jìn)行檢測；優(yōu)化加入LPS用于固定的蛋白質(zhì)并檢測血清抗體；參見實(shí)施例1。
4.定義 c＝濃度，如所指定的以％(m/v)、％(v/v)、mol/l或mmol/l作為單位。
5.縮寫詞清單 5.1EDC，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺氫氯化物 5.2LPS，脂多糖 5.3NaCl，氯化鈉 5.4NaOH，氫氧化鈉 5.5NHS，N-羥基琥珀酰亞胺 5.6PBS，磷酸緩沖鹽水 5.7Se，腸炎沙門氏菌 5.8Sg，黃金海岸沙門氏菌 5.9Sl，利文斯通沙門氏菌 5.10Sm，火雞沙門氏菌 5.11SOP，標(biāo)準(zhǔn)操作步驟 5.12St，鼠傷寒沙門氏菌 5.13TCA，三氯乙酸 6.原理 在有蛋白質(zhì)存在的情況下并由高碘酸鈉促進(jìn)，氧化LPS。利用NAP-5柱使LPS-蛋白質(zhì)溶液脫鹽。在借助于1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化在小珠表面的羧酸基團(tuán)、接著和碳酰肼進(jìn)行反應(yīng)以后，將經(jīng)脫鹽的氧化的LPS-蛋白質(zhì)復(fù)合物固定到小珠的固相。然后用氰基硼氫鈉穩(wěn)定結(jié)合的LPS。常規(guī)使用前，利用一組參比單克隆凝集血清對小珠軛合的LPS結(jié)合于抗沙門氏菌抗體的性能進(jìn)行評估。
7.反應(yīng) 7.1碳水化合物部分的氧化 高碘酸鹽將誘導(dǎo)尤其在碳水化合物部分上的鄰順式二醇之間鍵合的氧化破壞(如在例如甘露糖中)以產(chǎn)生醛官能團(tuán)，參見圖18。此反應(yīng)通常在暗處以及在緩沖液(pH范圍在4.5和5.5之間)中進(jìn)行，其中使用新鮮制備的在0.1M乙酸鈉中的10-100mM偏高碘酸鈉。
注1在圖18中指示的用來連接所示單糖和多糖中(如在例如LPS中)的其它單糖殘基的共軛位置只是示例性的。R’和R分別表示在糖鏈中的遠(yuǎn)側(cè)和近側(cè)位置。在多糖鏈內(nèi)、在包含敏感鄰二醇的每個單糖成分中，羥基氧化成醛本身可以重復(fù)。
注2高碘酸鹽(當(dāng)存在時)也將氧化某些β-氨基乙醇衍生物如在膠原中的羥賴氨酸殘基、以及蛋氨酸(氧化成其亞砜)和某些硫醇(通常氧化成二硫化物)。此外，借助于高碘酸鹽可以將肽和蛋白質(zhì)的N端絲氨酸和蘇氨酸殘基選擇性地氧化成醛基。然而，這些反應(yīng)的速率通常低于鄰二醇氧化的速率。
7.2軛合到蛋白 在有蛋白質(zhì)存在的情況下進(jìn)行氧化作用。二醛化合物，如在本文的LPS的多糖鏈中的氧化的單糖成分，可以和在蛋白質(zhì)中的任何氨基起反應(yīng)并可以形成產(chǎn)生取代的亞胺的希夫堿鍵合。參見圖19。
注通過氫硼化物促進(jìn)的還原作用，穩(wěn)定取代的亞胺，同時復(fù)合物附著到小珠表面。這種類型的反應(yīng)圖解稱作還原性胺化作用。
7.3固定到熒光珠 利用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺氫氯化物(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧酸標(biāo)記的小珠。活化作用以后是和碳酰肼進(jìn)行反應(yīng)?；钚匀┕倌軋F(tuán)自發(fā)地和酰肼起反應(yīng)以形成腙，然后被還原以穩(wěn)定共價鍵。參見圖20。
注蛋白質(zhì)(R″)攜帶多個-NH2基團(tuán)并因此可以軛合多個氧化的LPS本體，另一方面，在LPS中的多糖部分可以攜帶在單個分子中的多個游離醛基。在小珠上的酰肼層可以部分或完全地俘獲這些醛基。凈結(jié)果可以是共價連接于小珠表面的蛋白質(zhì)-LPS的非常穩(wěn)定的復(fù)合物網(wǎng)絡(luò)。
8.試劑和材料 在所有的操作步驟中，除非另有說明，僅使用認(rèn)可的分析級試劑和蒸餾水或相當(dāng)純度的水。提到公司時，僅是為了信息和識別目的而不意味著推薦(除非如此陳述)。
8.1化學(xué)藥品 8.1.1乙酸(J.T.Baker，Deventer，荷蘭) 8.1.2胺耦聯(lián)試劑盒(Biacore AB，Uppsala，瑞典)，其包括 8.1.2.1包含115mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的管瓶 8.1.2.2包含750gm 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDC)的管瓶 8.1.2.3包含10.5ml、c＝1mol/l乙醇胺氫氯化物-氫氧化鈉(pH8.5)的管瓶 8.1.3Bio-Plex校正試劑盒(Bio-Rad，Veenendaal，荷蘭) 8.1.4碳酰肼，CN4H6O(Fluka Chemie GmbH，Buchs，瑞士) 8.1.5羧甲基-葡聚糖鈉鹽(Fluka) 8.1.6磷酸二氫鉀(KH2PO4)(Merck，Darmstadt，德國) 8.1.7Proclin 150(Supleco，Bellefonte，PA，美國) 8.1.8單克隆抗沙門氏菌O抗原 8.1.8.1抗O4(SIFIN，Berlin，德國) 8.1.8.2抗O5(SIFIN) 8.1.8.3抗O61(SIFIN) 8.1.8.4抗O7(SIFIN) 8.1.8.5抗O8(SIFIN) 8.1.8.6抗O9(SIFIN) 8.1.8.7抗O10(SIFIN) 8.1.9沙門氏菌LPS，通過TCA提取機(jī)構(gòu)內(nèi)部分離的LPS(SOPCHEMIE/A21)，借助于蛋白質(zhì)制備自沙門氏菌細(xì)菌血清變型腸炎沙門氏菌(Se)、黃金海岸沙門氏菌(Sg)、利文斯通沙門氏菌(Sl)、火雞沙門氏菌(Sm)以及鼠傷寒沙門氏菌(St)(SOP CHEMIE/A23) 8.1.10羊抗-小鼠Ig-PE(Chemicon，Boronia，Victoria，澳大利亞) 8.1.11乙酸鈉三水合物(J.T.Baker，Phillipsburgh，NJ，美國) 8.1.12氯化鈉(Merck) 8.1.13氰基硼氫鈉(NaCNBH3)(Fluka) 8.1.14磷酸氫二鈉(Na2HPO4)(Merck) 8.1.15氫氧化鈉，c＝50mmol/l(Biacore) 8.1.16偏高碘酸鈉(NaIO4)(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，荷蘭) 8.1.17水獲自Milli Q水純化裝置 8.2溶液 8.2.1乙酸溶液，c＝0.1g/ml用9ml水稀釋1ml乙酸(8.1.1)。
8.2.2乙酸緩沖溶液，c＝10mmol/l，pH 4.0將0.272g乙酸鈉三水合物(8.1.11)溶解在180ml水中，用乙酸(8.1.1)調(diào)節(jié)至pH4.0，然后補(bǔ)充水至200ml。此緩沖液可穩(wěn)定大約6個月。
8.2.3乙酸緩沖溶液，c＝1.0mol/l，pH 5.5將13.6g乙酸鈉三水合物(8.1.11)溶解在90ml水中，用乙酸(8.1.1)調(diào)節(jié)至pH 5.5，然后補(bǔ)充水至100ml。此緩沖液可穩(wěn)定大約6個月。
8.2.4乙酸緩沖液，c＝100mmol/l，pH 5.5用9.0ml水稀釋1.0ml乙酸緩沖溶液，c＝1.0mol/l(8.2.3)。
8.2.5碳酰肼溶液，c＝100mmol/l將9.0mg碳酰肼(8.1.4)溶解在1000μl水中。
8.2.6碳酰肼溶液，c＝5mmol/l用190μl水稀釋10μl碳酰肼溶液(8.2.5)。使用前制備。
8.2.7EDC-溶液在10.0ml水中再生EDC(8.1.2.2)。
8.2.7.1在聚丙烯管(9.15)中將此溶液(8.2.7)分成100μl的等分部分。在-18℃或更低溫度下儲存。等分部分可穩(wěn)定兩個月。使用前融化冷凍的等分部分并對它們進(jìn)行溫和攪拌以確保均勻的溶液。
8.2.8乙醇胺溶液在聚丙烯管(9.15)中吸移200μl c＝1mol/l乙醇胺溶液(8.1.2.3) 8.2.9NHS溶液在10.0ml水中再生NHS(8.1.2.1)。
8.2.9.1在聚丙烯管(9.15)中將此溶液(8.2.9)分成100μl的等分部分。在-18℃或更低溫度下儲存。等分部分可穩(wěn)定兩個月。使用前融化冷凍的等分部分并對它們進(jìn)行溫和攪拌以確保均勻的溶液。
8.2.10PBS(5.6)，c＝100mmol/l，pH 7.2在1L水(8.1.17)中溶解67.9g氯化鈉(8.1.12)、14.7g磷酸氫二鈉(8.1.14)以及4.3g磷酸二氫鉀(8.1.6)。
8.2.11PBS，c＝10mmol/l，pH 7.2在1L水(8.1.17)中稀釋100mL 10倍濃縮的PBS(8.2.10)。
8.2.12抗小鼠Ig-PE，預(yù)稀釋的通過混合40μl抗小鼠Ig-PE(0)和160μl PBS(8.2.11)稀釋熒光共軛物5倍。
8.2.13氰基硼氫鈉，c＝1.00mol/l將62.8mg氰基硼氫鈉(8.1.13)溶解在1000μl10mM乙酸溶液pH 4.0(8.2.2)中。
8.2.14氰基硼氫鈉，c＝100mmol/l用1620μl乙酸溶液，c＝10mmol/l，pH 4.0(8.2.2)稀釋180μl氰基硼氫鈉溶液(8.2.13)。使用前制備。
8.2.15氫氧化鈉，c＝5mmol/l在玻璃管瓶(9.10)中用3.6ml水稀釋400μl氫氧化鈉c＝50mmol/l(8.1.15)。
8.2.16偏高碘酸鈉溶液，c＝100mmol/l將214mg偏高碘酸鈉(8.1.16)加入10.0ml水(8.1.17)。
8.2.17“隨時可以使用”的偏高碘酸鈉在1.4ml聚丙烯管(9.14)中吸移100μl偏高碘酸鈉溶液，c＝100mmol/l(8.2.16)然后用離心蒸發(fā)器(9.4)進(jìn)行干燥。
8.2.18高碘酸鈉溶液，c＝50mmol/l將“隨時可以使用”的高碘酸鈉(8.2.17)溶解在200μl乙酸溶液，c＝100mmol/l pH 5.5(8.2.4)中。在使用前制備。
8.3標(biāo)準(zhǔn)單克隆參比溶液 8.3.1濃縮單克隆沙門氏菌抗O5(8.1.8.2)通過加入45μl PBS，c＝10mmol/l，pH 7.2(8.2.11)，稀釋5μl抗O510倍。
8.3.2單克隆沙門氏菌抗O5通過加入67.5μl PBS c＝10mmol/l.pH 7.2(8.2.11)將7.5μl抗O5(8.3.1)稀釋10倍。
8.3.3單克隆抗沙門氏菌O抗原(8.1.8)在微量滴定板(9.20)中用67.5μl的PBS(8.2.11)稀釋7.5μl的每種單克隆(8.1.8.1、8.1.8.3、8.1.8.4、8.1.8.5、8.1.8.6、8.1.8.7)。
8.3.4稀釋三次的單克隆抗體在相同微量滴定板(8.3.3)的孔中，將25μl單克隆抗體溶液(8.3.2和8.3.3)加入50μl PBS c＝10mmol/l，pH 7.2(8.2.11)。
8.3.5重復(fù)步驟8.3.4兩次以在抗O4、抗O6、抗O7、抗O8、抗O9以及抗O10的情況下在微量滴定板的新鮮孔中獲得9和27倍稀釋的抗體。在抗O5的情況下，這些稀釋因子分別為90和270倍。
8.3.6從最高稀釋度(8.3.5)除去25μl。
8.3.7現(xiàn)在抗體溶液隨時可以使用。
注和最初制劑(8.1.8)相比，在抗O5的情況下最終稀釋度因子是100、300、900以及2700倍，而在其它情況下抗體最終被稀釋10、30、90以及270倍。
8.4輔助材料 8.4.1NAP-5柱(0.5ml，Sephadex G-25，Amersham Biosciences)。
8.4.2在0.01％含水硫柳汞中以1.25×107小珠/mL(BioRad)混合第24、25、26、27以及28號COOH-小珠(5.6μm COOH微球體)。
9.設(shè)備和儀器 提到公司時，僅是為了信息和識別目的而不意味著推薦(除非如此陳述)。等效設(shè)備和儀器可以同樣適用。
