專利名稱：：通過檢測細(xì)胞/組織中g(shù)alnac-t14的表達(dá)判定對apo2l/trail的凋亡敏感性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：亡受體激動劑抗體敏感的生物標(biāo)志物的方法和測定法。更具體的說，本發(fā)明涉及檢測與GalNac-T蛋白質(zhì)家族有關(guān)的分子的方法和測定法，其中GalNac-T蛋白質(zhì)家族預(yù)示哺乳動物癌細(xì)胞對Apo2L/TRAIL或死亡受體激動劑抗體(諸如DR4或DR5激動劑抗體)的敏感性。
背景技術(shù)：
：本領(lǐng)域已經(jīng)鑒定了屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族的多種配體和受體。在這些配體中有肺瘤壞死因子-a("TNF-a，，)、腫瘤壞死因子-(3("TNF-(3"或"淋巴毒素-a，，)、淋巴毒素-(3("LT-卩，，)、CD30配體、CD27配體、CD40配體、OX-40配體、4-lBB配體、LIGHT、Apo-l配體(也稱作Fas配體或CD95配體)、Apo-2配體(也稱作Apo2L或TRAIL)、Apo-3配體(也稱作TWEAK)、APRIL、OPG配體(也稱作RANK配體、ODF或TRANCE)和TALL-1(也稱作BlyS、BAFF或THANK)(參見例如Ashkenazi,NatureReview,2:420-430(2002);AshkenaziandDixit,Science,281:1305-1308(1998);AshkenaziandDixit,CumOpin.CellBiol"11:255-260(2000);Golstein,CumBiol"7:750-753(1997);Wallach,CytokineReference,AcademicPress,2000,pages377-411;Locksleyetal.,Cell,104:487-501(2001);GrussandDower,Blood，85:3378-3404(1995);Schmidetal"Pro"Natl.Acad.Sci"83:1881(1986);Dealtryetal.,Eur.J.Immunol"17:689(1987);Pittietal.,J.Biol.Chem.，271:12687-12690(1996);Wileyetal"Immunity,3:673-682(1995);Browningetal"Cell,72:847-856(1993);Armitageetal"Nature,357:80-82(1992);WO97/01633,公開于1997年1月16日；WO97/25428,公開于1997年7月17日；Marstersetal"CumBiol"8:525-528(1998);Chicheporticheetal.，Biol.Chem.,272:32401-32410(1997);Hahneetal"J.Exp.Med"188:1185-1190(1998);WO98/28426,公開于1998年7月2日；WO98/46751,公開于1998年10月22日；WO98/18921,公開于1998年5月7日；Mooreetal"Science,285:260-263(1999);Shuetal.,J.LeukocyteBiol"65:680(1999);Schneideretal"J.Exp.Med"189:1747-1756(1999);Mukhopadhyayetal"J.Biol.Chem.,274:15978-15981(1999))。由這些TNF家族配體介導(dǎo)的多種細(xì)胞應(yīng)答的誘發(fā)通常是通過它們與特定細(xì)胞受體結(jié)合而開始的。有些但非所有TNF家族配體結(jié)合細(xì)胞表面"死亡受體"，并由此誘發(fā)多種生物學(xué)活動以激活胱天蛋白酶或者執(zhí)行細(xì)胞死亡或凋亡途徑的酶(Salvesenetal.，Cell,91:443-446(1997))。在迄今為止已經(jīng)鑒定的TNF受體超家族成員中包括TNFR1、TNFR2、TACI、GITR、CD27、OX-40、CD30、CD40、HVEM、Fas(也稱作Apo-l或CD95)、DR4(也稱作TRAIL-R1)、DR5(也稱作Apo-2或TRAIL-R2)、DcRl、DcR2、護(hù)骨蛋白(OPG)、RANK和Apo-3(也稱作DR3或TRAMP)(參見例如Ashkenazi,NatureReviews,2:420-430(2002);AshkenaziandDixit,Science,281:1305-1308(1998);Ashke應(yīng)iandDixit,Curr.Opin.CellBiol"11:255-260(2000);Golstein,Curr.Biol"7:750-753(1997);Wallach,CytokineReference,AcademicPress,2000,pages377-411;Locksleyetal"Cell,104:487-501(2001);GmssandDower,Blood,85:3378-3404(1995);Hohmanetal.，J.Biol.Chem.,264:14927-14934(1989);Brockhausetal"Proc.Natl.Acad.Sci.,87:3127-3131(1990);EP417,563,公開于1991年3月20日；Loetscheretal.,Cell,61:351(1990);Schalletal"Cell,61:361(1990);Smithetal"Science,248:1019-1023(1990);Lewisetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,88:2830-2834(1991);Goodwinetal.,Mol.Cell.Biol"11:3020-3026(1991);Stamenkovicetal"EMBOJ.,8:1403-1410(1989);Mallettetal.,EMBOJ.，9:1063-1068(1990);Andersonetal"Nature,390:175-179(1997);Chicheporticheetal"J.Biol.Chem.,272:32401-32410(1997);Panetal.,Science,276:111-113(1997);Panetal.，Science,277:815-818(1997);Sheridanetal.，Science,277:818-821(1997);Degli-Espostietal.，J.Exp.Med.,186:1165-1170(1997);Marstersetal.,Curr.Biol"7:1003-1006(1997);Tsudaetal.，BBRC，234:137-142(1997);Nocentinietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,94:6216-6221(1997);vonBulowetal.,Science,278:138-141(1997))。大多數(shù)這些TNF受體家族成員都有細(xì)胞表面受體的典型結(jié)構(gòu)，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，而其它成員則天然發(fā)現(xiàn)是缺少跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的可溶性蛋白質(zhì)。典型TNFR的胞外部分包含從NH2-末端起始的多個富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CRD)的重復(fù)氨基酸序列模式。數(shù)年前，將稱作Apo2L或TRAIL的配體鑒定為TNF細(xì)胞因子家族的成員(參見例如Wileyetal.，Immunity,3:673-682(1995);Pittietal.，J.Biol.Chem,,271:12697-12690(1996);WO97/01633;WO97/25428;美國專利5,763,223,授權(quán)于1998年6月9日；美國專利6，284,236，授權(quán)于2001年9月4日)。全長天然序列人Apo2L/TRAIL多肽是281個氨基酸的II型跨膜蛋白質(zhì)。有些細(xì)胞能通過酶促切割多肽的胞外區(qū)來生成天然的可溶形式多肽(Marianietal.,J.Cell.Biol.,137:221-229(1997))。對可溶形式Apo2L/TRAIL的晶體學(xué)研究揭示了與TNF和其它相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)類似的同三聚體結(jié)構(gòu)(Hymowitzetal.，Molec.Cell,4:563-571(1999);Chaetal"Immunity,11:253-261(1999);Mongkolsapayaetal.,NatureStructuralBiology,6:1048(1999);Hymowitzetal.:Biochemistry,39:633-644(2000))。但是，與其它TNF家族成員不同，發(fā)現(xiàn)Apo2L/TRAIL具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，即三個半胱氨酸殘基(同三聚體中各個亞基的第230位)一起與鋅原子配位，而且鋅結(jié)合對于三聚體穩(wěn)定性和生物學(xué)活性來說是重要的(Hymowitzetal.,見上文；Bodmeretal"J.Biol.Chem.,275:20632-20637(2000))。文獻(xiàn)中已有報(bào)道，Apo2L/TRAIL可能在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起作用，包括自身免疫病，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(參見例如Thomasetal.,J.Immunol.,161:2195-2200(1998);Johnsenetal.,Cytokine,11:664-672(1999);Griffithetal"J.Exp.Med.,189:1343-1353(1999);Songetal"J.Exp.Med.,191:1095-1103(2000))。還有報(bào)道，可溶形式的Apo2L/TRAIL在多種癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，包括結(jié)腸、肺、乳房、前列腺、膀胱、腎、卵巢和腦腫瘤，以及黑素瘤、白血病和多發(fā)性骨髓瘤(參見例如Wileyetal.,見上文；Pittietal.,見上文；美國專利6,030,945,授權(quán)于2000年2月29日;美國專利6,746,668，授權(quán)于2004年6月8日;Riegeretal.,FEBSLetters,427:124-128(1998);Ashkenazietal.,J.Clin.Invest.104:155-162(1999);Walczaketal.,NatureMed.，5:157-163(1999);Keaneetal"CancerResearch,59:734-741(1999);Mizutanietal"Clin.CancerRes"5:2605-2612(1999);Gazitt，Leukemia,13:1817-1824(1999);Yuetal.，CancerRes.,60:2384-2389(2000);Chinnaiyanetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1754-1759(2000))。鼠腫瘤模型的體內(nèi)研究還表明，單獨(dú)使用Apo2L/TRAIL或者與化療或放療聯(lián)合能發(fā)揮實(shí)質(zhì)性的抗腫瘤作用(參見例如Ashkenazietal.,見上文；Walzcaketal.,見上文；Gliniaketal.，CancerRes"59:6153-6158(1999);Chinnaiyanetal.,見上文；Rothetal.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,265:1999(1999);PCT申請US/00/15512;PCT申請US/01/23691)。與許多類型的癌細(xì)胞相反，大多數(shù)正常人細(xì)胞類型表現(xiàn)出對某些重組形式Apo2L/TRAIL誘導(dǎo)的凋亡有抗性(Ashkenazietal.,見上文；Walzcaketal.，見上文)。Jo等人報(bào)道，多組氨酸標(biāo)記的可溶形式Apo2L/TRAIL在體外在分離的正常人肝細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，非人源的則不然(Joetal"NatureMed"6:564-567(2000);Nagata,NatureMed.，6:502-503(2000))。認(rèn)為，某些重組Apo2L/TRAIL制備物在生物化學(xué)特性和生物學(xué)活性方面對患病細(xì)胞和正常細(xì)胞可有所變化，這取決于例如標(biāo)簽分子的存在與否、鋅含量和三聚體含量百分比(參見Lawrenceetal"NatureMed,,LettertotheEditor,7:383-385(2001);Qinetal"NatureMed.,LettertotheEditor,7:385-386(2001))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Apo2L/TRAIL結(jié)合至少五種不同受體。至少兩種結(jié)合Apo2L/TRAIL的受體包含功能性胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域。一種這樣的受體稱作"DR4"(或稱作TR4或TRAIL-R1)(Panetal"Science,276:111-113(1997);WO98/32856,公開于1998年7月30日；WO99/37684,7〉開于1999年7月29日;WO00〃3349，公開于2000年12月7日；US2003/0036168，公開于2003年2月20日；US6,433,147，授權(quán)于2002年8月13日；US6,461,823,4受權(quán)于2002年10月8日；US6,342,383,授權(quán)于2002年1月29日)。另一種這樣的Apo2L/TRAIL受體稱作DR5(或稱作Apo-2、TRAIL-R或TRAIL-R2、TR6、Tango-63、hAP08、TRICK2、或KILLER)(參見例如Sheridanetal.,Science,277:818-821(1997);Panetal.，Science,277:815-818(1997);WO98/51793,公開于1998年11月19日；WO98/41629,公開于1998年9月24日；Screatonetal.,Curr.Biol"7:693-696(1997);Walczaketal.,EMBOJ.，16:5386-5387(1997);Wuetal.，NatureGenetics,17:141-143(1997);WO98/35986，公開于1998年8月20日；EP870,827,公開于1998年10月14日；WO98/46643，公開于1998年10月22日；WO99/02653，公開于1999年1月21日；WO99/09165，公開于1999年2月25日；WO99/11791,公開于1999年3月11日;WO03/042367,公開于2003年5月22日；WO02/097033，公開于2002年12月5日；WO03/038043,公開于2003年5月8日；US2002/0072091,7>開于2002年8月13日；US2002/0098550,公開于2001年12月7日；US6,313,269,授權(quán)于2001年12月6日；US2001/0010924,公開于2001年8月2日；US2003/01255540，7^開于2003年7月3日；US2002/0160446,公開于2002年10月31日；US2002/0048785，公開于2002年4月25日；US2004/0141952，7>開于2004年7月22日；US2005/0129699，公開于2005年6月16日；US2005/0129616,公開于2005年6月16日；US6,342,369，授權(quán)于2002年2月；US6,569,642,授權(quán)于2003年5月27日；US6,072,047,授權(quán)于2000年6月6日；US6,642,358,授權(quán)于2003年11月4日;US6,743,625，授權(quán)于2004年6月1日)。像DR4—樣，DR5據(jù)報(bào)道包含胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域且能夠通過配體結(jié)合(或者通過結(jié)合諸如模擬配體活性的激動性抗體等分子)發(fā)出凋亡信號。Apo-2L/TRAIL和DR5之間形成的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)描述于Hymowitzetal.,MolecularCell,4:563-571(1999)。配體結(jié)合后，DR4和DR5都能經(jīng)由稱作FADD/Mortl的含死亡結(jié)構(gòu)域的銜接物(adaptor)分子通過募集和活化凋亡起始物胱天蛋白酶-8而獨(dú)立引發(fā)凋亡(Kischkeletal.,Immunity,12:611-620(2000);Spricketal.,Immunity,12:599-609(2000);Bodmeretal.,NatureCellBiol"2:241-243(2000))。Apo2L/TRAIL據(jù)報(bào)道還結(jié)合那些稱作DcRl、DcR2和OPG的受體，認(rèn)為這些受體發(fā)揮信號傳遞的抑制物而非轉(zhuǎn)換器的功能(參見例如DCR1(也稱作TRID、LIT或TRAIL-R3)(Panetal.,Science,276:111-113(1997);Sheridanetal.，Science,277:818-821(1997);McFarlaneetal.,J.Biol.Chem.,272:25417-25420(1997);Schneideretal.,FEBSLetters,416:329-334(1997);Degli-Espostietal"J.Exp.Med.,186:1165-1170(1997);Mongkolsapayaetal.,J.Immunol"160:3-6(1998));DCR2(也稱作TRUNDD或TRAIL-R4XMarstersetal.，Curr.Biol"7:1003-1006(1997);Panetal.，F(xiàn)EBSLetters,424:41-45(1998);Degli-Espostietal.,Immunity,7:813-820(1997));和OPG(Simonetetal.,見上文))。與DR4和DR5相反，DcRl和DcR2受體不發(fā)出凋亡信號。文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了某些與DR4和/或DR5受體結(jié)合的抗體。例如，針對DR4受體且在某些哺乳動物細(xì)胞中具有激動或凋亡活性的抗DR4抗體描述于例如WO99/37684,公開于1999年7月29日；WO00/73349,公開于2000年7月12日；WO03/066661，公開于2003年8月14日。還可參見例如Gri伍thetal.,J.Immunol"162:2597-2605(1999》Chuntharapaietal"J.Immunol"166:4891-4898(2001);WO02/097033，7>開于2002年12月2日；WO03/042367,乂>開于2003年5月22日；WO03/038043,公開于2003年5月8日；WO03/037913，7^開于2003年5月8日；US2003/0073187,公開于2003年4月17日；US2003/0108516，公開于2003年6月12日。同樣已經(jīng)描述了某些抗DR5抗體，參見例如WO98/51793,公開于1998年11月8日；Gri伍thetal.,J.Immunol.,162:2597-2605(1999);Ichikawaetal.，NatureMed.,7:954-960(2001);Hylanderetal.,"AnAntibodytoDR5(TRAIL-Receptor2)SuppressestheGrowthofPatientDerivedGastrointestinalTumorsGrowninSCIDmice",Abstract,2dInternationalCongressonMonoclonalAntibodiesinCancers,Aug.29-Sept.1，2002，Banff,Alberta,Canada;WO03/038043，公開于2003年5月8日；WO03/037913,公開于2003年5月8日；US2003/0180296,^^開于2003年9月25日。另外，已經(jīng)描述了某些對DR4和DR5受體都具有交叉反應(yīng)性的抗體(參見例如美國專利6,252,050，授權(quán)于2001年6月26日)。發(fā)明概述本文所公開的方法提供了檢驗(yàn)哺乳動物組織或細(xì)胞樣品中一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)的方法和測定法，其中一種或多種所述生物標(biāo)志物的表達(dá)預(yù)示該組織或細(xì)胞樣品是否將對諸如Apo2L/TRAIL或抗DR5激動劑抗體的藥劑是敏感的。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，所述方法和測定法檢驗(yàn)GalNac-T蛋白質(zhì)家族中的分子(尤其是GalNAc-T14或GalNAc-T3)的表達(dá)。如上所述，大多數(shù)正常人細(xì)胞類型表現(xiàn)出對某些重組形式Apo2L/TRAIL的凋亡i秀導(dǎo)作用有^i元'f生(Ashkenazietal.，supra;Walzcaketal.,supra)。還，見察到有些患病人細(xì)胞類型群體(諸如某些癌細(xì)胞群體)對某些重組形式Apo2L/TRAIL的凋亡誘導(dǎo)作用有抵抗性(Ashkenazietal.,J.Clin.Invest.,1999supra;Walczaketal.,NatureMed.,1999,supra)。因此，通過某種測定法對哺乳動物組織或細(xì)胞樣品檢驗(yàn)選定的生物標(biāo)志物的表達(dá)，可以方便且有效的得到可用于評估治療患者的適宜或有效療法的信息。例如，自檢測哺乳動物組織或細(xì)胞樣品中GalNac-T14表達(dá)的測定法得到的信息可以為內(nèi)科醫(yī)師提供有用數(shù)據(jù)，用于為患有諸如癌癥或免疫相關(guān)疾病(諸如自身免疫病)的病癥的患者確定最佳治療方案(使用Apo2L/TRAIL或死亡受體激動劑抗體)。本發(fā)明提供了用于預(yù)測哺乳動物組織或細(xì)胞樣品(諸如癌細(xì)胞)對Apo2L/TRAIL或死亡受體激動劑抗體的敏感性的方法。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括獲取哺乳動物組織或細(xì)胞樣品，并對該組織或細(xì)胞^r驗(yàn)GalNac-T14的表達(dá)。所述方法可以以多種測定法才各式來進(jìn)行，包括;險(xiǎn)測mRNA和/或蛋白質(zhì)表達(dá)的測定法、酶活性測定法和本文討論的其它測定法。Apo2L/TRAIL和/或死亡受體抗體的凋亡誘導(dǎo)活性是l丈感的。在任選的實(shí)施方案中，還可以對所述組織或細(xì)胞檢驗(yàn)DR4、DR5、DcRl或DcR2受體的表達(dá)。本發(fā)明的其它方法包括在哺乳動物組織或細(xì)胞樣品中誘導(dǎo)凋亡的方法，包括以下步驟獲耳又哺乳動物組織或細(xì)胞樣品；對該組織或細(xì)胞樣品纟企驗(yàn)GalNac-T14的表達(dá)；并在測定出所述組織或細(xì)胞表達(dá)GalNac-T14之后，將所述組織或細(xì)胞樣品暴露于有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受體激動劑抗體。所述方法中用于檢驗(yàn)GalNac-T14表達(dá)的步驟可以以多種測定法格式來進(jìn)行，包括檢測mRNA和/或蛋白質(zhì)表達(dá)的測定法、酶活性測定法、和本文討論的其它測定法。在任選的實(shí)施方案中，所述方法還包括對所述組織或細(xì)胞樣品一全驗(yàn)DR4、DR5、DcRl或DcR2受體的表達(dá)。任選的是，所述組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。任選的是，所述組織或細(xì)胞樣品包括非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞或非何杰金氏淋巴瘤(non-hodgkin，slymphoma)細(xì)胞。本發(fā)明的其它方法還包括治療哺乳動物中的病癥諸如免疫相關(guān)病癥或癌癥的方法，包括以下步驟自所述哺乳動物獲取組織或細(xì)胞樣品；對該組織或細(xì)胞樣品檢驗(yàn)GalNac-T14的表達(dá)；并在測定出所述組織或細(xì)胞樣品表達(dá)GalNac-T14之后，對所述哺乳動物施用有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受體激動劑抗體。所述方法中用于檢驗(yàn)一種或多種生物標(biāo)志物表達(dá)的步驟可以以多種測定法格式來進(jìn)行，包括檢測mRNA和/或蛋白質(zhì)表達(dá)的測定法、酶活性測定法、和本文討論的其它測定法。在任選的實(shí)施方案中，所述方法還包括對所述組織或細(xì)胞樣品檢驗(yàn)DR4、DR5、DcRl或DcR2受體的表達(dá)。任選的是，所述方法包括治療哺乳動物中的癌癥。任選的是，在施用有效量的Apo2L/TRAIL和/或死亡受體激動劑抗體之外，所述方法包括對所述哺乳動物施用化療劑或放療。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，上述方法可以包括對哺乳動物組織或細(xì)胞檢驗(yàn)其它GalNac-T分子(諸如GalNac-T3)的表達(dá)。其它實(shí)施方案還例示為例如以下權(quán)利要求1.用于預(yù)測哺乳動物組織或細(xì)胞樣品對Apo2L/TRAIL的敏感性的方法，包括以下步驟獲取哺乳動物組織或細(xì)胞樣品；檢驗(yàn)該組織或細(xì)胞樣品以檢測GalNac-T14的表達(dá)，其中所述GalNac-T14的表達(dá)預(yù)示所述組織或細(xì)胞樣品對Apo2L/TRAIL的凋亡誘導(dǎo)活性是敏感的。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過檢測GalNac-T14mRNA的表達(dá)來檢驗(yàn)的。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過免疫組織化學(xué)來檢驗(yàn)的。4.權(quán)利要求l的方法，進(jìn)一步包括以下步驟檢驗(yàn)所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcRl或DcR2受體的表達(dá)。5.權(quán)利要求l的方法，其中所述組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述癌組織或細(xì)胞包括胰腺癌、淋巴瘤或非小細(xì)胞肺癌組織或細(xì)胞。7.