專利名稱：生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物傳感器以及一種用于測定樣品中目的靶分子的方法。
背景技術(shù)：
生物傳感器本質(zhì)上必須非常敏感，即其必須能檢測靶的非常低的表面 覆蓋度，優(yōu)選檢測到低于每平方微米一個(gè)分子。當(dāng)目的樣品與具有含能結(jié) 合目的耙分子的探針的生物識(shí)別表面的生物傳感器接觸時(shí)，在適當(dāng)?shù)臏赜?條件下靶分子將結(jié)合所述探針。如在生物傳感器中使用的大部分現(xiàn)有的生物識(shí)別表面是不可移動(dòng)的。這些靜態(tài)傳感器是平的(R. Ekins, J. Clin. Lig Assay, 1996, 19(2)， 146-156， US5432099)、包含突出物(W02005022151, US2005100947)或者是多孔的(Benoit等，—Anal.Chem—73， 2412-2420 (2001); Kessler等，J, Clin. Microbiol, 2004， 42(5)， 2173-2185)。在后一種情況下，待 分析的液體通過基質(zhì)被吸入。
對于試驗(yàn)的最大敏感度，重要的是在給定的溫育時(shí)間內(nèi)將盡可能多的 靶分子結(jié)合生物識(shí)別表面的元件?；|(zhì)對靶的吸附速率依賴于表面的"反 應(yīng)性"或親和力以及靶分子到表面的質(zhì)量傳遞性質(zhì)?？蓪⒔Y(jié)合速率描述為 r(on)-k(on)[T][S]，其中[T]等于靶濃度，[S]表面探針濃度以及k(on)等于結(jié)合常數(shù)。質(zhì)量傳遞性質(zhì)通過擴(kuò)散速率確定r(diff)= D*d[T]/dx以及對流速率r(conv)=v*σ*ω* [T]，其中D為T的擴(kuò)散系數(shù)，σ為耗盡層厚度，v 為流速以及ω為傳感器寬度。當(dāng)結(jié)合速率高于質(zhì)量傳遞速率，即當(dāng)不能足 夠快速地補(bǔ)充耗盡層以及探針不能與待測定的樣品中的靶分子達(dá)到充分的 連接時(shí)，吸附速率變得為擴(kuò)散限制性。當(dāng)靶的表面親和力高(k(on)大)，或 當(dāng)在目的樣品中存在低的靶濃度(一般在生物學(xué)樣品或臨床樣品情況下)時(shí)， 靶分子結(jié)合表面的速率將變得為擴(kuò)散限制性。然而，當(dāng)吸附動(dòng)力學(xué)為反應(yīng) 限制性時(shí)，生物傳感器達(dá)到最大的性能和速度。
尤其是從US 4956149中已知這種器件，在US 4956149中，描述了包 含彼此連接的傳感器和壓電驅(qū)動(dòng)器的生物傳感器。所述傳感器為由固定在 膜中并置于場效應(yīng)晶體管的門極上的葡萄糖氧化酶形成的葡萄糖傳感器。 所述傳感器被浸漬在樣品中以測定待檢測的可能物質(zhì)(在這種情況下為葡 萄糖)。通過驅(qū)動(dòng)該壓電元件，所述樣品被激動(dòng)，與非激動(dòng)樣品相比，信號(hào) 輸出增強(qiáng)。然而，在這個(gè)器件中，所述傳感器和驅(qū)動(dòng)元件為兩個(gè)不同的元 件。當(dāng)操作時(shí)，壓電驅(qū)動(dòng)器在液體中不移動(dòng)，僅包含分析物和/或檢測體的 液體移動(dòng)。在其中微型化高速進(jìn)展的領(lǐng)域這是一種不同的方法和技術(shù)缺點(diǎn)， 因此優(yōu)選例如在US 6068751描述的可以將全部組件整合到微流體性系統(tǒng) 中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供改進(jìn)的生物傳感器，其中傳感器的吸附動(dòng)力 學(xué)極大增強(qiáng)，并且優(yōu)選超出擴(kuò)散的限度。本發(fā)明的又一目的是提供包含能 實(shí)際上捕獲待檢測的靶分子的整合的生物識(shí)別元件的驅(qū)動(dòng)器。本發(fā)明人己 經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用包含(聚合物)驅(qū)動(dòng)元件結(jié)合生物識(shí)別元件的生物傳感器時(shí)可 以達(dá)到這個(gè)目的。因此所述傳感器的驅(qū)動(dòng)元件包含可以結(jié)合來自目的樣品 的靶分子的生物識(shí)別元件(的陣列)。