9.1分析天平(型號AE 240，Mettler，Zürich，瑞士) 9.2BioPlex 200(Bio-Rad) 9.3Bürker-Türk計數(shù)室(Mainit B.V.，Wormer，荷蘭) 9.4離心蒸發(fā)器(Jouan，Saint-Herblain，法國) 9.5Finn吸移管，5-40μl(Labsystems Oy，Helsinki，芬蘭) 9.6Finn吸移管，40-200μl(Labsystems Oy) 9.7Finn吸移管，200-1000μl(Labsystems Oy) 9.8Finn吸移管，1-5ml(Labsystems Oy) 9.9玻璃收集管，5ml，塞好的(Renes，Zeist，荷蘭) 9.10直徑為16mm的玻璃管瓶(Sarstedt B.V.，Etten-Leur，荷蘭) 9.11Gyro搖擺器SSL3(Stuart，Barloword Scientific Ltd.Stone，Staffordshire，英國) 9.12Axiovert 25顯微鏡(Zeiss，Sliedrecht，荷蘭) 9.13顯微鏡玻璃蓋載片(Chance Propper Ltd，Smethwick，Warley，英格蘭) 9.14具有微量滴定半圓頭的微搖動器(MS 1，Janke & Kunkel，Staufen，德國) 9.15直徑為7mm并具有防塵罩的聚丙烯管(Biacore) 9.16聚丙烯管，1.4ml(Micronic，Lelystad，荷蘭) 9.17pH計(型號pH 537，WTW，Weilheim，德國) 9.18聲處理浴，Branson 2200(Branson Ultrasonics B.V.，Soest，荷蘭) 9.19真空歧管，用來同時運(yùn)轉(zhuǎn)若干NAP-5柱(型號SPE-12G，具有PTFE活塞，J.T.Baker)。
9.20V形底微量滴定聚苯乙烯板，96孔規(guī)格(Greiner Bio-oneGmbH，F(xiàn)rickenhausen，德國) 9.21渦流混合器(KS-l，Janke & Kunkel) 10.軟件 用Bio-Plex Manager軟件來操作BioPlex儀器。
11.步驟 11.1LPS溶液的氧化和脫鹽 安全措施 脂多糖是有力的免疫原，在攝取或吸入以后其可以使敏感的人出現(xiàn)敗血性休克。應(yīng)采取預(yù)防措施以防止和這種生物試劑接觸。
高碘酸鈉是一種氧化劑并且當(dāng)與強(qiáng)氧化劑接觸時可能會引起爆炸。
該步驟使用了氰基硼氫鈉。因此進(jìn)行此步驟時應(yīng)采取預(yù)防措施，例如使用手套和防護(hù)罩。僅在化學(xué)通風(fēng)櫥中使用這種化學(xué)物質(zhì)。這種物質(zhì)對于水生生物是非常有毒的并且可以在水生環(huán)境中引起長期有害效應(yīng)。應(yīng)作為危險廢物處理該物質(zhì)和溶液廢棄物。
11.1.1氧化 11.1.1.1將500μl乙酸緩沖液c＝100mmol/l，pH 5.5(8.2.4)加入干LPS(8.1.9；參見安全措施) 11.1.1.2旋轉(zhuǎn)(9.21)溶液(11.1.1.1)并聲處理(9.18)20分鐘，然后觀測再生過程以便溶解所有LPS。
11.1.1.3將20μl高碘酸鹽溶液c＝50mmol/l(8.2.18)加入LPS溶液(11.1.1.2) 11.1.1.4旋轉(zhuǎn)(9.21)溶液(11.1.1.3) 11.1.1.5在冰上并避光條件下培養(yǎng)40分鐘。
11.1.1.16如在11.1.2中所描述的，通過使溶液(11.1.1.4)脫鹽來使氧化作用驟冷 11.1.2脫鹽 11.1.2.1將NAP-5柱(8.4.1)放在歧管(9.19)上。
11.1.2.2通過僅在重力作用下三部分3ml的乙酸緩沖液c＝10mmol/l，pH 4.0(8.2.2)流過柱床來對柱(11.1.2.1)進(jìn)行調(diào)節(jié)。使緩沖液完全進(jìn)入凝膠床。
11.1.2.3將0.5ml氧化LPS溶液(11.1.1.5)吸移到柱上。使樣品完全進(jìn)入凝膠床。不收集流過的溶液。
11.1.2.4用1ml乙酸緩沖液c＝10mmol/l，pH 4.0(8.2.2)洗脫經(jīng)氧化的LPS。將洗脫物收集在5ml玻璃管(9.9)中。
11.1.2.5旋轉(zhuǎn)(9.21)溶液(11.1.2.4)10秒，然后加入2μl Proclin150(8.1.7)。
11.1.2.6當(dāng)并不立即使用時(11.1.2.5)，在4℃至7℃下儲存樣品。
11.1.2.7在固定之前，如在以下表34和表35中所指出的，對可以用于不同基質(zhì)和種類用途的包含LPS的溶液(11.1.2.5)進(jìn)行稀釋。
表34.用來固定小珠的LPS溶液的量來檢測相對于豬血清中的沙門氏菌O抗原的抗體 表35.用于固定到熒光珠所使用的LPS溶液的量來檢測在雞血清中和沙門氏菌O抗原起反應(yīng)的抗體。
11.2LPS固定于小珠 11.2.1對小珠(8.4.2)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)混合最少1分鐘 11.2.2將300μL小珠(11.2.1)轉(zhuǎn)移到新鮮容器(9.16)中 11.2.3在14.000g時離心5分鐘 11.2.4利用200μl吸移管(9.6)小心地從小珠除去上層清液。
11.2.5在管瓶中留下少量的溶液(10μL)并在渦流混合器(9.21)上在剩余溶液中對小珠進(jìn)行混合。
11.2.6融化兩部分的100μl EDC(8.2.7.1) 11.2.7融化兩部分的100μl NHS溶液(8.2.9.1)。
11.2.8混合180μl的EDC(11.2.6)和180μl的NHS(11.2.7)。
11.2.9將300μl EDC/NHS混合物(11.2.8)轉(zhuǎn)移到小珠(11.2.4)然后利用吸移管精確地懸浮。
11.2.10在gyro搖擺器(9.11)上促進(jìn)反應(yīng)20分鐘。
11.2.11在14,000g時離心5分鐘。
11.2.12從小珠小心除去上清液，留下少量(大約10μL)上清液在沉淀物的頂部并利用渦流混合器(9.21)使小珠懸浮。
11.2.13將300μL 5mM碳酰肼溶液(8.2.6)加入小珠(11.2.12)然后利用吸移管精確地懸浮。
11.2.14在gyro搖擺器(9.11)上促進(jìn)反應(yīng)20分鐘。
11.2.15在14,000g時離心5分鐘，從小珠除去上清液，留下少量(大約10μL)上清液在沉淀物的頂部并利用渦流混合器(9.21)使小珠懸浮。
11.2.16將300μL 1M乙醇胺溶液(8.2.8)加入小珠(11.2.15)然后利用吸移管精確地懸浮。
11.2.17在gyro搖擺器(9.11)上促進(jìn)反應(yīng)20分鐘。
11.2.18在14,000g時離心5分鐘，從小珠除去上清液，留下少量(大約10μL)上清液在沉淀物的頂部并利用渦流混合器(9.21)使小珠懸浮。
11.2.19加入在乙酸鈉c＝10mmol/l，pH 4.0(11.1.2.7)中的300μL稀釋的氧化LPS然后利用吸移管精確懸浮。
11.2.20在gyro搖擺器(9.11)上允許反應(yīng)90分鐘。
11.2.21在14,000g時離心5分鐘，從小珠除去上清液，留下少量(大約10μL)上清液在沉淀物的頂部并利用渦流混合器(9.21)使小珠懸浮。
11.2.22加入300μL氰基氫硼化物溶液c＝100mmol/l(8.2.14)然后利用吸移管精確懸浮。
11.2.23在gyro搖擺器(9.11)上促進(jìn)反應(yīng)60分鐘。
11.2.24在14,000g時離心5分鐘，從小珠小心除去上清液，留下少量(大約10μL)上清液在沉淀物的頂部并利用渦流混合器(9.19)使小珠懸浮。
11.2.25加入300μL PBS(8.2.11)。
11.2.26加入1μL Proclin 150(8.1.7)然后混合懸浮液 11.2.27小珠準(zhǔn)備好用于試驗(yàn)在生物材料中的沙門氏菌抗體 11.2.28對LPS耦聯(lián)的小珠進(jìn)行計數(shù) 11.2.28.1旋轉(zhuǎn)LPS耦聯(lián)小珠懸浮液(11.2.25)并將1μL轉(zhuǎn)移到新鮮的1mL管(9.15)中 11.2.28.2通過加入24μL LPS c＝10mmol/l，pH 7.2(8.2.11)進(jìn)行稀釋并混合。
11.2.28.3用milliQ超純水(8.1.17)潤濕Bürker-Türk(9.3)計數(shù)室的外部載體然后將蓋玻片(9.13)從前面慢慢地推進(jìn)到計數(shù)室。
11.2.28.4用20μl小珠溶液(11.2.28.2)充滿吸移管，慢慢地在吸移管的管尖形成液滴。
11.2.28.5將此液滴(11.2.28.4)放置在蓋玻片和計數(shù)室之間。
11.2.28.6由于毛細(xì)管效應(yīng)，蓋玻片和計數(shù)室基面(base)之間的間隙會充滿。在小珠溶液可以在小室切面邊緣溢流以前，必須移走吸移管的管尖。如果可以看到任何氣泡或如果液體溢流越過邊緣并進(jìn)入槽中，則必須清洗計數(shù)室并且必須重復(fù)進(jìn)料。
11.2.28.7將充滿的計數(shù)室放置在顯微鏡(9.12)下并放大圖像10倍。
11.2.28.8可以在頂部左方角開始計數(shù)，然后沿著箭頭所示方向(圖23，下圖)。可以用降低的顯微鏡照明來增強(qiáng)計數(shù)。
11.2.28.9對在粗線區(qū)域內(nèi)(參見圖24)的16個方格(圖23，上圖)中的小珠數(shù)目進(jìn)行計數(shù)。
11.2.28.10在計數(shù)時注意 11.2.28.10.1對于所有計數(shù)室使用降低的顯微鏡照明。
11.2.28.10.2在較大方格和組方格(group squares)中的計數(shù)細(xì)胞的差異不能超過10個細(xì)胞。
11.2.28.10.3必須對所有細(xì)胞計數(shù)進(jìn)行雙重校對。在計數(shù)兩個計數(shù)網(wǎng)格以后，以相同方式計數(shù)底部計數(shù)網(wǎng)格作為校對。當(dāng)這樣做時，要確保計數(shù)室未被干燥。通過僅在計數(shù)之前不久注滿底室并在沉降時間以后計數(shù)，就可以防止干燥。
11.2.28.10.4兩個計數(shù)網(wǎng)格的總計數(shù)之間的差異不能超過10個細(xì)胞。然后計數(shù)平均值用于計算公式或按相應(yīng)系數(shù)放大。
11.2.28.11用稀釋因子(25×)放大計數(shù)的數(shù)目(11.2.28.9)除以計數(shù)面積(1mm2)和計數(shù)室深度以計算每ml小珠的濃度。
11.3抗沙門氏菌抗體的檢測 注在開始測定前確保所有溶劑和試劑容器包含足夠完成所有操作步驟的體積。
11.3.1通過30分鐘激光加熱步驟使BioPlex儀器(9.2)進(jìn)入操作狀態(tài)，接著是用適當(dāng)?shù)男Ｕ軇?8.1.3)并按照快速指導(dǎo)進(jìn)行啟動和校正步驟。
11.3.2用PBS c＝10mmol/l，pH 7.2(8.2.11)混合和稀釋LPS涂布的小珠(11.2.26)，以使每個小珠的濃度等于5000/ml。
11.3.3將50μL小珠混合物(11.3.2)轉(zhuǎn)移到已經(jīng)充滿稀釋的單克隆抗O抗原(8.3.7)的微量滴定板。
11.3.4在微量滴定板振蕩器(9.14)上培養(yǎng)30分鐘。
11.3.5加入10μL 5倍稀釋的抗小鼠Ig-PE(8.2.12)。
11.3.6在微量滴定板振蕩器(9.14)上培養(yǎng)15分鐘。
11.3.7注意記錄樣品孔以及它們的內(nèi)含物。
11.3.8將板放置在BioPlex(9.2)中，設(shè)置最大計數(shù)時間至120秒并計數(shù)至少50個小珠/LPS組。
11.3.9啟動軟件程序以計數(shù)小珠的熒光，其中所述小珠具有俘獲的(熒光)抗體。
對于步驟的概略說明參見圖21。
表36中提供了沙門氏菌單克隆抗體的典型應(yīng)答。
表36.用LPS涂布的小珠和提供信號的輔助熒光抗體培養(yǎng)的參比血清的典型應(yīng)答。
實(shí)施例10 輕度的高碘酸鹽氧化 抗沙門氏菌抗體的最終結(jié)合的成功，因而動物中侵襲性感染的篩查，在很在程度上依賴于LPS的多糖部分和LPS核心區(qū)的寡糖部分的單糖成分的氧化。根據(jù)針對例如沙門氏菌的不同血清型所描述的結(jié)構(gòu)可以推斷，氧化可以導(dǎo)致抗原結(jié)構(gòu)的破壞，其中抗原結(jié)構(gòu)尤其是LPS的多糖部分的一部分。