用于在哺乳動物組織或細(xì)胞樣品中誘導(dǎo)凋亡的方法，包括以下步驟獲耳又哺乳動物組織或細(xì)胞樣品；^r驗(yàn)該組織或細(xì)胞樣品以檢測GalNac-T14的表達(dá)；并在檢測到所述GalNac-T14的表達(dá)之后，將所述組織或細(xì)胞樣品暴露于有效量的Apo2L/TRAIL。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過檢測GalNac-T14mRNA的表達(dá)來檢驗(yàn)的9.權(quán)利要求7的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過免疫組織化學(xué)來檢驗(yàn)的。10.4又利要求7的方法，進(jìn)一步包括以下步驟檢驗(yàn)所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcRl或DcR2受體的表達(dá)。11.權(quán)利要求7的方法，其中所述組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述癌組織或細(xì)胞包括胰腺癌、淋巴瘤或非小細(xì)胞肺癌組織或細(xì)胞。13.權(quán)利要求7的方法，其中將所述細(xì)胞暴露于有效量的包含圖l氨基酸114-28l的Apo2L/TRAIL多肽。14.治療哺乳動物中的病癥諸如免疫相關(guān)病癥或癌癥的方法，包括以下步驟自所述哺乳動物獲取組織或細(xì)胞樣品；檢驗(yàn)該組織或細(xì)胞樣品以檢測GalNac-T14的表達(dá)；并在檢測到所述GalNac-T14的表達(dá)之后，對所述哺乳動物施用有效量的Apo2L/TRAIL。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過檢測GalNac-T14mRNA的表達(dá)來檢驗(yàn)的。16.權(quán)利要求14的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過免疫組織化學(xué)來檢驗(yàn)的。17.權(quán)利要求14的方法，進(jìn)一步包括以下步驟檢驗(yàn)所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcRl或DcR2受體的表達(dá)。18.權(quán)利要求14的方法，其中所述組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述癌組織或細(xì)胞包括胰腺癌、淋巴瘤或非小細(xì)胞肺癌組織或細(xì)胞。20.權(quán)利要求14的方法，其中對所述哺乳動物施用有效量的包含圖l氨基酸114-281的Apo2L/TRAIL多肽。21.權(quán)利要求14的方法，其中還對所述哺乳動物施用化療劑或放療。22.權(quán)利要求14的方法，其中還對所述哺乳動物施用細(xì)胞因子、細(xì)胞毒劑或生長抑制劑。23.權(quán)利要求7的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽連接有聚乙二醇分子。24.權(quán)利要求14的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽連接有聚乙二醇分子。25.用于預(yù)測哺乳動物組織或細(xì)胞樣品對死亡受體抗體的敏感性的方法，包括以下步驟獲^f又哺乳動物組織或細(xì)胞樣品；檢驗(yàn)該組織或細(xì)胞樣品以檢測GalNac-T14的表達(dá)，其中所述GalNac-T14的表達(dá)預(yù)示所述組織或細(xì)胞樣品對死亡受體抗體的凋亡誘導(dǎo)活性是敏感的。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過檢測GalNac-T14mRNA的表達(dá)來檢驗(yàn)的。27.權(quán)利要求25的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過免疫組織化學(xué)來檢驗(yàn)的。28.權(quán)利要求25的方法，進(jìn)一步包括以下步驟檢驗(yàn)所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcRl或DcR2受體的表達(dá)。29.權(quán)利要求25的方法，其中所述組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述癌組織或細(xì)胞包括胰腺癌、淋巴瘤或非小細(xì)胞肺癌組織或細(xì)胞。31.權(quán)利要求25的方法，其中所述死亡受體抗體是激動性抗DR4抗體或激動性抗DR5抗體。32.用于在哺乳動物組織或細(xì)胞樣品中誘導(dǎo)凋亡的方法，包括以下步驟獲取哺乳動物組織或細(xì)胞樣品；檢驗(yàn)該組織或細(xì)胞樣品以檢測GalNac-T14的表達(dá)；并在檢測到所述GalNac-T14的表達(dá)之后，將所述組織或細(xì)胞樣品暴露于有效量的死亡受體抗體。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過檢測GalNac-T14mRNA的表達(dá)來檢驗(yàn)的34.權(quán)利要求32的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過免疫組織化學(xué)來檢驗(yàn)的。35.權(quán)利要求32的方法，進(jìn)一步包括以下步驟檢驗(yàn)所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcRl或DcR2受體的表達(dá)。36.權(quán)利要求32的方法，其中所述組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述癌組織或細(xì)胞包括胰腺癌、淋巴瘤或非小細(xì)月包"市癌纟且織或細(xì)月包。38.權(quán)利要求32的方法，其中將所述細(xì)胞暴露于有效量的激動性抗DR4抗體或激動性抗DR5抗體。39.權(quán)利要求38的方法，其中將所述細(xì)胞暴露于有效量的能與圖3A所示DR5受體結(jié)合的激動性抗DR5抗體。40.治療哺乳動物中的病癥諸如免疫相關(guān)病癥或癌癥的方法，包括以下步驟自所述哺乳動物獲>又組織或細(xì)胞樣品；檢驗(yàn)該組織或細(xì)胞樣品以檢測GalNac-T14的表達(dá)；并在檢測到所述GalNac-T14的表達(dá)之后，對所述哺乳動物施用有效量的死亡受體抗體。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過檢測GalNac-T14mRNA的表達(dá)來檢驗(yàn)的。42.權(quán)利要求40的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過免疫組織化學(xué)來檢驗(yàn)的。43.權(quán)利要求40的方法，進(jìn)一步包括以下步驟檢驗(yàn)所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcRl或DcR2受體的表達(dá)。44.權(quán)利要求40的方法，其中所述組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述癌組織或細(xì)胞包括胰腺癌、淋巴瘤或非小細(xì)胞肺癌組織或細(xì)胞。46.權(quán)利要求40的方法，其中對所述哺乳動物施用有效量的抗DR4或DR5抗體。47.權(quán)利要求40的方法，其中還對所述哺乳動物施用化療劑或放療。48.權(quán)利要求40的方法，其中還對所述哺乳動物施用細(xì)胞因子、細(xì)胞毒劑或生長抑制劑。附圖簡述圖l顯示了人Apo-2配體cDNA的核香酸序列(SEQIDNO:2)及其衍生的氨基酸序列(SEQIDNO:l)。核苷酸第447位處的"N"用于指示該核苷酸石成基可以是"T"或"G"。圖2A和2B顯示了全長人DR4cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:4)及其衍生的氨基酸序列(SEQIDNO:3)。人DR4的相應(yīng)核苷酸和氨基酸序列還報(bào)導(dǎo)于Panetal.，Science,276:111(1997)。圖3A顯示了人DR5411個氨基酸的序列(SEQIDNO:5)，披露于1998年11月19日公開的WO98/51793。本領(lǐng)域已知人DR5的一種轉(zhuǎn)錄剪接變體。該DR5剪接變體編碼人DR5440個氨基酸的序列(SEQIDNO:6)，如圖3B和3C所示，披露于1998年8月20日公開的WO98/35986。圖3D顯示了全長人DcRlcDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:7)及其衍生的氨基酸序列(SEQIDNO:8)。人DcRl(及其具體結(jié)構(gòu)域)的相應(yīng)核苷酸和氨基酸序列還顯示和披露于WO98/58062。圖3E顯示了全長人DcR2cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:9)及其衍生的氨基酸序列(SEQIDNO:IO)。人DcR2(及其具體結(jié)構(gòu)域)的相應(yīng)核苷酸和氨基酸序列還顯示于WO99/10484。圖4A顯示了人GalNac-T14的核苷酸序列(SEQIDNO:ll)及其衍生的氨基酸序列(SEQIDNO:12)。這些序列還披露于Wangetal.,BBRC,300:738-744(2003)。圖4B顯示了人GalNac-T3的核苦酸序列(SEQIDNO:13)及其衍生的氨基酸序列(SEQIDNO:14)。這些序列還披露于Bennettetal.,J.Biol.Chem.,271:17006-17012(1996)。圖5提供了在對非小細(xì)胞肺癌("NSCLC")細(xì)胞系分析對Apo2L(+0.5%胎牛血清"FBS，，或10。/c)FBS)或DR5單克隆抗體"DR5ab"(交聯(lián)的"XL，，或非交聯(lián)的)(+0.5。/。胎牛血清"FBS"或10Q/c)FBS)凋亡活性的敏感性或抵抗性時得到的數(shù)據(jù)的IC50匯總表，所述數(shù)據(jù)是在MTT細(xì)胞毒性測定法中測得的。圖6提供了在對胰腺癌細(xì)胞系分析對Apo2L(+0.5%胎牛血清叩88，，或10。/。FBS)或DR5單克隆抗體"DR5ab"(交聯(lián)的"XL"或非交聯(lián)的)(+0.5%胎牛血清"FBS"或10。/。FBS)凋亡活性的敏感性或抵抗性時得到的數(shù)據(jù)的IC50匯總表，所述lt據(jù)是在MTT細(xì)胞毒性測定法中測得的。圖7提供了在對非何杰金氏淋巴瘤("NHL，，)細(xì)胞系分析對Apo2L(+10%胎牛血清"FBS，，)或DR5單克隆抗體"DR5ab，，(交聯(lián)的"XL"或非交聯(lián)的)(+10%胎牛血清叩88")凋亡活性的敏感性或抵抗性時得到的數(shù)據(jù)的IC50簡表，所述數(shù)據(jù)是在MTT細(xì)胞毒性測定法中測得的。圖8提供了選出的NSCLC、胰腺癌和NHL細(xì)胞系對DR5抗體的敏感性(sensitivity)("sen")或抵抗性(resistance)("RES，，)的比較及其與GalNac-T14表達(dá)的相關(guān)性，所述GalNac-T14表達(dá)是通過GalNac-T14mRNA表達(dá)來測量的。圖9提供了根據(jù)GalNac-T14mRNA表達(dá)模式水平排列(降序)的各種NSCLC、胰腺癌和NHL細(xì)胞系的柱形圖。圖10A-D圖示了特定0-糖基化酶在Apo2L/TRAIL敏感性和抵抗性癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)(A)在與不同劑量的Apo2L/TRAIL—起溫育后測量細(xì)胞存活力。每種細(xì)胞系的IC50計(jì)算為引起存活力喪失50。/。的Apo2L/TRAIL濃度。每個細(xì)胞存活力實(shí)驗(yàn)在存在低(0.5%)和高(10%)月臺牛血清時重復(fù)至少3次。黑色、灰色或空心符號分別描繪對Apo2L/TRAIL高度敏感、中等敏感或耐受的細(xì)胞系。(B)胰腺癌和惡性黑素瘤細(xì)胞系中的ppGalNAcT-14mRNA表達(dá)水平(探針組219271一at)。細(xì)胞系是根據(jù)組織類型和對Apo2L/TRAIL的敏感性而排列的。黑色、灰色或空心柱像A—樣描繪細(xì)胞系。(C)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中的Fut-6(頂圖，探針組211885—x_at)和ppGalNAcT-3(底圖，探針組203397_s—at)mRNA表達(dá)水平。細(xì)胞系像B—樣排列。小圖B和C中的P值基于細(xì)胞系敏感性(包括高度的和中等的)與高于截留值的mRNA表達(dá)之間相關(guān)性的Fisher檢驗(yàn)。(D)Apo2L/TRAIL對已建立的肺瘤異種移植物生長的影響。攜帶GalNAcT-3/Fut-6-陽性(左小圖)或GalNAcT-3/Fut-6-陰性(右小圖)肺瘤的無胸腺棵鼠接受媒介物(vehicle)或Apo2L/TRAIL(60mg/kg/天，i.p.,第0-4天)并監(jiān)測肺瘤體積(均值士SE,N^10只小鼠/組)。圖11圖示了特定0-糖基化酶改變對Apo2L/TRAIL的敏感性的調(diào)控。(A)將Co10205細(xì)胞與泛O-糖基化酶抑制劑,基-GalNAc(bGalNAc)—起預(yù)溫育，用Apo2L/TRAIL處理24小時，并測定細(xì)胞存活力(DMSO^某介物對照)。(B)將PSN-1(胰腺癌)和Hs294T(黑素瘤)細(xì)胞用胱天蛋白酶-8或ppGalNAcT-14siRNA轉(zhuǎn)染48小時，與Apo2L/TRAIL—起再溫育24小時，并測定細(xì)胞存活力。使用針對非靶向序列的siRNA雙鏈體(Dharmacon)作為對照(NTC)。(C)將DLD-1結(jié)腸直腸癌細(xì)胞通過siRNA用ppGalNAcT-3或Fut-6轉(zhuǎn)染并像B—樣測試。(D)將HEK293細(xì)胞用編碼指定基因及ppGalNAcT-14的質(zhì)?；蜉d體對照共轉(zhuǎn)染。在24小時時通過膜聯(lián)蛋白V染色(左小圖)測量凋亡。將H1569黑素瘤細(xì)胞用指導(dǎo)ppGalNAcT-14表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒或?qū)φ漳孓D(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)；將所得細(xì)胞系集合用Apo2L/TRAIL處理24小時并測定細(xì)胞存活力(右小圖)。通過使用抗FLAG抗體的Western印跡分析來驗(yàn)證有表位標(biāo)簽的ppGalNAcT-14的表達(dá)。圖12圖示了(A)由Apo2L/TRAIL誘導(dǎo)的胱天蛋白酶級聯(lián)的分析。將PSN-1和DLD-1細(xì)胞分別用針對ppGalNAcT-14或Fut-6的siRNA轉(zhuǎn)染48'J、時。將細(xì)胞用Apo2L/TRAIL處理4或8小時，并通過使用胱天蛋白酶-8、Bid、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3或肌動蛋白(作為加載對照)特異性抗體的免疫印跡分析溶胞物。(B)將PSN-l細(xì)胞像A—樣用ppGalNAcT-14siRNA轉(zhuǎn)染，用Apo2L/TRAIL處理4小時，并測定溶胞物中的胱天蛋白酶-3/7酶活性。(C)Apo2L/TRAILDISC的分析。將PSN-l細(xì)胞像A—樣用ppGalNAcT-14siRNA轉(zhuǎn)染。添加FLAG-Apo2L/TRAIL(lmg/ml)達(dá)0-60分鐘，將細(xì)胞溶解，并用抗FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀。通過免疫印跡檢測DISC相關(guān)FADD、胱天蛋白酶-8、DR4。(D)將PSN-1細(xì)胞像C一樣進(jìn)行轉(zhuǎn)染、處理、和DISC免疫沉淀，并如文獻(xiàn)所述測量DISC相關(guān)胱天蛋白酶-8酶活性(Sharpetal.，J.Biol.Chem.,280:19401(2005))。圖13圖示了(A)CHO細(xì)胞中生成的重組人DR5(長剪接變體)的單糖分析，通過HPAEC-PAD(高效陰離子交換層析-脈沖電流測定)進(jìn)行。(B)人Apo2L/TRAIL受體(440個氨基酸的長型人DR5"hDR5L"、411個氨基酸的短型人DR5"hDR5S，，和hDR4)、鼠DR5(mDR5)、人Fas(hFas)和人TNFRl(hTNFRl)的序列比較。框指示推定的O-糖基化位點(diǎn)。(C)對應(yīng)于D的總?cè)馨锏拿庖哂≯E分析。DR5L-5T和DR5S-5T是包含5個蘇氨酸變成丙氨酸替代的構(gòu)建物，DR5L-5T3S和DR5S-5T3S是包含5個蘇氨酸變成丙氨酸和3個絲氨酸變成丙氨酸替代的構(gòu)建物，所述殘基位于潛在O-糖基化位點(diǎn)內(nèi)。(D)將HEK293細(xì)胞用指定的DR5構(gòu)建物及載體或ppGalNAcT-14質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48小時，并通過膜聯(lián)蛋白V染色測量凋亡。(E)來自皮膚癌(SCC-鱗狀細(xì)胞癌)、肺癌、胰腺癌(Panc)、乳腺癌、卵巢癌(Ov)、子宮內(nèi)膜癌(Endo)、膀胱癌(Bla,TCC=移行細(xì)胞癌)和NHL(FL-濾泡性淋巴瘤，DLBCI^彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤)的原代人腫瘤樣品中ppGalNAcT-14mRNA表達(dá)水平(Affymetrix芯片，探針組219271—at)。每一類樣品的中值表達(dá)表示為灰色水平條。顯示了對應(yīng)于來自圖10B的細(xì)胞系數(shù)據(jù)的500和200的截留值(黑素瘤)。圖14圖示了(A)siRNA敲低后48小時后PSN-1或DLD-1細(xì)胞中ppGalNAcT-14或ppGalNAcT-3mRNA表達(dá)的降低，通過Taqman分析測量。(B)通過在siGalNAcT-14(1)介導(dǎo)的ppGalNAcT-14敲低之后轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(空的)、野生型GalNAcT-14(GalNAcT-14)或含siRNA沉默突變的GalNAcT-14(GalNAcT-14si(l)Mut)，在PSN-l細(xì)胞中重建GalNAcT-14表達(dá)。(C)C170(結(jié)腸直腸癌)細(xì)胞中干擾RNA對ppGalNAcT-3或Fut-6的下調(diào)抑制Apo2L/TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)規(guī)程像11C一樣。表lA)siRNA敲低表型匯總表。標(biāo)示了其中GalNAcT-14或ppGalNAcT-3和Fut-6下調(diào)導(dǎo)致針對Apo2L/TRAIL的保護(hù)的細(xì)胞系，指示至少一種所測試的siRNA寡核苷酸引起小于50。/o的保護(hù)作用(+)或大于50%的保護(hù)作用(++)。(0)指示不存在針對Apo2L/TRAIL的保護(hù)作用。(D)，(E)在用指定siRNA敲低^小時之后，將細(xì)胞用漸增劑量的依托泊香(etoposide)或十字孢石成(staurosporine)(STS)處理24小時并進(jìn)行細(xì)胞存活力測定法。(F)在Apo2L/TRAIL處理之后，將過表達(dá)ppGalNAcT-14的逆轉(zhuǎn)錄病毒PA-TU-8902和PL-45細(xì)胞系集合進(jìn)行細(xì)胞存活力測定法。使用抗FLAG抗體的Western印跡分析指示這些細(xì)胞中有逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)的ppGalNAcT-14。圖15(A)Apo2L/TRAIL敏感性Colo205和抵抗性結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系RKO和SW1417中Apo2L/TRAIL誘導(dǎo)的胱天蛋白酶激活級聯(lián)的Western印跡分析。將細(xì)胞用1000ng/mlApo2L/TRAIL處理8和24小時，并將總的溶胞物進(jìn)行4吏用胱天蛋白酶-8、Bid、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3和肌動蛋白(作為加載對照)特異性抗體的western印跡分析。(B)DLD-l細(xì)胞中Apo2L/TRAILDISC處Fut-6降低的胱天蛋白酶-8募集和激活的敲低。實(shí)驗(yàn)規(guī)程依照12D。(C)通過FACS分析在用指定基因進(jìn)行了siRNA敲低的細(xì)胞中測量DR4和DR5的細(xì)胞表面表達(dá)。發(fā)明詳述本文中描述或提到的技術(shù)和規(guī)程一般得到了本領(lǐng)域技術(shù)人員的充分理解，而且通常利用常規(guī)方法，諸如例如廣泛應(yīng)用的分子克隆方法，記載于Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual第2版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y。適當(dāng)時，涉及l(fā)吏用市售試劑盒和試劑的規(guī)程一^:依照制造商規(guī)定的方案和/或參數(shù)進(jìn)行，除非另有說明。在描述本發(fā)明的方法和測定法之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所描述的具體方法、方案、細(xì)胞系、動物種或?qū)?、?gòu)建物和試劑，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然可以有所變化。還應(yīng)當(dāng)理解本文中所使用的術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施方案，并非意圖限制本發(fā)明的范圍，只通過所附權(quán)利要求才對本發(fā)明范圍進(jìn)行限制。必須注意的是，在用于本文及所附權(quán)利要求時，單數(shù)形式"一個/種"、"該"和"所述"等包括復(fù)數(shù)所指物，除非另有明確規(guī)定。如此，例如，提到"遺傳改變"包括一處或多處此類改變，提到"探針"包括一種或多種探針及其本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的等效物，諸如此類。將本文中提到的所有出版物收入本文作為參考，以披露和描述與所引用出版物有關(guān)的方法和/或材料。引用本文中所引用的出版物是因?yàn)樗鼈兪窃诒旧暾埖奶峤蝗罩肮_的。本文中的任何文字都不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明的發(fā)明人沒有資格憑借更早的優(yōu)先權(quán)日或在先發(fā)明日而早于所述出版物。此外，實(shí)際發(fā)表日可能與所顯示的有所不同，需要獨(dú)立查證。I.定義術(shù)語"Apo2L/TRAIL"、"Apo-2L"和"TRAIL"在本文中用于指包含圖l所示氨基酸序列的氨基酸殘基114-281(含端點(diǎn))、殘基95-281(含端點(diǎn))、殘基92-281(含端點(diǎn))、殘基91-281(含端點(diǎn))、殘基41-281(含端點(diǎn))、殘基15-281(含端點(diǎn))或殘基1-281(含端點(diǎn))的多肽序列，以及上述序列的生物學(xué)活性片4殳、刪除、插入或替代變體。在一個實(shí)施方案中，多肽序列包含圖1的殘基114-281。并且任選由圖1的殘基114-281組成。任選的是，多肽序列包含圖1的殘基92-281或殘基91-281。Apo-2L多肽可以由圖l所示天然核苷酸序列編碼。任選的是，編碼殘基Pro119(圖l)的密碼子可以是"CCT"或"CCG"。在其它實(shí)施方案中，所述片段或變體具有生物學(xué)活性，且與任一上文所述Apo2L/TRAIL序列具有至少約80。/。的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約90%的序列同一性，甚至更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。任選的是，Apo2L/TRAIL多肽由在嚴(yán)格條件下與圖l所提供的編碼多核普酸序列發(fā)生雜交的核苷酸序列編碼。該定義涵蓋Apo2L/TRAIL的替代變體，其中其至少一個天然氨基酸用丙氨酸殘基替代。Apo2L/TRAIL的具體替代變體包括那些其中至少一個氨基酸用丙氨酸殘基替代的變體。這些替代變體包括那些鑒定為例如"D203A"、"D218A"和"D269A"的變體。使用這種命名法來鑒定其中第203、218和/或269位(使用圖l所示編號方式)天冬氨酸殘基用丙氨酸殘基替代的Apo2L/TRAIL變體。任選的是，Apo2L變體可以包含已公開的PCT申請WO01/00832的表I中所描述的一處或多處丙氨酸替多處殘基替代。該定義還涵蓋乂人Apo-2L/TRAIL來源分離的或者通過重組或合成方法制備的天然序列Apo-2L/TRAIL。本發(fā)明的Apo-2L/TRAIL包括PCT出版物WO97/01633和WO97/25428中披露的稱作Apo-2L/TRAIL或TRAIL的多肽。術(shù)語"Apo2L/TRAIL"或"Apo2L"通常用于指Apo-2L/TRAIL的各種形式，包括多肽的單體、二聚體或三聚體形式。除非另有說明，Apo-2L序列中提及的所有氨基酸殘基編號采用依照圖l的編號。例如，"D203"或"Asp203"指圖l提供的序列中第203位的天冬氨酸殘基。術(shù)語"Apo2L/TRAIL胞外域"或"Apo2L/TRAILECD"指基本上不含跨膜域和胞質(zhì)域的Apo2L/TRAIL形式。通常，ECD具有少于l。/。的此類跨膜域和胞質(zhì)域，且優(yōu)選具有少于0.5%的此類結(jié)構(gòu)域。應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明多肽所鑒定的任何跨膜域是依照本領(lǐng)域常規(guī)用于鑒定那種類型的疏水結(jié)構(gòu)域的標(biāo)準(zhǔn)而鑒定的?？缒び虻木_邊界可以變化，但最有可能是最初鑒定的結(jié)構(gòu)域的任一末端不超過約5個氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，ECD由該多肽的可溶性胞外域序列組成，不含^f爭膜域和胞質(zhì)或胞內(nèi)域(且不與膜結(jié)合)。具體的Apo-2L/TRAIL胞外域序列記載于PCT公開號WO97/01633和WO97/25428。術(shù)語"Apo2L/TRAIL單體"或"Apo2L單體"指Apo2L的胞外域序列的共價(jià)鏈。術(shù)語"Apo2L/TRAIL二聚體，，或"Apo2L二聚體"指通過二硫鍵以共價(jià)連接相連的兩個Apo-2L單體。該術(shù)語在用于本文時包括游離存在的Apo2L二聚體和Apo2L三聚體形式內(nèi)的Apo2L二聚體(即與另一個、第三個Apo2L單體結(jié)合)。術(shù)語"Apo2L/TRAIL三聚體，，或"Apo2L三聚體"指非共價(jià)結(jié)合的三個Apo2L單體。術(shù)語"Apo2L/TRAIL聚集體"用于指自結(jié)合的較高寡聚物形式的Apo2L/TRAIL,諸如Apo2L/TRAIL三聚體，它們形成例如六聚體和九聚體形式的Apo2L/TRAIL?？