一方面，本發(fā)明涉及一種具有包含能結(jié)合來自目的樣品的靶分子的生 物識(shí)別元件的驅(qū)動(dòng)元件的生物傳感器，其中所述包含聚合物材料的驅(qū)動(dòng)元 件可通過驅(qū)動(dòng)裝置在第一和第二位置之間被驅(qū)動(dòng)。
又一方面，本發(fā)明涉及一種檢測目的樣品中的靶分子的方法，所述方
法包括使用本發(fā)明的生物傳感器。


由下文描述的實(shí)施方式，本發(fā)明的這些和其他方面將顯而易見，并參 照所述實(shí)施方式進(jìn)行描述。
在附圖中，圖1為本發(fā)明的生物傳感器的側(cè)面示意圖。圖l(a)為靜止位 置，在正常操作下，可能為開始位置以及其中發(fā)生捕獲靶分子檢測的位置 的傳感器的模式圖。圖l(b)為處于垂直于樣品液體流動(dòng)的驅(qū)動(dòng)位置并積極捕獲靶分子的傳感器的模式圖。觀察到在這種情況下仍可進(jìn)行檢測。例如當(dāng) 裝置的焦點(diǎn)深度大于驅(qū)動(dòng)元件的凈位移時(shí)的光學(xué)檢測。
具體實(shí)施例方式
圖1示出了本發(fā)明的生物傳感器的側(cè)面示意圖。圖l(a)公開了在第一(非 驅(qū)動(dòng))位置具有生物識(shí)別表面元件(3)的具有驅(qū)動(dòng)(聚合物)傳感器元件(2)的 生物傳感器(l)的實(shí)施方式。當(dāng)與包含多種靶分子(4)的樣品流(5)接觸時(shí)，所 述驅(qū)動(dòng)元件2可從第一位置(a)移動(dòng)到第二(驅(qū)動(dòng))位置(b)，從而通過改善的 吸附動(dòng)力學(xué)，g卩，反應(yīng)限制性而不是擴(kuò)散限制性獲得改善的傳感器敏感性 以及獲得更好的洗液效率。
所述驅(qū)動(dòng)元件可以由具有其上粘附生物識(shí)別表面的柔性材料的薄片 (flap)或柱(beam)組成。所述材料優(yōu)選為柔性聚合物。在靜止?fàn)顟B(tài)下，所述 薄片為水平位置?？赏ㄟ^如溫度、光、電場或(電)磁場的特定刺激物將所述 薄片設(shè)定為移動(dòng)。優(yōu)選使用磁場，最優(yōu)選使用電磁場。當(dāng)所述傳感器被驅(qū) 動(dòng)時(shí)，所述薄片被移動(dòng)到第二位置以與液體樣品改善接觸，并且所述表面 可探入所述液體探測靶分子。通過將薄片移動(dòng)到第二位置，隨著到達(dá)表面 的擴(kuò)散距離的降低，與液體樣品活性接觸的面積大大增加，以及吸附動(dòng)力 學(xué)通過驅(qū)動(dòng)移動(dòng)而增加。在一次測定中可重復(fù)移動(dòng)以進(jìn)一步改善與樣品液 體的接觸。
因此在本發(fā)明的一方面，提供了一種具有包含能結(jié)合來自目的樣品的 耙分子的生物識(shí)別元件的驅(qū)動(dòng)元件的生物傳感器，其中所述驅(qū)動(dòng)元件可以 通過驅(qū)動(dòng)裝置在第一和第二位置之間被驅(qū)動(dòng)。所述活化元件可以優(yōu)選為可 逆連接。在特定實(shí)施方式中，所述驅(qū)動(dòng)元件包含和優(yōu)選由聚合物驅(qū)動(dòng)元件 組成。所述材料是本領(lǐng)域已知的，如橡膠和彈性體(例如聚硅氧烷)、熱塑性 彈性體(如聚酯和聚醚酯或聚醚聚氨酯)、交聯(lián)聚合物和(水)凝膠、光聚合物， 如有或無介觀有序元件的聚(甲基)丙烯酸酯。