專利名稱：：抗體鑒定測試的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種測量抗體制劑激活Fc受體的能力的方法，該方法包^下步驟a)將所述抗M此聚集，b)將表達(dá)Fc受體的細(xì)胞與所述聚集的抗^接觸，且c)測量由所述抗體的Fc區(qū)域激活所述細(xì)胞的Fc受體而導(dǎo)致的細(xì)胞牲
背景技術(shù)：
：隨著在研究中的應(yīng)用一增加，作為傳統(tǒng)治療的替代方法，抗體hM^成了診斷和治療的可選工具。多種治療用的血漿來源或生物技術(shù)來源的抗體制劑現(xiàn)在已經(jīng)上市或者處于臨床開發(fā)階段.將其屬性i^行開發(fā)，用以獲得可以特異性與其乾點(diǎn)結(jié)合、有效募集免疫細(xì)胞的治療工具。最近幾年來，研究方向關(guān)注于提高抗體的效力，特別關(guān)注于對抗體的恒定Fc區(qū)域的操控。恒定Fc區(qū)域負(fù)責(zé)抗體的"效應(yīng)物"屬性，即其允許免疫效應(yīng)細(xì)胞及補(bǔ)體分子的動員。這種能力由于某些免疫細(xì)胞上糖蛋白(Fc受體或稱FcR)的存在而成為可能。一旦抗體通過其可變區(qū)與乾抗原結(jié)合，這些受體能夠結(jié)合于抗體的恒定區(qū)。通過與這些細(xì)胞結(jié)合，抗體觸發(fā)不同的細(xì)J3^U制，例如吞謹(jǐn)作用及ADCC(抗體^1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)JI^性作用).這提出了如何基于其"效力"(即由于抗體Fc區(qū)域結(jié)合于Fc受體，觸發(fā)免疫細(xì)g制的能力)對抗體進(jìn)行區(qū)別的問題.在文獻(xiàn)FR0211416中，申請人描述了一種測量抗體功能活性的方法，該方法包括在抗體;S^斤述抗體的抗原存在的情況下，將表達(dá)CD16受體的細(xì)胞與^JL介質(zhì)相接觸，并測量至少一種由表達(dá)CD16受體的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，這種測量方法表示出由抗體所致的免疫系統(tǒng)效應(yīng)細(xì)胞的激活。因此，這種方法能夠評價(jià)由抗原-抗體復(fù)合物所致的效應(yīng)細(xì)胞激活。然而，這種方法中，效應(yīng)細(xì)胞的激活同時(shí)依賴于抗體對其把點(diǎn)的親和力以及Fc區(qū)域與Fc受體結(jié)合的能力.因此，該測試并不能"^Hh舉獨(dú)由抗體Fc區(qū)域?qū)е碌男?yīng)細(xì)胞激活。為了解決這一問題，文獻(xiàn)EP1298219提出一種能夠測量抗體Fc區(qū)域的功能性的方法，這種測量方法不會受抗體Fab區(qū)域結(jié)合能力的影響。這種方法包括固定待測試的抗體，將其引A^達(dá)Fc受體的效應(yīng)細(xì)胞，并且測量由于效應(yīng)細(xì)胞被抗體Fc區(qū)域激活所導(dǎo)致的效應(yīng)細(xì)胞中的反應(yīng)，在該方法中，所述抗體通過包^t^平板或WUi而被固定。由于同時(shí)依賴于抗體與平板的正確結(jié)合、其在平板或m上的取向、以及抗體所帶電荷，因此不能控制被固定的抗^量，事實(shí)上，抗體電荷絲于其^J^化程度，這影響其固定在^MM4SLh的能力。因此，該參數(shù)與所測試的抗體功能導(dǎo)致了測試的差異性，這^Nt得難以對比具有不同序列和/或特異性的兩種抗體的Fc區(qū)域的功能性。另外，該測試^人單核細(xì)胞系(THP-1)進(jìn)行，為了獲得FcyRma受體的持續(xù)'錄面表達(dá)，THP-1必須被干擾素y激活。這種預(yù)先激活為測試差異性的顯著來源，因此難以對比實(shí)驗(yàn).因此，現(xiàn)有技術(shù)中提出的基于其"效力"區(qū)別抗體的方法，或者不是特別適合于評價(jià)由于抗體Fc區(qū)域所致的效應(yīng)細(xì)胞激活，或者可重復(fù)性不夠理想，因此難以標(biāo)準(zhǔn)化。這沈乏申請人開發(fā)一種新方法的目的，本發(fā)明方法能夠測量抗體制劑激活Fc受體的能力，所述方法不僅可重復(fù)性好，又特別能夠"W抗體Fc區(qū)域激活Fc受體的能力，并且不會因抗體Fab區(qū)域的特性而干擾該刑介.
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的第一個目標(biāo)涉及一種測量抗體制劑激活Fc受體的能力的方法，包括以下步驟a)將所述抗M此聚集，b)將表達(dá)Fc受體的細(xì)胞與所述聚集的抗^目接觸，且c)測量由所述抗體的Fc區(qū)域激活所述細(xì)胞的Fc受體而導(dǎo)致的細(xì)為本發(fā)明之目的，"將所述抗^JL此聚集"是指將^bfr含有抗體的溶液中的抗體結(jié)合在形成網(wǎng)絡(luò)，在該網(wǎng)絡(luò)的抗^間表現(xiàn)出很強(qiáng)的偶聯(lián).這種抗體的聚集具有用可控及同質(zhì)的方式將抗體定向的功能，使得所有抗體或大部分抗體的Fc區(qū)域適當(dāng)呈現(xiàn)于朝向表達(dá)Fc受體的效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體的方向上。事實(shí)上，申請人驚異地注意到這種聚集的效果為不論所研究抗體的特異性或一級序列如何，某些抗體的Fc區(qū)域1會用特定的方式進(jìn)行定向。根據(jù)本發(fā)明的方法具有能夠研究本方法中所用抗體的數(shù)量和效應(yīng)細(xì)胞的激活之間的劑量-反應(yīng)關(guān)系的優(yōu)點(diǎn)，以及具有可重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)。此外，申請人驚異地注意到，這種方法使得能夠通過Fc受體激活效應(yīng)細(xì)胞，而不需要乾抗原的存在。事實(shí)上，一旦抗體已經(jīng)通過其可變區(qū)與把抗原結(jié)合，F(xiàn)c受體即能夠在體內(nèi)結(jié)合于抗體的恒定區(qū).缺少在其表面表i^L抗原的細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)為，消除了由于這些細(xì)胞的存在所致的生物測試中差異性的來源，并且因此減少了可能在使用本方法的過程中引入差異因此，現(xiàn)有技術(shù)的方法中因把細(xì)胞的存在導(dǎo)致的生物差異性，以及抗體的特異性和一鈒序列的影響，在本發(fā)明的方法中是有限的，甚至為零。為了實(shí)施本發(fā)明，可以^^域技^員已知的所有用于抗體聚集的方法(例如聚集例如整個免疫球蛋白G的方法)進(jìn)行抗體聚集，例如^加熱法或免疫學(xué)手段，這一列舉并不構(gòu)成伶河形式的限制。另外，4^本發(fā)明的方法具有利用溶液中的抗體實(shí)施的優(yōu)點(diǎn)。為本發(fā)明之目的，"Fc受體"是指存在于效應(yīng)細(xì)胞上的、抗體Fc區(qū)域的靴受體，例如CD16(FcYR邁)及CD32(FcvRn),為本發(fā)明之目的，"抗體"是指無論其特異性及同種型，只要包括Fc區(qū)域或擁有與Fc區(qū)域相同功能的區(qū)域的M抗體。因此，其可以是完整抗體或者抗體片段，例如Fc抗體片段.另外，在^本發(fā)明的方法中使用的抗體可以是IgG(IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、IgE、IgA或IgD,或者也可以是它們的混合物.另外，在本發(fā)明的方法中使用的抗體可以是單克隆抗體和/或多克隆抗體。在其為單克隆抗體的情況下，這些抗體可以是嵌合抗體、人源化抗體、來源于人類的抗體或來源于動物的抗體。為本發(fā)明之目的，"表達(dá)Fc受體的細(xì)胞"是指^T在其表面表達(dá)Fc受體的細(xì)胞，所述細(xì)胞可以天然i&4Jtil一受體，或在經(jīng)基因修飾后表iiil一受體，通過示例性方式，可以提到NK細(xì)胞、激活的單核細(xì)胞、外周血粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中'錄細(xì)胞、CD8淋巴細(xì)胞、Ty5淋巴細(xì)胞、NKT細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞，這一列舉并不構(gòu)成,形式的限制.有利地，當(dāng)抗體的Fc區(qū)域與在這些細(xì)胞表面表達(dá)的Fc受糾目結(jié)合時(shí)，這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生反應(yīng)。