刹捎帽绢I(lǐng)域知道的方法和測定法(并使用商品化材料)，諸如天然大小排阻HPLC("SEC")、使用十二烷基硫酸鈉的變性大小排阻("SDS-SEC，，)、反相HPLC和毛細(xì)管電泳來測定Apo2L/TRAIL單體、二聚體或三聚體(或其它聚集體)的存在和數(shù)量。"Apo-2配體受體"包括本領(lǐng)域稱作"DR4"和"DR5"的受體，其多核香酸和多肽序列分別顯示于圖2和3。Pan等人描述了稱作"DR4"的TNF受體家族成員(Panetal.，Science,276:111-113(1997);WO98/32856，公開于1998年7月30日；WO99/37684,公開于1999年7月29日；WO(KV73349,公開于2000年12月7日；US6,433,147,授權(quán)于2002年8月13日；US6,461,823，授權(quán)于2002年10月8日；US6,342,383，^受權(quán)于2002年1月29日)。Sheridan等人(Science,277:818-821(1997))和Pan等人(Science,277:815-818(1997))描述了Apo2L/TRAIL的另一種受體(還可參見WO98/51793，公開于1998年11月19日；WO98/41629，公開于1998年9月24日)。此受體稱作DR5(該受體還可稱作Apo-2、TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAP08、TRICK2或KILLER;Screatonetal"Curr.Biol.,7:693-696(1997);Walczaketal.,EMBOJ.，16:5386-5387(1997);Wuetal.，NatureGenetics,17:141-143(1997);WO98/35986,公開于1998年8月20日；EP870,827,公開于1998年10月14日；WO98/46643,公開于1998年10月22日；WO99/02653，公開于1999年1月21日；WO99/09165,公開于1999年2月25日；WO99/11791，公開于1999年3月11日；US2002/0072091,公開于2002年8月13日；US2002/0098550，公開于2001年12月7日；US6，313，269,授權(quán)于2001年12月6日；US2001/0010924，公開于2001年8月2日；US2003/01255540,公開于2003年7月3日；US2002/0160446，公開于2002年10月31日；US2002/0048785，公開于2002年4月25日；US6,569,642，授權(quán)于2003年5月27日；US6,072,047,授權(quán)于2000年6月6日；US6,642,358,授權(quán)于2003年11月4日)。如上所述，Apo-2L的其它受體包括DcRl、DcR2和OPG(參見Sheridanetal.，見上文；Marstersetal.,見上文；Simonetetal.,見上文)。術(shù)語"Apo-2L受體"在用于本文時涵蓋天然序列受體和受體變體。這些術(shù)語涵蓋在多種哺乳動物包括人中表達(dá)的Apo-2L受體。Apo-2L受體可以是內(nèi)源表達(dá)的，如在多種人組織譜系中天然發(fā)生的，或者可以是通過重組或合成方法表達(dá)的。"天然序列Apo-2L受體"包括與衍生自自然界的Apo-2L受體具有相同氨基S交序列的多肽。因此，天然序列Apo-2L受體可以具有來自任何哺乳動物的天然存在Apo-2L受體的氨基酸序列。此類天然序列Apo-2L受體可以從自然界分離，或者可以通過重組或合成手段生產(chǎn)。術(shù)語"天然序列Apo-2L受體，，明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式的受體(例如含有例如胞外域序列的可溶形式)、天然存在的變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位基因變體。受體變體可包括天然序列Apo-2L受體的片段或刪除突變體。圖3A顯示了1998年11月19日公開的WO98/51793中披露的411個氨基酸的人DR5序列。本領(lǐng)域知道人DR5的一種轉(zhuǎn)錄剪接變體。此DR5剪接變體編碼圖3B和3C所示1998年8月20日公開的WO98/35986中披露的440個氨基酸的人DR5序列。"死亡受體抗體"在用于本文時通常指針對腫瘤壞死因子受體超家族中的、包含能夠發(fā)出凋亡信號的死亡結(jié)構(gòu)域的受體的抗體，這樣的抗體包括DR5抗體和DR4抗體。"DR5受體抗體"、"DR5抗體"或"抗DR5抗體，，以廣義使用，指結(jié)合至少一種形式的DR5受體(諸如圖3A所示l-411序列或圖3B-3C所示l-440序列)或其胞外域的抗體。任選的是，DR5抗體與異源序列或分子融合或連接。優(yōu)選的是，異源序列容許或幫助抗體形成更高等級或寡聚復(fù)合物。任選的是，DR5抗體結(jié)合DR5受體但不與任何其它Apo-2L受體(例如DR4、DcRl或DcR2)結(jié)合或發(fā)生交叉反應(yīng)。任選的是，該抗體是DR5信號活性的激動劑。任選的是，根據(jù)BIAcore結(jié)合測定法的測量，本發(fā)明的DR5抗體在約0.1nM到約20mM的濃度范圍內(nèi)結(jié)合DR5受體。任選的是，根據(jù)BIAcore結(jié)合測定法的測量，本發(fā)明的DR5抗體呈現(xiàn)出約0.6nM到約18mM的Ic50值。"DR4受體抗體"、"DR4抗體"或"抗DR4抗體，，以廣義使用，指結(jié)合至少一種形式的DR4受體或其胞外域的抗體。任選的是，DR4抗體與異源序列或分子融合或連接。優(yōu)選的是，異源序列允許或幫助抗體形成更高等級或寡聚復(fù)合物。任選的是，DR4抗體結(jié)合DR4受體但不與任何其它Apo-2L受體(例如DR5、DcRl或DcR2)結(jié)合或發(fā)生交叉反應(yīng)。任選的是，該抗體是DR4信號活性的激動劑。任選的是，根據(jù)BIAcore結(jié)合測定法的測量，本發(fā)明的DR4抗體在約0.1nM到約20mM的濃度范圍內(nèi)結(jié)合DR4受體。任選的是，根據(jù)BIAcore結(jié)合測定法的測量，本發(fā)明的DR4抗體呈現(xiàn)出約0.6nM到約18mM的Ic50值。術(shù)語"激動劑"以最廣義使用，包括在體外、原位或在體內(nèi)部分或完全增強(qiáng)、刺激或激活A(yù)po2L/TRAIL、DR4或DR5的一種或多種生物學(xué)活性的任以及文獻(xiàn)中報(bào)道的其它活性。激動劑可以直接或間接方式起作用。例如，激動劑可以在體外、原位或在體內(nèi)由于其直接結(jié)合DR4或DR5從而引起受體活化或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果，從而部分或完全增強(qiáng)、刺激或激活DR4或DR5的一種或多種生物學(xué)活性。激動劑還可以在體外、原位或在體內(nèi)由于例如刺激另一種效應(yīng)分子繼而？1起DR4或DR5活化或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果而間接地部分或完全增強(qiáng)、刺激或激活DR4或DR5的一種或多種生物學(xué)活性。設(shè)想了激動劑可作為間接起作用的分子來增強(qiáng)或提高DR4或DR5活化或活性的增強(qiáng)分子。例如，激動劑可增強(qiáng)哺乳動物中內(nèi)源Apo-2L的活性。這可通過例如預(yù)復(fù)合DR4或DR5或者通過穩(wěn)定各自配體與DR4或DR5受體的復(fù)合物(諸如穩(wěn)定Apo-2L與DR4或DR5之間形成的天然復(fù)合物)來實(shí)現(xiàn)。術(shù)語"生物標(biāo)志物"作用于本申請時一般指其在哺乳動物組織或細(xì)胞中/上的表達(dá)可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法(或本文所披露的方法)來一企測且預(yù)示哺乳動物組織或細(xì)胞對Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體的敏感性的分子，包括基因、蛋白質(zhì)、碳水化合物結(jié)構(gòu)或糖脂。本發(fā)明所設(shè)想的此類生物標(biāo)志物包括但不限于GalNac-T蛋白質(zhì)家族中的分子。人N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶("GalNac-T")基因和蛋白質(zhì)家族的成員已有記載(參見例如Hang等，"Thechemistryandbiologyofmucin-typeO-linkedglycosylationinitiatedbythepolypeptideN-acetyl-—-galactosaminyltransferases，，,Bioorganic&MedicinalChemistry(availableMay2005atwww.sciencedirect.com)及其虧j用的參考文獻(xiàn)；Wangetal,，BBRC,300:738-744(2003)及其引用的參考文獻(xiàn))，而且認(rèn)為它在決定蛋白質(zhì)中O-連接糖鏈的數(shù)目和位置中起作用。任選的是，此類生物標(biāo)志物的表達(dá)測定出高于在對照組織或細(xì)胞樣品中所觀察到的。任選的是，例如，此類生物標(biāo)志物的表達(dá)將使用基因表達(dá)微陣列、定量PCR或免疫組織化學(xué)(IHC)測定法來測定。任選的是，在測試組織或細(xì)胞樣品中檢測出的GalNac-T生物標(biāo)志物(諸如GalNac-T14或GalNac-T3)表達(dá)水平比在對照組織或細(xì)胞樣品中所觀察到的高至少750倍(通過AffymetrixUl33P微陣列分析來測量)或者高500倍或優(yōu)選至少1000倍(使用定量PCR來^r測生物標(biāo)志物的表達(dá))。"UDP-N-乙?；?D-半乳糖胺多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶-T14"、"pp-GalNac-T14"、"GalNac-T14"、"GALNT14"在本文中用于指具有包含N-端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、主干區(qū)(stemregion)和催化域的GalNac-T分子家族的特征性特征的II型成員蛋白質(zhì)。在一個任選的實(shí)施方案中，人GalNac-T14分子包含1659個堿基對，編碼552個氨基酸的蛋白質(zhì)，如圖4A所示。全長人cDNA已經(jīng)保藏于GenBank，編號AB078144。如文獻(xiàn)中所披露的(Wangetal.,BBRC，300:738-744(2003))，已經(jīng)鑒定了包含(或不包含)特定外顯子(諸如外顯子2、3和/或4)的GalNac-T14剪接異構(gòu)體。本申請?jiān)O(shè)想了檢驗(yàn)GalNac-T14的任何所述各種異構(gòu)體的表達(dá)，而任何一種所述異構(gòu)體的表達(dá)預(yù)示哺乳動物組織或細(xì)胞樣品對Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體的敏感性。"UDP-N-乙酰基-D-半乳糖胺多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶-T3"、"pp-GalNac-T3"、"GalNac-T3"、"GALNT3，，在本文中用于指具有包含N-端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、主干區(qū)和催化域的GalNac-T分子家族的特征性特征的II型成員蛋白質(zhì)。在一個任選的實(shí)施方案中，人GalNac-T3多肽包含圖4B所示氨基酸序列。GalNac-T3進(jìn)一步記載于Bennettetal.，J.Biol.Chemistry,271:17006-17012(1996)。"受試者，，或"患者，，指需要治療的任何單個受試者，包括人。還意圖作為受試者包括的有參加臨床研究試驗(yàn)而沒有顯示出任何疾病臨床體征的任何受試者、參加流行病學(xué)研究的受試者、或作為對照的受試者。術(shù)語"哺乳動物，，在用于本文時指歸入哺乳類的任何哺乳動物，包括人、牛、馬、犬和貓。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，哺乳動物指人。"組織或細(xì)胞樣品"指從受試者或患者的組織得到的相似細(xì)胞的集合。組織或細(xì)胞樣品的來源可以是實(shí)體組織，像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活4企樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液；來自受試者的妊娠或發(fā)育任何時間的細(xì)胞。組織樣品還可以是原代的或培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系。任選的是，組織或細(xì)胞樣品是從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤得到的。組織樣品可能包含在自然界中天然不與所述組織混雜的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩沖劑、固定劑、營養(yǎng)物、抗生素、等等。為本發(fā)明目的，組織樣品的"切片"指一塊或一片組織樣品，例如從組織樣品上切下來的一薄片組織或細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)了解，可以制作多片組織樣品切片并依照本發(fā)明進(jìn)行分析，前提是應(yīng)當(dāng)了解，本發(fā)明包括將組織樣品的同一切片用于形態(tài)學(xué)和分子兩個水平的分析或者針對蛋白質(zhì)和核酸二者進(jìn)行分析的方法。"相關(guān)(correlate)"或"關(guān)聯(lián)"指以任何方式將第一分析或方案的性能和/或結(jié)果與第二分析或方案的性能和/或結(jié)果進(jìn)行比較。例如，可以將第一分析或方案的結(jié)果用于實(shí)施第二分析或方案，和/或，可以使用第一分析或方案的結(jié)果來決定是否應(yīng)當(dāng)實(shí)施第二分析或方案。就本發(fā)明的各個實(shí)施方案而言，可以使用分析性測定法(諸如mRNA表達(dá)或IHC)的結(jié)果來決定是否應(yīng)當(dāng)實(shí)施使用Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體的特定治療方案。"核酸，，意圖包括任何DNA或RNA,例如組織樣品中存在的染色體、線粒體、病毒和/或細(xì)菌核酸。術(shù)語"核酸"涵蓋雙鏈核酸分子的兩條鏈或其中之一，并且包括完整核酸分子的任何片段或部分。"基因"意指在編碼或轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)或調(diào)控其它基因表達(dá)方面具有功能性作用的任何核酸序列或其部分。所述基因可以完全由負(fù)責(zé)編碼功能性蛋白質(zhì)的核酸組成，或者只有負(fù)責(zé)編碼或表達(dá)蛋白質(zhì)的部分核酸。核酸序列可以在基因的外顯子、內(nèi)含子、起始或終止區(qū)、啟動子序列、其它調(diào)控序列或獨(dú)特鄰近區(qū)中包含遺傳異常。術(shù)語"標(biāo)記物"在用于本文時指與試劑諸如核g婦笨針或抗體直接或間接偶聯(lián)或融合，以便于檢測它所偶聯(lián)或融合的試劑的化合物或組合物。標(biāo)記物可以是自身可檢測的(例如放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的情況中，可催化可一企測的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。術(shù)語"抗體，，在本文中以最廣義使用，明確覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(如雙特異性抗體)，及抗體片段，只要它們展現(xiàn)所需生物學(xué)活性。"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片^:的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體(diabody);線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。"天然抗體"通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈中有所變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈在一端具有一個可變區(qū)(Vh)，接著是多個恒定區(qū)。每條輕鏈在一端具有一個可變區(qū)(VL)，而另一端是一個恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)排列在一起，而輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成界面。術(shù)語"可變的，，指可變區(qū)中的某些部分在抗體序列中差異廣泛且用于每種特定抗體針對其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱作高變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)的三個區(qū)段?？勺儏^(qū)中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自包含四個FR，它們大多釆取(3-折疊構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成(3-折疊結(jié)構(gòu)一部分的三個高變區(qū)而連接。每條鏈中的高變區(qū)通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見Kabat等人，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD，1991)。恒定區(qū)不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)中抗體的參與。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱作"Fab"片段，各自具有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)，和一個殘余"Fc"片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F(ab')2片,爻，它具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且仍能夠交聯(lián)抗原。"Fv"是包含完整抗原識別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個重鏈可變區(qū)和一個輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，各個可變區(qū)的三個高變區(qū)相互作用而在VH-VL二聚體表面確定了一個抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變區(qū)(或只包含對抗原特異的三個高變區(qū)的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段還包含輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。Fab，片段因在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基而與Fab片段有所不同，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab，-SH是本文中對其中恒定區(qū)半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離硫醇基的Fab，的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為成對Fab，片段生成的，在Fab，片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。來自任何脊推動物物種的抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"，根據(jù)其恒定區(qū)氨基酸序列，可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡巾自(K)和拉姆達(dá)(x)。根據(jù)抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列，可將其歸入不同的類別。完整抗體有五種主要的類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同抗體類別對應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱作a、S、s、y和P。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。"單鏈Fv，，或"scFv"抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，該Fv多肽在VH和Vt結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pltickthun，《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》，vol.113,Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，NewYork,pp.269-315，1994。術(shù)語"雙抗體，，指具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VrJ中包含相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(vo。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的描述于例如EP404,097;WO93/11161;Hollingeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。術(shù)語"單克隆抗體"在用于本文時指由一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗體是高度特異的，針對單一抗原性位點(diǎn)。另外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的同一決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)越性體現(xiàn)在它們是通過雜交瘤培養(yǎng)合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語"單克隆"指示抗體由基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，并不解釋為需要通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohleretal.，Nature256:495(1975)描述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(參見例如美國專利4,816，567)。"單克隆抗體"還可使用例如Clacksonetal.,Nature352:624-628(1991)和Marksetal.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體庫分離。單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)所需生物學(xué)活性(美國專利4,816，567;Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長類動物(如舊大陸猴類(OldWorldMonkey),諸如狒狒(baboon)、恒河猴(rhesus)或獼猴(cynomolgusmonkey)等)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列的"靈長類化(primatized)"抗體(美國專利5，693,780)。非人(如鼠源)抗體的"人源化，，形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。通常，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變區(qū)，其中整個或基本上整個高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且整個或基本上整個FR是人免疫球蛋白序列的FR。任選的是，人源化抗體還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見Jonesetal.,Nature321:522-525(1986);Riechmannetal.，Nature332:323-329(1988);Presta,CumOp.Struct.Biol.2:593-596(1992)。術(shù)語"高變區(qū)"在用于本文時指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(LI)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變區(qū)中的31-35(HI)、50-65(H2)和95畫102(H3);Kabat等人，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991)和/或那些來自"高變環(huán)"的殘基(例如輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(LI)、50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變區(qū)中的26-32(HI)、53-55(H2)和96-101(H3);ChothiaandLesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。"框架區(qū)"或"FR，，殘基指本文定義的高變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。"結(jié)合，，目的抗原的抗體指能夠以足夠親和力和/或親合力結(jié)合抗原的抗體，使得該抗體可作為治療劑或診斷劑用于靶向表達(dá)該抗原的細(xì)胞。為了本發(fā)明，"免疫療法，，指用抗體治療哺乳動物(優(yōu)選人類患者)的方法，其中抗體可以是未偶聯(lián)的或"棵的"抗體，或者抗體可以偶聯(lián)或融合有異源分子或試劑，諸如一種或多種細(xì)胞毒劑，由此產(chǎn)生"免疫偶聯(lián)物"。"