其他實(shí)例為由堆疊導(dǎo)電 (stacked conductive)和聚合物膜結(jié)合組合物具有分散磁性(納米)顆粒的聚合 物材料(如Fe304納米顆粒)組成的復(fù)合材料結(jié)構(gòu)。(參見例如D丄Broer 等，Smart Materials. Chapter 4 in True Visions: Tales on the Realization of Ambient Intelligence, Emile Aarts禾口 Jose Encamacao編著,Springer Verlag,2005，或G.N.Mol等，Adv,Funct.Mat—15, 1155-1159(2005))。申請人共同 未決的專禾U申請"Microfluidic system based on actuator elements"中也描述 了聚合物驅(qū)動(dòng)微元件。這些材料已知能在特定刺激物下顯著變形，因此可 以作為優(yōu)選的驅(qū)動(dòng)聚合物材料。通過使用聚合物驅(qū)動(dòng)元件，可以得到很大 的形狀變化，其允許更柔性的設(shè)計(jì)。在驅(qū)動(dòng)元件中生物識(shí)別元件的整合消 除了如壓電元件的外部驅(qū)動(dòng)器的需要。
所述生物識(shí)別元件的表面層可以為具有其上設(shè)置有結(jié)合劑(也稱為探 針)的單層或多層。所述生物識(shí)別元件也可以例如通過將珠移植到驅(qū)動(dòng)元 件，包含粘附在驅(qū)動(dòng)元件的微珠。所述珠優(yōu)選為聚合物珠?？蛇x擇地，所述生物識(shí)別元件可以粘附在驅(qū)動(dòng)元件的片或板的形式，其用結(jié)合劑(或探針)點(diǎn)的陣列進(jìn)行點(diǎn)樣?？梢詫⑻结樤O(shè)計(jì)成可逆或不可逆地結(jié)合靶分子。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述生物識(shí)別元件為多孔的。在某些實(shí)施 方式中，所述探針位于多孔元件的孔中。根據(jù)其分子大小，多孔生物識(shí)別 元件的使用可以將探針帶到支持物的孔中，在所述孔中其暴露于待確定其 濃度的靶分子，可以同樣受到孔的幾何形狀的影響。當(dāng)所述驅(qū)動(dòng)元件被驅(qū) 動(dòng)到第二位置時(shí)，通常其基本上與樣品流的方向垂直，液體將流過多孔元 件。在多孔元件的孔中可以容易地捕獲到待檢測的靶分子。
所述表面或孔可以裝有用于特異性捕獲靶分子的探針?？梢酝ㄟ^已知 的方法尤其是來自生物技術(shù)微陣列(DNA-芯片)的例如來自Affymetrix、 Agilent、 GE healthcare、 Metrigenix、 Pamgene、 Dow Corning等的方法在所 述表面或孔中提供所述探針。通常這種探針可以選自包括抗原、半抗原、 抗體、抗體片段、DNA、 PNA、 LNA或RNA序列或其組合、可以與細(xì)胞 受體反應(yīng)的化學(xué)品、酶、蛋白質(zhì)、(寡或多)肽、螯合物、適體、納米體 (nanobody)?？蛇x擇地，根據(jù)驅(qū)動(dòng)元件的材料，人們可以選擇或合成對探針 具有高結(jié)合能力的材料。例如，人們可以使用能結(jié)合DNA探針的正電荷材 料?？蛇x擇地，人們可以使用可以用于將探針分子化學(xué)錨定到基質(zhì)的具有 特異反應(yīng)性基團(tuán)(如羧酸、環(huán)氧化物、胺、巰氫等)的材料。還可選擇地，人 們可以在驅(qū)動(dòng)材料上涂敷對探針具有高結(jié)合能力的涂層，從而使例如驅(qū)動(dòng) 性質(zhì)(整批材料)與特異性表面性質(zhì)(涂層)組合。這些材料、其化學(xué)性質(zhì)和其 合成方法用于此目的對本領(lǐng)域技術(shù)人員是廣泛己知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在其中毫不困難地選擇。