為本發(fā)明之目的，"表達(dá)Fc受體的細(xì)胞的反應(yīng)"是指由于這些細(xì)胞的Fc受體與抗體Fc區(qū)域的相互作用，導(dǎo)致的，可測量的細(xì)Ji&^應(yīng).該反應(yīng)可以是細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞夕卜的。通過示例的方式，可以提到一種或多種細(xì)胞因子的測量，細(xì)胞內(nèi)鈣離子、穿孔素、顆粒酶或一氧化氮水平的測量，這一列舉并不構(gòu)成,形式的限制。有利地，該聚集通過使用F(ab，)2抗-IgG片段得以實(shí)現(xiàn)。該方法在控制抗體Fc區(qū)域的定向方面可以實(shí)現(xiàn)特別有利的聚集。事實(shí)上，每個F(ab，)2片段結(jié)合兩個待測試的不同抗體，因此用適合的方式定向了待測試抗體的Fc區(qū)域。這種定向特別適合于與效應(yīng)細(xì)胞的Fc受^目互作用，因此適合于^t應(yīng)細(xì)胞的激活。能夠用于本實(shí)施方案的F(ab，)2抗-IgG片段可針對抗體的伶阿片段、部分或結(jié)構(gòu)域，例如Fc區(qū)域、Fab區(qū)域或整個IgG分子。F(ab，)2片殺二也可以是單克隆來源或多克隆來源的。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，待測試抗體的濃度及F(ab，)2的濃度可被精確地控制。因此能夠計(jì)算兩者之間的關(guān)系，這使得無論何種待測試的抗體制劑均能夠?qū)崿F(xiàn)可重復(fù)測試。特別有利地，該F(ab，)2抗-IgG片段為針對被測試的抗體制劑的抗-Fab或抗-F(ab，)2.該片段可以為來源于羊或兔的片段。在該具體實(shí)施方案中，每個F(ab，)2片段結(jié)合于兩個待測試抗體分子的Fab部分，由此可以用一種合適的方式將待測試抗體Fc區(qū)域定向，使其能夠與FcR結(jié)合，并激活在表面表達(dá)這些FcRs的細(xì)胞。根據(jù)另一實(shí)施方案，該聚集為熱聚集.抗體首先被加熱以使其彼此聚集(本發(fā)明之方法的步驟a))，然后將其與表達(dá)Fc受體的細(xì)胞相接觸(步猓b)).^T適于將抗^L此聚集的加熱方法均可以用于實(shí)施本發(fā)明的方法。通過示例性的方式，可以提到在601C下加熱抗體30分沖[1].M本發(fā)明的另一實(shí)施方案，可通過將Fab區(qū)^fe此交聯(lián)或者將重鏈和輕^^此交聯(lián)來實(shí)現(xiàn)聚集。為本發(fā)明之目的，"交聯(lián)"是指兩個抗體分子之間的任何橋接，例如將這些抗體的Fc區(qū)域朝向效應(yīng)細(xì)胞的CD16受體同向地定向.有利地，一個抗體可以參與一個或多個^^接。因此，抗體能夠形成網(wǎng)絡(luò)，其定向適合于與效應(yīng)細(xì)胞攜帶的CD16受體的最佳結(jié)合。有利地，,允許抗^^交聯(lián)(橋接)的方法均適于實(shí)施本發(fā)明。通過示例性的方式，可以提到形成化學(xué)鍵或通過UV照射進(jìn)行橋接，這一列舉不構(gòu)成伶河形式的限制。有利地，由效應(yīng)細(xì)Ji&^達(dá)的Fc受體選自CD16(FcY謹(jǐn)a和FcyRinb)，CD32(FcyRIIa和FcyRIIb)，及CD64'特別有利地，選擇CD16。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)Fc受體的細(xì)胞為用編碼所述受體的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在該實(shí)施方案中，能夠控制效應(yīng)細(xì)胞遞呈的受體的同種異型.事實(shí)上，根據(jù)所需要的測試，可以使用只含有依特性而選擇的一種受體的細(xì)胞，或者含有這些受體的結(jié)合的細(xì)胞，來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法.例如，可以通過轉(zhuǎn)染編碼CD16的基因，選擇使用只表達(dá)CD16的效應(yīng)細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。這樣就能夠消除另一個差異因子，即位于效應(yīng)細(xì)胞表面的Fc受體的性質(zhì)和數(shù)量的差異。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)Fc受體的細(xì)胞為表達(dá)CD16的Jurkat細(xì)胞，該細(xì)胞系在這些細(xì)胞的非特異性激活劑例如PMA(乙酸肉豆蔻酖佛》皮酯(Phorbol-12inyristate-13-acetate))存在的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。用該細(xì)胞系實(shí)現(xiàn)4^本發(fā)明的方法的一個特別有利的方面是基于這樣的事實(shí)不需要在將效應(yīng)細(xì)胞與聚集的抗體接觸之前對該細(xì)胞系進(jìn)行激活.事實(shí)上，某些效應(yīng)細(xì)胞系需J^一種或多種細(xì)胞因子來激活，以使Fc受體充分^效表達(dá)(例如參見文獻(xiàn)EP1298219)。這種用細(xì)胞因子進(jìn)行的預(yù)先激活經(jīng)常是隨機(jī)性的，導(dǎo)致了時(shí)間的浪費(fèi)及難以克服的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化的困難。另外，用編碼CD16受體的表達(dá)栽體轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞系具有永生化的優(yōu)點(diǎn)，并且因此可以在培養(yǎng)基中無限增殖。這些細(xì)胞具有在接受雙重刺激的情況下可被激活的優(yōu)點(diǎn).在本發(fā)明的方法中，JurkatCD16細(xì)胞的激活可由PMA(為T細(xì)胞的非特異激活物)及CD16與抗體Fc區(qū)域的結(jié)合而實(shí)現(xiàn).Jurkat細(xì)胞的激活由培養(yǎng)上清液中IL-2的釋放顯示出來.結(jié)果，對應(yīng)于CD16的抗體Fc區(qū)域的功能越強(qiáng)，釋放到上清液中的IL-2的量^高。有利地，由所述抗體的Fc區(qū)域激活所述細(xì)胞Fc受體而導(dǎo)致的細(xì)J!&^應(yīng)的測量為對表達(dá)CD16受體的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一種細(xì)胞因子的量的測量。事實(shí)上，除了由上清液中的IL-2的#顯示以外，效應(yīng)細(xì)胞的激活還可其它指標(biāo)顯示.例如，培養(yǎng)基中細(xì)胞因子的濃度可通過商業(yè)上可用的ELISA(bioassay)測試的方式進(jìn)行測量.其它的方法能夠斧階細(xì)胞因子(例如IL-2)的合成:這些方法為分析IL-2信使RM的定量RT-PCR及Northern印跡雜交法(Northernblot),或者對細(xì)胞內(nèi)IL-2及培養(yǎng)上清液中IL-2定量的Western印跡雜交法(Westernblot)及細(xì)胞計(jì)量術(shù)(cytometry)，這一列舉并不構(gòu)成伶河形式的限制。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，測量至少一種細(xì)胞因子的量通過實(shí)行對這些細(xì)胞因子mRNA的分析而實(shí)現(xiàn)，這些mRNA的量與相應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)水平相關(guān)，這顯示了效應(yīng)細(xì)胞的激活水平-有利地，選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、MCP-1、TNFalpha(TNFct)或IFNga咖a(IFNy)的至少一種細(xì)胞因子^X量測量，這一列舉并不構(gòu)成^T形式的限制。特別有利地，細(xì)Jlfc^應(yīng)的測量為白細(xì)胞介素IL-2的定量測量。分泌的白細(xì)胞介素IL-2的水平與ADCC型反應(yīng)活性相關(guān)。事實(shí)上，在著;f艮強(qiáng)的相關(guān)性(文獻(xiàn)FR一0211416)。因此，>^發(fā)明的方法^別有利于篩選細(xì)胞辠性抗體，特別是為了治療用途.在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，細(xì)J!&^應(yīng)的測量為對鈣內(nèi)流、砩酸化、轉(zhuǎn)錄因子或凋亡的測量。