分離的"抗體指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成分指將會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化至(l)根據(jù)Lowry方法的測定，抗體重量超過95%,最優(yōu)端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染的還原或非還原條件下的SDS-PAGE,達(dá)到同質(zhì)。既然抗體的天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備。表述"有效量"指有效預(yù)防、改善或治療所討論疾病或狀況的藥劑(例如Apo2L/TRAIL、抗DR4或DR5抗體等)的量。術(shù)語"處理"、"治療"和"療法"在用于本文時指治療性處理、預(yù)防性處理、和防范性處理。連續(xù)治療或施用指以至少每天一次為基礎(chǔ)、期間沒有中斷一天或多天的處理。間歇治療或施用或者間歇方式的治療或施用指本質(zhì)上并非連續(xù)而是循環(huán)的處理。術(shù)語"細(xì)胞因子"是由一種細(xì)胞群釋放，作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱。此類細(xì)胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子中包括生長激素，諸如人生長激素、N-曱硫氨酰人生長激素和牛生長激素；曱狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促曱狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH);肝生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；肺瘤壞死因子-a和-p;穆勒氏(Mullerian)抑制性物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長因子；血小板衍生生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF-a和TGF-(3;胰島素樣生長因子-I和-II;紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子；干擾素，諸如干擾素-a、-p和i;集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細(xì)胞CSF(M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)和粒細(xì)胞CSF(G-CSF);白介素(IL),諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL隱8、IL-9、IL-ll、IL-12、IL-13、IL-17;及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時，術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)及天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等效物。術(shù)語"細(xì)胞毒劑，，在用于本文時指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y，Re186)、化療劑、和毒素諸如細(xì)菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素或其片段。"化療劑"指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?alkylatingagents),諸如塞替派(thiotepa)和環(huán)石舞酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN);石黃酸烷基酯類(alkylsulfonates),諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和口底泊舒凡(piposulfan);氮丙口定類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzodepa)、卡波酉昆(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐石粦酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐石克代石舞酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);番荔牙支內(nèi)酉旨類(acetogenins)(尤其是布4iM也辛(bullatacin)和布4立他辛酮(bullatacinone));喜初于石威(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan));苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CBI-TMI);艾才留塞》各素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;〉每纟帛才卬素(spongistatin);氮芥類(nitrogenmustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、月旦石粦酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥月旦甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲石粦胺(trofosfamide)、尿嘧口定氮芥(uracilmustard);亞；肖脲類(nitrosoureas),i者如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素(calicheamicin),尤其是力口利車霉素yll和加利車霉素①11，參見例如Agnew，C/zem,￡d33:183-186(1994);dynemicin包才舌dynemicinA;二膦酸鹽類(bisphosphonates),諸如氯膦酸鹽(clodronate);埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomycin)、力文線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、》文線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_二氮-5_氧丄-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(AdriamycinTM)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、口票呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、4連黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)才亥菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司<也丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin);抗代謝物，諸如曱氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，諸如二曱葉酸(denopterin)、曱氨喋呤(methotrexate)、蝶羅呤(pteropterin)和三曱曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、碌b咪嘌呤(thiamiprine)和硫鳥噤呤(thioguanine);嘧口定類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎月包苷(azacitidine)、6-氮尿芬(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苦(cytarabine)、雙脫氧尿普(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)和氟尿苦(floxuridine);雄激素類，諸如卡魯華酮(calusterone)、丙酉吏屈4也力,酮(dromostanolonepropionate)、表石克名#酉享(epitiostanol)、美力食烷(mepitiostane)和睪內(nèi)面旨(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane);葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸(folinicacid);醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);恩尿嘧口定(eniluracil);安吖口定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達(dá)曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋銨(elliptini醫(yī)acetate);埃坡霉素(epothilone);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼達(dá)明(lonidamine);美登木素生物石威類(maytansinoids)，i者如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米4乇脈月宗(mitoguazone);米4乇蒽酉毘(mitoxantrone);莫口底達(dá)醇(mopidamol);二胺硝吖咬(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);p比柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酸(podophyllinicacid);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK;雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺旋鍺(spirogermanium);纟田交4連孑包菌酉同臥復(fù)(tenuazonicacid);三亞胺酉昆(triaziquone);2,2'，2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、斗干孑包菌素(roridin)A禾口蟲它4亍菌素(anguidin));烏#立iS(urethan);長春地辛(vindesine);達(dá)卡巴。秦(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine);二澳甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);艱泊溴》克(pipobroman);gacytosine;阿4唐月包苷(arabinoside)("Ara-C，，)；環(huán)石粦酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);類紫杉醇類(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL⑧，Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)和多西4也塞(docetaxel)(TAXOTERE,Rh6ne-PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他濱(gemcitabine)(GemzarTM);6-碌u鳥。票呤(thioguanine);巰基噪呤(mercaptopurine);曱氨p某呤(methotrexate);柏類似物，諸如順柏(cisplatin)和卡柏(carboplatin);長春石威(vinblastine);柏(platinum);依托泊苷(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長春新械(vincristine);長春瑞濱(vinorelbine)(NavelbineTM);能滅瘤(novantrone);替尼泊苦(teniposide);依達(dá)曲沙(edatrexate);道i若霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);希羅達(dá)(xeloda);伊本膦酸鹽(ibandronate);CPT-11;拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(difluoromethylomithine)(DMFO);類牙見黃酸(retinoid)，卞者如一見黃酸(retinoicadd);卡培他濱(capecitabine);及任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。該定義還包括作用為調(diào)節(jié)或抑制激素對肺瘤作用的抗激素劑，諸如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NolvadexTM)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FarestonTM);抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、醋酸曱地孕酮(megestrolacetate)(MegaceTM)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔口坐(fadrozole)、伏氯峻(vorozole)(Rivisor)、來曲哇(letrozole)(FemaraTM)和阿那曲哇(anastrozole)(ArimidexTM);抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞4木(goserelin);及<壬<可上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。"生長抑制劑"在用于本文時指在體外或在體內(nèi)抑制細(xì)胞，尤其是過表達(dá)本文中所鑒定的任何基因的癌細(xì)胞生長的化合物或組合物。如此，生長抑制劑是顯著降低處于S期的過表達(dá)所述基因的細(xì)胞百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(jìn)(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))、泰素(taxol)、和拓樸異構(gòu)酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苦(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯G1的藥劑也溢出進(jìn)入S期停滯，例如DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達(dá)卡巴。秦(dacarbazine)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、曱氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見772eMo/ecw/ar5as&o/Ga"cer，MendelsohnandIsrael編，第l章,題為"Cellcycleregulation,oncogenes,andantineoplasticdrugs",Murakami&a/.,WBSaunders,Philadelphia(1995),尤其是第13頁。術(shù)語"凋亡"和"凋亡活性"以廣義使用，指哺乳動物中有序或受控形式的細(xì)胞死亡，通常伴隨著一種或多種特征性細(xì)胞變化，包括細(xì)胞質(zhì)濃縮、質(zhì)膜微絨毛喪失、細(xì)胞核節(jié)段化、染色體DNA降解或線粒體功能喪失。例如可以通過本領(lǐng)域已知的細(xì)胞存活力測定法(例如Alamar藍(lán)測定法或MTT測定法)、FACS分析、胱天蛋白酶活化、DNA片段化(參見例如Nicoletti"a/.,//mmw"o/.MeAoA139:271-279(1991))、及多聚ADP核糖聚合酶、"PARP"、切割測定法來測定和測量這種活性。在用于本文時，術(shù)語"病癥，，一般指將會從使用本文中所描述的組合物進(jìn)行的處理中獲益的任何疾患，包括可以用有效量的Apo2L/TRAIL、抗DR4抗體和/或抗DR5抗體來治療的任何疾病或病癥。這包括慢性和急性病癥，以及那些使哺乳動物易患所討論病癥的病理狀況。待治療病癥的非限制性例子包括良性和惡性癌癥；炎性、血管發(fā)生性和免疫學(xué)病癥、自身免疫性病癥、關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、多發(fā)性硬化及HIV/AIDS。術(shù)語"癌癥"、"癌性"或"惡性腫瘤"指向或描述哺乳動物中特征通常為細(xì)胞生長不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、白血病、母細(xì)胞瘤和肉瘤。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌、骨髓瘤、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、胃腸(道)癌、腎的癌(renalcancer)、卵巢癌、肝癌、成淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴細(xì)胞性白血病、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌(kidneycancer)、前列腺癌、曱狀腺癌、黑素瘤、軟骨肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胰腺癌、多形性成月緣細(xì)月包瘤(glioblastomamultiforme)、宮頸癌、腦癌、胃癌、膀月先癌、肝細(xì)月包瘤(hepatoma)、乳&泉癌、結(jié)腸癌、及頭和頸癌。術(shù)語"免疫相關(guān)疾病"指哺乳動物中由哺乳動物免疫系統(tǒng)成分引起、介導(dǎo)、或以其它方式促成發(fā)病的疾病。還包括刺激或干預(yù)免疫應(yīng)答對疾病發(fā)展具有改善作用的疾病。該術(shù)語包括自身免疫病、免疫介導(dǎo)的炎性疾病、非免疫介導(dǎo)的炎性疾病、感染性疾病、和免疫缺陷病。在可依照本發(fā)明治療的免疫相關(guān)和炎性疾病的例子中，有些是免疫或T細(xì)胞介導(dǎo)的，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型慢性關(guān)節(jié)炎、脊推關(guān)節(jié)病、系統(tǒng)性硬化(硬皮病)、特發(fā)性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格倫氏(Sjogren)綜合征、系統(tǒng)性血管炎、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血(免疫性全血細(xì)胞減少癥、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿)、自身免疫性血小板減少癥(特發(fā)性血小板減少性紫癜、免疫介導(dǎo)的血小板減少癥)、曱狀腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、橋本氏(Hashimoto)曱狀腺炎、幼年型淋巴細(xì)胞性曱狀腺炎、萎縮性曱狀腺炎)、糖尿病、免疫介導(dǎo)的腎病(腎小球腎炎、腎小管間質(zhì)性腎炎)、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病諸如多發(fā)性硬化、特發(fā)性脫髓鞘多神經(jīng)病或格-巴二氏(Guillain-Barr6)綜合征、和慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病、肝膽病諸如傳染性肝炎(曱型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活動性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎、和硬化性膽管炎、炎性和纖維化肺病諸如炎性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏(Crohn)病)、麩膠敏感性腸病、和惠普爾氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介導(dǎo)的皮膚病包括大皰性皮膚病、多形紅斑和接觸性皮炎、4艮屑病、變應(yīng)性疾病諸如哮喘、變應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、食物過敏和蕁麻瘆、肺的免疫學(xué)疾病諸如嗜曙紅細(xì)胞性肺炎、特發(fā)性肺纖維化和超敏反應(yīng)性肺炎、移植相關(guān)疾病包括移植物排斥和移才直物抗宿主病。感染性疾病包括AIDS(HIV感染)、曱型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎、細(xì)菌感染、真菌感染、原蟲感染和寄生蟲感染。"自身免疫病"在本文中以廣義、一般意義使用，指哺乳動物中因哺乳動物個體對其自身組織組分的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答而破壞正常或健康組織的病癥或疾患。例子包括但不限于紅斑狼瘡、曱狀腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、多發(fā)性硬化、自身免疫性糖尿病和炎性腸病(IBD)。術(shù)語"標(biāo)記的"和"帶標(biāo)簽的"在用于本文時指包含抗體或多肽且其與"標(biāo)簽多肽"融合的嵌合分子。標(biāo)簽多肽具有足夠殘基以提供表位而可制備針對其的抗體或者提供一些其它功能諸如寡聚的能力(例如具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的肽所發(fā)生的)，但又足夠短使得其不干擾所述抗體或多肽的活性。標(biāo)簽多肽優(yōu)選還是相當(dāng)獨(dú)特的，使得標(biāo)簽特異性抗體基本上不與其它表位發(fā)生交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)簽多肽通常具有至少6個氨基酸殘基，通常約8個到約50個氨基酸殘基之間(優(yōu)選約10個到約20個殘基之間)。術(shù)語"二價(jià)金屬離子"指具有兩個正電荷的金屬離子。二價(jià)金屬離子的例子包括但不限于鋅、鈷、鎳、鎘、鎂和錳?？刹捎玫拇祟惤饘俚木唧w形式包括鹽形式(例如藥學(xué)可接受鹽形式)，諸如上述二價(jià)金屬離子的氯化物、乙酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽和硫酸鹽形式。任選的是，用于本發(fā)明的二價(jià)金屬離子是鋅，優(yōu)選鹽形式，硫酸鋅或氯化鋅。"分離的"，在用于描述本文中所公開的各種肽或蛋白質(zhì)時，意指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的肽或蛋白質(zhì)。肽或蛋白質(zhì)的天然環(huán)境的污染性成分指通常會干擾其診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將肽或蛋白質(zhì)純化至(1)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的^末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(2)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色的非還原性或還原性條件下的SDS-PAGE,達(dá)到同質(zhì)，或(3)根據(jù)質(zhì)譜或肽作圖技術(shù)，達(dá)到同質(zhì)。既然肽或蛋白質(zhì)的天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的物質(zhì)包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位肽或蛋白質(zhì)。然而，分離的肽或蛋白質(zhì)通常通過至少一個純化步驟來制備。關(guān)于本文中所鑒定的序列的"百分比(。/。)氨基酸序列同一性"定義為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代^見為序列同一性的一部分，候選序列中與參考序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。可以以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行序列對比以測定百分比氨基酸序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定測量序列對比的適宜參數(shù)，包括指派對所比較的全長序列獲得最大對比所需的算法。為了本發(fā)明，可使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2來獲得百分比氨基酸序列同一性值，ALIGN-2程序由Genentech公司編寫，其源代碼已經(jīng)連同用戶文檔一起提交給美國版權(quán)局(USCopyrightOffice,Washington,DC,20559)，并以美國版權(quán)注冊號TXU510087注冊。公眾可通過Genentech乂^司(SouthSanFrancisco,California)得到ALIGN-2程序。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不變雜交反應(yīng)的"嚴(yán)格性"可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定，而且通常根據(jù)探針長度、洗滌溫度和鹽濃度憑經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。一般而言，較長的探針要求較高的溫度以正確退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于當(dāng)互補(bǔ)鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中時變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間的期望同一性程度越高，可使用的相對溫度也越高。結(jié)果是，推斷出較高相對溫度將趨向于使反應(yīng)條件更為嚴(yán)格，而較低溫度也就較不嚴(yán)格。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的其它細(xì)節(jié)和解釋，參見Ausubel"a/.,a^TeW尸ratoco/sMo/ecw/w所o/ogy,WileyIntersciencePublishers(1995)。"