盡管己糖醇的氧化快速發(fā)生，但吡喃糖苷(其主要存在于沙門氏菌LPS中)需要更高的高碘酸鹽濃度以促進(jìn)同時氧化。吡喃糖醇，其具有α-赤型羥基，如在阿拉伯糖構(gòu)型、半乳糖構(gòu)型或甘露糖構(gòu)型中(如在沙門氏菌spp.LPS中)，比α-蘇型羥基，如在木糖變體或葡萄糖變體中，更容易被氧化。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，在開環(huán)以及產(chǎn)生用于附著例如蛋白質(zhì)分子的醛官能團(tuán)的同時，也可以產(chǎn)生α-羥基羰基化合物，如果高碘酸鹽仍然存在其可以再次氧化。因此，在足夠高濃度的氧化劑的情況下，正是非共軛單糖(其不是寡糖或多糖的一部分)通過高碘酸鹽氧化被完全破壞成甲酸和甲醛。在相對較高的高碘酸鹽濃度下，1，3-二酮和雙軸向二醇可以被氧化。
因此，比僅產(chǎn)生醛基更多的分解或氧化反應(yīng)將導(dǎo)致不能檢測生物材料樣品中的感染，盡管對于由包含多胺的分子(如蛋白質(zhì))的存在所支撐的固相具有良好的偶聯(lián)反應(yīng)。換言之，需要高碘酸鹽輕度反應(yīng)以使抗原結(jié)構(gòu)不受損，但足以使蛋白質(zhì)和固相之間的耦聯(lián)成為可能。
結(jié)果 利用一定濃度范圍的偏高碘酸鈉并在pH 5.5的條件下氧化來自Se、Sg、Sl以及St的LPS 40分鐘。氧化以后，將LPS耦聯(lián)于生物傳感器表面并監(jiān)測固定效率和抗原活性。
從圖25可以明顯看到，來自腸炎沙門氏菌的LPS的更高氧化度在生物傳感器芯片上產(chǎn)生相應(yīng)更高的涂層水平。然而，盡管更高的固定水平，來自抗體探測的應(yīng)答會降低，如圖26和圖27所示。對于這種類型的LPS，確定了1.8mM的最佳高碘酸鹽濃度。
以類似的方式，試驗(yàn)了氧化對來自黃金海岸沙門氏菌的LPS的固定和抗原活性的影響(圖28和圖29)。研究發(fā)現(xiàn)，高碘酸鈉濃度具有相同最佳值(1.8mM)。對于利文斯通沙門氏菌，獲得了類似的結(jié)果(圖30和圖31)。還發(fā)現(xiàn)偏高碘酸鹽的最佳值為1.8mM。
實(shí)施例11 從沙門氏菌spp.提取脂多糖 警告和安全措施 沙門氏菌spp.，其用于本提取方法以獲得脂多糖(LPS)，屬于二類危險微生物。二類危險微生物被描述如下它們可以誘導(dǎo)疾病如腹瀉和發(fā)熱，但疾病的擴(kuò)散可能不會發(fā)生，并且有有效的預(yù)防或治療方法。因此，當(dāng)使用活細(xì)菌進(jìn)行操作時，應(yīng)采取預(yù)防措施，如用70％乙醇對設(shè)備和手進(jìn)行消毒。活沙門氏菌spp.的廢棄物應(yīng)分別通過高壓滅菌或作為生物有害廢棄物加以破壞或處理。
LPS化合物是高度致熱的并且可以引起發(fā)熱。為了避免吸入，要小心處理LPS的水溶液并且當(dāng)處理固體材料時戴面罩。如果任何這些化合物進(jìn)入血流，則立即就診。
引言 沙門氏菌是革蘭氏陰性菌，并且它的外膜包括各種抗原結(jié)構(gòu)，其中包括鞭毛、外膜蛋白以及脂多糖(LPS)。LPS分子包括所謂脂質(zhì)A部分(其被包埋在外膜的小葉中)、核心區(qū)以及多糖。核心區(qū)由兩個或三個庚糖以及八碳原子、帶負(fù)電荷的單糖KDO的兩個或三個殘基組成。核心區(qū)將脂質(zhì)A連接于多糖，其還稱作O側(cè)鏈。就菌株之間的長度和組成而論，該O側(cè)鏈?zhǔn)歉叨瓤勺兊模⑶以诰陜?nèi)受到沙門氏菌生長條件的影響。盡管有變化，但以PS編碼的抗原結(jié)構(gòu)對于一定的沙門氏菌血清變型是唯一的。事實(shí)上，抗原結(jié)構(gòu)O3、O4、O6/7、O8、O9、O10以及O12占大約90％的已知存在于豬產(chǎn)品(尤其是荷蘭屠宰場)中的沙門氏菌血清變型。
為了檢測對O抗原的體液應(yīng)答(作為家畜暴露于沙門氏菌的指征)，LPS可以用來探測產(chǎn)生的抗體與這些生物分子的結(jié)合。為此，可以提取來自鼠傷寒沙門氏菌(O4、O5、O12)、腸炎沙門氏菌(O9、O12)、利文斯通沙門氏菌(O6/O7)、黃金海岸沙門氏菌(O6、O8)以及火雞沙門氏菌(O3、O10)的LPS。
內(nèi)部的提取是最重要的，因?yàn)閬碜詢H有限數(shù)目的沙門氏菌血清變型的LPS可商業(yè)上獲得。此外，內(nèi)部的生產(chǎn)可以保證連續(xù)獲得用于成功抗體檢測測定的LPS類型。為此本文描述的內(nèi)部的提取方法是基于由Staub(0)描述的實(shí)驗(yàn)記錄。三氯乙酸(TCA)提取包含1-10％蛋白質(zhì)污染的LPS。此產(chǎn)物適用于將LPS共價固定于涂布在生物傳感器芯片的金金屬表面上的羧甲基化葡聚糖層(參見SOPCHEMIE/A22(實(shí)施例12))。固定有LPS的芯片連同Biacore光學(xué)SPR生物傳感器裝置可以用來追蹤血清中的沙門氏菌-LPS抗體(同樣看作已知血清特征)。
1.應(yīng)用的范圍和領(lǐng)域 該方法描述了借助于三氯乙酸從若干沙門氏菌血清變型提取LPS。提取的LPS適合于改性以方便其固定在羧甲基化葡聚糖表面上。
2.參考文獻(xiàn) Staub，A.M.，Methods in Carbohydrate Chemistry，5，92(1965) SPO Chemie/A22Immobilisation of Salmonella-derived LPSonto a biosensor chip(Biacore)and detection of serum antibodiesreporting a current or past Salmonella infection(實(shí)施例12)。
SOP Chemie/A23Optimalisation of protein addition to LPSforimmobilization and detection of serum antibodies(實(shí)施例13)。
3.定義 c＝濃度，如所指定的以％(m/v)、％(v/v)、mol/l或mmol/l作為單位。
4.縮寫詞清單 4.1BGA亮綠瓊脂 4.2BHI腦心浸液 4.3BHIa腦心浸液瓊脂 4.4LPS脂多糖 4.5NB營養(yǎng)肉湯 4.6NaCl氯化鈉 4.7NaOH氫氧化鈉 4.8TCA三氯乙酸 5.原理 脂多糖(LPS)是借助于三氯乙酸(TCA)并通過沙門氏菌的提取來獲得。在腦心浸液瓊脂板上培養(yǎng)沙門氏菌，然后從腦心浸液瓊脂板上收集沙門氏菌。在若干洗滌步驟(用鹽溶液)和若干離心步驟以后，加入TCA。在低溫下培養(yǎng)酸化的懸浮液3小時以溶解來自細(xì)菌細(xì)胞的LPS。離心懸浮液以除去細(xì)胞物質(zhì)并中和pH。然后在低溫下通過乙醇沉淀法部分地純化和濃縮LPS。最后，通過透析除去鹽和乙醇，然后通過離心作用將在保留的包含LPS的溶液中的剩余顆粒沉淀出來。凍干上清液并稱量以確定產(chǎn)生的LPS的回收率。
6.試劑和材料 在所有的操作步驟中，除非另有說明，僅使用認(rèn)可的分析級試劑和蒸餾水或相當(dāng)純度的水。提到公司時，僅是為了信息和識別目的而不意味著推薦(除非如此陳述)。
6.1化學(xué)藥品 6.1.1亮綠瓊脂(Oxoid，Basingstroke，英格蘭，CM329) 6.1.2腦心浸液(Oxoid，CM225) 6.1.3腦心浸液瓊脂(Oxoid，CM375) 6.1.4無水乙醇(Merck，Darmstad，德國，1.00983.2500) 6.1.587％甘油(Merck，1.04091.1000) 6.1.6第2號營養(yǎng)肉湯(Oxoid，67) 6.1.7氯化鈉(Merck，1.06404.1000) 6.1.8氫氧化鈉(Merck，1.06498.1000) 6.1.9乙二醇(Merck，9621.2500) 6.1.10三氯乙酸(Merck，1.00807.0250) 6.1.11水獲自Milli Q純化裝置(8.24) 6.2沙門氏菌凝集血清 6.2.1抗O4(Pro-Lab diagnostics，Salmonella reference section ofthe Central Veterinary Laboratory，Weybridge，英國) 6.2.2抗O5(Pro-Lab diagnostics) 6.2.3抗O6，7(Pro-Lab diagnostics) 6.2.4抗O8(Pro-Lab diagnostics) 6.2.5抗O9(Pro-Lab diagnostics) 6.2.6抗O 12(Pro-Lab diagnostics) 6.2.7抗O多A-S(相對于組A至組S的抗血清)(Pro-Labdiagnostics) 6.2.8抗O多E(相對于因子O3、O10、O15、O19、O34的抗血清)(Pro-Lab diagnostics) 6.3菌株 6.3.1腸炎沙門氏菌(23號，噬菌體1型菌株RIVM，荷蘭；90-16-706) 6.3.2黃金海岸沙門氏菌(Division’s working bank，UtrechtUniversity，荷蘭) 6.3.3利文斯通沙門氏菌(Division’s working bank) 6.3.4火雞沙門氏菌(Division’s working bank) 6.3.5鼠傷寒沙門氏菌X-193(ASG，Lelystad) 6.4試劑 除非另有說明，所有制備的介質(zhì)在2-8℃下可以儲存3個月。
在瓊脂培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿中分散以后，在室溫冷卻平皿。在瓊脂硬化以后，顛倒平皿并在桌面上室溫干燥2至3天。
6.4.1亮綠瓊脂(BGA)平皿在1.0L水(6.1.11)中懸浮52克BGA(6.1.1)。煮沸以完全溶解培養(yǎng)基。充分混合并在培養(yǎng)皿(7.29)中分散15ml。
6.4.2腦心浸液(BHI)液體培養(yǎng)基在1.0L水(6.1.11)溶解37克BHI液體培養(yǎng)基(6.1.2)。充分混合，分配到最終容器然后通過在121℃下高壓滅菌15分鐘進(jìn)行滅菌。
6.4.3腦心浸液瓊脂(BHIa)在1.0L水(6.1.11)中懸浮47克BHI瓊脂(6.1.3)。煮沸以完全溶解培養(yǎng)基。充分混合并將15ml在分散在培養(yǎng)皿(7.29)中。
6.4.4冷卻溶液混合1.0L乙二醇(6.1.9)和3L水(7.1.11) 6.4.5冷乙醇在冷凍箱(-18℃)(7.1.11)中儲存1L乙醇(6.1.4) 6.4.6無菌87％甘油在121℃下對50ml甘油(6.1.5)進(jìn)行高壓滅菌15分鐘。
6.4.7營養(yǎng)肉湯(NB)在1.0L水(6.1.11)中溶解25克NB(6.1.6)。充分混合，分配到100ml的燒瓶中然后通過在121℃下高壓滅菌15分鐘進(jìn)行滅菌。
6.4.8鹽水(c＝0.9％(m/v))在1.0L水(6.1.11)中溶解9克氯化鈉(NaCl)(6.1.7)。使用前，在冰凍器中冷卻鹽水過夜。
6.4.9三氯乙酸(TCA)溶液，c＝0.25mol/l在1.0L水(6.1.11)中溶解40.8克TCA(6.1.10)。
6.4.10三氯乙酸(TCA)溶液，c＝0.50mol/l在1.0L水(6.1.11)中溶解81.7克TCA(6.1.10)。
6.4.11氫氧化鈉(NaOH)溶液，c＝5.0mol/l在200ml水(6.1.11)中溶解40克NaOH(6.1.8)。
6.4.12氫氧化鈉(NaOH)溶液，c＝0.10mol/l在49.0ml水(6.1.11)中稀釋1.0ml c＝5mol/l的NaOH(6.4.11)。
7.設(shè)備和儀器 提到公司時，僅是為了信息和識別目的而不意味著推薦(除非如此陳述)。等效設(shè)備和儀器可以同樣適用。