這些^t的增加與效應(yīng)細(xì)胞的激活相關(guān)，顯示出抗體激活效應(yīng)細(xì)胞Fc受體的能力。有利地，該方法適用于評價(jià)細(xì)胞產(chǎn)生能夠與CD16受體交互作用的單克隆抗體的能力，即，"^抗體或抗體制劑的細(xì)J!^性。在文獻(xiàn)中，已經(jīng)證明抗體對CD16的親和力依賴于Fc受體的特性例如CD16的多態(tài)性[2，3],以及依賴于Fc區(qū)域的特性，或者依賴于在與Fc受體的結(jié)合中起作用的位于免疫^l蛋白重鏈297位的天冬酖胺上的*^巖藻糖的水平[4，5]。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系可以是任何能夠分裂的細(xì)胞系，但M特別地選自CH0、YB2/0、SP2/0、SP2/0-AG14、IR983F、Namalwa人骨髄瘤細(xì)胞、PERC6細(xì)胞系、CH0細(xì)胞系(特別是CH0-K-1、CH0-UclO、CH0-Lecl、CH0-Lec13、CH0Pro-5、CH0dhfr-)、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、C0S-7、293-膽K、BHK、K6H6、NSO、SP2/0-Ag14及P3X63Ag8.653，這一列舉并不構(gòu)成^"形式的限制.有利地，該方法適于評價(jià)一個或多個純化步驟后獲得的抗體制劑Fc區(qū)域的效力和完整性，本發(fā)明的方法的另一個應(yīng)用為監(jiān)測置于變性條件下的單克隆或多克隆抗體制劑(特別為治療用抗體)的穩(wěn)定性。本發(fā)明的方法因此特別適用于監(jiān)測治療用制劑的時(shí)間穩(wěn)定性。事實(shí)上，申請人監(jiān)測了M在變性條件下幾個月的抗體制劑的活性，并顯示出活性在降低。因此，當(dāng)^在高溫下例如401C時(shí)，治療用制劑隨著時(shí)間推移喪失了其活性.另外，不同于包含有攜帶把抗原的細(xì)胞的測試，本發(fā)明的方法能夠區(qū)別抗體的哪一部分與活性喪失有關(guān)。顯然，當(dāng)變性時(shí)，是抗體的Fc區(qū)域失去了其對CD16的親和力(參見實(shí)施例4)。另外，該方法有利地適用于測量抗體Fc區(qū)域的功能性。為本發(fā)明之目的，"抗體Fc區(qū)域的功能性"是指該Fc區(qū)域通過與Fc受體(特別為CD16受體)的結(jié)合激活效應(yīng)細(xì)胞的能力。本發(fā)明的方法為高度可重復(fù)的(參見實(shí)施例2第5段)，由于不同序列和/或特異性的抗體的測量效率是相同的，因此4^發(fā)明方法可常^L應(yīng)用于分析抗體制劑的功能性，也可用于高細(xì)胞毒性抗體的篩選。有利地，該方法適用于評價(jià)由轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因哺乳動物產(chǎn)生的單克隆抗體的產(chǎn)量。通過實(shí)族根據(jù)本發(fā)明的方法，可對這樣產(chǎn)生的抗體的Fc區(qū)域激活Fc受體的能力進(jìn)行鑒定.有利地，該方法適用于選擇治療用的有效抗體。通過示例的方式，選出的抗體可使細(xì)胞因子釋放水平(例如IL-2)增加大于100%，或250%,優(yōu)選500X，更優(yōu)100094而選出，以上增加比率可針對無抗體的對照組或者針對給定抗體作為陰性參照物的對照組進(jìn)行觀察而得出.有利地，該方法適用于選擇巖藻糖含量小于6596，優(yōu)選小于40%的抗體組合物.事實(shí)上，已證明抗體制劑的活性依賴于在重鏈297位的IMt單元中的巖藻糖M,抗體由重紗輕,成，重紗輕^t過^^連接在^^.每>^在N-末端位點(diǎn)由抗體所針對的抗原的特異性可變區(qū)(或結(jié)構(gòu)域)組成；在C-末端由恒定區(qū)組成，恒定區(qū)由輕鏈的一個CL域和重鏈的多個結(jié)構(gòu)域(C&、CH2和CH3)構(gòu)成.可變區(qū)和重鏈的C仏結(jié)構(gòu)域以及輕鏈的CL結(jié)構(gòu)域聯(lián)合形成了抗體的Fab部分，該部分通過非常有彈性的^鏈區(qū)連接至Fc區(qū)域，這使得每個Fab可以結(jié)合乾抗原.該Fc區(qū)域?yàn)榭贵w效應(yīng)物屬性的媒介，使得抗體可接i^t應(yīng)物分子例如Fcyr受體(FcgammaR)。由兩個球狀結(jié)構(gòu)域CH2和CH3構(gòu)成的該Fc區(qū)域，在該兩條廷的每一^Ji存在與天冬跣胺297(Asn297)相結(jié)合的雙觸角型N-聚糖的情況下，在012結(jié)構(gòu)域的水平上^y^S^匕。這種類型的N-^t表現(xiàn)為如下的""^:形態(tài)(表現(xiàn)型"GO"，其它糖基可加于此)讓GlcNAc，甘露搪因此，絲本發(fā)明的抗體組合物中，"巖藻糖"是指由這些N-絲攜帶的巖藻糖。當(dāng)存在巖藻糖分子時(shí)，該分子與N-寡糖中的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)結(jié)合，該GlcNAc自身可結(jié)合Asn297。由每個抗體的兩條重鏈各自攜帶的一個N-IMt，可以攜帶或不攜帶一個巖藻糖分子.因此，根據(jù)是否沒有N-聚糖攜帶巖藻糖分子、只有一個N-IMt攜帶巖藻糖分子、或兩個N-M均攜帶巖藻糖分子，每個抗體可以分別包括0、1、2個巖藻糖分子，因此，"抗體組合物巖藻糖的含量小于65%"是指一種抗體組合物，該組合物中抗體的每^Ht基化位點(diǎn)(Asn297)攜帶的彩瞎結(jié)構(gòu)總量中，巖藻糖W所占的比例少于65%。申請人已經(jīng)證明，這種組合物具有特殊有利的ADCC活性。優(yōu)^ifc，選擇包括20-459i或者25-409i巖藻糖討的抗體組合物。在本發(fā)明的方法中顯示出功能活性與巖藻糖水平之間的量化關(guān)系，即在抗體組合物(制劑)中的巖藻糖水平減少時(shí)，對應(yīng)于CD16的抗體的功能活性增加。本發(fā)明的另一目的涉及一種單克隆抗體組合物的制備方法，包含以下步驟a)從雜交瘤、異種雜交瘤、或者^一種或多種表達(dá)所述抗體的載體轉(zhuǎn)染的伶阿動物、植物或人的細(xì)胞系中，獲得抗體；b)通過F(ab，)2抗-IgG片段聚集步騍a)中獲得的抗體；c)將步驟b)中獲得的抗體加A^JI';^物，該混合物包括-包含表達(dá)CD16的細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞，一乙酸肉豆蔻耽佛波酯(PMA)d)測量表達(dá)CD16的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一種細(xì)胞因子的量；e)針對無抗體的對照組，或者針對以給定抗體作為陰性參照物的對照組，按照被測量的細(xì)胞因子量的增加大于0.5、1、2、5、10、100或500倍篩選抗體組合物。有利地，包括表達(dá)CD16的細(xì)胞的M細(xì)胞為JurkatCD16細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，至少一種細(xì)胞因子的量的測量通過對這些細(xì)胞因子的mRM進(jìn)行分析而實(shí)現(xiàn)。這些mRM的量與相應(yīng)細(xì)胞因子的表fcjc平相關(guān)，其顯示出效應(yīng)細(xì)胞激活的水平。例如，對選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、MCP-l、TNFalpha(TNFa)或IFNga咖a(IFNy)的至少一種細(xì)胞因子進(jìn)行定量測量，這一列舉并不構(gòu)成伶時(shí)形式的限制。有利地，細(xì)J!&^應(yīng)的測量為白細(xì)胞介素IL-2的定量測量。分泌的白細(xì)胞介素(例如IL-2)的水平與ADCC型反應(yīng)活'1^目關(guān).事實(shí)上，在效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌與效應(yīng)細(xì)胞的CD16介導(dǎo)的ADCC反應(yīng)活性之間存在著很強(qiáng)的相關(guān)性(文獻(xiàn)FR0211416)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，細(xì)J!&^應(yīng)的測量為對鈣內(nèi)流、磷酸化、轉(zhuǎn)錄因子或凋亡的測量.這些^的增加與效應(yīng)細(xì)胞的激活相關(guān)，顯示出抗體激活效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體的能力。