高嚴(yán)格性條件"，如本文中所定義的，通過如下各項(xiàng)定義(1)采用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行清洗；0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基^5克酸鈉，于50。C;(2)在雜交過程中采用變性劑；50%(v/v)曱酰胺及0.1%牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5及750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，CC;或(3)采用50%曱酰胺，5xSSC(0.75MNaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM石舞酸鈉(pH6.8)，0.1%焦磷酸鈉，5xDenhardt氏溶液，超聲處理的鮭精DNA(50jig/ml),0.1%SDS,和10%硫酸右旋糖普，42°C，及于"。C在02xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)和50%曱酰胺中清洗，接著于55。C在含EDTA的0.1xSSC中進(jìn)行高嚴(yán)格性清洗。"中等嚴(yán)才各條寸牛"可以^口Sambrook&"/.，Mo/ecw/arC7om'"g:爿丄a6ora組y她咖a/,NewYork,ColdSpringHarborPress(1989)中所述鑒定，包括于37。C在含200/0甲酰胺，5xSSC(150mMNaCl,15mM檸檬酸三鈉),50mM磷酸鈉(pH7.6),5xDenhardt氏溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml變性剪切的鮭精DNA的溶液中溫育過夜，接著于約37-50。C在lxSSC中清洗濾膜。技術(shù)人員將認(rèn)識到如何在必要時調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)諸如探針長度等因素。術(shù)語"引物"指與互補(bǔ)RNA或DNA靶多核苷酸雜交并充當(dāng)通過核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用從單核苷酸逐步合成多核苷酸的起點(diǎn)(如例如聚合酶鏈反應(yīng)中所發(fā)生的)的寡核苷酸序列。術(shù)語"控制序列"指在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動子、任選操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強(qiáng)子。若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是"可操作連4妄的"。例如,若前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)序列(secretoryleader)的DNA表達(dá)成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)(preprotein),則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置促進(jìn)翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，"可操作連接的"意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強(qiáng)子不必相鄰。連接可以通過在方便的限制性位點(diǎn)處的連接反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。若沒有此類位點(diǎn)，則依照常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"和"ADCC"指由細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨p莖細(xì)胞)識別耙細(xì)胞上結(jié)合的抗體，隨后引起耙細(xì)胞溶解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)Fc7Rin,而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、FcyRII和FcyRIII。RavetchandKinet,Annu.Rev.Immunol.,9:457-92(1991)中第464頁表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測定法，諸如美國專利5,500,362或5,821,337中所描述的?？捎糜诖祟悳y定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。或者/另外，可在體內(nèi)評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynesetal.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公開的。"人效應(yīng)細(xì)胞"指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。優(yōu)選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)FcYRIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。術(shù)語"Fc受體"和"FcR"用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的FcR(Y受體)，包括FcyRI、FcYRII和FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcYRII受體包括FcyRIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體")，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)域。活化受體FcyRIIA在其胞質(zhì)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(itam)。抑制受體FcyRIIB在其胞質(zhì)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見Dagron，Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的綜述參見RavetchandKinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991);Capeletal"Immunomethods4:25-34(1994);deHaasetal.,J.Lab.Clin.Med.126:330-341(1995))。術(shù)語"FcR"在本文中涵蓋其它FcR，包括未來將會鑒定的FcR。該術(shù)語還包括新生兒受體(neonatalreceptor),FcRn,它負(fù)責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyeretal.，J.Immunol.117:587(1976);Kimetal.,J.Immunol.24:249(1994))。FcR在本文中包括多態(tài)性，諸如編碼FcYRHIa的基因中的遺傳二態(tài)性，它導(dǎo)致位于受體結(jié)合IgGl的區(qū)域中的氨基酸第158位為苯丙氨酸(F)或纈氨酸(V)。純合纈氨酸FcYRIIIa(FcylIIa-158V)已經(jīng)在體外顯示出相對于純合苯丙氨酸FcYRIIIa(FcyRIIIa-158F)或雜合(Fcyina-158F/V)受體具有更高的對人IgGl的親和力且介導(dǎo)提高的ADCC。"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性"或"CDC"指在存在補(bǔ)體時分子溶解靶物的能力。補(bǔ)體激活途徑是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合與關(guān)聯(lián)抗原復(fù)合的分子(如抗體)起始的。為了評估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC測定法，例如Gazzano-Santoroetal,,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所描述的。II.本發(fā)明的例示方法和材料本文所公開的方法和測定法涉及4企驗(yàn)哺乳動物組織或細(xì)胞樣品中一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)，其中一種或多種所述生物標(biāo)志物的表達(dá)的確定預(yù)示或指示所述組織或細(xì)胞樣品是否將對藥劑諸如Apo2L/TRAIL和/或死亡受體抗體諸如抗DR5激動劑抗體或抗DR4激動劑抗體敏感。所述方法和測定法包括那些檢驗(yàn)GalNac-T分子家族成員(包括GalNac-T14和GalNac-T3)的表達(dá)的方法和測定法。如上文所討論的，一些患病人類細(xì)胞類型的群體(諸如某些癌細(xì)胞群體)對Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)效應(yīng)耐受。因此相信本文所公開的方法和測定法可提供方便、高效且潛在經(jīng)濟(jì)的(cost-effective)手段，來獲得有用的數(shù)據(jù)和信息用于評估治療患者的適宜的或有效的療法。例如，已經(jīng)診斷為患有癌癥或免疫相關(guān)疾患的患者可以進(jìn)行活檢以獲得組織或細(xì)胞樣品，然后通過多種體外測定法4企驗(yàn)該樣品以確定該患者的細(xì)胞是否會對治療劑諸如Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體壽文感。本發(fā)明提供了預(yù)測哺乳動物組織或細(xì)胞樣品(諸如癌細(xì)胞)對Apo2L/TRAIL或死亡受體激動劑抗體的敏感性的方法。任選的是，獲得哺乳動物組織或細(xì)胞樣品并檢驗(yàn)GalNac-T14表達(dá)。這些方法可使用多種測定法格式進(jìn)行，包括檢測mRNA表達(dá)的測定法、檢測蛋白質(zhì)表達(dá)的測定法(諸如免疫組織化學(xué)測定法)、和檢測酶UDP-N-乙?；?D-半乳糖胺:多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性的生化測定法。所述組織或細(xì)胞中/上所述GalNac-T14生物標(biāo)志物表達(dá)的確定預(yù)示所述組織或細(xì)胞將對Apo2L/TRAIL和/或死亡受體抗體的生物學(xué)效應(yīng)敏感。申請人驚訝的發(fā)現(xiàn)，GalNac-T14的表達(dá)與這些組織和細(xì)胞對Apo2L/TRAIL和死亡受體激動劑抗體的敏感性相關(guān)。如下所述，樣品中多種生物標(biāo)志物諸如GalNac-T14的表達(dá)可以用多種方法來分析，其中很多是本領(lǐng)域已知并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，包括但不限于免疫組化和/或Western分析、定量的基于血液的測定法(例如血清ELISA)(例如用來一企驗(yàn)蛋白質(zhì)表達(dá)水平)、生化酶活性測定法、原位雜交、mRNA的Northem分析和/或PCR分析、和基因組Southern分析(例如用來檢驗(yàn)基因缺失或擴(kuò)增)，以及多種可通過基因和/或組織陣列分析進(jìn)行的測定法中的任何一種。評估基因和基因產(chǎn)物狀況的典型規(guī)程可見例如Ausubel等人編，1995，CurrentProtocolsInMolecularBiology,第2單元(Northern印跡)、第4單元(Southem印跡)、第15單元(免疫印跡)和第18單元(PCR分析)。為了舉例說明，下面提供了涉及樣品中GalNac-T14檢測的規(guī)程。本發(fā)明的任選方法包括檢驗(yàn)或測試哺乳動物組織或細(xì)胞樣品中GalNac-T14存在的規(guī)程。可以采用多種方法來檢測GalNac-T14,包括例如免疫組化分析、免疫沉淀、Westem印跡分析、分子結(jié)合測定法、ELISA、ELIFA、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)、和免疫沉淀接著MS、單糖分析。例如，檢測組織或細(xì)胞樣品中GalNac-T14表達(dá)的任選方法包括將樣品與抗GalNac-T14抗體接觸，然后檢測該抗體對樣品中GalNac-T14的結(jié)合。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，使用免疫組化和染色規(guī)程來檢驗(yàn)樣品中GalNac-T14的表達(dá)。組織切片的免疫組化染色已經(jīng)證明是評估或檢測樣品中蛋白質(zhì)存在的可靠方法。免疫組化(IHC)技術(shù)利用抗體來原位探查和顯現(xiàn)細(xì)胞抗原，通常利用生色或熒光方法。樣品的制備可以使用來自哺乳動物(通常為人類患者)的組織或細(xì)胞樣品。樣品的例子包括但不限于癌細(xì)胞，諸如結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卯巢癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤和白血病的細(xì)胞。任選的是，樣品包括非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞或非何杰金氏淋巴瘤細(xì)胞。樣品可以通過本領(lǐng)域已知的多種規(guī)程獲得，包括但不限于手術(shù)切除、穿刺抽吸或活檢。組織可以是新鮮的或冷凍的。在一個實(shí)施方案中，樣品固定和包埋在石蠟等中。組織樣品可以用常規(guī)方法固定(即保存)(見例如"ManualofHistologicalStainingMethodoftheArmedForcesInstituteofPathology",第3版(1960)LeeG.Luna,HT(ASCP)編，TheBlakstonDivisionMcGraw-HillBookCompany,NewYork;TheArmedForcesInstituteofPathologyAdvancedLaboratoryMethodsinHistologyandPathology(1994)UlrekaV.Mikel編，ArmedForcesInstituteofPathology,AmericanRegistryofPathology,Washington,D.C.)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，固定劑的選擇取決于對該樣品作組織學(xué)染色或其它分析的目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，固定的時間長短依賴于組織樣品的大小和所用的固定劑。舉例而言，中性緩沖的福爾馬林、布安固定液(Bouin，s)或低聚曱醛都可以用來固定樣品。一般而言，首先將樣品固定，然后通過遞增系列濃度的醇脫水，用石蠟或其它切片介質(zhì)浸潤和包埋，使組織樣品可切片?；蛘?，可以將組織切片，并固定所得的切片。舉例而言，可以通過常規(guī)方法將組織樣品在石蠟中包埋禾口力口工(見例^口"ManualofHistologicalStainingMethodoftheArmedForcesInstituteofPathology",同上)?？墒褂玫氖灥睦影ǖ幌抻赑araplast、Broloid和Tissuemay。一旦組織樣品被包埋，則可用切片機(jī)等將樣品切片(見例^口"ManualofHistologicalStainingMethodoftheArmedForcesInstituteofPathology",同上)。舉例而言，對于這種規(guī)程，切片厚度的范圍可以為約3微米到約5微米。一旦切片，即可使用多種標(biāo)準(zhǔn)方法將切片附著至載玻片。載玻片粘合劑的例子包括但不限于硅烷、明膠、聚L-賴氨酸等。例如，石蠟包埋切片可以附著于帶正電荷的載玻片和/或聚L-賴氨酸包被的載玻片。如果包埋材料使用的是石蠟，那么組織切片通常脫石蠟并用水重新水化。組織切片可以用數(shù)種常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)方法脫石蠟。例如，可以使用二曱苯和逐漸降低的系列濃度的醇(見例如"ManualofHistologicalStainingMethodoftheArmedForcesInstituteofPathology",同上)?；蛘撸梢?lt;吏用市售的非有機(jī)脫石蠟劑，諸如Hemo-De7(CMS,Houston,Texas)。任選的是，制備樣品以后，可使用IHC分析組織切片。IHC可以與別的技術(shù)諸如形態(tài)學(xué)染色和/或熒光原位雜交聯(lián)合使用?？捎玫腎HC—4殳方法有兩種直接和間接測定法。根據(jù)第一種測定法，直接測定抗體對靶抗原(例如GalNac-T14)的結(jié)合。該直接測定法使用經(jīng)過標(biāo)記的試劑，諸如熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記的一抗(primaryantibody),其無需進(jìn)一步抗體相互作用即可顯現(xiàn)。在典型的間接測定法中，未偶聯(lián)的一抗結(jié)合至抗原，然后經(jīng)過標(biāo)記的二抗(secondaryantibody)結(jié)合至該一抗。在二抗與酶標(biāo)記物偶聯(lián)的情況下，加入生色或熒光底物以顯現(xiàn)抗原。由于數(shù)個二抗可與一抗上的不同表位反應(yīng)，產(chǎn)生信號的放大。免疫組化所用的一抗和/或二抗通常用可檢測的成分(moiety)標(biāo)記?？捎玫臉?biāo)記物^l多，通?？梢苑譃橄旅鎺最?a)放射性同位素，諸如"S、14C、1251、SH和1311。例如，可以使用CurrentProtocolsinImmunology,第1和2巻,Coligen等人編,Wiley-Interscience,NewYork,NewYork,Pubs.(1991)中描述的技術(shù)用放射性同位素標(biāo)記抗體，放射性可以用閃爍計(jì)數(shù)法測量。(b)膠體金顆粒。(c)焚光標(biāo)記物，包括但不限于稀土螯合物(銪螯合物)、德克薩斯紅、羅丹明、熒光素、丹石黃酰、麗絲胺(Lissamine)、傘形酮、藻紅蛋白(phycocrytherin)、藻藍(lán)蛋白、或市售的焚光團(tuán)諸如SPECTRUMORANGE7和SPECTRUMGREEN7和/或上述一種或多種的衍生物。焚光標(biāo)記物可以使用例如CurrentProtocolsinImmunology,同上中7>開的技術(shù)與抗體偶聯(lián)。熒光可以用熒光計(jì)定量。(d)可用的酶底物標(biāo)記物有很多，美國專利4,275,149綜述了其中的一些。酶通常催化生色底物發(fā)生可以用多種技術(shù)測量的化學(xué)改變。例如，酶可催化底物中的顏色變化，該變化可以用分光光度法測量?；蛘撸缚筛淖兊孜锏臒晒饣蚧瘜W(xué)發(fā)光。定量熒光變化的技術(shù)如上所述。化學(xué)發(fā)光底物通過化學(xué)反應(yīng)成為電子激發(fā)狀態(tài)，然后可發(fā)射可測量(例如使用化學(xué)發(fā)光測量儀)的光，或者將能量供給熒光受體。酶標(biāo)記物的例子包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶；美國專利4,737,456)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)、蘋果酉吏脫氫酶(malatedehydrogenase)、脲酶、過氧化物酶諸如辣根過氧化物酶(HRPO)、44性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(諸如尿酸酶和黃噪呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。將酶偶聯(lián)到抗體的技術(shù)見O'Sullivan等人，MethodsforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjugatesforuseinEnzymeImmunoassay,于MethodsinEnzym.中(J,Langone和H.VanVunakis編)，Academicpress,NewYork,73:147-166(1981)。酶-底物組合的例子包括例如(i)辣根過氧化物酶(HRPO)及底物過氧化氫，其中過氧化氫氧化染料前體(例如正苯二胺(OPD)或鹽酸3，3，,5,5，-四曱基聯(lián)苯胺(TMB));(ii)堿性磷酸酶(AP)及生色底物對-磷酸硝基苯酯；和(iii)(3-D-半乳糖苷酶(P-D-Gal)及生色底物(例如對硝基苯基-P-D-半乳糖苷)或熒光底物(例如4-曱基傘形基-P-D-半乳糖苷)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可用的其它酶-底物組合有很多。關(guān)于這些的一般性綜述可參見美國專利4,275，149和4，318,980。有時，標(biāo)記物和抗體是間接偶聯(lián)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知道多種實(shí)現(xiàn)此目的的技術(shù)。例如，可以將抗體和生物素偶聯(lián)，并將上述四大類標(biāo)記物中的任意標(biāo)記物與親合素偶聯(lián)，反之亦然。生物素選"f奪性的與親合素結(jié)合，這樣所述標(biāo)記物就可以間接的與所述抗體偶聯(lián)。或者，為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物和抗體的間接偶聯(lián)，將抗體與小的半抗原偶聯(lián)，將上述不同類型標(biāo)記物中的一種與抗半抗原抗體偶聯(lián)。這樣，可實(shí)現(xiàn)所述標(biāo)記物與抗體的間接偶聯(lián)。除了上面討論的樣品制備方法，可能需要在IHC之前、之中或之后進(jìn)一步處理組織切片。例如，可進(jìn)行表位修復(fù)(epitoperetrieval)方法，諸如在檸檬酸緩沖液中加熱組織樣品(見例如Leong等人，Appl.Immunohistochem.4(3):201(1996))。在任選的封閉步驟后，將組織切片在合適的條件下以充分的時間暴露于一抗，使得一抗結(jié)合組織樣品中的靶蛋白質(zhì)抗原。實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的適宜條件可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。通過使用上述任一種可檢測標(biāo)記物來測定抗體結(jié)合樣品的程度。優(yōu)選的是，標(biāo)記物是酶標(biāo)記物(例如HRPO),其催化生色底物諸如3,3，-二氨基聯(lián)苯胺生色團(tuán)的化學(xué)變化。優(yōu)選的是，所述酶標(biāo)記物與特異性結(jié)合一抗的抗體偶聯(lián)(例如，一抗是兔多克隆抗體，二抗是山羊抗兔抗體)。任選的是，IHC分析中用來檢測GalNac-T14表達(dá)的抗體是抗GalNac-T14抗體。或者，可以采用與GalNac-T14具有交叉反應(yīng)性的其它GalNac-T抗原的抗體。任選的是，所述抗GalNac-T14抗體是單克隆抗體。這樣制備的標(biāo)本可以封固并加蓋玻片。然后對樣品進(jìn)行評估，例如使用顯微鏡，而且可以使用本領(lǐng)域常規(guī)使用的染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)?？梢匀缦略u估染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)表l染色情況得分細(xì)胞中未觀察到染色0在多于10%的細(xì)胞中檢測到微弱/幾乎無法察覺的染色1+在多于10%的細(xì)胞中觀察到微弱到中等的染色2+在多于10%的細(xì)胞中觀察到中等到強(qiáng)烈的染色3+典型地，在這樣的IHC測定法中，2+左右或更高的染色得分被認(rèn)為預(yù)示或指示哺乳動物細(xì)胞(諸如哺乳動物癌細(xì)胞)對Apo2L/TRAIL或死亡受體激動劑^t體每丈感。在備選的方法中，可以使樣品與所述生物標(biāo)志物特異性的抗體在足以形成抗體-生物標(biāo)志物復(fù)合物的條件下接觸，然后檢測所述復(fù)合物。生物標(biāo)志物的存在可以通過多種方式檢測，諸如通過Westem印跡(有或無免疫沉淀)和ELISA規(guī)程來測定多種組織和細(xì)胞樣品，包括血漿或血清。使用這樣的測定法格式的免疫測定技術(shù)有很多，參見例如美國專利4,016，043;4,424,279和4,018,653。上述這些包括非竟?fàn)幮灶愋偷膯挝稽c(diǎn)和雙位點(diǎn)或"夾心"測定法，以及傳統(tǒng)的竟?fàn)幮越Y(jié)合測定法。這些測定法還包括經(jīng)過標(biāo)記的抗體直接結(jié)合耙生物標(biāo)志物。夾心測定法是最有用和最常用的測定法之一。夾心測定技術(shù)存在多種變化形式，本發(fā)明意圖涵蓋所有這些變化形式。簡言之，在典型的正向測定法(forwardassay)中，將未標(biāo)記的抗體固定在固相支持物上，將待測試的樣品與所結(jié)合的分子接觸。在一段合適時間的溫育后，其中溫育時間足以允許抗體-抗原復(fù)合物的形成，加入對所述抗原特異性的、且已用能夠產(chǎn)生可檢測信號的報(bào)道分子標(biāo)記的二抗，并溫育，提供充分的時間供另一抗體-抗原-標(biāo)記抗體的復(fù)合物形成。洗去任何未反應(yīng)的物質(zhì)，然后通過觀察報(bào)道分子所產(chǎn)生的信號來測定抗原的存在。這些結(jié)果可以是通過簡單觀察可視信號而得到的定性結(jié)果，也可以是通過與含有已知量的生物標(biāo)志物的對照樣品比較而定量得到的結(jié)果。正向測定法的變化形式包括同時測定法(simultaneousassay),其中將樣品和經(jīng)過標(biāo)記的抗體同時施加于所結(jié)合的抗體。這些技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的，包括顯而易見的任何微小變化。在典型的正向夾心測定法中，對生物標(biāo)志物具有特異性的一抗共價(jià)或被動結(jié)合至固相表面。固相表面通常是玻璃或聚合物，其中最常用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相支持物的形式可以是管、珠、微量培養(yǎng)板的盤、或任何其它適于實(shí)施免疫測定法的表面。結(jié)合過程是本領(lǐng)域眾所周知的，一般由交聯(lián)共價(jià)結(jié)合或物理吸附組成，在制備測試樣品的過程中洗滌聚合物-抗體復(fù)合物。然后將等份待測樣品施加于固相復(fù)合物并在合適的條件下(例如從室溫到40。C，諸如25。C到32。C之間(含二端點(diǎn)))溫育足夠的時間(例如2-40分鐘或者過夜，如果更方^f更的話)以允許抗體中存在的任何亞基的結(jié)合。溫育階段以后，將抗體亞基固相洗滌并干燥，并與所述生物標(biāo)志物的一部分特異的二抗溫育。