一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物ca72-4的熒光免疫試紙條及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種血液樣本的快速定量檢測(cè)試紙條及檢測(cè)方法，尤其是涉及利用量子點(diǎn)技術(shù)測(cè)定血清或血漿中糖類抗原72-4 (簡(jiǎn)稱CA72-4)的快速定量檢測(cè)試紙條及其測(cè)試方法，屬于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]胃癌是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，占全部惡性腫瘤的第3位，占消化道惡性腫瘤的首位，且胃癌病人得到確診后其5年生存率非常低。
[0003]CA72-4是1981年Coleher等從乳腺癌肝轉(zhuǎn)移灶中得到的一種腫瘤相關(guān)糖蛋白，其分子量大于1000，000，屬于粘蛋白類癌胚胎抗原。組織化學(xué)研究證明它存在于50%的乳腺癌和85% -95%結(jié)腸、胰腺、胃、肺及卵巢的腫瘤中，不表現(xiàn)于良性腫瘤和正常成人組織中。一般認(rèn)為，CA72-4是一種較廣譜的腫瘤標(biāo)志物，其血清中的含量對(duì)卵巢癌、胃癌、直腸癌、肝癌、肺癌等有臨床診斷價(jià)值。目前，CA72-4廣泛應(yīng)用于癌癥的診斷及免疫療法的監(jiān)測(cè)，術(shù)前CA72-4的水平亦可作為胃癌侵襲性及病人預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。
[0004]目前臨床上用于測(cè)定CA72-4的方法主要有放免法、酶聯(lián)免疫檢測(cè)(簡(jiǎn)稱ELISA)法、化學(xué)發(fā)光法等。放免法檢測(cè)因其方法學(xué)本身的限制，其靈敏度和抗干擾能力嚴(yán)重不足，已基本上退出市場(chǎng)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)是目前臨床檢測(cè)CA72-4的主要技術(shù)，但是檢測(cè)成本高，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決臨床上測(cè)定CA72-4遇到的以上問(wèn)題，本發(fā)明提供一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物CA72-4的熒光免疫試紙條，采用標(biāo)記了抗CA72-4單克隆抗體CC49的量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合墊與包被了抗CA72-4單克隆抗體B72.3的硝酸纖維素膜的檢測(cè)線和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜的質(zhì)控線進(jìn)行組合；采用雙抗體夾心免疫層析的原理，樣本中的抗原在側(cè)向移動(dòng)的過(guò)程中與量子點(diǎn)標(biāo)記的特異性抗體相結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，繼續(xù)向前方流動(dòng)和硝酸纖維素膜的檢測(cè)線上特異性抗體結(jié)合形成雙抗體夾心復(fù)合物，進(jìn)而進(jìn)行結(jié)果的判定。具備操作簡(jiǎn)便，迅速，反應(yīng)靈敏度高以及便于大規(guī)模推廣使用的優(yōu)點(diǎn)。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物CA72-4的熒光免疫試紙條，包括樣品墊、量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙和底板，其特征在于，所述熒光免疫試紙條所用的免疫層析法的類型為雙抗夾心法，所述樣品墊、量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次相互重疊地鋪設(shè)在所述底板上；所述量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合墊上設(shè)置有量子點(diǎn)標(biāo)記的抗CA72-4單克隆抗體CC49涂層；所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線上設(shè)置有抗CA72-4單克隆抗體B72.3，所述質(zhì)控線上設(shè)置有羊抗鼠IgG。
[0007]進(jìn)一步地，所述樣品墊和所述量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合墊均是玻璃纖維素膜，所述硝酸纖維素膜是pall vividl70，所述底板是聚氯乙烯(簡(jiǎn)稱PVC)底板。
[0008]本發(fā)明還公開(kāi)了如上所述的檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物CA72-4的熒光免疫試紙條的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0009]步驟一，量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的制備:
[0010]I)將量子點(diǎn)與2嗎啉代乙磺酸(簡(jiǎn)稱MES)混合振蕩，離心，棄上清，得到預(yù)處理后的量子點(diǎn)；
[0011]2)將所述預(yù)處理后的量子點(diǎn)與(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(簡(jiǎn)稱m)C)、MES混合，于旋轉(zhuǎn)混合器上避光反應(yīng)，然后離心，棄上清，得到沉淀一；
[0012]3)將所述沉淀一與N-羥基硫代琥珀酰亞胺(簡(jiǎn)稱NHS)和磷酸鹽緩沖液(簡(jiǎn)稱PBS)混合，于旋轉(zhuǎn)混合器上避光反應(yīng)，然后離心，棄上清，得到沉淀二 ；