有利地，由表達(dá)CD16的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一種細(xì)胞因子的量的測量，為對表達(dá)CD16的細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2的量的測量。本發(fā)明的另一主題涉及一種用于實(shí)施測量治療用抗體活性的生物測試的試劑盒，該試劑盒包括為實(shí)施一種前述方法而必需的要素，且特別包括(l)聚集所述治療用抗體的手段，(2)能夠表達(dá)Fc受體的細(xì)胞，(3)當(dāng)所述細(xì)胞的Fc受體^L/斤述抗體的Fc區(qū)域激活時(shí)，測量能夠表達(dá)Fc受體的所述細(xì)胞的反應(yīng)的手段，和(4)實(shí)施根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法所必需的其它要素.用于實(shí)施測量治療用抗體活性的生物測試的試劑盒，包括(l)聚集所述治療用抗體的手段，(2)能夠表達(dá)Fc受體的細(xì)胞，(3)當(dāng)所述細(xì)胞的Fc受^f^J^斤述抗體的Fc區(qū)域激活時(shí)，測量所述能夠表達(dá)Fc受體的細(xì)胞的反應(yīng)的手段，和(4)實(shí)施根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法所必需的其它要素.在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在所述試劑盒內(nèi)含有的測量所述細(xì)胞的反應(yīng)的手段為定量測量由所述細(xì)胞產(chǎn)生的至少一種細(xì)胞因子的手段。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒中定量測量至少一種細(xì)胞因子的手段為分析所述細(xì)胞因子的mRNA的手段.在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述試劑盒中測量所述細(xì)Jffe^應(yīng)的手段為測量鈣內(nèi)流、磷酸化、轉(zhuǎn)舉因子或凋亡的手段。本發(fā)明的其它方面及優(yōu)點(diǎn)在下面的實(shí)施例中進(jìn)行說明，其必須^L認(rèn)為是示例性的，并不限制^^發(fā)明的范圍。圖1:(A)由5個^N^體的平均熒光強(qiáng)度的測量值確定的校準(zhǔn)曲線，(B)由抗-CD16標(biāo)記物的FACS分析獲得的JCD16+Val群體的CD16表達(dá)特征圖，圖2:聚集的抗-D抗體(批號C029-025)劑量->^應(yīng)曲線。曲線為JCD16+Phe細(xì)胞的特異性曲線.加粗的垂直線劃定了用于以后的逸瞼的濃度范圍(0.625-1Opg/ml)。圖3:JCD16+Phe細(xì)胞的IL-2分泌動力學(xué)圖。圖4:抗體巖藻糖水平對其活性的影響.U)在存在靶細(xì)胞的測試中，抗-Gpl20HIV抗體(100&巖藻糖)、AD1(10(^巖藻糖)、T125010(81%巖藻糖)、R270(64X巖藻糖)、R297(409i巖藻糖)及R297(2594巖藻糖)抗體活性的測試，(B)在無靶細(xì)胞的測試中，抗"Gpl20HIV抗體(100%巖藻糖)、AD1(100!4巖藻糖)、T125CH0(81X巖藻糖)、R270(6496巖藻糖)、R297(404巖藻糖)、C029-025(33X巖藻糖)及R297(25X巖藻糖)抗體活性的測試。圖5:通過每月對其活性的測量，對批號05-081在40"C下的穩(wěn)定性的監(jiān)測。圖6:對應(yīng)于其在10ng/ml和5ng/ml濃度下激活CD16的能力，通過ELISA測試測得的溫度對抗-D單克隆抗體活性的影響。圖7:對應(yīng)于其在10jig/ml和5ng/ml濃度下激活CD16的能力，通過定量RT-PCR測試測得的溫度對抗-D單克隆抗體活性的影響.實(shí)施例1.細(xì)鵬養(yǎng)1.1細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞系克隆E6-1(No.ATCCTIB-152)，由A.Weiss在1984年保藏于ATCC[6]。該克隆E6-1由野生型Jurkat細(xì)胞系獲得。它由Schneider等[7]于1977年從一名患有急性淋巴細(xì)胞白血病的14歲兒童的外周血中分離出來。這種表達(dá)T細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞系在受到兩種不同的激活信號刺激時(shí)能夠產(chǎn)生白細(xì)胞介素2(IL-2)。然而，所分泌的IL-2水平會根據(jù)細(xì)胞系的來源及處理?xiàng)l件而變化.這是已經(jīng)轉(zhuǎn)染不同來源的Jurkat克隆以使其在膜水平表達(dá)FcYRHIa受體的原因.細(xì)胞系通過轉(zhuǎn)染編碼人嵌合FcyRina(與y鏈的跨膜結(jié)構(gòu)域;SJfc內(nèi)結(jié)構(gòu)^9聯(lián)合的CD16JJ^卜結(jié)構(gòu)域)與新霉素篩逸基因的表達(dá)栽體而獲得。由于這些細(xì)J^i^158位具有苯丙氨酸的人CD16，因此將它們稱作JCD16+Phe。1.2培養(yǎng)絲傳代培養(yǎng)基將JCD16+Phe細(xì)胞置于下述培養(yǎng)基中培養(yǎng)IMDM培養(yǎng)基(Iscove，sModifiedDulbecco，sMedium)+4mML-;&^跣胺+25mMHEPES緩沖液(Gibco，Invitrogen)，并添加經(jīng)Y射線照射并去凈傳的10%FCS條牛血清，F(xiàn)oetalCalfSerum)(Invitrogen)和0.5mg/ml的新霉素類似物(G418硫酸鹽)(Pr咖ega).該細(xì)胞系以每周兩次傳代培養(yǎng)的i^維持培養(yǎng)，接種率為0.2xl()6細(xì)胞/inl。2流式細(xì)胞術(shù)不同的標(biāo)"K^EPICSXL細(xì)JJfc^(BeckmanCoulter)中進(jìn)行分析'2.1JCD16+Phe細(xì)胞系的表型分析該表型分析涉及不同膜標(biāo)記物的分析，所iiM標(biāo)記物為CD45(淋巴細(xì)胞標(biāo)記物)、CD19(B淋巴細(xì)胞的特異性標(biāo)記物)、CD2、CD3、CD4及CD8(T淋巴細(xì)胞的特異性標(biāo)記物)、CD58(CD2的配體)以及IL-2受體不同的鏈(CD25或IL-2Rot、CD122或IL-2RP、以及CD132或IL-2Ry)。在100H1的IXPBS(褲酸緩沖必中對106細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記.其條件如下一10nl抗"CD2FITC(2-異疏氰酸熒光素，CoulterClone,Beck腿nCoulter)+10n1抗-CD3RD1(R-藻紅蛋白，CoulterClone,BeckmanCoulter)+lOpl抗-CD19ECD(R-藻紅蛋白/TexasRed混合染料(tandemdye)，CoulterClone,BeckmanCoulter)+10pl抗"CD16PC5(R-藻紅蛋白/花青素5';S^染料，IOTest，BeckmanCoulter)'-lOjnl抗-CD45FITC(CoulterClone,Beck咖nCoulter)+10jal抗-CD3RD1(CoulterClone,BeckmanCoulter)+10nl抗-CD4BCD(CoulterClone,BeckmanCoulter)+lOpl抗"CD8PC5(CoulterClone,BeckmanCoulter)。一10pl抗-CD58PC5(IOTest，CoulterClone).-5yl抗-CD122FITC(CoulterClone,BeckmanCoulter)+IOmI抗-CD132PE(藻紅蛋白，BDPhar邁igen)+10p1抗-CD25PC5(IOTest,CoulterClone)。同上述四個標(biāo)"iM目并行實(shí)施同型對照，并分別相應(yīng)為-10|i1IgGl-FITC(CoulterClone,BeckmanCoulter)+10jj1IgGl-RDl(CoulterClone,BeckmanCoulter)+lOplIgG2b-ECD(CoulterClone,BeckmanCoulter)+10p1IgGl-PC5(IOTest，BeckmanCoulter)。-10n1IgGl-FITC(CoulterClone,BeckmanCoulter)+10|i1IgGl—RD1(CoulterClone,BeckmanCoulter)+lOplIgGl-CD4BCD(CoulterClone,BeckmanCoulter)+10p1IgG卜PC5(CoulterClone,BeckmanCoulter)。