7.1分析天平(型號AE240，Mettler，Zürich，瑞士)，稱量范圍0-40克(SOP CHEMIE/011) 7.2天平(型號MC1 LC2000P，Sartorius Instrumenten BV，Nieuwegein，荷蘭) 7.3高速離心機(jī)(T-124 Centrikon，Kontron，Zürich，瑞士) 7.4超高速離心機(jī)(RC-5B，Sorvall，Newton，Connecticut，美國) 7.5聚丙烯離心管，用于Centrikon 290ml(253483，Beun deRonde，Abcoude，荷蘭) 7.6離心管，用于回轉(zhuǎn)器SM-24，Sorvall(Sorvall) 7.7錐形管(50ml)(Cellstar 210261，Greiner bio-one，Alphena/d Rijn，荷蘭) 7.8錐形管(15ml)(Cellstar 188271，Greiner bio-one) 7.9低溫管(1.8ml)(Cryo’s 122261，Greiner bio-one) 7.10透析膜夾(Part#CB-1050，Cellu Sep，Membrance FiltrationProducts Inc.，Seguin，Texas，美國) 7.11Spectra/Por透析管MwCO 1000(Spectrum Laboratories Inc.，Rancho Dominguez，Califomia，美國) 7.12Finn吸移管，200-1000μl(Labsystems Oy，Helsinki，芬蘭) 7.13Finn吸移管，40-200μl(Labsystems Oy，Helsinki，芬蘭) 7.14Finn吸移管，5-40μl(Labsystems Oy，Helsinki，芬蘭) 7.15凍干儀(7570001，Labconco Corporation，Kansas City，Missouri，美國) 7.16冷凍箱，-18℃，冷凍范圍-16至-25℃(Elbanton，Kerkdriel，荷蘭) 7.17冷凍箱，-80℃(U57085 Classic，New BrunschwickScientific BV，Nijmegen，荷蘭) 7.18玻璃燒杯，15L(Schott-Duran，Omnilabo International BV，Breda，荷蘭) 7.19載玻片(AA00000102E，Menzel-Glaser，Braunschweig，德國) 7.20冰鹽浴在加入150ml自來水以后混合大約150克NaCl(7.1.7)和3L冰屑(crunch) 7.21自制-4℃培養(yǎng)器(測得的液體與乙醇沉淀LPS提取物(9.3.37)的接觸溫度，大約l℃) 7.21.1循環(huán)冷凝器；設(shè)置溫度-4℃(WK230，Lauda，Lauda-Knigshofen，德國) 7.21.2中心冷卻核PROTEAN II(165-1806，BioRad laboratoriesB V，Veenendaal，荷蘭) 7.21.3聚苯乙烯盒和定位塑料離心機(jī)轉(zhuǎn)筒(fitting plastic innerbowl) 7.21.3.1整個系統(tǒng)(8.22.1，8.22.2)注滿冷卻溶液(7.4.4) 7.22磁攪拌器(EM3300T，LaboTech B.V.，Ochten，荷蘭) 7.23Milli Q水純化裝置(Millipore，Bedford，Ma，美國) 7.24pH計(型號pH 537，WTW，Weilheim，德國) 7.25冷凍裝置(Elbanton) 7.26Centrikon回轉(zhuǎn)器(A6.14，Kontron) 7.27Sorvall回轉(zhuǎn)器(SM-24，Sorvall) 7.28Drigalski玻璃刮勺(408014，Omnilabo International BV) 7.29培養(yǎng)皿(633102，Greiner bio-one) 7.30附加的Powerpette(Jencons，Bedfordshire，英格蘭) 7.31渦流混合器(KS-l，Janke & Kunkel，Staufen，德國) 8.步驟 8.1制備儲用培養(yǎng)物 8.1.1通過一個菌落、或接種環(huán)的內(nèi)含物鋪展在BGA平皿(6.4.1)上來制作沙門氏菌(6.3)的分離菌。
8.1.2在37℃下培養(yǎng)平皿(8.1.1)過夜。
8.1.3用接種環(huán)從平皿(8.1.2)挑選單個菌落然后懸浮在100mlNB(6.4.7)中 8.1.4在37℃下培養(yǎng)過夜 8.1.5將50ml甘油(6.4.5)加入100ml培養(yǎng)的NB培養(yǎng)基(8.1.4)中 8.1.6將培養(yǎng)基/甘油混合物(8.1.5)等分加入11個14ml(7.9)(容積為12.5ml)和12個1.5ml(7.10)(容積為1ml)的無菌管中。
8.1.71.5ml管之一被標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)庫。借助于本文描述的方法(8.1)，此管的內(nèi)含物將僅用來制備1和12.5ml的更多等分部分。
8.1.8在-80℃快速冷凍等分部分(8.1.6)并儲存直到使用。
8.2通過凝集作用確定沙門氏菌分離菌純度 8.2.1將25μl(7.15)無菌鹽水(6.4.8)吸移到載玻片(7.20)上。
8.2.2將來自平板培養(yǎng)的沙門氏菌(8.1.2)的一個菌落懸浮在鹽水(6.4.8)中。
8.2.3利用便易的容器滴落裝置(container drop system)加入單滴凝集血清(6.2)。
8.2.4通過慢慢地、前后地傾斜載玻片兩分鐘來混合血清和懸浮液。
8.2.5通過在黑色背景的前面查看聚集形成來確定凝集。
8.2.6通過比較聚集結(jié)果和表37來揭示沙門氏菌株的類別。
8.2.7當(dāng)培養(yǎng)的菌株類別不同于在表37中預(yù)測的聚集時，可以斷定，試驗(yàn)的培養(yǎng)物并不(僅僅)是由預(yù)期的沙門氏菌血清型組成。在這樣的情況下，必須制備新的儲用培養(yǎng)物。
8.3提取方法 8.3.1制備120個BHI瓊脂平板(6.4.3)。
8.3.2融化具有沙門氏菌儲用培養(yǎng)物(8.1.8)的12.5ml管。
8.3.3用刮勺(7.29)將100μl(7.14)儲用培養(yǎng)物(8.1.8)鋪展在每個平板(8.3.1)上。
8.3.4在37℃下培養(yǎng)過夜。
8.3.5用10L水(6.1.11)裝滿15L的容器(7.19)，然后在冷凍裝置(7.26)中冷卻到4-8℃直到使用。
8.3.6稱量(7.3)6個空的離心管(7.6)并在質(zhì)量表上記錄它們的重量(參見圖32)。
8.3.7將milliQ(6.1.11)和TCA(6.4.9、6.4.10)容器放入制備的冰鹽浴(7.21)中。
8.3.8取培養(yǎng)過夜的二十個平板(8.3.4)然后向每個平板加入1ml的鹽水。
8.3.9通過在瓊脂上輕刮(作圓形移動)Drigalski刮勻(7.29)并在鹽水中制作細(xì)菌的懸浮液，來收獲細(xì)菌。
8.3.10將懸浮液收集在6個預(yù)稱量的離心管(8.3.6)之一中。
8.3.11用2ml鹽水(6.4.8)溶液洗滌每個平板(8.3.9)兩次。
8.3.12合并懸浮液(8.3.11)和離心管(6.3.10)的內(nèi)含物。
8.3.13對剩余的平板(8.3.4)重復(fù)步驟8.3.8至8.3.12五次。
8.3.14將100ml鹽水(6.4.8)加入每個離心管。
8.3.15確定管(8.3.14)的皮重。
8.3.16在10,000xg和4℃(7.4，7.27)下離心15分鐘。
8.3.17將上清液移注到廢棄物容器中。
8.3.18在10ml鹽水(6.4.8)懸浮每種細(xì)菌沉淀物直到形成均勻的懸浮液。
8.3.19將75ml鹽水(6.4.8)加入每個離心管。
8.3.20重復(fù)步驟8.3.14至8.3.19一次。
8.3.21重復(fù)步驟8.3.15至8.3.17一次。
8.3.22稱量(7.3)具有細(xì)菌沉淀物(8.3.21)的管并在質(zhì)量表上記錄稱量結(jié)果(參見表32)。
8.3.23通過從包含細(xì)胞管(8.3.22)的重量減去空管(8.3.6)的重量確定沉淀細(xì)菌的質(zhì)量(＝m)。
8.3.24借助于10ml吸移管(7.31)并通過重復(fù)吸入和洗滌，用x ml(為了確定x，參見表38)的水(6.1.11)懸浮細(xì)菌沉淀物(8.3.22)。
8.3.25將兩個離心管的懸浮液合并在一個管中。
8.3.26對于剩余的離心管重復(fù)8.3.25。
8.3.27加入x ml的y M TCA(6.4.10)(關(guān)于x和y的數(shù)值，參見表38)。
8.3.28在每個懸浮液(8.3.27)中插入攪棒。
8.3.29在磁攪拌器(7.23)上并在4℃下攪拌懸浮液(8.3.28)3小時。
8.3.30移走攪棒。
8.3.31在20,000xg和4℃(7.5，7.28)下離心懸浮液30分鐘。
8.3.32將離心管的上清液收集在500ml燒瓶中。
8.3.33用5M NaOH(6.4.11)和0.10M NaOH(6.4.12)將上清液的pH調(diào)節(jié)至pH 6.5。
8.3.34確定pH經(jīng)調(diào)節(jié)的上清液(8.3.33)的容積(V)。
8.3.35通過將加注的燒瓶(8.3.34)放入-18℃冷凍箱(7.17)中30分鐘，使上清液冷卻到冰點(diǎn)。
8.3.36加入2*e ml(對于e的數(shù)值參見表38)冰冷的乙醇(6.4.5)。
8.3.37在-4℃(7.21)下冷卻溶液過夜。
8.3.38將溶液分配到6個離心管(7.6)。
8.3.39在20,000xg和4℃(7.4，7.27)下離心溶液30分鐘。
8.3.40從透析管(7.12)切取三部分(每個部分的長度為10cm)。
8.3.41用水(6.1.11)簡短地洗滌透析袋(8.3.40)并保持它們濕潤在水(6.1.11)中直到進(jìn)一步使用。
8.3.42在透析管(8.3.41)的一端夾住膜夾(7.11)，留下1cm管不受約束。
8.3.43將上清液(8.3.39)移注到廢棄物瓶中。
8.3.44借助于吸移管(7.13)從離心管移走剩余的上清液。
8.3.45將1ml水(6.1.11)加入每個離心管(8.3.44)中。
8.3.46借助于1ml吸移管(7.13)并通過吸入和沖洗來懸浮沉淀物。
8.3.47用兩個離心管的再懸浮沉淀物(8.3.46)裝滿制備的透析袋(8.3.42)之一。
8.3.48用(z-1)/6ml(對于z的值，參見表38)水(6.1.11)洗滌每個管，然后合并洗滌物和透析袋(8.3.47)的內(nèi)含物。
8.3.49在裝滿的透析管(8.3.48)的頂部夾住另一個夾(6.10)，在溶液和夾之間留下小氣泡。
8.3.50對剩余的離心管重復(fù)步驟8.3.42至8.3.49。
8.3.51將三個裝滿的透析管放入4℃的預(yù)冷卻水(8.3.5)中。
8.3.52在磁攪拌器(7.23)上，在4℃和連續(xù)溫和攪拌條件下，培養(yǎng)透析管(8.3.51)的內(nèi)含物兩天。
8.3.53通過用7L新鮮的預(yù)冷卻水(6.1.11)對水進(jìn)行更換，以更新透析物至少兩次。
8.3.54將透析管的內(nèi)含物收集在50ml容器(7.8)中。
8.3.55將收集的容積(8.3.54)分配在離心管(7.7)中。
8.3.56在20,000xg和4℃(7.5)下對管進(jìn)行離心30分鐘。
8.3.57在分析天平(7.2)(沒有罩)上稱量空的50ml容器(7.8)并在質(zhì)量表上記錄其重量(參見圖32)。
8.3.58將上清液(8.3.56)收集在預(yù)稱量的容器(8.3.57)中。
8.3.59在-80℃的冷凍箱(6.15)中冷凍上清液。
8.3.60凍干(6.15)冷凍的上清液(8.3.59)直至觀察到干燥白色晶體結(jié)構(gòu)。
注小心處理凍干的LPS，因?yàn)樗撵o電特性可以容易地使它空氣傳播。
注LPS是眾所周知的毒素，當(dāng)人吸入或吞下時其可以誘導(dǎo)臨床效應(yīng)。應(yīng)嚴(yán)格遵守安全措施，如面罩，以防止任何中毒。
8.3.61在分析天平(7.2)上稱量容納凍干的LPS的容器(8.3.60)并在質(zhì)量表上記錄獲得的質(zhì)量(參見圖32)。