二抗與報(bào)道分子連接，報(bào)道分子用來表征該二抗與該分子標(biāo)志物的結(jié)合。一種備選方法涉及將樣品中的靶生物標(biāo)志物固定，然后將所固定的靶暴露于特異性的抗體，該抗體可以用也可以不用報(bào)道分子標(biāo)記。依賴于靶的量和報(bào)道分子信號的強(qiáng)度，所結(jié)合的靶可通過用抗體直接標(biāo)記而得以檢測?；蛘?，將經(jīng)過標(biāo)記的、對一抗特異性的二抗暴露于靶-一抗復(fù)合物，形成靶-一抗-二抗三元復(fù)合物。通過報(bào)道分子發(fā)出的信號來檢測該復(fù)合物。"報(bào)道分子"在用于本說明書時指這樣的分子，其由于自身化學(xué)性質(zhì)而提供可分析鑒定的信號，該信號使結(jié)合抗原的抗體能夠被檢測。在這種類型的測定法中最常用的報(bào)道分子是酶、熒光團(tuán)或含放射性核素的分子(即放射性同位素)、和化學(xué)發(fā)光的分子。在酶免疫測定法的情況中，酶與二抗偶聯(lián)，一般是通過戊二醛或高碘酸鹽偶聯(lián)。但是很容易認(rèn)識到，存在本領(lǐng)域技術(shù)人員容易得到的多種不同的偶聯(lián)技術(shù)。常用的酶包括辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等等。通常，選擇在特定酶水解時產(chǎn)生可檢測的顏色變化的底物來與相應(yīng)的酶一起使用。合適的酶的例子包括堿性磷酸酶和過氧化物酶。也可以使用熒光底物，其產(chǎn)生焚光產(chǎn)物而不是上述的生色底物。在所有情況中，將酶標(biāo)記的抗體施加于一抗-分子標(biāo)志物復(fù)合物，讓其結(jié)合，然后洗去多余的試劑。然后向抗體-抗原-抗體復(fù)合物施加含有合適底物的溶液。底物將與二抗所連接的酶反應(yīng)，產(chǎn)生定性的可3見信號，該信號可以進(jìn)一步定量，通常通過分光光度法，用來指示樣品中存在的生物標(biāo)志物的量。或者，可以將熒光化合物，諸如熒光素和羅丹明，化學(xué)偶聯(lián)到抗體上，而不影響其結(jié)合能力。當(dāng)受特定波長的光照射而被活化時，熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體吸收光能，誘導(dǎo)分子的激發(fā)狀態(tài)，然后發(fā)射可以用光學(xué)顯微鏡視覺檢測的特征性顏色的光。如酶免疫測定法(EIA)中那樣，讓焚光標(biāo)記的抗體與一抗-分子標(biāo)志物復(fù)合物結(jié)合。洗去未結(jié)合的試劑后，再將余下的三元復(fù)合物暴露于合適波長的光，觀察到的熒光指示目的分子標(biāo)志物的存在。免疫熒光和EIA技術(shù)在本領(lǐng)域都是非常成熟的。然而，其它的報(bào)道分子，諸如放射性同位素、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光分子，也可以使用。本發(fā)明的方法還包括檢驗(yàn)組織或細(xì)胞樣品中GalNac-T14mRNA的存在和/或表達(dá)的規(guī)程。評估細(xì)胞中mRNA的方法是眾所周知的，包括例如使用互補(bǔ)DNA探針的雜交測定法(諸如使用經(jīng)過標(biāo)記的GalNac-T14核糖核酸探針的原位雜交、Northern印跡和相關(guān)技術(shù))和多種核酸擴(kuò)增測定法(諸如使用GalNac-T14特異性的互補(bǔ)引物的RT-PCR和其它擴(kuò)增型4企測方法，諸如例如分支DNA、SISBA、TMA等)?？梢允褂肗orthern、斑點(diǎn)印跡或PCR分析方便地對來自哺乳動物的組織或細(xì)胞樣品測定例如GalNac-T14mRNA。例如，RT-PCR測定法諸如定量PCR測定法是本領(lǐng)域眾所周知的。在本發(fā)明的一個說明性實(shí)施方案中，一種檢測生物學(xué)樣品中GalNac-T14mRNA的方法包括使用至少一種？1物通過逆轉(zhuǎn)錄從該樣品產(chǎn)生cDNA;使用GalNac-T14多核苷酸作為有義和反義引物擴(kuò)增所產(chǎn)生的cDNA以擴(kuò)增其中的GalNac-T14cDNA;并檢測所擴(kuò)增的GalNac-T14cDNA的存在。另外，這樣的方法可包括一個或多個可確定生物學(xué)樣品中GalNac-T14mRNA水平的步驟(例如通過同時檢驗(yàn)比較性對照"持家"基因諸如肌動蛋白家族成員的mRNA序列水平)。任選的是，可以測定所擴(kuò)增的GalNac-T14cDNA的序列。本發(fā)明的這個方面的材料實(shí)例包括GalNac-T14引物和引物對(其允許特異性擴(kuò)增本發(fā)明的多核苷酸或其任意特定的部分)以及選擇性的或特異性的與本發(fā)明的核酸分子或其任意部分雜交的探針。探針可以用可檢測的標(biāo)志物例如放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合物或酶來標(biāo)記。這樣的探針和引物可以用來檢測樣品中GalNac-T14多核苷酸的存在，及作為檢測表達(dá)GalNac-T14蛋白的細(xì)胞的手段。如本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的，基于本文提供的序列可以制備很多種不同的引物和探針，用來有效擴(kuò)增、克隆和/或測定GalNac-T14mRNA的存在和/或水平。的mRNA,諸如GalNac-T14mRNA的規(guī)程。使用核酸微陣列，將來自測試和對照組織樣品的測試和對照mRNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記，以生成cDNA探針。然后將這些^笨針與固定在固相支持物上的核酸陣列雜交。該陣列這樣配置，使陣列的每個成員的序列和位置都是已知的。例如，可以用一組選定的可能在某些疾病狀態(tài)中表達(dá)的基因在固相支持物上形成陣列。經(jīng)過標(biāo)記的探針與特定的陣列成員發(fā)生雜交表明衍生該探針的樣品表達(dá)該基因。疾病組織的差異基因表達(dá)的分析可提供有價(jià)值的信息。微陣列技術(shù)使用核酸雜交技術(shù)和計(jì)算技術(shù)在單次實(shí)驗(yàn)中評估數(shù)以千計(jì)的基因的mRNA表達(dá)序型(profile)(參見例如2001年10月11日公開的WO01/75166;制備陣列的討論可參見例如美國專利5,700,637;美國專利5，445,934和美國專利5,807,522;Lockart，NatureBiotechnology,14:1675-1680(1996);Cheung,V.G.等人，NatureGenetics21(Suppl):15-19(1999))。DNA微陣列是含有基因片段的微型陣列，這些基因片段或是直接合成到玻璃或其它支持物上，或是點(diǎn)樣到玻璃或其它支持物上。單個陣列中通常呈現(xiàn)數(shù)以千計(jì)的基因。典型的微陣列實(shí)驗(yàn)涉及下面的步驟1.由從樣品分離的RNA制備熒光標(biāo)記的靶物，2.經(jīng)過標(biāo)記的靶物與微陣列雜交，3.洗滌，染色，并掃描陣列，4.分析掃描的圖像，和5.生成基因表達(dá)序型。目前有兩種類型的DNA微陣列在使用寡核苷酸(通常是25聚物至70個核苷酸的寡聚物)陣列和含有從cDNA制備的PCR產(chǎn)物的基因表達(dá)陣列。形成陣列時，寡核苷酸可以預(yù)先合成再點(diǎn)樣到表面上，或者直接在表面上(原位)合成。AffymetrixGeneChip系統(tǒng)是一種市售的微陣列系統(tǒng)，其包含通過直接在玻璃表面上合成寡核苷酸而制造的陣列。探針/基因陣列通過聯(lián)合基于半導(dǎo)體的光刻和固相化學(xué)合成技術(shù)，將通常為25聚物的寡核苷酸直接合成在玻璃晶片上。每個陣列含有多達(dá)400,000種不同的寡聚物，每種寡聚物以數(shù)以百萬計(jì)的拷貝數(shù)存在。由于寡核苷酸探針是在陣列上的已知位置合成的，使用AffymetrixMicroarraySuite軟件，雜交樣式和信號強(qiáng)度可以在基因的身份和相對表達(dá)水平方面進(jìn)行解析。每種基因在該陣列上由一系列的不同寡核苷酸探針?biāo)?。每個探針對由一完全匹配的寡核苷酸和一錯配的寡核苷酸組成。完全匹配的探針具有與特定基因完全互補(bǔ)的序列，由此測量該基因的表達(dá)。錯配的探針和完全匹配的探針的不同之處在于中心堿基位置有單個堿基的替代，干擾了耙基因轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合。這有助于確定對完全匹配的寡聚物測得的信號有影響的背景和非特異性雜交。該MicroarraySuite軟件從完全匹配的探針的雜交強(qiáng)度中減去錯配探針的雜交強(qiáng)度，以確定每個探針組的絕對強(qiáng)度或比強(qiáng)度值(specificintensityvalue)。探針是基于Genbank和其它核苷酸庫的現(xiàn)有信息來選擇的。這些序列被認(rèn)為識別基因3，端的獨(dú)特區(qū)域。使用GeneChip雜交爐("rotisserie"爐)進(jìn)行一次多達(dá)64個陣列的雜交。射流工作站(fluidicsstation)執(zhí)行探針陣列的洗滌和染色。它是完全自動化的，包括四個組件，每個組件持有一個探針陣列。每個組件通過MicroarraySuite軟件Y吏用預(yù)編程的射流規(guī)程進(jìn)行獨(dú)立控制。掃描裝置是共聚焦激光掃描儀，其測量與探針陣列結(jié)合的標(biāo)記cDNA所發(fā)射的熒光的強(qiáng)度。配備MicroarraySuite軟件的計(jì)算機(jī)工作站控制所述射流工作站和掃描儀。MicroarraySuite軟件使用為探針陣列預(yù)編程的雜交、洗滌和染色規(guī)程可控制多達(dá)8個射流工作站。該軟件還采集雜交強(qiáng)度信號并通過合適的算法將其轉(zhuǎn)換為每個基因的有/無判定。最后，該軟件通過比較分析檢測實(shí)驗(yàn)之間基因表達(dá)的變化，并以.txt文件的格式輸出，該文件可以供其它軟件程序用來進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。熒光原位雜交(FISH)測定法還可用于使用經(jīng)標(biāo)記探針來檢測生物標(biāo)志物mRNA的表達(dá)。這樣的測定法是本領(lǐng)域已知的(參見例如Kallioniemietal.,1992;美國專利6,358，682)。所選的生物標(biāo)志物的表達(dá)也可以通過檢驗(yàn)基因缺失或基因擴(kuò)增來評估。基因缺失或擴(kuò)增可以通過本領(lǐng)域已知的多種規(guī)程中的任一種來測量，例如通過使用合適標(biāo)記探針進(jìn)行的常規(guī)Southern印跡、Northern印跡以定量mRNA的轉(zhuǎn)錄(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:5201-5205(1980))、斑點(diǎn)印跡(DNA分析)或原位雜交(例如FISH)、使用合適標(biāo)記探針進(jìn)行的比較基因組雜交(CGH)或細(xì)胞遺傳學(xué)方法。例如，可以使用這些方法來檢測GalNac-T14基因的缺失或擴(kuò)增。另外，可以檢驗(yàn)組織或細(xì)胞樣品中生物標(biāo)志物諸如GalNac-T14基因的曱基化狀態(tài)。永生化和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中基因5，調(diào)控區(qū)經(jīng)常發(fā)生CpG島的異常去曱基化和/或過度曱基化，并可能造成多種基因的表達(dá)改變。本領(lǐng)域中有很多才企-驗(yàn)基因曱基化狀態(tài)的測定法是眾所周知的。例如，在Southem雜交方法中，可以使用曱基化敏感的限制酶來評估CpG島的甲基化狀態(tài)，該酶不能切割含曱基化CpG位點(diǎn)的序列。另外，MSP(甲基化特異PCR)可以容易地描述給定基因的CpG島中的所有CpG位點(diǎn)的曱基化狀態(tài)。該方法包括首先用亞硫酸氫鈉修飾DNA(這將把所有非曱基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶)，然后用甲基化DNA特異性(相對于非曱基化DNA)的引物擴(kuò)增。涉及曱基化干擾的規(guī)程還可以參見例如下列文獻(xiàn)CurrentProtocolsInMolecularBiology，第12單元，F(xiàn)rederickM.Ausubel等人編，1995;DeMarzo等人，Am.J.Pathol.155(6):1985-1992(1999);B訓(xùn)ks等人，CancerEpidemiol.BiomarkersPrev.，1998,7:531-536);及Lethe等人，Int.J.Cancer76(6):卯3-908(1998)。GalNac-T14在組織或細(xì)胞樣品中的表達(dá)也可以通過基于功能或活性的測定法來一企驗(yàn)。例如，可以進(jìn)行本領(lǐng)域已知的測定法來測定或4全測組織或細(xì)胞樣品中特定酶N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性的存在(參見例如Bennettetal.:J.Biol.Chem.,271:17006-17012(1996);Wangetal"BBRC，300:738-744(2003);Hangetal.,supra,availableMay2005atwww.sciencedirect.com)。在本發(fā)明的方法中，設(shè)想了還可以檢驗(yàn)組織或細(xì)胞樣品中Apo2L/TRAIL的表達(dá)或結(jié)合Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體的受體的表達(dá)。如上所述和本領(lǐng)域已知的，目前認(rèn)為Apo2L/TRAIL結(jié)合至少五種不同的受體DR4、DR5、DcRl、DcR2和OPG。4吏用本領(lǐng)域已知的方法，包括本文描述的方法，可以在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測Apo2L/TRAIL、DR4、DR5、DcRl、DcR2和/或OPG的表達(dá)。例如，可以使用上面描述的IHC技術(shù)來檢測樣品中一種或多種所述分子的存在。設(shè)想了對于不但4t驗(yàn)組織或樣品中GalNac-T14標(biāo)志物的存在，還壽企驗(yàn)例如DR4、DR5或DcRl的存在的方法，可以從相同的組織或樣品制備不同的玻片，并用對各種特定的生物標(biāo)志物或受體特異性的試劑來測試各個玻片?；蛘?，可以從組織或細(xì)胞樣品制備單個玻片，并使用針對各種生物標(biāo)志物或受體的抗體進(jìn)行多色染色程序(multi-colorstainingprotocol),從而得以顯現(xiàn)和檢測各種生物標(biāo)志物或受體。設(shè)想了，在確定了組織或細(xì)胞樣品表達(dá)指示該組織或細(xì)胞樣品對Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體敏感的GalNac-T14以后，可以對哺乳動物施用有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體來治療病癥，諸如該哺乳動物正患有的癌癥或免疫相關(guān)病癥。哺乳動物中本文所述的多種病理狀態(tài)的診斷可以由熟練從業(yè)人員進(jìn)行。診斷技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，其允許例如診斷或檢測哺乳動物中的癌癥或免疫相關(guān)疾病。例如，癌癥可以通過包括但不限于扣診、血液分析、x射線、NMR等技術(shù)來鑒定。免疫相關(guān)疾病也可以容易地鑒定。Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體可以根據(jù)已知方法來施用，諸如推注(bolus)或一段時間連續(xù)輸注形式的靜脈內(nèi)施用、經(jīng)由肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、表面、或吸入路徑。任選的是，施用可以使用多種市售裝置通過微型泵(mini-pump)進(jìn)行。施用Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體的有效劑量和方案可以憑經(jīng)驗(yàn)確定，做出這樣的決定在本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)?？梢允褂脝蝹€或多個劑量。目前認(rèn)為，單獨(dú)使用的Apo2L/TRAIL的有效劑量或量的范圍可以為每日約l嗎/kg到約100mg/kg體重或更高。劑量的種間縮》文(interspeciesscaling)可以以本領(lǐng)i戈已知方式進(jìn)4亍，例如Mordentietal.,Pharmaceut.Res.，8:1351(1991)所公開的。當(dāng)采用Apo2L/TRAIL體內(nèi)施用時，正常劑量的范圍可以為每曰約10ng/kg到100mg/kg哺乳動物體重或更高，優(yōu)選約l嗎/kg/日到10mg/kg/日，依賴于施用路徑。文獻(xiàn)中提供了具體的劑量和投遞方法的指導(dǎo)，見例如美國專利4,657,760;5,206,344;或5,225,212。本文預(yù)期，不同劑型將對不同治療化合物和不同病癥有效，例如以一種器官或組織為目標(biāo)的施用可能需要與以另一種器官或組織為目標(biāo)的施用不同的遞送方式。還設(shè)想了所述方法中還可以釆用其它療法。所述一種或多種其它療法可包括但不限于施用放射療法、細(xì)胞因子、生長抑制劑、化療劑、細(xì)胞毒劑、酪氨酸激酶抑制劑、ras法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、血管發(fā)生抑制劑、和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，這些是本領(lǐng)域已知的，并且上文有進(jìn)一步具體限定。設(shè)想了所述其它療法可以作為與Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體分開的藥劑使用。另外，還可使用基于靶向腫瘤抗原的治療性抗體，諸如RituxanTM或Herceptin,以及抗血管發(fā)生抗體，諸如抗VEGF?；焺┑呐渲坪蛣┝拷o藥方案可以根據(jù)制造商的指示或者如熟練從業(yè)人員憑經(jīng)驗(yàn)決定的使用。所述化療的配制和劑量給藥方案還可參見ChemotherapyService,M.C.Perry編,Williams&Wilkins，Baltimore,MD(1992)。化療劑可在Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體施用之前或之后，或與之同時施用?？赡芟Ｍ€施用針對其它抗原的抗體，諸如結(jié)合CD20、CDlla、CD18、CD40、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、或其它TNFR家族成員(諸如OPG、TNFR1、TNFR2、GITR、Apo-3、TACI、BCMA、BR3)的抗體。或者/并且，可以對患者共施用結(jié)合相同抗原或兩種或多種不同抗原的兩種或多種抗體。有時，還對患者施用一種或多種細(xì)胞因子可能是有益的。施用后，可以分析體外處理的細(xì)胞。如果進(jìn)行了體內(nèi)處理，可以使用熟練,人業(yè)人員眾所周知的多種方法監(jiān)測所處理的哺乳動物。例如，可對肺瘤細(xì)胞進(jìn)行病理學(xué)檢驗(yàn)以測定壞死，或者分析血清以測定免疫系統(tǒng)應(yīng)答。本發(fā)明還提供了用于上面描述或提示過的用途的試劑盒或制品。這樣的試劑盒可包含載體裝置，其被分為區(qū)室以密閉的容納一種或多種容器裝置，諸如小瓶、管等等。每個容器裝置包含上述方法中要使用的不同成分中的一種。例如，容器裝置中的一個可包含探針，該探針是或可以是可^^測標(biāo)記的。這樣的探針可以是分別對GalNac-T14蛋白或GalNac-T14基因或信使RNA特異性的抗體或多核普酸。在試劑盒利用核酸雜交來檢測靶核酸時，該試劑盒還可以具有含有核苷酸的容器，該核苷酸用于擴(kuò)增靶核酸序列，和/或具有包含報(bào)道工具的容器，所述報(bào)道工具諸如生物素結(jié)合蛋白，諸如親合素或鏈霉親合素，其與報(bào)道分子諸如酶、焚光或放射性同位素標(biāo)記物結(jié)合。本發(fā)明的試劑盒通常將包括上面描述的容器，和一種或多種其它的容器，這些其它的容器包含從商業(yè)和使用者觀點(diǎn)看來需要的材料，包括緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器和帶使用說明書的包裝插頁。容器上可能有標(biāo)簽，指示該組合物用于特定的療法或非治療性應(yīng)用，還可以指示體內(nèi)或體外用途的指導(dǎo)，諸如上面描述的那些用途。本發(fā)明的試劑盒有多個實(shí)施方案。一個典型的實(shí)施方案是一種試劑盒，包括容器、所述容器上的標(biāo)簽、及所述容器內(nèi)含有的組合物，其中所述組合物包括結(jié)合GalNac-T14多肽序列的一抗，所述容器上的標(biāo)簽指示該組合物可用于評估至少一種類型的哺乳動物細(xì)胞中GalNac-T14蛋白的存在，以及使用GalNac-T14抗體評估至少一種類型的哺乳動物細(xì)胞中蛋白質(zhì)存在的指導(dǎo)。該試劑盒可進(jìn)一步包括用于制備組織樣品和將抗體和探針施加于組織樣品的相同切片的一套指導(dǎo)和材料。該試劑盒可包括一抗和二抗，其中二抗與標(biāo)記物偶聯(lián)，例如酶標(biāo)記物。另一個實(shí)施方案是一種試劑盒，包括容器、所述容器上的標(biāo)簽、及所述容器內(nèi)含有的組合物，其中所述組合物包括在嚴(yán)格條件下與GalNac-T14多核香酸互補(bǔ)物(complement)雜交的多核苷酸，所述容器上的標(biāo)簽指示該組合物可用于評估至少一種類型的哺乳動物細(xì)胞中GalNac-T14的存在，以及使用GalNac-T14多核苷酸評估至少一種類型的哺乳動物細(xì)胞中GalNac-T14RNA或DNA存在的指導(dǎo)。該試劑盒中其它任選組分包括一種或多種緩沖液(例如封閉緩沖液、洗滌緩沖液、底物緩沖液等等)、其它試劑諸如被酶標(biāo)記物化學(xué)改變的底物(例如色原)、表位修復(fù)液、對照樣品(陽性和/或陰性對照)、對照玻片等。實(shí)施例通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步描述和例示本發(fā)明的各個方面，它們并非意圖限制本發(fā)明的范圍。方法和材料細(xì)胞培養(yǎng)物和細(xì)胞系以下人細(xì)胞系非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)系H2122、A427、H647、SK隱MES畫1、H838、H358、H2126、H460、H1703、H2405、H650、H1568、H1666、H322T、SW1573、H292、H1650、H522、EKVX、H661、H23、LXFL529、H226、A549、H1781、H1299、HOP62、訓(xùn)09、HOP92、HI793、H1975、H1651、calu-l、H1435、HOP18、H520、H441、H2030、H1155、H1838、H596、HLFa;月夷&泉癌系Pane05.04、BxPC3、HPAC、SU.86.86、HuP-T3、PSNl、Pane08,13、MiaPaCa-2、PA-TU-8988T、Pane03.27、Capan-l、SW1990、CFPAC-l、PA-TU-8902、Pane02.03、Pane04.03、PL45、Aspc-l、Hs766T、Pane10.05、Panel、Capan-2、HPAF-II;和NHL:JEKO-l、SU-DHL-4、OCI畫LY-19、SR、Farage、DOHH-2、Toledo、WSU-NHL、KARPAS-422、GRANTA-519、Pfeiffer、HT、SC-1、DB。各細(xì)胞系來自ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,Virginia))、DSMZ(德國《效生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures))、JCRB(曰本細(xì)胞資源庫(JapaneseCellResourcesBank))或ECACC(歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(EuropeanCollectionofCellCultures))，并在補(bǔ)充有10%熱滅活胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和10mMHEPES的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞毒性測定法MTT測定法(CellTiter96非放射性細(xì)胞增殖測定法，Promega)是基于可存活細(xì)胞將可溶性黃色四唑鹽(MTT)還原成藍(lán)色曱臢(formazan)晶體的能力細(xì)胞的量。為了進(jìn)行MTT測定法，將預(yù)先混合的經(jīng)優(yōu)化的染料溶液加至裝有各種濃度(0-1000ng/ml)Apo2L/TRAIL或DR5抗體的96孔板的培養(yǎng)孔。在4小時溫育期間，活細(xì)胞將染料溶液的四唑化合物轉(zhuǎn)變成曱朥產(chǎn)物。然后將增溶/終止液加至培養(yǎng)孔以溶解曱臘產(chǎn)物，并使用96孔讀板儀(SpectraMax)記錄570nm吸光度。570nm吸光度讀數(shù)與增殖測定法中通常使用的細(xì)胞數(shù)成正比。盡管曱艚產(chǎn)物的最大吸光度位于570nm而且純?nèi)芤罕憩F(xiàn)為藍(lán)色，然而測定結(jié)束時的顏色可能不是藍(lán)色，取決于培養(yǎng)物培養(yǎng)基中曱臢相對于其它成分(包括血清、酸化的酚紅和未還原的MTT)的存在數(shù)量。通過實(shí)施細(xì)胞滴定來優(yōu)化細(xì)胞數(shù)，用以在測定法線性范圍的高末端附近產(chǎn)生測定信號。由于不同細(xì)胞類型具有不同代謝活性水平，因此為每種細(xì)胞系分開進(jìn)行。對所檢驗(yàn)的大多數(shù)腫瘤細(xì)胞，使用5，000-20，000個細(xì)胞/孔。下面是所采用的測定法的逐步描述1.用于生物測定法的細(xì)胞來自原種(stock)培養(yǎng)物。2.測定細(xì)胞數(shù)和錐蟲藍(lán)存活力，并將細(xì)胞懸浮至最終數(shù)目為5,000-20,000個細(xì)〗包/孔。3.將50nl細(xì)胞懸浮液分發(fā)入96孔板。4.將板在增濕的5%C02氣氛中于37。C溫育過夜。5.將50pl含有范圍為0-1000ng/ml的各種濃度Apo2L/TRAIL或DR5抗體的培養(yǎng)基加至96孔板。對照是50pl培養(yǎng)基(不含Apo2L/TRAIL或DR5抗體)和100jiU培養(yǎng)物培養(yǎng)液(不含細(xì)胞)。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)在一組3個孔中且在3天進(jìn)行。各孔的總體積是100pl/孔。6.將板在增濕的5。/。C02氣氛中于37。C溫育72小時。7.將15pl染料溶液加至每個孔。8.將板在增濕的5Q/。C02氣氛中于37。C溫育可長達(dá)4小時。9.將1OOpl增溶/終止液加至每個孔。