一10plIgG2a—PC5(IOTest，CoulterClone)。-5p1IgGl-FITC(CoulterClone,BeckmanCoulter)+10n1IgG卜PE(BDPharmigen)+10pi1IgG2a-PC5(IOTest，CoulterClone)。環(huán)境溫度下，將細(xì)胞與各種不同的單克隆抗體在黑暗中孵育30分鐘。將細(xì)胞在1XPBS中洗滌后，在1200rpm離心5分鐘，用細(xì)胞術(shù)直接分析標(biāo)記，2.2CD16位點(diǎn)數(shù)量的確定在細(xì)絲面表達(dá)的FcyRffla受錄量儲QIFIKIT(DakoCytomation)技^:#^估.該技術(shù)需要提前確定占據(jù)這些細(xì)J!fc4面的所有抗原位點(diǎn)所必需的抗-CD160L隆3G8，與熒光素偶聯(lián)的抗"CD16IgGl，I咖unotech)的飽和劑量。將該細(xì)胞(0.25x10fi/100ji1生理鹽水)與增加劑量的抗~CD163G8在環(huán)境溫度下孵育30分鐘。在生理鹽水中洗滌后在1200rpm離心5分鐘，然后將這些細(xì)胞與50n1稀釋至1/20的PE標(biāo)記的抗小鼠IgGF(ab，)2(H+L)(BeckmanCoulter)在黑暗中孵育30分鐘.在孵育結(jié)束后，洗滌這些細(xì)胞并通過FACS(fluorescence-activatedcellsorting,熒光活化細(xì)胞分選)直M析，根據(jù)試劑盒(No.K0078)中提供的實(shí)驗(yàn)方案，對2.5xl()S個細(xì)胞進(jìn)行CD16位點(diǎn)數(shù)量的測定。將這些細(xì)胞與500ng所研究的抗體在環(huán)境溫度下孵育30分鐘。洗滌及離心(1200rpm，5分鐘)后，將這些細(xì)胞與100nl稀釋至1/50的FITC偶聯(lián)的抗小鼠IgGF(ab，)2(Qifikit)在環(huán)境溫度下黑暗中孵育30分鐘。然后洗滌這些細(xì)胞并用FACS直接分析。3.Jurkat細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的測試3.1存在攜帶特異性抗原的紅細(xì)胞的測試3.1.1測逸陣品的制備抗-D抗體樣品按照八個濃度數(shù)值進(jìn)行測試，所述濃度為3.125ng/ml、6.25ng/ml、9.4ng/ml、12.5ng/ml、18.75ng/ml、25ng/ml、37.5ng/ml和50ng/ml。每種濃度通過將樣品稀釋于IMDM+5%去4傳FCS而獲得，3.1.2乾細(xì)胞的制備靶細(xì)胞為從，獲得的獼猴D+紅細(xì)胞，優(yōu)選為0+。將它們用木;^蛋白酶(Bio-Rad)進(jìn)行處理，將其按體積/體積加入到^1微球，并在37"孵育IO分鐘。該反應(yīng)通過加入大量的生理鹽水(O.99iNaCl，Ecotainer，BBRA1M)而停止，然后將細(xì)胞用0.9%的NaCl洗滌三次，前兩次洗滌后分別在3000rpm離心5分沖，最后一次洗滌后離心10分沖。然后該球狀#^#釋于IMDM+5倍#傳FCS中，以獲得濃度為8x10fi細(xì)胞/ml(0.08%)的細(xì)胞懸液。3.1.3PMA'溶液的制備40ng/ml濃度的PMA溶液(10pg/ml，Sig咖)通狄I腿+5%FCS中稀釋至1/250而制備.3.1.4效:應(yīng)細(xì)胞的制備將在測試前經(jīng)過48-72小時(shí)傳代培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞在Malassez玻片上計(jì)數(shù)，以確定^^樣品的細(xì)胞懸液體積內(nèi)具有107個可用細(xì)胞(一個微孔平板所必需的數(shù)量)。將該體積的細(xì)胞懸液在1200rpm離心10分鐘.然后將所得的細(xì)lfeW以2xl(^細(xì)胞/ml的濃度重新懸浮在DM+594FCS之中.重新進(jìn)行計(jì)數(shù)以確認(rèn)懸液的濃度，如果需要的話則通過加入1說+5沐FCS來調(diào)準(zhǔn)。3.1.5實(shí)施測試在有96個U形孔的平板的每個孔中置入如下成份-50[i1待測試的抗-D抗體，—50nl絲懸液(即每50pl4xl()5紅細(xì)胞)，—50pl細(xì)胞懸液(即每50pl4xl()5細(xì)胞)，-50jilPMA(即每50nl2ng)。向每個平板均加入抗-D參照物溶液以及對應(yīng)于抗-D多克隆抗體(Rhophylac300TM，Biotest)的對照樣品。這些孔通過攪拌混勻。將該平板在37"C孵育過夜。次日，通過在125g離心1^使細(xì)胞沉降'除去上清液，通過ELISA分析確定IL-2的濃度。3.2無乾抗原的測試將所研究的抗^L據(jù)3.1.1章節(jié)中確定的八個濃度數(shù)值預(yù)先進(jìn)行測試.在本測試中，用特異性的F(ab，)2抗-IgG片段(1.3mg/ml，JacksonI皿nuno-ResearchLaboratories)代替紅細(xì)胞。將上述抗體片段也在IMDM+5XFCS中稀釋為八個濃度，抗-D與F(ab，)2抗-IgG抗體在1/1.5的比率下進(jìn)行研究.PMA溶液制備為10ng/ml的濃度.Jurkat細(xì)胞以2.1.4章節(jié)限定的濃度稀釋于IMDM+594FCS中。在有96個U形孔的平板中的每個孔中置入如下成份-50n1待測試的抗-D抗體，-50^1F(ab，)2抗-IgG片段，-50nl細(xì)胞懸液，-50n1PMA(即每50|j10.5ng).這些孔通過攪拌混勻，將該平板在37"C孵育過夜.次日，通過在125g離心1M使細(xì)胞沉降.除去上清液，通過ELISA分析或者對編碼IL-2的信使RNA(mRNA)的分析，來確定IL-2的濃度.3.3通過ELISA技術(shù)分析的細(xì)胞上清液IL-2劑量3.3.1材料和方法分泌的IL-2的量根據(jù)Duoset人IL-2試劑盒(DY202，RftDSystems)的操作方法進(jìn)行分析.##獲抗體分配在微孔平板的各個孔中.在牛白蛋白溶液中#后，待分析的上清液以及IL-2的參照溶液以不同的稀釋濃度進(jìn)行應(yīng)用.然后加入生物素化人抗-IL-2抗體，隨b入鏈親和素it^化物酶HRP溶液.在加AJ^物(四甲^^:胺)后，產(chǎn)生藍(lán)色的顯色。用硫酸(H2S04)將M終止后，經(jīng)在450nm波長下對平板讀數(shù)而確定每個孔的光密度。每個孔的IL-2濃度應(yīng)用Biolise軟件進(jìn)行計(jì)算，該軟件確定了IL-2數(shù)值的回歸曲線([IL-2]=a[抗體〗2+b[抗體]+c)，并且考慮到每個孔中樣品的稀釋倍數(shù)。3.3.2結(jié)果的解釋由ELISA分析確定的IL-2濃度能夠確定每個被測試的抗-D抗體的活性.這用如下方式計(jì)算從參照物抗體開始，通過^^J被測量的IL-2濃>￡作為抗體濃度范圍的函數(shù)，建立二度方程曲線。對于每個應(yīng)用的樣品濃度，通過該曲線的二度方程的方式計(jì)算出等價(jià)參照物抗-D的濃度?？紤]到所研究抗體的稀釋度，每個等價(jià)抗-D值采用的理論濃度為有靶細(xì)胞的測試為50ng/ml，無乾細(xì)胞的測試為10jig/ml。然后計(jì)算每個樣品的平均值。為確定樣品的活性百分比，人為地將參照物規(guī)定為IOOX活性。然后只需要計(jì)算如下關(guān)系重新計(jì)算的樣品平均濃度/重新計(jì)算的參照物平均濃度因此，如果未知抗-D的平均活性百分?jǐn)?shù)小于lOO，這意味著該抗體的活性低于參照物抗體的活性。另一方面，如果活性百分?jǐn)?shù)大于100，這意味著所研究的抗-D具有大于參照物的活性。3.4通過分析編碼IL-2的mRNA分析IL-2該技術(shù)依賴于對編碼IL-2的信使RNA(mRNA)的分析。首先，從細(xì)胞提取總RNA。將RNA利用一種叫做逆轉(zhuǎn)錄酶的酶轉(zhuǎn)換為互補(bǔ)DNA(cDNA)。與IL-2相對應(yīng)的該基因序列經(jīng)定量多^SmiU^(PCR)通過特異性引物被檢測。為了互相對比樣品，將該分析標(biāo)準(zhǔn)化是必需的。itit過同時(shí)分析編碼W基因或結(jié)構(gòu)基因的mRNA來實(shí)現(xiàn)，所iii^基罔或結(jié)構(gòu)基因的表i^jc平在所有細(xì)胞中都是相同的，而與培養(yǎng)^UN激條件無關(guān).在這些測試中選擇的^t基因?yàn)閎-肌動蛋白，它是細(xì)胞的細(xì)胞骨架的一種組成成分，細(xì)胞被激活的程M高，IL-2cDNA/b-肌動蛋白的比率越高。