所用的探針可以為不同特異性的探針，也就是說對不同靶分子特異性 探針，或者其兩種或更多種可以為具有相同特異性但具有不同親和力的探 針，也就是說對相同靶分子為特異性但是對于其反應(yīng)具有不同的平衡常數(shù)
K。后者的選擇特別用于在未知樣品中待分析的分析物濃度可以在相當(dāng)大的 范圍內(nèi)變化，例如2或3個(gè)數(shù)量級(jí)的情況，如在懷孕婦女的尿中HCG測定 可以在0.1 100或更高IU/ml變化的情況。
所用的探針優(yōu)選為抗體或其功能部分，更優(yōu)選為單克隆抗體或其功能 部分。生物學(xué)液體的多種成分的單克隆抗體是市售可得的或可以通過已知 的技術(shù)制備。所用的抗體可以表現(xiàn)常規(guī)親和常數(shù)，例如108或109升/摩爾 上升，例如以l(T或l()U升/摩爾的級(jí)數(shù)上升，但是也可以使用具有親和常 數(shù)為1012 1013升/摩爾的高親和力抗體。本發(fā)明可以使用本身未標(biāo)記的這 樣的探針，但是不限于此。
所述探針可以以用于將探針涂敷到如試管的支持物的已知或常規(guī)使用 的任何方式涂敷到生物識(shí)別元件，例如通過使支持物上各間隔分離位置接 觸例如在1自2的點(diǎn)上0.5微升的小滴形式的結(jié)合劑溶液，并將小滴洗去 之前使其保持接觸一段時(shí)間。也可以使用其它生物印刷或壓紋技術(shù)。當(dāng)使 用例如噴墨印刷時(shí)可以涂敷較小的小滴體積。幾皮升至幾納升的小滴體積 是本領(lǐng)域的狀態(tài)并導(dǎo)致點(diǎn)直徑一般在10 500Min的范圍，從而允許在小(驅(qū) 動(dòng))基質(zhì)上存在大量(不同)捕獲點(diǎn)。
所述靶分子優(yōu)選選自包括DNA、 RNA、蛋白質(zhì)、肽、抗體、細(xì)胞、電
解質(zhì)、酶、藥學(xué)活性化合物、有機(jī)分子或其代謝物的組?；诖龣z測的目 的靶分子的選擇，可以設(shè)計(jì)其檢測探針。例如對于檢測例如體液中的抗體 的化合物存在、不存在或數(shù)量，探針的設(shè)計(jì)基于結(jié)合所述抗體的抗原或其 片段。在檢測特異性DNA序列的情況，例如遺傳性障礙的情況下，可以以 探針的形式設(shè)計(jì)互補(bǔ)核苷酸序列并用于本發(fā)明的器件中。
本發(fā)明可以用于測定生物學(xué)液體中存在的靶分子，所述生物學(xué)液體例 如如血液、血清、唾液或尿液的人體液。其也可來自動(dòng)物、植物或食物來 源或來自污物、生物學(xué)廢棄物、洗滌液等。它們可以用于測定液體樣品中 天然存在或可以人工存在的許多激素、蛋白質(zhì)、酶或其它分析物，如藥物、
毒藥、重金屬等，所述樣品可以在與生物傳感器接觸前進(jìn)行預(yù)處理，即在接觸生物傳感器之前，可以在樣品上進(jìn)行如免疫學(xué)測定或PCR測定的某些測定，或者可以對樣品進(jìn)行分離或純化。在這個(gè)實(shí)施方式中，所述生物傳感器作為給定測定的檢測平臺(tái)。
例如，本發(fā)明可以用于提供一種器件，所述器件用于定量測定與妊娠和生殖相關(guān)的許多激素，如FSH、 LH、 HCG、催乳素和類固醇激素(例如孕酮、雌二醇、睪酮和雄烯二酮)，或與腎上腺垂體軸相關(guān)的激素，如皮質(zhì)醇、ACTH和醛固酮，或甲狀腺相關(guān)激素，如T4、 T3和TSH以及其結(jié)合蛋白TBG，或者病毒，如肝炎、AIDS或皰疹病毒，或者細(xì)菌，如葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、月市炎球菌(pneumococci)、淋球菌(gonococci)和腸球菌(enterococci)，或者真菌，如念珠菌(Candida)或者腫瘤相關(guān)肽如AFP或CEA，或者藥物，如作為不法運(yùn)動(dòng)員性能改進(jìn)劑禁用的藥物，或者食物污染物。在各情況下，所用的探針對待測定的靶分子是特異 的(與樣品中的其他物質(zhì)比較)并且可以為單克隆抗體或其單鏈DNA探針。