10.將板于37。C溫育過夜。11.使用96孔讀板儀記錄570nm波長處的吸光度。使用參比波長750nm來降低由細(xì)胞碎片、指紋和其它非特異性吸收引起的背景。12.使用陰性對照的吸光度平均值作為空白值并從所有其它讀數(shù)中扣除。將存活細(xì)胞-未處理)的吸光度平均值，用以計(jì)算存活細(xì)胞的量(以％表述)。13.百分比存活細(xì)胞(Y軸)對Apo2L/TRAIL或DR5抗體濃度(X軸，log刻度)繪圖，并通過查找對應(yīng)于50。/。存活細(xì)胞的X軸數(shù)值(ng/ml)來確定IC50值。Affymetrix才示^己方案對所有樣品采集OD260/280讀數(shù)，并在BioAnalyzer上運(yùn)行樣品。使用5iag高品質(zhì)總RNA。A.cDNA第一條鏈的合成1.引物雜交DEPC-H20xi^E5旋渦震蕩混勻?？焖傩D(zhuǎn)。RNA(5|ig)y|il于70。C溫育IO分鐘。摻入物(spike)(l:4##^^(stock)，5嗎)lpl快速旋轉(zhuǎn)并置于冰上。T7-(dT)24引物1pl體積12|Lll2.溫度調(diào)節(jié)5XcDNA第一條鏈緩沖液4pi向每份樣品中添加7pi(混合液)。0.1MDTT2pl35通過旋渦震蕩混勻。快速旋轉(zhuǎn)。10mMdNTP混合液1(il于42。C溫育2分鐘。體積7pl第一條鏈合成SSIIRT1總體積20pi向每份樣品中添加lplSSIIRT。通過用移液器吸入和推出或者通過輕微旋渦震蕩來混勻。快速旋轉(zhuǎn)。于42。C溫育l小時。B.cDNA第二條鏈的合成1.將第一條鏈反應(yīng)液置于水上。簡短離心以使凝聚物沉降在管壁上。2.配制如下第二條鏈混合液母液(master-mix)。3.將130nl第二條鏈混合液母液加至20plcDNA第一條鏈(終體積=150(^1)。4.通過用移液器吸入和推出或者通過輕微旋渦震蕩來混勻。快速旋轉(zhuǎn)。5.在冷卻水浴中于16。C溫育2小時。6.添加2pl[10U]T4DNA聚合酶。通過用移液器吸入和推出或者通過輕微旋渦震蕩來混勻。快速旋轉(zhuǎn)。7.于16。C溫育5分鐘。8.添加10pl0.5MEDTA。輕孩￡旋渦震蕩。快速旋轉(zhuǎn)。9.對cDNA進(jìn)行清潔規(guī)程或者保存于-20。C供以后使用。雙鏈cDNA的清潔(GeneChip樣品清潔模塊(GeneChipSampleCleanupModule))1.將600plcDNA結(jié)合緩沖液加至162pl最終的雙鏈cDNA合成制備物。通過旋渦震蕩混合3秒鐘。2.檢查混合液的顏色是黃色的(與不含cDNA合成運(yùn)行物的cDNA結(jié)合緩沖DEPC處理的H205X第二條鏈反應(yīng)緩沖液10mMdNTP混合液10U/jilDNA連接酶10U/^ilDNA聚合酶I2,1RNA酶H總體積91|il30pl3pl1W4^11|al130pl'液相如乂)。若混合液的顏色是橙色或紫羅蘭色，則添加10(al3M乙酸鈉pH5.0并混勻?；旌弦旱念伾珜⒆兂牲S色。3.將500nl樣品施加至安置在2ml收集管中的cDNA清潔旋轉(zhuǎn)柱(CleanupSpinColumn)。以28,000xg(210,000rpm)離心1分鐘。丟棄流出液作為*危險(xiǎn)性廢液。4.給旋轉(zhuǎn)柱再次加載剩余混合液(262^1)并如上離心。丟棄流出液作為*危險(xiǎn)性廢液并丟棄收集管。5.將旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移入新的2ml收集管(提供的)。將750plcDNA清洗緩沖液施加至^走轉(zhuǎn)柱。以^8,000xg(210,000rpm)離心1分鐘。丟棄流出液。6.打開旋轉(zhuǎn)柱的蓋并以最大速度(525,000xg)離心5分鐘。將旋轉(zhuǎn)柱放入離心機(jī)中，使用間隔的吊桶。將蓋安置到鄰接的吊桶上，使得它們的取向與旋轉(zhuǎn)方向相反，即如果旋轉(zhuǎn)是順時針方向的，那么以逆時針方向確定蓋的方向。這避免了對蓋的損害。丟棄流出液和收集管。7.將旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移入1.5ml收集管。將10plcDNA洗脫緩沖液直接施加至旋轉(zhuǎn)柱膜。確保將cDNA洗脫緩沖液直接分散到膜上。于室溫溫育1分鐘并以最大速度(S25,OOOxg)離心1分鐘以洗脫。IVT反應(yīng)的設(shè)置和運(yùn)行Enzo:生物陣列高產(chǎn)量RNA轉(zhuǎn)錄物標(biāo)記試劑盒(BioarrayHighYieldRNATranscriptlabelingkit)(PartNo.900182)1.使用lO(il清潔后的雙鏈cDNA。2.配制如下IVT混合液母液蒸餾水或去離子水12(ilIOXHY反應(yīng)緩沖液4|il1Ox生物素標(biāo)記的核糖核苦酸4^110XDTT4jul10XRNA酶抑制劑混合液20XT7RNA聚合酶總體積4pl2pl30pl3.將30ialIVT混合液母液(master-mix)加至10(al雙鏈cDNA(總體積=4(^1)。4.通過用移液器吸入和推出或者通過輕微旋渦震蕩來混勻?？焖傩D(zhuǎn)。5.立即將管置入37。C水浴。溫育5小時。6.保存于-20。C,如果不立即純化RNA的話。生物素標(biāo)記的cRNA的清潔(GeneChip樣品清潔模塊)1.將60plHsO加至IVT反應(yīng)液并通過旋渦震蕩混合3秒鐘。2.將350ialIVTcRNA結(jié)合緩沖液加至樣品并通過旋渦震蕩混合3秒鐘。3.將25(Hil乙醇(96-100。/o)加至裂解液并用移液器混勻。不要離心。4.將樣品(700pl)施加至安置在2ml離心管中的IVTcRNA清潔旋轉(zhuǎn)柱。以^8,000xg(^10，000rpm)離心15秒鐘。5.4吏洗脫液再一次流過才主。以^8,000xg(SIO，OOOrpm)離心15秒鐘。丟棄流出液作為**危險(xiǎn)性廢液并丟棄收集管。6.將旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移入新的2ml收集管(提供的)。7.施加500plIVTcRNA清洗緩沖液并以28,000xg(^10,000rpm)離心15秒鐘以清洗。丟棄流出液。8.將500fi180%(v/v)乙醇施加至旋轉(zhuǎn)柱，并以^8，000xg(^10,000rpm)離心15秒鐘。丟棄流出液。9.打開旋轉(zhuǎn)柱的蓋并以最大速度(S25,000xg)離心5分鐘。丟棄流出液和收集管。10.將旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移入新的1.5ml收集管。11.將llpl不含RNA酶的水直接施加至旋轉(zhuǎn)柱膜。靜置1分鐘。以最大速度(S25，000xg)離心1分鐘以洗脫。12.將10(il不含RNA酶的水直接施加至旋轉(zhuǎn)柱膜。靜置1分鐘。以最大速度(S25，000xg)離心1分鐘以洗脫。cRNA(IVT產(chǎn)物)的定量使用分光光度法分析來測定RNA產(chǎn)量。適用如下規(guī)則10D26()nm=4(^g/mlRNA。檢查260nm和280nm處的OD以測定樣品濃度和純度。純的RNA維持A260/A280比率接近2.0(1.9與2.1之間的比率是可接受的)。為了在使用總RNA作為起始材料時對cRNA定量，調(diào)整后的cRNA產(chǎn)量必須計(jì)算以反映未標(biāo)記總RNA的遺留物(carryover)。在使用估算值100%遺留物時，使用如下公式來測定調(diào)整后的cRNA產(chǎn)量調(diào)整后的cRNA產(chǎn)量=RNAm-(總RNAi)(y)RNAm=IVT后測得的cRNA量Og)總RNAi:總RNA的起始量Og)y=IVT中所使用的cDNA反應(yīng)的分?jǐn)?shù)斷裂cRNA供靶物制備為了斷裂，使用調(diào)整后的cRNA濃度。1.向每8jilRNA加H20中添加2nl5x斷裂緩沖液。20pgcRNA1-32jil5X斷裂緩沖液8|il不含RNA酶的水加至40jil總體積40pl2.于94。C溫育30分鐘。溫育后立即置于冰上。制備雜交靶物1.將20X真核雜交對照和寡聚物B2于65。C加熱5分鐘。Affymetrix基因芯片真核雜交對照試劑盒，Part#900362(150份包裝)2.輕微旋渦震蕩，旋轉(zhuǎn)沉降。3.混合液母液(假設(shè)斷裂后的cRNA濃度為0.5pg^1):標(biāo)準(zhǔn)陣列01)終濃度斷裂后的cRNA15iag300.05jig^1寡聚物B2(3nM)550pM20x對照摻入物151.5，5，25，100pM30.1mg/ml0.5mg/ml0.1mg/mlIX(BioB,C,D，Cre)鯡精(HerringSperm)DNA乙?；疊SA3Hucot-1DNA(1mg/ml)302XMES雜交緩沖液150H2064終體積3004.將270nl混合液母液等分入管并向每管中添加30nl斷裂后的cRNA。這就是雜交混合液。5.臨使用才使探針陣列平衡至室溫。6.將探針陣列充滿lxMES雜交緩沖液，并電轉(zhuǎn)雜交爐中以45。C,60rpm溫育10分鐘。7.將雜交混合液在99。C水浴中加熱5分鐘。8.將雜交混合液轉(zhuǎn)移入45。C水浴達(dá)5分鐘。9.將雜交混合液以最大速度離心5分鐘。10.從雜交陣列中除去lxMES雜交緩沖液。11.將探針陣列充滿上述的200)il雜交混合液。12.用Tough-Spots密封隔片。13.將探針陣列以45。C，60RPM雜交19小時。14.依照Affymetrix的方案清洗、染色和掃描探針陣列。Affymetrix材料項(xiàng)目賣主目錄號T7-(dT)24引物BiosearchTechnolgies定制對照摻入物自制-SuperscriptII/5X第一條鏈緩沖液/0.1MDTTInvitrogen18064-0145X第二條鏈緩沖液Invitrogen10812-01410mMdNTPInvitrogen18427-088lOU/pl大腸桿菌DNA連接酶Invitrogen18052-01910U/|il大腸桿菌DNA聚合酶IInvitrogen18010-0252U/jil認(rèn)A酶HInvitrogen18021-07110U/|alT4DNA聚合酶Invitrogen18005-0250.5MEDTASigmaE畫7889ENZO高產(chǎn)量RNA轉(zhuǎn)錄物標(biāo)記試劑盒Affymetrix或ENZO900182(ENZO)基因芯片樣品清潔模塊Affymetrix900371乙酰化牛血清清蛋白Invitrogen15561-020山羊IgG-試劑級Sigma1-5256抗鏈霉親合素抗體(山羊)，生物素化的VectorLabsBA-0500R-藻紅蛋白鏈霉親合素MolecularProbesS-86620XSSPEBioWhittaker51214真核對照試劑盒Affymetrix卯0362水，分子生物學(xué)級Ambion9934人Cot-lDNARoche1-581-0745MNaCl，不含RNA酶、不含DNA酶Ambion9760防沫劑0-30SigmaA-808210%Tween-20PierceChemical28320MES游離酸單水合物SigmaM5287MES鈉鹽SigmaM3885EDTA二鈉鹽，0.5M溶液SigmaE7889ToughSpots,LabelDotsUSAScientific9902基因芯片雜交爐640Affymetrix800139基因芯片掃描^義3000，配有工作站Affymetrix00-0074FluidicsStationAffymetrix00-0081自動加樣儀，配有外部條形碼讀碼器Affymetrix00-0129定量PCRcDNA合成:<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>熱循環(huán)條件95°CIO分鐘40個循環(huán)95°C15秒鐘60°Cl分鐘TaqMan探針Assays-on-Demand(TaqManMGB探針，F(xiàn)AMTM染料標(biāo)記的)進(jìn)行內(nèi)源對照GAPDH(探針濃度100nM,正向和反向引物濃度200nM)的擴(kuò)增以標(biāo)準(zhǔn)化加至每項(xiàng)反應(yīng)的樣品RNA(cDNA)的量。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對定量。為了相對于內(nèi)源對照標(biāo)準(zhǔn)化的定量，為耙物和內(nèi)源參考物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為每份實(shí)驗(yàn)樣品，根據(jù)適宜的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定輩巴物和內(nèi)源參考物的量。然后，將靶物的量除以內(nèi)源參考物的量，得到標(biāo)準(zhǔn)化靶物數(shù)值。使用實(shí)驗(yàn)樣品之一作為校準(zhǔn)物，或lx樣品。然后將每個標(biāo)準(zhǔn)化耙物數(shù)值除以校準(zhǔn)物標(biāo)準(zhǔn)化靶物值，產(chǎn)生相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用上文所述方法和材料進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖示于圖5-9，見下文討論。圖5提供了在對非小細(xì)胞肺癌("NSCLC")細(xì)胞系分析對Apo2L(+0.5%胎牛血清"FBS，，或10。/。FBS)或DR5單克隆抗體"mab"(交聯(lián)的"XL，，或非交聯(lián)的)(+0.5%胎牛血清叩88，，或10%FBS)凋亡活性的敏感性或抵抗性時得到的數(shù)據(jù)的IC50匯總表，所述數(shù)據(jù)是在MTT細(xì)胞毒性測定法中測得的。圖6提供了在對胰腺癌細(xì)胞系分析對Apo2L(+0.5%胎牛血清叩88"或10%FBS)或DR5單克隆抗體"mab"(交聯(lián)的"XL"或非交聯(lián)的)(+0.5%胎牛血清"FBS"或10。/。FBS)凋亡活性的敏感性或抵抗性時得到的數(shù)據(jù)的IC50匯總表，所述數(shù)據(jù)是在MTT細(xì)胞毒性測定法中測得的。圖7提供了在對非何杰金氏淋巴瘤("NHL")細(xì)胞系分析對Apo2L(+10%胎牛血清"FBS，，)或DR5單克隆抗體"mab"(交聯(lián)的"XL，，或非交聯(lián)的)(+0.5%胎牛血清或10。/。胎牛血清"FBS，，)凋亡活性的敏感性或抵抗性時得到的數(shù)據(jù)的IC50筒表，所述數(shù)據(jù)是在MTT細(xì)胞毒性測定法中測得的。圖8提供了選出的NSCLC、胰腺癌和NHL癌細(xì)胞系對DR5抗體的敏感性("sen")或抵抗性("RES")的比較及其與GalNac-T14表達(dá)的相關(guān)性，所述GalNac-T14表達(dá)是通過GalNac-T14mRNA表達(dá)來測量的。圖9提供了根據(jù)GalNac-T14mRNA表達(dá)樣式水平排列(降序)的各種NSCLC、胰腺癌和NHL細(xì)胞系的柱形圖。凋亡性細(xì)胞死亡程序在多細(xì)胞生物體的發(fā)育和(體內(nèi))穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用(Danialetal.,Cell,116:205(2004))。胞內(nèi)刺激可以經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)在途徑來觸發(fā)凋亡，該途徑依賴于Bcl-2基因超家族的成員來激活凋亡性胱天蛋白酶機(jī)制(Coryetal.,Nat.Rev.Cancer,2:647(2002))。屬于肺瘤壞死因子(TNF)超家族的某些細(xì)胞因子可以經(jīng)由細(xì)胞外在途徑來激活凋亡，通過與包含功能性凋亡誘導(dǎo)性"死亡域"(DD)的一些受體相互作用(Ashkenazietal.,Science,281:1305(1998))。Fas配體(FasL)經(jīng)由Fas(Apol/CD95)來刺激凋亡，而Apo-2配體/TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)性配體(Apo2L/TRAIL)經(jīng)由DR4(TRAIL-Rl)和/或DR5(TRAIL-R2)來觸發(fā)凋亡(LeBlancetal.,CellDeathDiffer"10:66(2003))。在與它們的關(guān)聯(lián)配體結(jié)合后，這些受體與銜接物(adaptor)分子FADD(Fas相關(guān)死亡域)結(jié)合，后者募集凋亡起動劑胱天蛋白酶-8來形成誘導(dǎo)死亡的信號復(fù)合物(DISC)(參見例如Kischkeletal"EMBOJ.，14:5579(1995);Kischkeletal.，Immunity,12:611(2000》。DISC的結(jié)合刺激胱天蛋白酶-8，后者繼而切割和激活效應(yīng)物蛋白酶諸如胱天蛋白酶-3、6和7來執(zhí)行凋亡性死亡程序。在許多細(xì)胞類型中，與細(xì)胞內(nèi)在途徑的溝通可進(jìn)一步放大細(xì)胞外在死亡信號(Scaffidietal.,J.Biol.Chem.,274:1541(1999))。Apo2L/TRAIL在多種腫瘤細(xì)胞類型中誘導(dǎo)凋亡，對正常組織的影響很小或沒有影響，提示它可用于癌癥治療(參見例如Ashkenazi，Nat.Rev.Cancer,2:420(2002);Kelleyetal.,Curr.Opin.Pharmacol.,4:333(2004))。凋亡途徑各種成分的改變在特定癌細(xì)胞系中可降低Apo2L/TRAIL敏感性(Igneyetal.,Nat.Rev.Cancer,2:277(2002》。依照下文所列方法和方案進(jìn)行了各種實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)示于圖10-15。為了檢驗(yàn)對受體激活的敏感性，作為Apo2L/TRAIL濃度的函數(shù)，測試了一組人癌細(xì)胞系中的細(xì)胞存活力，包括23種胰腺癌、18種惡性黑素瘤和36種結(jié)腸直腸腺癌(圖10A和未顯示的數(shù)據(jù))。此項(xiàng)分析將29/77種(38%)細(xì)胞系歸入對Apo2L/TRAIL高度或中等敏感的。在這29種細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)50%細(xì)胞死亡所需要的Apo2L/TRAIL濃度的范圍為3-800ng/mL，均值為250ng/mL。還通過基因表達(dá)序型分析對這組細(xì)胞系進(jìn)行了檢驗(yàn)，使用54,613種基因-探針(組)的微陣列。雖然有些例外，但是展現(xiàn)出對Apo2L/TRAIL的強(qiáng)烈或中等敏感性的胰腺癌和黑素瘤細(xì)胞系比相應(yīng)的抵抗性細(xì)胞系表達(dá)顯著更高水平的0-糖基化酶ppGalNAcT-14m脂A(p=0.5xl(T4,Fisher精確檢驗(yàn)，為胰腺癌迭代(iteratively)指派截留值為750，為黑素瘤迭代指派截留值為300)(圖10B)。大多數(shù)Apo2L/TRAIL敏感性結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系顯示出相關(guān)0-糖基化酶ppGalNAcT-3的高mRNA表達(dá)，盡管數(shù)種抵抗性細(xì)胞系也表達(dá)這種基因，導(dǎo)致更微弱但顯著的差異(p=0.026，截留值指派為2000)(圖10C,底部)。整組中的例外是(a)5/29種(17%)敏感性細(xì)胞系表達(dá)的ppGalNAcT-14或ppGalNAcT-3低于截留值；(b)16/48種(33%)抵抗性細(xì)胞系具有高于截留的ppGalNAcT-14或ppGalNAcT-3水平。通過檢驗(yàn)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中其它O-糖基化酶的mRNA表達(dá)，在10/12種(83%)敏感性細(xì)胞系中較之在6/24種(25%)抵抗性細(xì)胞系中檢測到更高水平的Fut-6(p二0.013;截留值指派為200)(圖10C，頂部)。ppGalNAcT-14在胰腺癌和黑素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)與Fut-6在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)結(jié)果與Apo2L/TRAIL敏感性高度相關(guān)(p=L83xl()-7,N=77)。這組基因分別為23/32種(72%)標(biāo)志物陽性細(xì)胞系和39/45種(87%)標(biāo)志物陰性細(xì)胞系正確預(yù)測了敏感性或抵抗性。還使用肺瘤異種移植物在體內(nèi)檢驗(yàn)了Apo2L/TRAIL敏感性。對攜帶衍生自Fut-6陽性結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系Colo205和DLD-1的肺瘤的小鼠進(jìn)行5天Apo2L/TRAIL處理，引起肺瘤消退，接著肺瘤進(jìn)展(progression)大大延遲(圖IOD)。相反，衍生自Fut-6陰性結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系Colo320和RKO的胂瘤不響應(yīng)這種治療。ppGalNAcT-3/Fut-6陽性Cob205細(xì)胞系與泛O-糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑千基-GalNAc(Delannoyetal.，Glycoconj.，13:717(1996))的預(yù)先溫育顯著降低對Apo2L/TRAIL的敏感性(圖11A),提示O-糖基化與Apo2L/TRAIL信號傳導(dǎo)之間有功能性聯(lián)系。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)這一點(diǎn)，使用靶向ppGalNacT-14、ppGalNacT-3或Fut-6mRNA的特異性小干擾(si)RNA寡核香酸。為了排除脫靶(off-target)效應(yīng)，為每種基因合成了多重、非交疊的siRNA并通過定量RT-PCR驗(yàn)證了它們降低靶物表達(dá)的能力(圖14A)。我們用在siRNA靶向區(qū)內(nèi)包含6處"沉默"核香酸變化的突變型ppGalNacT-14質(zhì)粒進(jìn)一步證實(shí)了siRNA特異性(Editorial，NatCell.Biol"5:489(2003》(圖14B)。使用ppGalNAcT-14siRNA轉(zhuǎn)染ppGalNAcT-14陽性PSN-l胰腺癌細(xì)胞系和Hs294T黑素瘤細(xì)胞系實(shí)質(zhì)性降低了對Apo2L/TRAIL的敏感性，而胱天蛋白酶-8siRNA,如預(yù)期的，提供了基本上完全的保護(hù)(圖11B)。類似的，使用GalNAcT-3或Fut-6siRNA轉(zhuǎn)染DLD-1或C170結(jié)腸直腸癌細(xì)胞顯著消除減弱了對Apo2L/TRAIL的敏感性(圖11C和圖14C)。總之，GalNAcT-14si脂A在4/5種胰腺癌細(xì)胞系和2/2種黑素瘤細(xì)胞系中降低了對Apo2L/TRAIL的敏感性，而ppGalNAcT-3或Fut-6siRNA各自在2/3種結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中降低了敏感性。相反，用GalNAcT-14(etoposide)的敏感性(圖14D)。類似地，用GalNAcT-14或GalNAcT-3siRNA轉(zhuǎn)染PSN-1或C170細(xì)胞不影響對廣譜蛋白質(zhì)激酶抑制劑十字孢磁<(staurosporine)的敏感性(圖14E)。因?yàn)橐劳胁窜蘸褪宙邏A二者都經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)在途徑來刺激凋亡(Weietal.,Science,292:727(2001))，這些研究提示O-糖基化酶可能經(jīng)由細(xì)胞外在途徑來調(diào)控凋亡信號傳導(dǎo)。用ppGalNAcT-14轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞在與DR4或DR5共轉(zhuǎn)染時揭示了細(xì)胞死亡，但是相關(guān)受體Fas和TNFRl或細(xì)胞內(nèi)在途徑激動劑Bax則不然(圖IID)。此外，ppGalNAcT-14轉(zhuǎn)染提高了抵抗性細(xì)胞系H1568黑素瘤(圖11E)及PA-TU-8902和PL-45胰腺癌(圖14F)對Apo2L/TRAIL的敏感性，但是不改變對依托泊苷的敏感性(數(shù)據(jù)未顯示)?？傊珿alNAcT-14過表達(dá)使4/7種細(xì)胞系對Apo2L/TRAIL敏感。檢驗(yàn)了ppGalNacT-M或Fut-6的siRNA敲低對Apc^L/TRAIL誘導(dǎo)的胱天蛋白酶加工的影響。在用對照siRNA轉(zhuǎn)染的PSN-1和DLD-1細(xì)胞中，Apo2L/TRAIL誘導(dǎo)了基本上完全的胱天蛋白酶-8加工，導(dǎo)致對Bid、胱天蛋白酶_9和胱天蛋白酶-3的切割(圖12A)。胱天蛋白酶-8siRNA的轉(zhuǎn)染防止了這些事件。PSN-1細(xì)胞中ppGalNAcT-14的敲低或DLD-1細(xì)胞中Fut-6的敲低還顯著削弱了Apo2L/TRAIL誘導(dǎo)的胱天蛋白酶-8、Bid、胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-3的加工(圖12A)及胱天蛋白酶-3/7活性的刺激(圖12B)。表達(dá)低水平ppGalNAcT-3和Fut-6的Apo2L/TRAIL抵抗性RKO和SW1417結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系在胱天蛋白酶-8加工水平方面顯示出相似的阻斷(圖15A)。如此，O-糖基化酶可調(diào)控導(dǎo)致胱天蛋白酶-8激活的Apo2L/TRAIL途徑上游事件。胱天蛋白酶-8激活需要DISC裝配(Ashkenazietal.，Science,281:1305(1998))。PSN-l和DLD-l細(xì)胞中對Apo2L/TRAILDISC的分析(Kischkeletal.，Immunity,12:611(2000))指示，ppGalNAcT-14或Fut-6的敲低降低FADD和胱天蛋白酶-8募集至DISC、DISC所結(jié)合的胱天蛋白酶-8的加工、和DISC所結(jié)合的胱天蛋白酶-8酶活性的刺激(Sharpetal.,J.Biol.Chem.,280:19401(2005))(圖12C、圖12D和圖15B)。ppGalNacT-14和Fut-6siRNA都不實(shí)質(zhì)性改變DISC中DR4和DR5的量或者Apo2L/TRAIL對表達(dá)DR4和DR5二者的PSN-1或DLD-1細(xì)胞的劑量依賴性結(jié)合(圖12C、圖15B和未顯示的數(shù)據(jù))。如此，ppGalNAcT-14和Fut-6未表現(xiàn)出通過影響細(xì)胞表面受體水平或Apc^L/TRAIL結(jié)合來調(diào)控凋亡。與此一致，一組77種細(xì)胞系中的Apo2L/TRAIL壽文感性未顯示出與關(guān)聯(lián)信號受體DR4和DR5或誘何受體DcRl和DcR2的細(xì)胞表面表達(dá)的顯著相關(guān)性(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，針對ppGalNAcT-l4、ppGalNacT-3或Fut-6的大多數(shù)siRNA不改變PSN-l、C170或DLD-1細(xì)胞上的DR4和DR5水平(圖15C)。