8.3.62計算LPS的產(chǎn)率(LPS重量(8.3.61)-容器重量(8.3.57))/凈細(xì)胞總質(zhì)量(8.3.23)*100％。
8.3.63在4℃下在封閉容器中儲存凍干的LPS粉末直到使用。
該步驟的概要描述在圖33中。
表37.用于凝集讀數(shù)的檢查板，用來依據(jù)沙門氏菌種類和沙門氏菌血清變型揭示所存在細(xì)菌的類別 圖注+＝聚集形成，凝集陽性 -＝?jīng)]有聚集形成，凝集陽性 表38.轉(zhuǎn)換表，用來確定用于提取和沉淀的水(x)、TCA(x)、乙醇(e)的容積以及TCA濃度(y)，以及用于透析步驟(以從沙門氏菌分離和純化LPS)的水(z)的容積。
字母說明m是指質(zhì)量(9.3.23)，而v是指pH經(jīng)調(diào)節(jié)的上清液容積(9.3.34)。
n.ey.還未確定。
實(shí)施例12 將源自沙門氏菌的LPS固定到生物傳感器芯片(biacore)上并對報道目前或過去沙門氏菌感染的血清抗體進(jìn)行檢測 0.警告和安全措施 脂多糖是有力的免疫原，其在攝取或吸入以后可以使敏感的人出現(xiàn)敗血性休克。應(yīng)采取預(yù)防措施以防止和這種生物試劑接觸。
高碘酸鈉是一種氧化劑并且當(dāng)與強(qiáng)氧化劑接觸時可能會引起爆炸。
該步驟使用了氰基硼氫鈉。因此進(jìn)行此步驟時應(yīng)采取預(yù)防措施，例如使用手套和防護(hù)罩。僅在化學(xué)通風(fēng)櫥中使用這種化學(xué)物質(zhì)。這種物質(zhì)對于水生生物是非常有毒的并且可以在水生環(huán)境中引起長期有害效應(yīng)。應(yīng)作為危險廢物處理該物質(zhì)和溶液廢棄物。
1.引言 在沙門氏菌屬的抗原結(jié)構(gòu)的成分中，菌體抗原是重要的，其可以作為一種方法來追蹤在這種微生物侵入性感染以后動物的免疫應(yīng)答。菌體抗原位于脂多糖(LPS)的多糖部分上，其是細(xì)菌細(xì)胞壁的成分。在提取和分離小心選擇的LPS以后(參見SOPCHEMIE/A21(實(shí)施例11))，包含抗原的LPS共價耦聯(lián)于生物傳感器芯片表面，以血清特征上監(jiān)測樣品是否存在抗沙門氏菌抗體，其中借助于它們與固定在芯片表面上的包含抗原的LPS的結(jié)合(參見SOP CHEMIE/A23(實(shí)施例13))。該SOP描述了用于氧化、LPS固定到生物傳感器芯片(BIACORE)上以及血清中抗體分析的方法。
2.應(yīng)用的范圍和領(lǐng)域 為了分析來自雞的血清樣品是否存在抗沙門氏菌抗體，這些抗體和O4、5、6、7、8、9以及12菌體抗原起反應(yīng)。
3.參考文獻(xiàn) Concentration Analysis Handbook，Version AA，December 2001，Biacore AB，Uppsala，Sweden BLAapplications Handbook，Version AB(reprinted 1998)，Biacorehttp//www.jp.amershambiosciences.com/tech_support/manual/pdf/dnapuri/52207400af.pdf SOP Chemie/A21Extraction of lipopolysaccharides fromSalmonella spp.(實(shí)施例11) SOP Chemie/A23Optimalisation of protein addition to LPSforimmobilization and detection of serum antibodies(實(shí)施例13)。
4.定義 c＝濃度，如所指定的以％(m/v)、％(v/v)、mol/l或mmol/l作為單位。
5.縮寫詞清單 5.1.1EDCN-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺氫氯化物 5.1.2NHSN-羥基琥珀酰亞胺 5.1.3LPS Se來自腸炎沙門氏菌血清變型 5.1.4LPS Sg來自黃金海岸沙門氏菌血清變型 5.1.5LPS Sl來自利文斯通沙門氏菌血清變型 5.1.6LPS Sm來自火雞沙門氏菌血清變型 5.1.7LPS St來自鼠傷寒沙門氏菌血清變型 6.原理 在有蛋白質(zhì)存在的情況下并由高碘酸鈉促進(jìn)，氧化LPS。利用NAP-5柱使LPS-蛋白質(zhì)溶液脫鹽。在借助于1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)以及碳酰肼活化在生物傳感器芯片上的羧甲基葡聚糖層以后，將LPS-蛋白質(zhì)復(fù)合物固定到CM5芯片上。然后用氰基硼氫鈉穩(wěn)定結(jié)合的LPS。常規(guī)使用前，利用一組參比多單克隆凝集血清對生物傳感器芯片軛合的LPS結(jié)合于抗沙門氏菌抗體的性能進(jìn)行評估。
7.反應(yīng) 7.1碳水化合物部分的氧化 高碘酸鹽將誘導(dǎo)尤其在碳水化合物部分上的鄰二醇之間鍵合的氧化破壞(如在例如甘露糖中)以產(chǎn)生醛官能團(tuán)。此反應(yīng)通常在暗處以及在緩沖液(pH范圍在4.5和5.5之間)中進(jìn)行，其中使用新鮮制備的在0.1M乙酸鈉中的10-100mM偏高碘酸鈉(圖18)。
注1在此方案中指示的用來連接多糖中(如在例如LPS中)的單糖的共軛位置只是示例性的。R’和R分別表示在糖鏈中的遠(yuǎn)側(cè)和近側(cè)位置。在多糖鏈內(nèi)、在包含鄰二醇的每個單糖成分中，氧化成醛本身可以重復(fù)。
注2高碘酸鹽(當(dāng)存在時)也將氧化某些β-氨基乙醇衍生物如在膠原中的羥賴氨酸殘基、以及蛋氨酸(氧化成其亞砜)和某些硫醇(通常氧化成二硫化物)。此外，借助于高碘酸鹽可以將肽和蛋白質(zhì)的N端絲氨酸和蘇氨酸殘基選擇性地氧化成醛基。然而，這些反應(yīng)的速率通常低于鄰二醇氧化的速率。
7.2軛合到蛋白 在有蛋白質(zhì)存在的情況下進(jìn)行氧化作用。二醛化合物，如在本文的LPS的多糖鏈中的氧化的單糖成分，可以和在蛋白質(zhì)中的任何氨基起反應(yīng)并可以形成產(chǎn)生取代的亞胺的希夫堿鍵合(圖19)。
注通過氰基硼氫鈉促進(jìn)的還原作用(還原性胺化作用)(amination)，穩(wěn)定取代的亞胺，同時復(fù)合物附著到葡聚糖表面。
7.3固定到傳感器表面 利用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺氫氯化物(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化傳感器芯片處在的羧甲基化葡聚糖層?；罨饔靡院笫呛吞茧逻M(jìn)行反應(yīng)?；钚匀┕倌軋F(tuán)自發(fā)地和酰肼起反應(yīng)以形成腙，其然后被還原以穩(wěn)定共價鍵(圖34)。
注蛋白質(zhì)R″攜帶多個-NH2基團(tuán)并因此可以軛合多個氧化的LPS本體。另一方面，在LPS中的多糖部分可以攜帶在單個分子中的多個游離醛基。酰肼-葡聚糖層可以部分或完全地俘獲這些醛基。凈結(jié)果可以是在表面上的蛋白質(zhì)-LPS-葡聚糖的非常穩(wěn)定的復(fù)合物網(wǎng)絡(luò)。
8.試劑和材料 在所有的操作步驟中，除非另有說明，僅使用認(rèn)可的分析級試劑和蒸餾水或相應(yīng)純度的水。提到公司時，僅是為了信息和識別目的而不意味著推薦(除非如此陳述)。
8.1化學(xué)藥品 8.1.1乙酸(J.T.Baker，Deventer，荷蘭) 8.1.2胺耦聯(lián)試劑盒(Biacore AB，Uppsala，瑞典)，其包括 8.1.2.1包含115mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的管瓶 8.1.2.2包含750gm 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDC)的管瓶 8.1.2.3包含10.5ml、c＝1mol/l乙醇胺氫氯化物-氫氧化鈉(pH8.5)的管瓶 8.1.3CHAPS(Plus one，Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典) 8.1.4碳酰肼，CN4H6O(Fluka Chemie GmbH，Buchs，瑞士) 8.1.5羧甲基-葡聚糖鈉鹽(Fluka) 8.1.6甘氨酸，c＝10mmol/l pH 1.5(Biacore) 8.1.7鹽酸胍(Calbiochem，San Diego，CA，美國) 8.1.8HBS-EP緩沖液(Biacore)，其包含HEPES緩沖劑，c＝10mmol/l，pH 7.4；氫氧化鈉，c＝150mmol/l；EDTA，c＝3mmol/l；以及表面活性劑P20，C＝0.005％(v/v)。
8.1.9沙門氏菌抗型特異性單克隆試驗(yàn)試劑 8.1.9.1抗沙門氏菌gr.B(SIFIN，Berlin，德國)，包含mAb抗O4、O5、O27 8.1.9.2抗沙門氏菌gr.C(SIFIN)，包含mAb抗O7、O8 8.1.9.3抗沙門氏菌gr.D(SIFIN)，包含mAb抗O9、Vi 8.1.9.4抗沙門氏菌gr.E(SIFIN)，包含mAb抗O3、O19 8.1.10沙門氏菌單價“O”體細(xì)胞抗血清 8.1.10.1抗O4(Pro-Lab diagnostics，Salmonella reference sectionof the Central Veterinary Laboratory.Weybridge，英國) 8.1.10.2抗O5(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.3抗O6，7(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.4抗O8(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.5抗O9(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.6抗O10(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.7抗O12(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.8抗O19(Pro-Lab diagnostics) 8.1.10.9抗O多E(O3、O10、O15、O19、O34；Pro-Labdiagnostics) 8.1.11沙門氏菌多價“O”體細(xì)胞抗血清 8.1.11.1抗O多A-S(O2、O3、O4、O5、O6，7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O28、O30、O34、O35、O38、O40、O41；Pro-Lab diagnostics) 8.1.12沙門氏菌LPS，通過TCA提取機(jī)構(gòu)內(nèi)部分離的LPS(SOPCHEMIE/A21(實(shí)施例11))，借助于蛋白質(zhì)制備自沙門氏菌細(xì)菌血清變型腸炎沙門氏菌(Se)、黃金海岸沙門氏菌(Sg)、利文斯通沙門氏菌(Sl)、火雞沙門氏菌(Sm)以及鼠傷寒沙門氏菌(St)(SOPCHEMIE/A23，實(shí)施例13) 8.1.12.1.1在+4℃或更低溫度儲存0.5mg LPS的等分部分。
8.1.13禽類參比血清 8.1.13.1SPF-CH，SPF血清，稱作陰性對照血清(Animal HealthService Ltd.(GD)，Deventer，荷蘭) 8.1.13.2ELA-SE，腸炎沙門氏菌陽性對照血清，來自雞并供ELISA(GD)之用 8.1.13.3ELA-ST，鼠傷寒沙門氏菌陽性對照血清，來自雞并供ELISA(GD)之用 8.1.13.4SPA-PG，雞瘟沙門氏菌陽性對照血清，來自雞并供ELISA(GD)之用 8.1.13.5CH-SI，嬰兒沙門氏菌陽性對照血清，來自雞并供ELISA(GD)之用 8.1.14乙酸鈉三水合物(J.T.Baker，Phillipsburgh，NJ，美國) 8.1.15氯化鈉(Merck，Darmstadt，德國) 8.1.16氰基硼氫鈉(NaCNBH3)(Fluka) 8.1.17氫氧化鈉，c＝50mmol/l(Biacore) 8.1.18高碘酸鈉(Sigma Chemical Comp.，St.Louis，MO，美國) 注此化學(xué)藥品是光敏的。避光儲存此物質(zhì)。