[0013]4)將所述沉淀二與抗CA72-4單克隆抗體CC49、PBS混合，避光反應(yīng)后，過(guò)夜，離心，棄上清，得到沉淀三；
[0014]5)將所述沉淀三用含有牛血清白蛋白(簡(jiǎn)稱BSA)的PBS溶液重懸，靜置封閉后，得到量子點(diǎn)標(biāo)記抗體；
[0015]步驟二，量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合墊和樣品墊的處理:將玻璃纖維素膜依次用水、無(wú)水乙醇浸泡，然后干燥，再置于含有蔗糖、海藻糖和BST的結(jié)合墊處理液中浸泡，再干燥，得到經(jīng)過(guò)處理的量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合墊；將玻璃纖維素膜依次用水、無(wú)水乙醇浸泡，然后干燥，再置于含有NaCl、聚乙烯吡咯烷酮(簡(jiǎn)稱？￥?)、1^的11-20、854、硼酸鹽緩沖液(簡(jiǎn)稱BS)的樣品墊處理液中浸泡，再干燥，得到經(jīng)過(guò)處理的樣品墊；
[0016]步驟三，將所述步驟一得到的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體包被到所述步驟二得到的經(jīng)過(guò)處理的量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合墊上，得到帶有抗體的量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合墊；
[0017]步驟四，將抗CA72-4單克隆抗體B72.3固定到檢測(cè)線，將羊抗鼠IgG固定到質(zhì)控線，得到帶有抗體的硝酸纖維素膜；
[0018]步驟五，將所述步驟二得到的經(jīng)過(guò)處理的樣品墊、所述步驟三得到的帶有抗體的量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合墊、所述步驟四得到的帶有抗體的硝酸纖維素膜、吸水紙依次相互重疊地鋪設(shè)在底板上，然后切割以設(shè)定試紙條寬度，得到所述檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物CA72-4的熒光免疫試紙條。
[0019]進(jìn)一步地，所述步驟一中加入的量子點(diǎn)、EDC、NHS和CC49按照摩爾比為1:4000:2000:8。
[0020]進(jìn)一步地，所述步驟一中的含有BSA的PBS溶液為含質(zhì)量百分比1.5%的BSA的pH值是7.4的PBS溶液，于振蕩器振蕩，封閉30min。
[0021]進(jìn)一步地，所述步驟二中的結(jié)合墊處理液是含質(zhì)量百分比5%蔗糖、質(zhì)量百分比2%海藻糖，pH值是7.4的0.02M的硼酸鹽吐溫溶液(簡(jiǎn)稱BST)，且量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合墊的處理具體過(guò)程為:將玻璃纖維素膜于超純水浸泡15分鐘后，再置于無(wú)水乙醇浸泡15分鐘后，于干燥箱50°C條件下干燥，再置于所述結(jié)合墊處理液中浸泡30分鐘后，于干燥箱37°C條件下干燥過(guò)夜，得到經(jīng)過(guò)處理的量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合墊。
[0022]進(jìn)一步地，所述步驟二中的樣品墊處理液是含質(zhì)量百分比2% NaCl、質(zhì)量百分比0.2% PVP、質(zhì)量百分比0.1% Tween-20、質(zhì)量百分比0.5% BSA，pH值是7.4的0.02M的BS，且樣品墊的處理具體過(guò)程為:將玻璃纖維素膜于超純水浸泡15分鐘后，再置于無(wú)水乙醇浸泡15分鐘后，于干燥箱50°C條件下干燥，再置于所述樣品墊處理液中浸泡30分鐘后，于干燥箱37°C條件下干燥過(guò)夜，得到經(jīng)過(guò)處理的樣品墊。
[0023]更具體地，所述步驟一的具體過(guò)程是:量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的制備:
[0024]I)將pH值是6.0的0.0lM MES加入至100 μ I發(fā)射波長(zhǎng)為620nm的量子點(diǎn)后，將上述混合物于振蕩器振蕩5秒后，于離心機(jī)中14000 - 20000rpm離心5分鐘，棄上清，得到預(yù)處理后的量子點(diǎn)；
[0025]2)將所述預(yù)處理后的量子點(diǎn)與EDC以摩爾比1:4000混合后，加入pH值是6.0的0.0lM MES中，于旋轉(zhuǎn)混合器上避光反應(yīng)15min，然后14000 — 20000rmp離心2min，棄上清，
得到沉淀一；
[0026]3)將所述沉淀一與NHS以摩爾比1:2000混合后，加入100 μ I 0.02Μ pH值是7.2的PBS緩沖液中，于旋轉(zhuǎn)混合器上避光反應(yīng)15min，然后14000 — 20000rmp離心2min，棄上清，得到沉淀二；
[0027]4)將所述沉淀二與抗CA72-4單克隆抗體CC49以摩爾比1:8混合后，加入100 μ I0.02Μ pH值是7.2的PBS緩沖液中，室溫避光反應(yīng)3小時(shí)，而后置于17°C 16?20小時(shí)，14000rpm離心2min，棄上清，得到沉淀三；
[0028]5)將所述沉淀三用100 μ I含有質(zhì)量百分比1.5%的BSA pH值是7.4的PBS緩沖液重懸，靜置封閉30min后，得到量子點(diǎn)標(biāo)記抗體。
[0029]本發(fā)明還提供如上所述的檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物CA72-4的熒光免疫試紙條的應(yīng)用方法，其特征在于:
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