編碼IL-2的mRM為暫時(shí)的，因此，在實(shí)驗(yàn)條件下刺激后測定了基因表達(dá)最高峰的時(shí)間(4-6小時(shí)).3.4.1材#方法1)細(xì)胞培養(yǎng)該測試在以下條件下實(shí)施-200y1濃度為107細(xì)胞/ml的JURKATCD16+細(xì)胞懸液；-抗-D單克隆抗體mAb與F(ab，)2:-200ji1濃度為10ng/ml的抗-D單克隆抗體rnAb及200jLi1濃度為15ng/ml的F(ab，h特異性抗體片段(JacksonI咖imo-Research)j或-200n1濃度為5ug/ml的抗-D單克隆抗體mAb及200n1濃度為7.5ng/ml的F(ab，)2特異性抗體片段(JacksonI咖uno-Research);-200*i1濃度為40ng/ml的PMA。所有這些使用的溶液均制備于DM+5%FCS中。該細(xì)胞隨后在受控空氣條件下(95%空氣+5%0)2)，于371C在醉育器中孵育。2)總RNA的提取使用兩種商用試劑盒提取總MA:(QIAGEN):-QIAshredder試劑盒j一RNeasyProtect^:型試劑盒；然后被提取的RNA在260咖波長下通過分光ifeJL計(jì)分析。3)逆轉(zhuǎn)錄步驟cDM通過在421C孵育1小時(shí)獲得-lHg線性RNA(^熱至65C，隨后立即^HP到4TC);-寡聚dT引物；-dATP,dCTP，dGTP和dTTP;-二琉蘇糖醇(DTT);-RNA酶抑制物；—逆轉(zhuǎn)錄酶。4)PCR步驟PCR步l^ii過使用下述的特異性引物進(jìn)行對于IL-2IL-2Hl:AACAGTGCACCTACTTCAAGIL-2H2:GTTGAGATGATGCTTTGACAb-肌動蛋白BACTHI:GGGTCAGAAGGATTCCTATGBACTH2:GGTCTCAAACATGATCTGGG定量PCR通過佳^A卯liedBiosystems7300儀器;^使用PowerSyberGreenmastermix試劑盒(AppliedBiosystems)來實(shí)現(xiàn)。用于兩個引物對的程序?yàn)?951c下1個去雜交循環(huán)10-40個循環(huán)-95"下去雜交10秒鐘；-60t:下"退火"(引物配對)15秒；-72"C下延伸60秒。在PCR結(jié)W，擴(kuò)增的產(chǎn)物緩慢變性，并逐漸確定游離曲線，以;M"擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的用TC表示的Tm僻鏈溫JO。3.4.2結(jié)果對比兩種不同濃度(5pg/ml及10mg/ml)的抗-DmAb制劑，一種制劑儲存在5"，而另一種在40TC絲三個月。為了定量RT-PCR技術(shù)的需要，樣品在細(xì)胞測試培養(yǎng)開始后4小時(shí)提取亂為了通過ELISA分析培養(yǎng)物上清液中IL-2的技術(shù)的需要，樣品在培養(yǎng)開始后16小時(shí)進(jìn)行分析，1)ELISA結(jié)果在測試開始16小時(shí)后，上清液中的IL-2濃度^I一種分析試劑盒(RftDSystems)進(jìn)行定量測量。獲得的結(jié)果顯示在圖6中.2)定量RT-PCR結(jié)果在測試開始4小時(shí)后，JurkatCD16+細(xì)胞中IL-2基因的表達(dá)通過實(shí)時(shí)RT-PCR進(jìn)fr^估，該結(jié)果已經(jīng)相對于b肌動蛋白遍在基因進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。該結(jié)果顯示在圖7中。3.4.3結(jié)論在被刺激的JurkatCD16+細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IL-2濃度的直#^析方法，和通過定量RT-PCR對其基因表達(dá)的分析方法之間，具有相關(guān)性，至于ELISA測試，IL-2基因表達(dá)的強(qiáng)度依賴于被研究的mAb的性質(zhì)及其濃度.該技術(shù)因此能夠用于研究mAb的Fc區(qū)域和CD16受體的相互作用.實(shí)施例l1、細(xì)胞系的鑒定1.1細(xì)胞系的基因^在本測試開發(fā)前，用Q-PCR(A卯lied7300)通過等位基因分型(allelicdiscrimination)對每個細(xì)胞系進(jìn)行了基因分型。該基因分型通過RT-PCR祐iiL實(shí)。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>通過Q-PCR(DM)和RT-PCR(RM)分析細(xì)胞系的基因型。JurkatCD16+細(xì)胞系在其Jgt^面不表達(dá)FcyRffl。被稱作Phe的JurkatCD16+細(xì)胞系表達(dá)T(Phe)基因型。1.2細(xì)胞系的表型通過FACS標(biāo)記分析膜標(biāo)記物能夠獲得下列結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>經(jīng)細(xì)胞術(shù)分析兩種轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞系的膜標(biāo)記物，因此，細(xì)胞系具有如下表型CD45+、CD2+、CD3+、CD4+、CD16+、CD58+和CD132+,1.3CD16位點(diǎn)數(shù)量的確定本實(shí)驗(yàn)的目的是通過由細(xì)胞術(shù)分析的間接標(biāo)記定量CD16抗原位點(diǎn)的數(shù)量.該技術(shù)基于使用五個^^的10nm直徑的^Ml，所述一用確定的增加量(103到10fi的抗體結(jié)合能力或ABC)的單克隆抗體(小鼠抗-人CD5)包被。使用這些不同的幹本可以構(gòu)建平均熒光強(qiáng)度(MFI)與抗體結(jié)合能力(ABC)的相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線(calibrationline)。這些細(xì)胞用相應(yīng)的一抗(抗"CD16)飽和，用飽和的標(biāo)記二抗進(jìn)行顯示。當(dāng)使用上述條件時(shí)，結(jié)合的一抗數(shù)量相當(dāng)于位于細(xì)J^面的抗原位點(diǎn)數(shù)量。結(jié)果，熒光強(qiáng)度與結(jié)合至細(xì)胞的一抗數(shù)量相關(guān).細(xì)胞的ABC通過校準(zhǔn)曲線確定。下表為測定的所研究細(xì)胞系CD16位點(diǎn)的數(shù)量的概括表(研究在若千次傳代培養(yǎng)后進(jìn)行)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>從庫中獲得的小瓶解凍后，每個細(xì)胞系在選棒的培養(yǎng)基中通過若干次傳代培養(yǎng)進(jìn)行監(jiān)測，以證實(shí)CD16表達(dá)的^。因此，注意到經(jīng)過數(shù)次傳^，CD16的表達(dá)被保持，而_@^一次傳代培養(yǎng)到另一傳代培養(yǎng)時(shí)，在相同的培養(yǎng)條件下只有微小變化.另外，選擇壓力和其結(jié)果傾向于顯示出具有高表達(dá)潛力的克隆選擇正在發(fā)生。另外，通過確定端值幹沐(下端10X;sui端10%)位點(diǎn)的數(shù)量，該技術(shù)能夠精確分析細(xì)胞表面CD16表達(dá)的異質(zhì)性.實(shí)施例2:CD16激活測試1、測試的特異性測試的特異性證實(shí)如下在Jurkat細(xì)胞IL-2分泌的測試中引入若千對照，以確認(rèn)細(xì)胞激活機(jī)制.由分析試劑盒提供的IL-2參照劑量的^一點(diǎn)確定了閾值檢出限為15pg/ml。低于這個閾值，細(xì)胞的IL-2分泌被認(rèn)為是不可檢出的，下表為引入IL-2產(chǎn)生測試的每一對照組經(jīng)過n次實(shí)驗(yàn)的IL-2平均水平與標(biāo)準(zhǔn)差的一覽表(<LT=低于15pg/ml的極限閾值)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>對僅有細(xì)胞的培養(yǎng)上清液的分析能夠確定細(xì)胞的基礎(chǔ)分泌水平，發(fā)現(xiàn)該水平是檢測不到的.該對照能夠證實(shí)在缺少伶阿刺激時(shí)該細(xì)胞不分泌IL-2,另外，這些對照能夠確認(rèn)需要兩種刺激物(PMA和抗-D/F(ab，)2復(fù))導(dǎo)致該細(xì)胞的激活，事實(shí)上，當(dāng)缺少這兩種刺激物之一(對照組PMA+F(ab，)2或F(ab，)2+抗-D)時(shí)，IL-2的分泌很少，甚至為零。相似地，CD16的激活需要抗體的聚集，例如在缺少F(ab，)2時(shí)可獲得IL-2的分泌，但是卻大大低于PMA和抗-D/F(ab，)2聚集^在時(shí)所獲得的IL-2分泌。