8.1.19表面活性劑(Triton X-100)(Sigma) 8.1.20吐溫20(Sigma) 8.1.21吐溫80(Sigma) 8.1.22水獲自Milli Q水純化裝置(MilliQplus) 8.2溶液 8.2.1乙酸溶液，c＝0.1g/ml用9ml水稀釋1ml乙酸(8.2)。
8.2.2乙酸緩沖溶液，c＝10mmol/l，pH 4.0將0.272g乙酸鈉三水合物(8.2.14)溶解在180ml水中，用乙酸(8.3.1)調(diào)節(jié)至pH4.0，然后補(bǔ)充水至200ml。此緩沖液可穩(wěn)定大約6個月。
8.2.3乙酸緩沖溶液，c＝1.0mol/l，pH 5.5將13.6g乙酸鈉三水合物(8.2.14)溶解在90ml水中，用乙酸(8.3.1)調(diào)節(jié)至pH 5.5，然后補(bǔ)充水至100ml。此緩沖液可穩(wěn)定大約6個月。
8.2.4乙酸緩沖液，c＝100mmol/l，pH 5.5用9.0ml水稀釋1.0ml乙酸緩沖溶液，c＝1.0mol/l(8.3.3)。
8.2.5碳酰肼溶液，c＝100mmol/l將9.0mg碳酰肼(8.2.4)溶解在1000μl水中。
8.2.6碳酰肼溶液，c＝5mmol/l用190μl水稀釋10μl碳酰肼溶液(8.3.5)。使用前制備。
8.2.7CHAPS溶液，c＝0.05％(m/v)將0.02g(8.2.3)溶解在40ml HBS-EP(8.2.8)中。
8.2.8去污溶液，c＝0.3％(m/v)在100ml水中溶解0.3g CHAPS(8.2.3)、0.3g吐溫20(8.2.21)、0.3g吐溫80(8.2.22)以及0.3gTriton X-100(8.2.20)。
8.2.9EDC溶液在10.0ml水中再生EDC(8.1.2.2)。
8.2.9.1在-18℃或更低溫度下在聚丙烯管(9.12)中儲存此溶液(8.3.9)的100μl部分。等分部分可穩(wěn)定兩個月。
8.2.9.2使用前融化冷凍的等分部分并溫和地攪拌它們以確保均勻的溶液。
8.2.10乙醇胺溶液在聚丙烯管(9.12)中吸移200μl c＝1mol/l乙醇胺溶液(8.1.2.3)。
8.2.1l胍溶液，c＝6mol/l在10ml去污溶液(8.3.8)中溶解17.18g鹽酸胍(8.2.7)并用甘氨酸緩沖溶液(8.2.6)調(diào)節(jié)容積至30ml。此溶液可穩(wěn)定大約三個月。
8.2.12NHS溶液在10.0ml水中再生NHS(8.1.2.1)。
8.2.12.1在聚丙烯管(9.12)中將此溶液(8.3.12)分成100μl的等分部分。在-18℃或更低溫度下儲存。等分部分可穩(wěn)定兩個月。
8.2.12.2使用前融化冷凍的等分部分并對它們進(jìn)行溫和攪拌以確保均勻的溶液。
8.2.13樣品稀釋緩沖液在200ml HBS-EP(8.2.8)中溶解2g羧甲基-葡聚糖鈉鹽(8.2.5)、9.97g氯化鈉(8.2.15)以及0.1g吐溫80(8.2.22)。
8.2.14氰基硼氫鈉，c＝1.00mol/l將62.8mg氰基硼氫鈉(8.2.16)溶解在1000μl乙酸溶液pH 4.0(8.3.2)中。
8.2.15氰基硼氫鈉，c＝100mmol/l用180μl乙酸溶液，c＝10mmol/l，pH 4.0(8.3.2)稀釋20μl氰基硼氫鈉溶液(8.3.14)。使用前制備。
8.2.16氫氧化鈉，c＝5mmol/l在玻璃管瓶(9.10)中用3.6ml水稀釋400μl氫氧化鈉c＝50mmol/l(8.2.17)。
8.2.17高碘酸鈉溶液，c＝100mmol/l將214mg高碘酸鈉(8.2.18)加入10.0ml水。
8.2.18“隨時可以使用”的高碘酸鈉在1.4ml聚丙烯管(9.13)中吸移100μl高碘酸鈉溶液，c＝100mmol/l(8.3.17)然后用離心蒸發(fā)器(8.4)進(jìn)行干燥。
8.2.19高碘酸鈉溶液，c＝50mmol/l將“隨時可以使用”的高碘酸鈉(8.3.18)溶解在200μl乙酸溶液，c＝100mmol/l pH 5.5(8.3.4)中。在使用前制備。
8.3標(biāo)準(zhǔn)參比溶液 8.3.1沙門氏菌抗O血清在微量滴定板(9.18)中，將20μl每種血清(8.2.10和8.2.11)稀釋在380μl樣品稀釋緩沖液(8.3.13)中，除抗O5血清之外2μl的此血清(8.2.10.2)被稀釋在400μl樣品稀釋緩沖液(8.3.13)中。
8.3.2沙門氏菌抗型特異性試驗(yàn)試劑將4μl每種血清(8.2.9.1、8.2.9.2、8.2.9.3以及8.2.9.4)稀釋在395μl樣品稀釋緩沖液(8.3.13)中。
8.3.3禽類參比血清在微量滴定板(9.18)中，將6μl血清(8.2.13.1和8.2.13.3)稀釋在295μl樣品稀釋緩沖液(8.3.13)中，以及將3μl血清(8.2.13.2和8.2.13.4)稀釋在295μl樣品稀釋緩沖液(8.3.13)中。
8.3.4搖動(9.11)。在使用前制備。
8.4輔助材料 8.4.1NAP-5柱(0.5ml，Sephadex G-25，Amersham Biosciences)。
8.4.2CM5芯片(Biacore)。
9.設(shè)備和儀器 9.1提到公司時，僅是為了信息和識別目的而不意味著推薦(除非如此陳述)。等效設(shè)備和儀器可以同樣適用。
9.2分析天平(型號AE 240，Mettler，Zürich，瑞士) 9.3Biacore 3000(Biacore) 9.4離心蒸發(fā)器(Jouan，Saint-Herblain，法國) 9.5Finn吸移管，5-40μl(Labsystems Oy，Helsinki，芬蘭) 9.6Finn吸移管，40-200μl(Labsystems Oy) 9.7Finn吸移管，200-1000μl(Labsystems Oy) 9.8Finn吸移管，1-5ml(Labsystems Oy) 9.9玻璃收集管，5ml，塞好的(Renes，Zeist，荷蘭) 9.10直徑為16mm的玻璃管瓶(Biacore) 9.11具有微量滴定半圓頭的微搖動器(MS 1，Janke & Kunkel，Staufen，德國) 9.12直徑為7mm并具有防塵罩的聚丙烯管(Biacore) 9.13聚丙烯管，1.4ml(Micronic，Lelystad，荷蘭) 9.14pH計(型號pH 537，WT W，Weilheim，德國) 9.15聲處理浴，Branson 2200(Branson Ultrasonics B.V.，Soest，荷蘭) 9.16注射過濾器0.45μm直徑25mm(Gelman Sciences，AnnArbor，MI，美國) 9.17真空歧管，用來同時運(yùn)轉(zhuǎn)若干NAP-5柱(型號SPE-12G，具有PTFE活塞，J.T.Baker)。
9.18V形底微量滴定聚苯乙烯板，96孔規(guī)格(Greiner Bio-oneGmbH.Frickenhausen，德國) 9.19渦流混合器(KS-1，Janke & Kunkel) 10.軟件 用Biacore 3000控制軟件4.1(1999-2003)來操作生物傳感器儀器。
11.步驟 11.1LPS溶液的氧化和脫鹽 安全措施 脂多糖是有力的免疫原，在攝取或吸入以后其可以使敏感的人出現(xiàn)敗血性休克。應(yīng)采取預(yù)防措施以防止和這種生物試劑接觸。
高碘酸鈉是一種氧化劑并且當(dāng)與強(qiáng)氧化劑接觸時可能會引起爆炸。
該步驟使用了氰基硼氫鈉。因此進(jìn)行此步驟時應(yīng)采取預(yù)防措施，例如使用手套和防護(hù)罩。僅在化學(xué)通風(fēng)櫥中使用這種物質(zhì)。這種物質(zhì)對于水生生物是非常有毒的并且可以在水生環(huán)境中引起長期有害效應(yīng)。應(yīng)作為危險廢物處理該物質(zhì)和溶液廢棄物。
11.1.1氧化 11.1.1.1將500μl乙酸緩沖液pH 5.5(8.3.4)加入LPS(8.2.12)(參見安全措施) 11.1.1.2充分旋轉(zhuǎn)(9.19)直到沉淀物被溶解。
11.1.1.3聲處理(9.15)溶液10分鐘并相對于溶液的透明程度(clearance)對溶液進(jìn)行判斷。
11.1.1.4當(dāng)透明程度不滿意時繼續(xù)聲處理直到獲得透明(恢復(fù)性的)溶液。
11.1.1.5將20μl高碘酸鹽溶液(8.3.19)加入LPS溶液(11.1.2.4) 11.1.1.6旋轉(zhuǎn)(9.19)溶液(11.1.2.5) 11.1.1.7在冰上并避光條件下培養(yǎng)40分鐘。
11.1.1.8如在11.1.3中所描述的，通過使溶液(11.1.2.6)脫鹽來使氧化作用驟冷 11.1.2脫鹽 11.1.2.1將NAP-5柱(8.5.1)放在歧管(9.17)上。
11.1.2.2通過僅在重力作用下三部分3ml的乙酸緩沖液(8.3.2)流過柱床來對柱(11.1.3.1)進(jìn)行調(diào)節(jié)。使緩沖液完全進(jìn)入凝膠床。
11.1.2.3將0.5ml氧化LPS溶液(11.1.2.8)吸移到柱上。使樣品完全進(jìn)入凝膠床。
11.1.2.4用1ml乙酸緩沖液(8.3.2)洗脫經(jīng)氧化的LPS。將洗脫物收集在5ml玻璃管(9.9)中。
11.1.2.5旋轉(zhuǎn)(9.19)溶液(11.1.3.4)10秒。
11.1.2.6當(dāng)并不立即使用時(11.1.3.5)，在4℃至7℃下儲存樣品。
11.1.2.7在固定之前，如在下表39中所指出的，對包含LPS的溶液進(jìn)行稀釋。
表39 11.2固定 注在開始測定裝置前確保所有溶劑和試劑容器包含完成所有操作步驟的足夠體積，以。
注斜體字是指操作Biacore 3000的軟件命令和菜單等。
11.2.1準(zhǔn)備 11.2.1.1融化一部分EDC(8.3.9.1) 11.2.1.2融化一部分NHS溶液(8.3.12.1)。
11.2.1.3將架Thermo A放置在右架位置(R2)以及將試劑架放置在中部(RR) 11.2.1.4命令連接CM5芯片(8.5.2)供給HBS-EP緩沖液(8.2.8)。
11.2.1.5將EDC溶液(11.2.1.1)放置在位置R2A1。
11.2.1.6將NHS溶液(11.2.1.2)放置在位置R2A2。
11.2.1.7將空管(9.12)放置在位置R2A3。
11.2.1.8將碳酰肼溶液(8.2.6)放置在位置R2A4。
11.2.1.9將乙醇胺溶液(8.2.10)放置在位置R2A5。
11.2.1.10將具有氧化的LPS的溶液(11.1.2.7)放置在位置R2A6。
11.2.1.11將氰基氫硼化物溶液(8.2.15)放置在位置R2A7。
11.2.1.12將在玻璃管瓶(9.10)中的6M胍溶液(8.2.11)放置在位置RR2。
11.2.1.13將在玻璃管瓶(9.10)中的CHAPS溶液(8.2.7)放置在位置RR4。
小心將一次性管放置在儀器的廢棄物出口的下面以收集所使用的氰基氫硼化物溶液。應(yīng)作為危險廢棄物來處理溶液廢棄物。
11.2.2固定CM5芯片 11.2.3文件(參見圖35)→新應(yīng)用向?qū)? 11.2.3.1打開模板→搜索文件向?qū)Ч潭?參見圖36) 11.2.3.2填寫記錄本(參見圖38) 11.2.3.3運(yùn)行，接著啟動 11.2.3.4注為了查看哪個指令在向?qū)е?，進(jìn)行編輯而不是運(yùn)行 11.2.4保存?zhèn)鞲衅鲌D(sensorgram)。保存默認(rèn)擴(kuò)展為“.blr”結(jié)果文件 11.2.5芯片隨時可以用于試驗(yàn)血清中的沙門氏菌抗體。
注獲得的固定水平應(yīng)接近如表40所指出的水平。否則，認(rèn)為固定起因于氧化不足。
表40.LPS的典型的固定水平 11.3抗沙門氏菌抗體的檢測 注在開始測定裝置前確保所有溶劑和試劑容器包含完成參比血清的所有操作步驟的足夠體積。
11.3.1使Biacore可供適當(dāng)?shù)腃M5芯片使用。