在某些實(shí)施方式中，所述液體可以為洗液，例如來自緩沖液或離液測 試用劑(reagentia)，并且可以包含去污劑。當(dāng)可活化(actuable)表面用于與檢 測上文描述的靶分子的相同原因時(shí)，可以更有效地進(jìn)行洗滌。優(yōu)選包括洗 滌以除去或降低可以來自非特異性吸附分子的本底信號(hào)，或又來自包含所 述分子的液體的干擾。
所述傳感器可進(jìn)一步包含優(yōu)選依賴于表面敏感檢測技術(shù)的檢測器。其 實(shí)例包括基于表面結(jié)合發(fā)光分子或反射分子(例如金屬)或干涉層結(jié)構(gòu)，使用 (巨)磁電阻(GMR)傳感器、隱失波檢測(表面細(xì)胞質(zhì)基因組反響)或激發(fā)，或 隱失波激發(fā)(波導(dǎo)熒光)、阻抗傳感器、光學(xué)傳感器。
在所述傳感器中代表靶分子濃度未知的樣品中探針占據(jù)的信號(hào)可以參 照由包含已知濃度的相同的靶分子的標(biāo)準(zhǔn)樣品獲得的劑量反應(yīng)曲線而校 準(zhǔn)。在各靶分子在一些標(biāo)準(zhǔn)樣品中存在時(shí)，這種標(biāo)準(zhǔn)樣品不必一起包含所 有靶分子。
根據(jù)檢測技術(shù)的性質(zhì)，所述檢測器優(yōu)選位于生物傳感器(l)中或其附近。 根據(jù)檢測技術(shù)，可從驅(qū)動(dòng)基質(zhì)的下面或上面讀出信號(hào)。例如，當(dāng)使用GMR 傳感器時(shí)，優(yōu)選在靶分子能吸附到生物識(shí)別元件的表面或孔中，驅(qū)動(dòng)器返回到用于檢測吸附的靶分子的第一位置后。根據(jù)使用的檢測技術(shù)，實(shí)際的元件或其表面的尺寸可以變化。例如在GMR傳感器的情況下，聚合驅(qū)動(dòng) 器的厚度可以優(yōu)選大約0.2-大約5微米。在隱失波傳感器的情況下， 一般 可以使用大約0.1-1微米的驅(qū)動(dòng)器，而阻抗傳感器可以需要低于0.2微米的 厚度。當(dāng)從上面進(jìn)行讀出和激發(fā)時(shí)，例如具有傳播波的熒光分子的激發(fā)和 具有相同光路的發(fā)光的檢測，聚合物層的厚度應(yīng)當(dāng)優(yōu)選其覆蓋裝置的焦點(diǎn) 深度?？梢栽O(shè)計(jì)使得由驅(qū)動(dòng)移動(dòng)引起的位移仍然在光學(xué)系統(tǒng)的焦點(diǎn)深度內(nèi)。
本發(fā)明的裝置優(yōu)選用于微流體，以及現(xiàn)在描述的方法結(jié)合了具有流動(dòng)基質(zhì)的層流微流體和表面敏感檢測。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述驅(qū)動(dòng)器包含多個(gè)(也稱為陣列)生物識(shí) 別元件，其中各生物識(shí)別元件能夠結(jié)合、優(yōu)選獨(dú)立地結(jié)合不同的靶分子， 從而同時(shí)鑒別一個(gè)樣品中的多種不同的靶分子。在可選擇的實(shí)施方式中， 在樣品流中將一組帶有多種靶分子的生物識(shí)別元件的驅(qū)動(dòng)器并排或順序設(shè) 置以在一次運(yùn)轉(zhuǎn)中捕獲多種靶分子。
本發(fā)明又一方面涉及一種檢測目的樣品中的靶分子的方法，所述方法包括步驟
使目的樣品基本上與如上所定義的生物傳感器接觸；
將所述聚合物驅(qū)動(dòng)元件從第一位置驅(qū)動(dòng)到第二位置；
使靶分子結(jié)合所述生物識(shí)別元件；
任選地，將所述驅(qū)動(dòng)元件從第二位置驅(qū)動(dòng)到第一位置；以及