另外，在每個實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)通過^PMA和離子霉素可達(dá)到最大激活。這些結(jié)果因此能夠證明需要對JCD16+細(xì)胞雙重刺激以獲得IL-2的分泌。2、劑量^t應(yīng)和抗體濃度范圍的確定為了確定抗-D濃度的最佳范圍用于以后的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行了劑量-反應(yīng)測試(由以下兩個曲線^)。為此目的，在^介質(zhì)中測試了濃度范圍為1-100yg/ml的R297抗體(批號c029-025).該實(shí)驗(yàn)一式五^M:行實(shí)施(參見圖2).對于低抗-D濃度，剌激后24小時(shí)上清液中的IL-2濃度曲線同在本測試中加入的抗-D濃度成正比，對于高抗-D濃度，曲線達(dá)到平臺區(qū)，3、激活動力學(xué)^育時(shí)間的確定為了確定最佳孵育時(shí)間，對兩個細(xì)胞系的IL-2分泌進(jìn)行了動力學(xué)研究。為此目的，該細(xì)胞由確定的抗-D濃度范圍(0.625-10ng/ml，批號C029-025)刺激8、24、32、48、56或72小時(shí)。對相應(yīng)于每個抗-D濃度、每次孵育的時(shí)間的上清液中的IL-2濃度進(jìn)行分析，從而能夠獲得圖3中的直線。該研究能夠顯示經(jīng)過8小時(shí)的刺M，細(xì)胞/^分泌非常少的IL-2。從24小時(shí)開始，IL-2水平達(dá)到最大值。經(jīng)過24小時(shí)的刺激后，該曲線甚至傾向于互相重疊.該最佳孵育持續(xù)時(shí)間固定在24小時(shí)以限制測試時(shí)間。4、測試中細(xì)胞濃度的滋:應(yīng)在生物測試中，將細(xì)胞濃度標(biāo)準(zhǔn)化是相對困難的。^9f究的目的g:證實(shí)給定樣品的活性百分比是否依賴于細(xì)胞濃度.為此目的，在三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，抗-D單克隆抗體樣品(批號R297No.05-081，T。)在五個不同的細(xì)胞濃度((:產(chǎn)105細(xì)胞/孔，C產(chǎn)2.5x105細(xì)胞/孔，C產(chǎn)5x105細(xì)胞/孔，C產(chǎn)7.5x105細(xì)胞/:jU5LC產(chǎn)106細(xì)胞/孔)下進(jìn)行測試，然后通過與參照物抗-D(批號C029-025)對比來確定其活性百分比，人為地將參照物的活性百分比設(shè)定為1009i,在三次實(shí)驗(yàn)中對應(yīng)每個濃度獲得的結(jié)^E示在下表中。<table>complextableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>對于JurkatCD16+Phe細(xì)胞，包括五個細(xì)胞濃度M的三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，被測試樣品R297No.05-081的活性百分比。在該研究中變異系數(shù)(CV)的分析顯示，無論所研究的細(xì)胞濃度如何，該三次實(shí)驗(yàn)得出的樣品No.05-081的活'帥近。5.測試的可重復(fù)性當(dāng)賴細(xì)胞甚至是細(xì)胞系進(jìn)行測試時(shí)，會引AA物差異性。因此，為將測試標(biāo)準(zhǔn)化之目的，保證測試的良好的可重復(fù)性是必要的.當(dāng)該測"^L用于"^純化方法對抗體活性的影響時(shí)，以及當(dāng)ii行治療用制劑的時(shí)間穩(wěn)定性研究時(shí)，這點(diǎn)更為必要，因此，在若干次實(shí)驗(yàn)中測試了樣品(批號C029-025)的活性。其活性百分比相對于與相同樣品對應(yīng)的參照物進(jìn)行計(jì)算，參照物的活,1^為地設(shè)定為畫。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>重復(fù)性測試:在n次實(shí)驗(yàn)中，樣品(批號C029-025)活性百分比的測定。對于生物測試，15-209i的最大變異系!8W于有效的測試而言是可以接受的。因此就我們的測試來說，獲得的CV(JurkatCD16+Phe為5%)在接受水平之下。因此，本測試可以作為常規(guī)測試用于監(jiān)測樣品的穩(wěn)定性，以及用于^￡樣品在其純化方法的#中的活性水平.實(shí)施例3:CD16相關(guān)抗體細(xì)胞泰性的#在文獻(xiàn)中已經(jīng)證明，位于免疫球蛋白重鏈層面的寡糖的巖藻糖基化水平會影響抗體的效應(yīng)物屬性。事實(shí)上，低巖藻糖水平會增加抗體與CD16結(jié)合的能力[2，6].另外，該機(jī)制與CD16的多態(tài)性完全無關(guān)[2，7],因此在本研究中，我們關(guān)注的^藻糖水平對抗體功能活性的影響.LFB具有不同的單克隆抗體制劑，并已經(jīng)鑒定了它們的位于多IMt鏈上的巖藻糖水平.1009&巖藻糖化的抗體對應(yīng)于兩條多IMt鏈的重鏈297位已經(jīng)完全巖藻糖化的免疫球蛋白。在存在靶細(xì)胞的測試以及無靶細(xì)胞的測試中，研究了具有不同巖藻糖水平的不同樣品—含有IOOX巖藻糖的抗-HIVGpl20，—含有IOOX巖藻糖的AD1(抗一D)，—含有81X巖藻糖的T125CHO(CHO細(xì)胞產(chǎn)生的抗-D),—含有64X巖藻糖的R270(抗-D)，-含有40X巖藻糖的R297，—含有33X巖藻糖的C029-025，—含有25%巖藻糖的R297。圖4A和4B分別^fJt4^著在測試中有靶細(xì)JI^在的情況下獲得的結(jié)果(4A)，以及無靶細(xì)胞但含有用F(ab，)2聚集的抗體制劑的情況下所得的結(jié)果。無"^;1何種用于確定樣品活性的測試，當(dāng)巖藻糖水平增加時(shí)，注意到了CD16相關(guān)抗體功能活性的減少.含有1009i巖藻糖水平的抗體例如ADl，甚至完db^乏對于該受體的活性。該研究能夠確認(rèn)巖藻糖水平會影響#與CD16的結(jié)合。在重鏈297位天冬,^#層面完全巖藻糖化的免疫球蛋白阻止了該抗體與CD16的所有相互作用，因此不會導(dǎo)致其激活。實(shí)施例4:監(jiān)測單克隆抗M定性的研究本測試的另一個應(yīng)用是方便地監(jiān)測置于變性條件下的治療性制劑的穩(wěn)定性(參見圖5)。通it^E每月測量樣品的活性，該監(jiān)測經(jīng)過數(shù)月完成。通過將樣品No.05-081置于401C來進(jìn)行這一研究。在有靶細(xì)胞的測試以及無靶細(xì)胞的測試(也稱為通用測試)中，在不同的時(shí)間(TO，T+l月和T+2月)進(jìn)行測試其活性。通過^參照抗M定100%活性(具有靶細(xì)胞的測試中的參照為研究批號R297的抗體，通用測試中的參照為試驗(yàn)批號C029-025的抗體)。該研究能夠探測樣品暴露在高溫下時(shí)的活性喪失，該活性喪失與樣品在高溫中暴露的持續(xù)時(shí)間成正比。該研究也顯示兩種測試可獲得相似結(jié)果.因此可將這兩種測試用于監(jiān)測治療性制劑的時(shí)間穩(wěn)定性。實(shí)施例5:經(jīng)熱聚集的抗體或經(jīng)針對F(ab，)2IgG片段的F(ab，)2片段聚集的抗體特異性產(chǎn)生的IL-2的比較研究經(jīng)熱聚集的(63TC下20分鐘)或者經(jīng)針對F(ab，)2IgG片段的F(ab，)2片段聚集的抗-D單克隆抗體制劑，對經(jīng)過基因重組以表達(dá)CD16的Jurkat細(xì)胞系的IL-2產(chǎn)生的劑量效應(yīng)。在對上清液中的IL-2進(jìn)行定量測試之前，先將聚集的單克隆抗體與JurkatCD16+細(xì)胞在37X:醉育16小時(shí)。結(jié)果在下表l給出:<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表l表1顯示，無^^何種聚集單克隆抗體的方法，上清液中細(xì)胞分泌的IL-2量與測試中使用的聚集的單克隆抗體的濃度之間均存在劑量/效應(yīng)關(guān)系。然而，可觀察到經(jīng)熱聚集的單克隆抗體所導(dǎo)致的IL-2分泌量，低于由IgG抗-F(ab，)2聚集的該抗體所導(dǎo)致的IL-2分泌量。參考文獻(xiàn)1.VanMirreetal.(2004).MonomericIgGinintravenousIgpr6parationsisafunctionalantiagonistofFcgRIIandFcg腿b.ThejournalofImmunologyj332:3392.FaragS.S.，F(xiàn)linnI.W.，ModaliR.，LehmanT.A.