11.3.2文件(參見圖36)→新應(yīng)用向?qū)? 11.3.2.1打開模板→搜索文件向?qū)Э刂菩酒潭?參見圖37) 11.3.2.2填寫記錄本(參見圖38) 11.3.2.3運(yùn)行，接著啟動(next en start) 11.3.2.4注為了查看哪個指令在向?qū)е校M(jìn)行編輯而不是運(yùn)行 11.3.3保存?zhèn)鞲衅鲌D。保存默認(rèn)擴(kuò)展為“.blr”的結(jié)果文件圖39示出LPS固定的典型的傳感器圖，而圖40示出用于抗血清分析的典型的傳感器圖。典型的應(yīng)答列在表41中。
表41.沙門氏菌抗體血清的典型應(yīng)答 實(shí)施例13 優(yōu)化加入LPS用于固定的蛋白質(zhì)并檢測血清抗體 警告和安全措施 脂多糖(LPS)是高度致熱的并且可以引起發(fā)熱。為了避免吸入，要小心處理LPS的水溶液并且當(dāng)處理固體材料時戴面罩。如果任何這些化合物進(jìn)入血流，則立即就診。
0.引言 最近的研究表明，當(dāng)在氧化之前將蛋白質(zhì)加入LPS時，則可以固定于羧甲基化葡聚糖金層并在某些情況下得到改善。進(jìn)而，也可以進(jìn)行和改善血清特征應(yīng)答。血清特征應(yīng)答的最佳值取決于加入LPS的蛋白質(zhì)的百分率。
通過加入血紅蛋白可以獲得這種蛋白質(zhì)效應(yīng)。血紅蛋白是一種天然存在的蛋白質(zhì)，其可以存在于所有溫血脊椎動物中。因此，沒有期望在血清中的交叉反應(yīng)抗血紅蛋白抗體。
1.應(yīng)用的范圍和領(lǐng)域 該方法描述了將適量的血紅蛋白加入脂多糖(LPS)，其是通過三氯酸提取而制得(參見SOP Chemie/A21脂多糖的提取和分離(實(shí)施例11))。最佳血紅蛋白部分被限定為一種產(chǎn)生高固定水平以及陽性對照血清的最大血清反應(yīng)的反應(yīng)混合物。此外，描述了隨時可以用于固定在傳感器芯片上的LPS反應(yīng)混合物的生產(chǎn)和儲存。
2.參考文獻(xiàn) SOP Chemie/A21脂多糖的提取和分離(版本3；實(shí)施例11) SOP Chemie/A22源自沙門氏菌的LPS固定到生物傳感器芯片(BIACORE)上以及對報道目前或過去沙門氏菌感染的血清抗體進(jìn)行檢測(版本3；實(shí)施例12) 3.縮寫詞清單 3.1LPS脂多糖 3.2SOP標(biāo)準(zhǔn)操作步驟 3.3NaAc乙酸鈉緩沖劑 3.4Hb血紅蛋白 3.5mQmilliQ超純水 4.原理 在SOP Chemie/A21(實(shí)施例11)中，描述了沙門氏菌spp.脂多糖(LPS)的生產(chǎn)。提取的LPS在用Biacore 3000裝置進(jìn)行的分析中用作配體，以檢測在源自豬和雞的血清中的抗沙門氏菌抗體(參見SOP CHEMIE/A22(實(shí)施例12))。為了改善LPS的固定，在氧化之前加入血紅蛋白。為了產(chǎn)生大量的材料以給出可重復(fù)的固定水平、血清特征數(shù)據(jù)以及方法性能，用血紅蛋白加強(qiáng)LPS，分成等分部分并在4℃下儲存以前進(jìn)行干燥。為了固定芯片，分批氧化等分部分之一并固定。
5.試劑和材料 在操作步驟中，除非另有說明，僅使用認(rèn)可的分析級試劑和蒸餾水或相當(dāng)純度的水。提到公司時，僅是為了信息和識別目的而不意味著推薦(除非如此陳述)。
5.1化學(xué)藥品 5.1.1乙酸(J.T.Baker，Deventer，荷蘭) 5.1.2豬血紅蛋白(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，荷蘭) 5.1.3MilliQ超純水(0) 5.1.4乙酸鈉三水合物(J.T.Baker，Phillipsburgh，NJ，美國) 5.2沙門氏菌凝集血清 5.2.1抗O4(Pro-Lab diagnostics，Salmonella reference section ofthe Central Veterinary L aboratory，Weybridge，英國) 5.2.2抗O5(Pro-Lab diagnostics) 5.2.3抗O6，7(Pro-Lab diagnostics) 5.2.4抗O8(Pro-Lab diagnostics) 5.2.5抗O9(Pro-Lab diagnostics) 5.2.6抗O10(Pro-Lab diagnostics) 5.2.7抗O12(Pro-Lab diagnostics) 5.2.8抗O19(Pro-Lab diagnostics) 5.2.9抗O多A-S(相對于組A至組S的抗血清)(Pro-Labdiagnostics) 5.2.10抗O多E(相對于因子O3、O10、O15、O19、O34的抗血清)(Pro-Lab diagnostics) 5.3型特異性沙門氏菌抗血清 5.3.1腸克隆(enteroclon)抗沙門氏菌組B(Sifin，Berlin，德國) 5.3.2腸克隆抗沙門氏菌組C(Sifin) 5.3.3腸克隆抗沙門氏菌組D(Sifin) 5.3.4腸克隆抗沙門氏菌組E(Sifin) 5.4禽類參比血清 5.4.1SPF-CH，沒有特異性病原體(SPF)的陰性對照血清(Animal Health Service Ltd.(GD)，Deventer，荷蘭) 5.4.2EIA-SE，供ELISA(GD)使用的雞腸炎沙門氏菌陽性對照 5.4.3EIA-ST，供ELISA(GD)使用的雞鼠傷寒沙門氏菌陽性對照 5.4.4SPA-PG，供ELISA(GD)使用的雞雞瘟沙門氏菌陽性對照 5.4.5CH-SI，供ELISA(GD)使用的雞嬰兒沙門氏菌陽性對照 5.5豬參比血清 5.5.1Sw-Liv，在ELISA(GD)中的豬利文斯通沙門氏菌陽性對照血清 5.5.2Sw-Typ，在ELISA(GD)中的豬鼠傷寒沙門氏菌陽性對照血清 5.5.3Sw-APP，在ELISA(GD)中的豬大葉性肺炎放線桿菌陽性對照血清 5.6脂多糖 如在SOP Chemie/A21中所描述的，提取、凍干和儲存脂多糖(LPS)(實(shí)施例11)。
5.6.1腸炎沙門氏菌LPS 5.6.2黃金海岸沙門氏菌LPS 5.6.3利文斯通沙門氏菌LPS 5.6.4火雞沙門氏菌LPS 5.6.5鼠傷寒沙門氏菌LPS 5.7試劑 5.7.1乙酸緩沖溶液，c＝10mmol/l，pH 4.0將0.272g乙酸鈉三水合物(5.1.4)溶解在180ml MQ(5.1.3)中，用乙酸(5.1.1)調(diào)節(jié)至pH 4.0，然后補(bǔ)充mQ(5.1.3)至200ml。在4℃下此緩沖液可穩(wěn)定大約6個月。
5.7.2乙酸緩沖溶液，c＝1.0mol/l，pH 5.5將13.6g乙酸鈉三水合物(5.1.4)溶解在90ml MQ(5.1.3)中，用乙酸(5.1.1)調(diào)節(jié)至pH 5.5，然后補(bǔ)充mQ(5.1.3)至100ml。在4℃下此緩沖液可穩(wěn)定大約6個月。
5.7.3血紅蛋白儲備溶液，5mg/ml在1ml mQ(5.1.3)中溶解5mg血紅蛋白(5.1.2)。
5.8輔助材料 5.8.1CM5芯片(Biacore AB，Uppsala，瑞士)。
6.設(shè)備和儀器 提到公司時，僅是為了信息和識別目的而不意味著推薦(除非如此陳述)。等效設(shè)備和儀器可以同樣適用。
6.1離心蒸發(fā)器(Jouan，Saint-Herblain，法國) 6.2Biacore 3000(Biacore) 6.3Finn吸移管，40-200μl(Labsystems Oy，Helsinki，芬蘭) 6.4玻璃收集管，5ml，12×75mm，帶有塞子(Renes，Zeist，荷蘭) 6.5MilliQ裝置(Millipore，Bedford，MA，美國) 6.6聲處理浴，Branson 2200(Branson Ultrasonics，Soest，荷蘭) 6.7渦流混合器(KS-1，Janke&Kunkel，Staufen，德國) 7.步驟 7.1脂多糖儲備溶液的生產(chǎn) 7.1.1從冷凍器收集產(chǎn)生的LPS(參見SOP Chemie/A21(實(shí)施例11))然后讓它適應(yīng)到室溫。
7.1.2從質(zhì)量數(shù)據(jù)表檢查在管中的產(chǎn)生的LPS(7.1.1)的重量(參見SOP Chemie/A21(實(shí)施例11))。
7.1.3利用公式1(9.1)計算要加入LPS的mQ容積。
7.1.4將計算的mQ(7.1.3)容積加入LPS管(7.1.2)(LPS最終濃度5mg/ml)。
7.1.5充分旋轉(zhuǎn)直到所有粉末被溶解。
7.1.6聲處理(6.6)溶液10分鐘并相對于溶液的透明程度對溶液進(jìn)行判斷。
7.1.7當(dāng)透明程度(7.1.6)不滿意時繼續(xù)聲處理(6.6)直到獲得透明(恢復(fù)性的)溶液。
7.2加入血紅蛋白 7.2.1在玻璃管(6.4)中制備四種(對于每種流體通道用一種)LPS溶液(7.17)，其稀釋在乙酸鈉緩沖液中，而緩沖液具有如表42(8)中所列出的不同血紅蛋白含量。
7.2.2加入每種新制備的LPS提取批料中的相對血紅蛋白起始量在表43(8)中給出。
7.2.3如表42(8)中所描述的，用mQ(5.1.3)加注到500μl的總?cè)莘e。
7.3氧化和脫鹽(參見SOP Chemie/A22；章節(jié)10.1(實(shí)施例12)) 7.3.1從10.1.1.2時開始氧化。
7.4固定(參見SOP Chemie/A22，章節(jié)10.2(實(shí)施例12)) 注在一個CM5芯片(5.8.1)上固定用四種不同相對量的血紅蛋白(7.3)加強(qiáng)的氧化LPS，以致每個流體通道表示不同相對量。
7.5檢測抗沙門氏菌抗體(參見SOP Chemie/A22，章節(jié)10.3(實(shí)施例12)) 7.6確定最佳血紅蛋白百分率 7.6.1對于每個流體通道，對于(5.2)列出的凝集血清和(5.3)列出的型特異性沙門氏菌抗血清的每一種，計算5個相對應(yīng)答的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
7.6.2產(chǎn)生聚成組的柱圖，其中x軸為凝集血清和型特異性沙門氏菌抗血清的名稱，而y軸為對于血紅蛋白(7.6.1)的所有不同相對量而言相對應(yīng)答單位的平均值(參見例如圖41)。
7.6.3對于每個流體通道，對于(5.4)列出的禽類參比對照血清和(5.5)列出的豬參比血清的每一種，計算4個相對應(yīng)答的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
7.6.4產(chǎn)生聚成組的柱圖，其中x軸為禽類對照血清和豬對照血清的名稱，而y軸為對于血紅蛋白(7.6.3)的所有不同百分率而言相對應(yīng)答單位的平均值(參見例如圖42)。
7.6.5通過利用每個x軸柱的標(biāo)準(zhǔn)差值將Y誤差線條加入兩個聚成組的圖(7.6.2，7.6.4)(參見例如圖41或圖42)。
7.6.6在新表(參見例如表47(8))中，相對于所有測得的相對血紅蛋白量，復(fù)制了所選擇的預(yù)期陽性血清(參見表44至表46(8))和陰性SPF雞血清的計算平均值。
7.6.7從預(yù)期陽性血清(7.6.6)的應(yīng)答減去SPF雞血清(7.6.6)的應(yīng)答(參見例如表48(8))。
7.6.8確定最高應(yīng)答/陽性血清/血紅蛋白相對量并給定此值為10(參見例如表49(8))。
7.6.9通過利用公式2a(9.2)計算其余流體通道的相對值(參見例如表49(8))。
7.6.10計算所有相對值的總和/血紅蛋白百分率(參見例如表49(8))。
7.6.11根據(jù)在四個流體通道/血紅蛋白百分率的最高得分總和確定最佳血紅蛋白百分率(就比較的四種百分率而言)。
7.6.12當(dāng)最佳相對血紅蛋白量(7.6.11)是所比較的最高或最低血紅蛋白量時，則必須在以下條件下重復(fù)步驟7.2至7.6.11。
7.6.12.1在Sg、Sm以及Sl(20％)的最低血紅蛋白量是最佳的情況下，則除0％和10％血紅蛋白之外重復(fù)20％和30％的量。