兩種siRNA在某些細(xì)胞系中不引起可檢測的DR4和DR5降低(圖15C)。然而，針對相同酶的其它siRNA抑制Apo2L/TRAIL誘導(dǎo)的凋亡而不改變受體水平。在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)人DR5的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD),純化所分泌的蛋白質(zhì)，進(jìn)行酸水解，并分析所結(jié)合的單糖(圖13A)。與DR5ECD中所預(yù)測的N-糖基化位點(diǎn)的缺失一致，我們沒有檢測到N-連接的聚糖。然而，來自2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的2份樣品展示出每摩爾DR5ECD有3摩爾GalNAc和3摩爾Gal(圖13A)，提示核心聚糖GalNAc-Gal對DR5上3個位點(diǎn)的0-連接修飾。蛋白質(zhì)O-糖基化修飾絲氨酸或蘇氨酸。使用先前為預(yù)測潛在O-糖基化位點(diǎn)而建立的生物信息學(xué)工具(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlvc)(Juleniusetal.，Glycobiology，15:153(2005))，我們在人DR5長型(DR5-L)和短型(DR5-S)剪接變體共有ECD序列中鑒定出兩個這樣的區(qū)域，在可變剪接區(qū)中鑒定出第三個位點(diǎn)(圖13B)。第一個氨基酸區(qū)段(74-77)包含3個絲氨酸；第二個(130-144)具有5個蘇氨酸；而第三個具有4個蘇氨酸和3個絲氨酸。鼠DR5具有與前2個區(qū)段相似的序列，分別有2個絲氨酸和4個蘇氨酸，而人DR4具有2個相似序列，包含1個絲氨酸和5個蘇氨酸。為了測試這些位點(diǎn)對于DR5的翻譯后修飾是否是重要的，構(gòu)建了一組DR5L和DR5S突變體，用丙氨酸替換區(qū)段130-144中的5個蘇氨酸(DR5L-5T、DR5S-5T)或者這5個蘇氨酸及區(qū)段74-77中的3個絲氨酸(DR5L-5T3S、DR5S-5T3S)。經(jīng)DR5L或DR5S轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的溶胞物DR5抗體免疫印跡揭示了所預(yù)期的DR5L或DR5S條帶的存在(圖13C)。該抗體還檢測出更高分子量(MW)的DR5條帶，其在用DR5L或DR5S與ppGalNAcT-14共轉(zhuǎn)染后與對照相比變得更豐富(圖13C,星號)。與野生型構(gòu)建物相比，這些更高M(jìn)W條帶的豐度及其由于ppGalNAcT-14的提升被DR5L-5T或DR5S-5T顯著減小，而且被DR5L-5T3S或DR5S-5T3S幾乎消除。這些結(jié)果提示，更高M(jìn)W條帶代表DR5的0-糖基化形式ppGalNAcT-14促進(jìn)它們的形成，而通過丙氨酸替代進(jìn)行的對所預(yù)測O-糖基化位點(diǎn)的漸進(jìn)消除逐漸逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。用鼠DR5或人DR4、DR5L或DR5S轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞揭示了細(xì)胞死亡(圖13D);每一種DR5突變體都展示出比其相應(yīng)野生型構(gòu)建物更少的活性，其中DR5S-5T3S(其缺乏所有三個位點(diǎn))具有最弱的活性。用ppGalNAcT-14轉(zhuǎn)染顯著增強(qiáng)由所有DR4和DR5構(gòu)建物引起的細(xì)胞死亡，除了DR5S-5T3S,它顯示出顯著更小的活性。大多數(shù)正常組織和來自皮膚癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和膀胱癌或者來自非何杰金氏淋巴瘤的腫瘤樣品顯示出低于截留值(對大多數(shù)癌確定為500，對皮膚癌確定為200，圖13E)的ppGalNAcT-14mRNA表達(dá)。然而，顯著比例的腫瘤樣品，范圍從小葉乳腺癌(lobularbreastcancer)的10%到肺癌和彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤的30%，顯示出ppGalNAcT-M的過表達(dá)。有些癌樣品具有比相應(yīng)正常組織高1000倍以上的mRNA表達(dá)水平。癌中ppGalNAcT-14的動態(tài)表達(dá)提示，這種基因及可能的其它相關(guān)酶可能為鑒定對Apo2L/TRAIL具有更大敏感性的腫瘤提供了有用的生物標(biāo)志物。O-連接聚糖展示出廣泛的結(jié)構(gòu)多樣性，而且它們調(diào)控質(zhì)膜蛋白質(zhì)生物學(xué)的多個方面，包括構(gòu)象、聚集、運(yùn)輸、半衰期及細(xì)胞粘附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(Hangetal.，Bioorg.Med.Chem.,13:5021(2005);Hanisch,Biol.Chem.,382:143(2001))。癌細(xì)胞常常展現(xiàn)出O-聚糖特征(profile)的顯著改變，產(chǎn)生獨(dú)特的腫瘤相關(guān)石友水化合物抗原(Brockhausen,Biochim.Biophys.Acta,1473:67(1999);Dubeetal"Nat.Rev.DrugDiscovery,4:477(2005);Fusteretal.,Nat.Rev.Cancer,5:526(2005))。O-糖基化還在腫瘤細(xì)胞歸巢至特定轉(zhuǎn)移部位中發(fā)揮重要作用(Fusteretal.,CancerRes"63:2775(2003);Ohyamaetal.,EMBOJ"18:1516(1999);Takadaetal.,CancerRes"53:354(1993》。顯著比例的來自多種人癌癥的原發(fā)性腫瘤樣品顯示出升高的0-糖基化酶ppGalNAcT-14表達(dá)，包括結(jié)腸癌和結(jié)腸直腸癌細(xì)胞樣品、黑素瘤細(xì)胞樣品和軟骨肉瘤細(xì)胞樣品。方法材料細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自Gibco(Invitrogen/Gibco,Carlsbad,CA),不帶標(biāo)簽的可溶性Apo2L/TRAIL如先前所述制備(Lawrenceetal.，Nat.Med.,7:383(2001》，O-連接的糖基化抑制劑千基-a-GalNAc購自Calbiochem,而所有其它化學(xué)制品(包括依托泊苷和十字孢堿)購自SigmaAldrich(St.Louis,MO)。細(xì)胞培養(yǎng)物和纟田胞系所有119種人癌瘤細(xì)胞系(名稱和目錄號參見補(bǔ)充資料)得自ATCC或DSMZ(Braunschweig,Germany),并在補(bǔ)充有10%熱滅活胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和10mMHEPES不含抗生素像青霉素/鏈霉素的RPMI1640中于37。C和5。/。C02培養(yǎng)。293人胚腎細(xì)胞(目錄號CRL-1573)也得自ATCC,并在補(bǔ)充有10%FBS的100。/。Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)。O-糖基化突變型CHO細(xì)胞系，ldlDCHO，得到了MontyKreiger博士(MIT，Boston,MA)的許可。細(xì)胞存活力測定法和凋亡測定法為了測定Apo2L/TRAIL的IC50,將細(xì)胞一式三份鋪入96孔板，讓其粘附24小時，然后用濃度漸增直到1000ng/ml的重組人Apo2L/TRAIL處理。溫育72小時后，對它們進(jìn)行存活力測定法-MTT測定法(Pierce)或CellTiter-Glo發(fā)光細(xì)胞存活力測定法(Promega)的測定，依照制造商的方案。每一項(xiàng)細(xì)胞存活力實(shí)驗(yàn)在低(0.5。/。)和高(10。/oFBS)血清中重復(fù)至少三次，而中等敏感性細(xì)胞系定義為獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的IC50之間的或者低和高血清之間的存活力。我們根據(jù)在根據(jù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中或者存在低(0.5%)較之高(10%)血清時所誘導(dǎo)的凋亡量的變化程度來定義中等敏感性。凋亡通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析所收獲細(xì)胞(貼壁的+漂浮在培養(yǎng)基中的)中被膜聯(lián)蛋白V(BDPharmingen)染上色的平均百分比來量化。微陣列雜交和數(shù)據(jù)分析使用RNeasy試劑盒(Quiagen)自未處理細(xì)胞(3xl(^)制備總細(xì)胞RNA。如先前所述(Hoffmanetal.,Nat.Rev.Genetics,5:229(2004);Yauchetal.,Clin.CancerRes"11:8686(2005)),制備經(jīng)標(biāo)記的cRNA并與寡核香酸微陣列(U133PGeneChip;AffymetrixIncorporated,SantaClara,CA)雜交。用GENECHIP3.1(Affymetrix)、Spotfire、GenePattern和Cluster/TreeView分析掃描圖像文件。為了鑒定敏感性和抵抗性細(xì)胞系間表達(dá)差異最大的基因，我們對基因表達(dá)值根據(jù)變化程度進(jìn)行篩選，經(jīng)篩選排除在所分析樣品間具有最小變化的基因，這通過測試樣品間的倍數(shù)變化和絕對變化、將最大值與最小值的比率(最大值/最小值)及最大值與最小值的差異(最大值-最小值)與預(yù)定值相比較、然后排除不符合這兩項(xiàng)條件的基因來完成。表達(dá)構(gòu)建物和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)自Apo2L/TRAIL敏感性細(xì)胞系的合并cDNA克隆編碼ppGalNAcT-14的DNA片段，并插入帶N-末端Flag標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(Invitrogen)。然后將此構(gòu)建物進(jìn)4亍4立點(diǎn)定向i秀變(QuikchangeMutagenesiskit,Stmtagene)以產(chǎn)生在與siRNA同源的序列中具有4-6個擺動堿基對改變但不改變蛋白質(zhì)序列的siRNA沉默突變體。突變跨越19bpsiRNA結(jié)合序列中央10bp的區(qū)域。自cDNA集合克隆DR5Long和DR5Short、DR4、鼠TRAIL受體、DR4、Fas(變體l)、TNFRl和Bax((3變體)的DNA序列并插入pRK表達(dá)載體(Genentech)。通過四個蘇氨酸變成丙氨酸殘基或者五個蘇氨酸變成丙氨酸殘基的位點(diǎn)特異突變產(chǎn)生DR5L和DR5S的0-糖基化突變體，分別為Mut4xTA(T130,T131,T132,T135)和Mut5xTA(T130,T131,T132,T135，T143)。在6孔板中進(jìn)行促凋亡分子的表達(dá)構(gòu)建物引入HEK293細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染，促凋亡分子的濃度為0.5)ig/孔，ppGalNAcT-14或載體對照為2.0嗎。使用Lipofectamine2000依照制造商的方案轉(zhuǎn)染細(xì)胞。溫育48小時后，將細(xì)胞進(jìn)行凋亡分析。為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建物，將ppGalNAcT-14和突變體克隆入pQCXIP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Clontech)。使用①NX-Ampho輔助細(xì)胞系生成高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。使用磷酸4丐(Invitrogen)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時分離上清液并與10嗎/ml聚凝胺(polybrene)—起加至靶細(xì)胞，接著以2700rpm離心1小時以增強(qiáng)感染。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，將細(xì)胞用2嗎/ml噤呤霉素進(jìn)行選擇。siRNA設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)染方案針對ppGalNAcT-14、ppGalNAcT-3、胱天蛋白酶-8和DR5的siRNA由Dharmacon(Lafayette,CO)使用他們專有的選擇標(biāo)準(zhǔn)來設(shè)計(jì)。所選擇的序列為-.siGalNAcT-14(1):5'GACCATCCGCAGTGTATTA-dTdT3'(=14-4)(SEQIDNO:15)siGalNAcT-14(2):5'ATACAGATATGTTCGGTGA-dTdT3'(=14-6)(SEQIDNO:16)siGalNAcT-3(1):5'CCATAGATCTGAACACGTT-dTdT3'(=3-2)(SEQIDNO:17)siGalNAcT-3(2):5'GCAAGGATATTATACAGCA-dTdT3'(=3-7)(SEQIDNO:18)siFut-6(1)5'GUACCAGACACGCGGCAUA-dTdT3'(=6-1)(SEQIDNO:19)siFut-6(2)5'ACCGAGAGGUCAUGUACAA-dTdT3'(=6-2)(SEQIDNO:20)siCaspase-8:5'GGACAAAGTTTACCAAATG隱dTdT3'(SEQIDNO:21)購買雙鏈RNA寡核苷酸形式的siRNA并轉(zhuǎn)染入各自細(xì)胞系，各siRNA的終濃度為25nM。使用針對非靶向序列的siRNA雙鏈體(Dharmacon)作為對照。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)通過反向轉(zhuǎn)染來轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中將懸浮的細(xì)胞加至預(yù)先鋪入的脂質(zhì)-siRNA復(fù)合物。Lipofectamine2000的濃度依照制造商的方案。溫育48小時后，收獲細(xì)胞供mRNA分析，或者與重組人Apo2L/TRAIL、依托泊苷或十字孢堿一起再溫育24-72、時供存活力分析或者4、8或24小時供Western印跡分析。用千基-a-GalNAc抑制O-糖基化將Colo205細(xì)胞在存在千基-a-GalNAc(2mM或4mM)的條件下培養(yǎng)72小時。此時將它們鋪入96孔板，讓其在仍然存在抑制劑的條件下粘附24小時。定量PCR使用標(biāo)準(zhǔn)Taqman技術(shù)通過定量RT-PCR評估GalNacT-14和GalNacT-3轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平。將轉(zhuǎn)錄物水平相對于持家基因GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并將結(jié)果表述為標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)值(=2'Da)。用于GalNacT-14(目錄號Hs00226180_ml—GT14)、GalNacT-3(目錄號Hs00237084—ml—GT3)和GAPDH(目錄號402869)的引物/探針組購自AppliedBiosystems(FosterCity,CA)。免疫沉淀、Western印跡分析和抗體IP:抗Apo2L(2Ell;ATCC編號HB-12256)、抗DR4(3G1和4G7，ATCC編號PTA-99)和抗DR5(3H3，ATCC編號12534和5C7)單克隆抗體由Genentech公司產(chǎn)生，使用受體-Fc融合蛋白作為抗原。使用Pierce的免疫純蛋白GIgG+定向試劑盒(目錄號44990)將用于免疫沉淀Apo2L/TRAILDISC的抗DR4(4G7)和抗DR5(5C7)單克隆抗體偶聯(lián)至瓊脂糖。使用Pierce的EZ-linkSulfo-NHS-LC生物素化試劑盒(目錄號21217)將用于免疫沉淀DISC中的DR4/5免疫檢測的抗DR4(3G1)和抗DR5(3H3)單克隆抗體生物素化。制備帶FLAG標(biāo)簽的Apo2L/TRAIL并與抗FLAG抗體M2(Sigma)交耳關(guān)，如文獻(xiàn)所述(Kischkel，Immunity,12:611(2000))。這些實(shí)驗(yàn)如先前關(guān)于Apo2L/TRAIL-FLAG+抗FLAGDISC分析所述來進(jìn)行(Kischkel，supra)。DR4/5DISC免疫沉淀實(shí)驗(yàn)也如所述來進(jìn)行，只是將抗DR4(4G7)和抗DR5(5C7)單克隆抗體直接偶聯(lián)至瓊脂糖供免疫沉淀(Sharpetal.,J.Biol.Chem.,280:19401(2005))。WB:在6孔板中接種5xl()S個細(xì)胞/孔。對于RNAi敲低實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞用不同siRNA處理48小時，接著用Apo2L/TRAIL處理4、8或24小時。所示時間后，將細(xì)胞在冰冷的PBS中清洗并在含1%TritonX-100的低滲裂解緩沖液(20mMHEPESpH7.5、10mMKCl、1.5mMMgCl2、ImMEDTA和lmMDTT)中裂解。對于每份樣品，在還原性條件下在10。/?；?0-20。/。梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離40嗎蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(SchleicherandSchuell)后，將膜在10%脫脂奶粉中溫育1小時，接著與以下一抗一起溫育l小時山羊抗胱天蛋白酶-3抗體(1:1000，R&D)、兔抗胱天蛋白酶-8抗體(1:1000，Pharmingen)、小鼠抗胱天蛋白酶-9抗體5B4(1:1000,MBL)、兔抗Bid抗體(l:lOOO,Pharmingen)、兔抗DR5抗體(1:500,Cayman)或山羊抗肌動蛋白抗體(1:200，SantaCruzBiotechnology)。將膜用TBS/0.05%Tween清洗五次，然后與各自偶聯(lián)有過氧化物酶、親和力純化的二抗(1:5000,Biorad)—起溫育30分鐘。將膜再清洗五次，并使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL，Amersham)顯影，對KodakBiomax膠片曝光。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)/FACS分析4吏用FACSCalibud危式細(xì)月包計(jì)量4義(BectonDickinsonImmunocytometrySystem,SanJose,CA)通過焚光激活的細(xì)胞分揀(FACS)來測定TNF家族受體DR4和DR5的表面表達(dá)。將經(jīng)所示siRNA轉(zhuǎn)染48小時的C1O和PSN-1細(xì)胞用10嗎/ml—抗4G7(抗DR4)或3H3(抗DR5)或者小鼠lgG對照抗體于4。C染色l小時。然后將細(xì)胞用PBS清洗并與偶聯(lián)有熒光素(FITC)的山羊抗小鼠二抗(JacksonLaboratories)于4。C溫育30分鐘。然后使用FACSCalibur流式細(xì)胞計(jì)量儀通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析細(xì)胞。胱天蛋白酶測定法在40inl含100iiM產(chǎn)熒光肽Ac-DEVD-AFC的胱天蛋白酶緩沖液(50mMHEPESpH7.4、100mMNaCl、10%蔗糖、lmMEDTA、0.1%CHAPS和10mMDTT)中于37。C測定胱天蛋白酶-3A7活性。在所示時間里連續(xù)測量活性，通過使用MolecularDevices熒光計(jì)以動力學(xué)模式(kineticmode)和使用405-510濾光片對測量自DEVD-AFC釋放的AFC。為了評估胱天蛋白酶活性，在40pl胱天蛋白酶緩沖液(含1OOpMDEVD-AFC)中使用20嗎總細(xì)胞蛋白質(zhì)(TritonX-100提取物)。CHO衍生的DR5的碳水化合物分析在用4NTFA水解后得到了CHO細(xì)胞衍生的DR5的單糖組成。所釋放的單糖的分析在DionexBioLCHPLC系統(tǒng)上進(jìn)行，該系統(tǒng)使用高效陰離子交換層析且偶聯(lián)有脈沖電流檢測儀。動物和皮下異種移植物研究在進(jìn)行實(shí)-瞼性研究前使雌性無胸腺棵鼠(TheJacksonLaboratory,BarHarbor,ME,USA)適應(yīng)Genentech的動物飼養(yǎng)設(shè)施最少1周。所有實(shí)驗(yàn)身見程得到了Genentech動物護(hù)理和寸吏用委員會(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee,IACAUC)的批準(zhǔn)。給每只小鼠皮下接種5xl()6個Co10205、DLD-1和RKO細(xì)胞或者20xl()6個Colo320HSR人結(jié)腸癌細(xì)胞(AmericanTypeCultureCollection)。使用數(shù)字式測徑器收集腫瘤測量結(jié)果并使用如下公式計(jì)算腫瘤體積(A二長度)(B-寬度)2。一旦腫瘤體積達(dá)到大約lS0-200mm3,就將小鼠隨機(jī)分組，并在第0-4天給予媒介物或Apo2L/TRAIL(60mg/kg/天)腹膜內(nèi)(i.p)進(jìn)行處理。權(quán)利要求1.用于預(yù)測哺乳動物組織或細(xì)胞樣品對死亡受體抗體的敏感性的方法，包括以下步驟獲取哺乳動物組織或細(xì)胞樣品；檢驗(yàn)該組織或細(xì)胞樣品以檢測GalNac-T14的表達(dá)，其中所述GalNac-T14的表達(dá)預(yù)示所述組織或細(xì)胞樣品對死亡受體抗體的凋亡誘導(dǎo)活性是敏感的。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述GalNac-丁14的表達(dá)是通過檢測GalNac-T14mRNA的表達(dá)來檢驗(yàn)的。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過免疫組織化學(xué)來檢驗(yàn)的。4.權(quán)利要求l的方法，進(jìn)一步包括以下步驟檢驗(yàn)所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcRl或DcR2受體的表達(dá)。5.權(quán)利要求l的方法，其中所述組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述癌組織或細(xì)胞是胰腺癌、淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤或軟骨肉瘤組織或細(xì)胞。7.權(quán)利要求l的方法，其中所述死亡受體抗體是激動性抗DR4或抗DR5抗體。8.用于在哺乳動物組織或細(xì)胞樣品中誘導(dǎo)凋亡的方法，包括以下步驟獲取哺乳動物組織或細(xì)胞樣品；檢驗(yàn)該組織或細(xì)胞樣品以檢測GalNac-T14的表達(dá)；并在檢測到所述GalNac-T14的表達(dá)之后，將所述組織或細(xì)胞樣品暴露于有效量的死亡受體抗體。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過檢測GalNac-T14mRNA的表達(dá)來檢測的。10.權(quán)利要求8的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過免疫組織化學(xué)來^r測的。11.權(quán)利要求8的方法，進(jìn)一步包括以下步驟檢驗(yàn)所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcRl或DcR2受體的表達(dá)。12.權(quán)利要求8的方法，其中所述組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述癌組織或細(xì)胞是胰腺癌、淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤或軟骨肉瘤組織或細(xì)胞。14.權(quán)利要求8的方法，其中將所述細(xì)胞暴露于有效量的激動性抗DR4或抗DR5抗體。15.權(quán)利要求14的方法，其中將所述細(xì)胞暴露于有效量的能與圖3A所示DR5受體結(jié)合的激動性抗DR5抗體。16.治療哺乳動物中的病癥諸如免疫相關(guān)病癥或癌癥的方法，包括以下步驟自所述哺乳動物獲取組織或細(xì)胞樣品；檢驗(yàn)該組織或細(xì)胞樣品以檢測GalNac-T14的表達(dá)；并在檢測到所述GalNac-T14的表達(dá)之后，對所述哺乳動物施用有效量的死亡受體抗體。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過檢測GalNac-T14mRNA的表達(dá)來檢驗(yàn)的。18.權(quán)利要求16的方法，其中所述GalNac-T14的表達(dá)是通過免疫組織化學(xué)來檢驗(yàn)的。19.權(quán)利要求16的方法，進(jìn)一步包括以下步驟檢驗(yàn)所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcRl或DcR2受體的表達(dá)。20.權(quán)利要求16的方法，其中所述組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述癌組織或細(xì)胞包括胰腺癌、淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤或軟骨肉瘤組織或細(xì)胞。22.權(quán)利要求16的方法，其中對所述哺乳動物施用有效量的抗DR4或抗DR5抗體。23.權(quán)利要求22的方法，其中還對所述哺乳動物施用化療劑或放療。24.權(quán)利要求22的方法，其中還對所述哺乳動物施用細(xì)胞因子、細(xì)胞毒劑或生長抑制劑。全文摘要本發(fā)明提供了檢驗(yàn)哺乳動物組織或細(xì)胞樣品中一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)的方法和測定法。依照本發(fā)明所公開的方法和測定法，檢測到GalNac-T相關(guān)分子(諸如GalNac-T14或GalNac-T3)的表達(dá)則預(yù)示或指示該組織或細(xì)胞樣品將對凋亡誘導(dǎo)劑(諸如Apo2L/TRAIL和抗DR5激動劑抗體)是敏感的。本發(fā)明還提供了試劑盒和制品。文檔編號G01N33/68GK101287990SQ200680037960公開日2008年10月15日申請日期2006年8月15日優(yōu)先權(quán)日2005年8月16日發(fā)明者克勞斯·W·瓦格納,阿維·J·阿什克納齊申請人:健泰科生物技術(shù)公司