檢測所述生物識(shí)別元件上靶分子的存在、不存在或量。
本發(fā)明的器件優(yōu)選用作選自分子診斷學(xué)、環(huán)境監(jiān)測和藥物篩選的優(yōu)選領(lǐng)域的生物傳感器。
權(quán)利要求
1、生物傳感器(1)，具有包含能結(jié)合來自目的樣品中的靶分子(4)的生物識(shí)別元件(3)的驅(qū)動(dòng)元件(2)，其中所述驅(qū)動(dòng)元件(2)，其包含聚合物材料，可以通過驅(qū)動(dòng)裝置在第一和第二位置之間被驅(qū)動(dòng)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器(l)，其中所述生物識(shí)別元件(3) 包含能結(jié)合靶分子的表面。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物傳感器(l)，其中所述驅(qū)動(dòng)元件(2) 由磁場和/或電場、光或溫度啟動(dòng)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的生物傳感器(l)，其中所述傳感器 進(jìn)一步包含使用表面敏感檢測或激發(fā)技術(shù)的檢測器。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的生物傳感器(l)，其中所述檢測器 位于所述驅(qū)動(dòng)元件(2)的對面，使得當(dāng)所述驅(qū)動(dòng)元件(2)位于第一位置時(shí)，可 以測定靶分子(4)的存在、不存在或量。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的生物傳感器(l)，其中所述靶分子 (4)選自包括DNA、 RNA、蛋白質(zhì)、肽、抗體、電解質(zhì)、藥學(xué)活性化合物、 有機(jī)分子或其代謝物的組。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的生物傳感器(l)，其中所述驅(qū)動(dòng)元 件(2)包含多個(gè)生物識(shí)別元件(3)，其中各生物識(shí)別元件(3)能結(jié)合不同的靶分 子(4)，從而同時(shí)鑒別樣品中多種不同的靶分子。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的生物傳感器(l)，其中所述目的樣 品來自人，如唾液、痰、血液、糞便、尿；動(dòng)物；植物；食物；污物；生 物學(xué)廢物；洗液來源。
9、 用于檢測目的樣品中的靶分子(4)的方法，所述方法包括步驟-使目的樣品與權(quán)利要求1-8中所定義的生物傳感器(l)接觸；-將所述驅(qū)動(dòng)元件(2)從第一位置驅(qū)動(dòng)到第二位置；-使靶分子(4)結(jié)合所述生物識(shí)別元件(3);-檢測所述生物識(shí)別元件(3)上靶分子(4)的存在、不存在或量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物傳感器，其具有包含能結(jié)合來自目的樣品的靶分子的生物識(shí)別元件的驅(qū)動(dòng)元件，其中，所述驅(qū)動(dòng)元件包含聚合物材料，可以通過驅(qū)動(dòng)裝置在第一和第二位置之間被驅(qū)動(dòng)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101346627SQ200680048985
公開日2009年1月14日 申請日期2006年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月23日
發(fā)明者H·R·施塔伯特, J·M·J·登東德, R·J·M·施羅德斯 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司