7.6.12.2在Se和St的最高相對血紅蛋白量是最佳的情況下，則除40％和50％血紅蛋白之外重復(fù)20％和30％的量。
7.6.12.3在Sg、Sm以及Sl的最高相對血紅蛋白量是最佳的情況下，則除60％和70％血紅蛋白之外重復(fù)百分率40％和50％。
7.6.13獲得血紅蛋白百分率的最佳值 7.6.13.1當(dāng)相對值(7.6.8)(每四個比較的相對血紅蛋白量)的總和具有最高值時。
7.6.13.2在比較的血紅蛋白(其中檢測到最高值)范圍內(nèi)，還確定了血紅蛋白加入量的更高和更低水平。
7.7在真空干燥的LPS原液中加入血紅蛋白 7.7.1在確定最佳血紅蛋白量以后，通過從管重量加上LPS溶液(7.1.7)減去從質(zhì)量數(shù)據(jù)表讀取的最初空管重量來計算剩余的5mg/ml LPS溶液的容積(參見SOP Chemie/A21(實(shí)施例11))。
7.7.2利用公式3(9.3)計算剩余LPS的量。
7.7.3利用公式4(9.4)計算要加入LPS的血紅蛋白量。
7.7.4將計算量的血紅蛋白(7.7.1)加入剩余的LPS溶液以達(dá)到在7.6.13中確定的最終濃度。
7.7.5顛倒、旋轉(zhuǎn)和/或聲處理溶液(7.7.4)直到完全溶解血紅蛋白。
7.7.6在玻璃管(6.4)中分配100μl。
7.7.7在旋轉(zhuǎn)式真空干燥器(6.1)中干燥分配的溶液(7.7.6)(加熱位置1，15分鐘，總運(yùn)行時間60分鐘)。
7.7.8將管塞住并在4-7℃下儲存直到使用。
在圖43中給出固定有黃金海岸沙門氏菌LPS-血紅蛋白復(fù)合物的CM5芯片的典型的基線應(yīng)答。
8.表 表42.在氧化以前將血紅蛋白(5.7.3)、乙酸鈉緩沖液(5.7.2)以及mQ(5.1.3)加入LPS(7.2.1) 表43.加入LPS的相對血紅蛋白起始量。
表44.(稀釋的)凝集血清結(jié)合于固定的沙門氏菌LPS的預(yù)期結(jié)果
圖標(biāo)+＝血清與固定LPS的陽性結(jié)合 -＝血清與固定LPS沒有結(jié)合

＝在最佳血紅蛋白附加測定中所選擇使用的血清 表45.(稀釋的)禽類參比血清結(jié)合于固定的沙門氏菌LPS的預(yù)期結(jié)果
圖標(biāo)+＝血清與固定LPS的陽性結(jié)合 -＝血清與固定LPS沒有結(jié)合

＝最佳血紅蛋白加入量確定中所選擇使用的血清 表46.(稀釋的)豬參比血清結(jié)合于固定的沙門氏菌LPS的預(yù)期結(jié)果
圖標(biāo)+＝血清與固定LPS的陽性結(jié)合 -＝血清與固定LPS沒有結(jié)合

＝最佳血紅蛋白加入量確定中所選擇使用的血清 表47.對具有不同血紅蛋白加入量的黃金海岸沙門氏菌固定LPS的典型血清特征應(yīng)答(制備的兩種CM5芯片的數(shù)據(jù)) 表48.從對具有不同血紅蛋白加入量的黃金海岸沙門氏菌固定LPS所選擇的陽性血清特征應(yīng)答(表47的數(shù)據(jù))減去CH-SPF的典型的表格(制備的兩種CM5芯片的數(shù)據(jù))。
表49.表48的相對值得分的典型表格(制備的兩種CM5芯片的數(shù)據(jù))。
9.公式 9.1公式1 mQ容積的計算 v＝w/5 v＝mQ(5.1.3)的容積(ml) w＝LPS(7.1.2)的重量(mg)(參見SOP Chemie/A21(實(shí)施例11)) 9.2公式2 陽性血清相對值的計算 Rv＝Mv/Mhv*10 Rv＝相對值 Mv＝平均值(7.6.1) Mhv＝平均最高值(7.6.8) 9.3公式3 剩余LPS量的計算 z＝w*0.005 z＝剩余LPS的量(mg) w＝剩余LPS溶液(7.7.1)的重量(mg) 9.4公式4 血紅蛋白量的計算 h＝y(tǒng)*z*0.01 h＝血紅蛋白的質(zhì)量(mg) y＝最佳血紅蛋白百分率(％)(7.6.13) z＝剩余LPS(9.3)的量(mg)
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權(quán)利要求
1.一種用于將多糖固定在載體上的方法，所述方法包括用氧化劑和包含至少兩個胺和/或酰胺基團(tuán)的聚合物接觸所述多糖以獲得多糖-聚合物復(fù)合物，以及將所述多糖-聚合物復(fù)合物耦聯(lián)于所述載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述聚合物是蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述多糖得自革蘭氏陰性菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多糖得自腸桿菌科。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多糖得自沙門氏菌(亞)種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多糖是脂多糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是血紅蛋白或肌紅蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述氧化劑是偏高碘酸鹽(鈉)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括活化所述載體的表面。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述載體包括涂布有金的玻璃表面。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述載體用包含羧基供體的涂層，優(yōu)選羧甲基化葡聚糖層改性。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述羧基供體和/或葡聚糖層用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺氫氯化物、N-羥基琥珀酰亞胺以及碳酰肼來活化。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，包括至少兩種不同的多糖。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述載體是生物傳感器芯片。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法獲得的載體。
16.一種載體，包括在其表面上固定的多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的載體，包括一涂層，所述涂層包含羧基供體，優(yōu)選羧甲基化葡聚糖，并連接于包含抗原的多糖，其中所述羧基供體和所述多糖借助于包含至少兩個胺和/或酰胺基團(tuán)的聚合物而彼此連接，其中至少所述多糖借助于在所述多糖上的高碘酸鹽氧化的鄰二醇和在所述聚合物上的胺和/或酰胺基團(tuán)連接于所述聚合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的載體，所述載體是微球體或小珠。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的載體，其中所述微球體或小珠是聚苯乙烯微球體或小珠。
20.根據(jù)權(quán)利要求15至19中任一項(xiàng)所述的載體，是編碼的。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的載體，其中所述載體通過存在特定標(biāo)記來編碼。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的載體，其中所述標(biāo)記包括顏色。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的載體，其中所述顏色是發(fā)熒光的顏色或發(fā)磷光的顏色。
24.一組微球體或小珠，包含至少兩種不同編碼的根據(jù)權(quán)利要求20至23中任一項(xiàng)所述的微球體或小珠。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的一組微球體或小珠，其中每一種所述不同編碼的微球體或小珠包括含有不同抗原的多糖。
26.一種生物傳感器，包括根據(jù)權(quán)利要求15或23所述的載體。
27.一種表面等離子體共振檢測系統(tǒng)，包括根據(jù)權(quán)利要求26所述的生物傳感器。
28.一種用于確定針對樣品中革蘭氏陰性菌的抗原的抗體是否存在的方法，所述方法包括用根據(jù)權(quán)利要求15或23中任一項(xiàng)所述的載體或根據(jù)權(quán)利要求26所述的生物傳感器接觸所述樣品并確定所述載體是否已結(jié)合任何抗體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述樣品是血液、源自血液的液體物質(zhì)、源自組織的液體，如肉滲出物、牛奶、蛋、來自眼的液體、唾液或糞便。
30.一種用于確定樣品中是否存在革蘭氏陰性菌的方法，所述方法包括用針對所述細(xì)菌的抗原的預(yù)定量的抗體接觸所述樣品，并用根據(jù)權(quán)利要求15或23所述的載體或根據(jù)權(quán)利要求26所述的生物傳感器來確定未結(jié)合于所述細(xì)菌的抗體量。
31.根據(jù)權(quán)利要求28至30中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過等離子體表面共振來確定與所述載體或所述生物傳感器的結(jié)合。
32.根據(jù)權(quán)利要求28至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品獲自人或動物。
33.一種用于確定樣品中是否存在革蘭氏陰性菌的方法，包括
-用靶細(xì)菌特異性噬菌體接觸所述樣品并使所述噬菌體感染所述樣品
-除去非結(jié)合的和/或非侵入的、產(chǎn)生噬菌體感染的樣品的噬菌體
-使所述噬菌體感染樣品與對所述使用的噬菌體易感染的指示生物接觸
-在至少一個噬菌體增殖周期內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)
-回收所述噬菌體以獲得包含噬菌體的樣品
-用根據(jù)權(quán)利要求15或23所述的載體或根據(jù)權(quán)利要求26所述的生物傳感器分析所述包含噬菌體的樣品。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述樣品獲自人、植物或動物。
35.根據(jù)權(quán)利要求33和34所述的方法，其中所述噬菌體包括圖22a、22b和/或22c的噬菌體。
36.根據(jù)權(quán)利要求15至23中任一項(xiàng)所述的載體，包含圖22a、22b和/或22c的噬菌體。
全文摘要
本發(fā)明涉及化學(xué)和診斷領(lǐng)域，更具體地說涉及診斷目前和/或過去和/或無癥狀感染或診斷暴露于革蘭氏陰性菌(如腸桿菌或軍團(tuán)菌)的歷史。甚至更具體地說，本發(fā)明涉及篩查動物或動物性產(chǎn)品是否存在不需要的/不希望的微生物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于篩查樣品是否存在針對不需要的/不希望的微生物的抗體的方法并且優(yōu)選地借助于生物傳感器實(shí)施這樣的方法。本發(fā)明還涉及用于將多糖固定到固體表面的方法。本發(fā)明另外提供了具有固定多糖的固體表面以及這樣的表面的應(yīng)用。
文檔編號G01N33/569GK101203760SQ200680022369
公開日2008年6月18日 申請日期2006年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月22日
發(fā)明者阿爾德特·安東尼·貝格韋夫, 格爾特魯達(dá)·科爾內(nèi)利婭·安東尼婭·瑪麗亞·博克肯, 貝爾塔·杰拉爾達(dá)·瑪麗亞·格特馬克 申請人:Rna控股有限公司