，YoungD.，andByrdJ.C.(2004)Blood,vol.103，n。4，1472-1474.3.WuJ.，EdbergJ.C，RedechaP.B.，BansalV.,GuyreP.M.,ColemanK.，SalmonJ.E.，andKimberlyR.P.(1997)J.Clin.Invest.Vol.100，n°5，1059-1070.4.ShieldsR.L.，LaiJ.，KeckR.，O，ConnellL:Y.，HongK,，MengY.G.，WeikertS.H.A.，andPrestaL.G.(2002)J.Biol.Chenu，vol.277，n。30，26733-26740.5.NiwaR.，HatanakaS.，Shoji-HosakaE.，SakuradaM.，KobayashiY.，-UeharaA.，YokoiH.，NakamuraK.，andShitaraK.(2004)，ClinicalCancerResearch,10，6248-6255.6.WeissA.，WiskocilR.L,，andStoboJ.D.(1984)J.Immunol.,vol.133，n°1，123-128,7.SchneiderU.，SchwenkH.U.,andBornka咖G.Q977)Int.J.Cancer.,vol.19,n°5，621—626.權(quán)利要求1.測量抗體制劑激活Fc受體的能力的方法，包括:a)將所述抗體彼此聚集，b)將表達(dá)Fc受體的細(xì)胞與所述聚集的抗體相接觸，且c)測量由所述抗體的Fc區(qū)域激活所述細(xì)胞的Fc受體而導(dǎo)致的細(xì)胞反應(yīng)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述聚集通過使用抗-IgGF(ab，)2片段而實(shí)現(xiàn)。3、^!l權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述抗-IgGF(ab，)2片段為4f對所測試的抗體制劑的抗-Fab或抗-F(ab，)2.4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述聚集為熱聚集。5、#41權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述聚集通過將Fab區(qū)#此交聯(lián)或?qū)⒅劓溑c輕鏈彼此交聯(lián)的方式實(shí)現(xiàn)。6、根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所迷Fc受體選自CD16(Fcy腿a和FcyRHIb)、CD32(FcyRna和FcyRnb)和CD64(FcYRI)。7、根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特4iMt于表達(dá)所述Fc受體的所述細(xì)胞為用編碼所述受體的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞.8、根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特;W^于表達(dá)所述Fc受體的所述細(xì)胞為表達(dá)CD16的Jurkat細(xì)胞，并且所述細(xì)胞系在存在這些細(xì)胞的非特異性激活劑例如PMA(乙酸肉豆蔻耽佛波酯)的情況下進(jìn)行培養(yǎng).9、根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于對由所述抗體的Fc區(qū)域激活所述細(xì)胞的Fc受體而導(dǎo)致的細(xì)J!&^的測量為對表達(dá)CD16受體的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一種細(xì)胞因子的量的測量.10、#權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于至少一種細(xì)胞因子的量的測量通^tii行對所述細(xì)胞因子mRNA的分析而實(shí)現(xiàn).11、絲權(quán)利要求9或10所述的方法，其特4M^于選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、MCP-1、TNFalpha(TNFot)或IFNga咖a(IFNy)的至少一種細(xì)胞因子被定量測量.12、4fLlt權(quán)利要求9-ll任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于白細(xì)胞介素IL-2被定量測量。13、^權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于分泌的白細(xì)胞介素IL-2的水平與ADCC型活，tM目關(guān).14、#^權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于對細(xì)il&^的測量為對鉤內(nèi)流、磷酸化、轉(zhuǎn)錄因子或凋亡的測量。15、根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，用于評價(jià)細(xì)胞產(chǎn)生能夠與CD16受體相互作用的單克隆抗體的能力。16、^!權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于所述產(chǎn)生抗體的細(xì)胞迤自CH0、YB2/0、SP2/0、SP2/0-AG14、IR983F、Namalwa人骨髄瘤細(xì)胞、PERC6細(xì)胞系、CHO細(xì)胞系(特別為CH0-K-1、CHO-LeclO、CHO-Lecl、CH0-Lec13、CH0Pro-5、CH0dhfr—)、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、C0S-7、293-HEK、BHK、K6H6、NSO、SP2/0-Ag14及P3X63Ag8,653。17、M權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的方法，用于^一個或多個純化步驟后抗體Fc區(qū)域的效力和完整性，或用于監(jiān)測置于變性務(wù)fr下的治療性制劑的穩(wěn)定性。18、M權(quán)利要求l-14任一項(xiàng)所述的方法，用于"^h抗體Fc區(qū)域的功能性。19、M權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的方法，用于"PHh由轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因哺乳動物產(chǎn)生的單克隆抗體的產(chǎn)量。20、#^權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的方法，用于篩選治療用的有效抗體。21、根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的方法，用于篩選抗體組合物，所述組合物的巖藻糖含量小于65沐，優(yōu)選小于40%.22、一種制備能夠激活CD16(FcyRm)受體的單克隆抗體組合物的方法，包含以下步驟a)從雜交瘤、異種雜交瘤、或者使用一種或多種表達(dá)所述抗體的載^染的^T動物、植物或人的細(xì)胞系中，獲得單克隆抗體；b)通過抗-IgGF(ab，)2片段聚集步驟a)中獲得的抗體；c)將步驟b)中獲得的抗體加A^^^物，該^^包括a.包含表達(dá)cd16(Fcyrhi)受體的細(xì)胞的^t應(yīng)細(xì)胞，b.乙酸肉豆蔻酖佛波酯d)測量表達(dá)CD16的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一種細(xì)胞因子的量；e)針對無抗體的對照組，或者針對以給定抗體作為陰性參照物的對照組，按照被測量的細(xì)胞因子量的增加大于0.5、1、2、5、10、100或500倍篩選抗體組合物，23、M權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于對表達(dá)CD16的細(xì)胞所產(chǎn)生的至少一種細(xì)胞因子的量的測量為對表達(dá)CD16的細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2的量的測量。24、實(shí)施測量治療用抗體活性的生物測試的試劑盒，包括(l)聚集所述治療用抗體的手段，(2)能夠表達(dá)Fc受體的細(xì)胞，(3)當(dāng)所述細(xì)胞的Fc受^所述抗體的Fc區(qū)域激活時(shí)，測量能夠表達(dá)Fc受體的所述細(xì)胞的反應(yīng)的手段，和(4)實(shí)施根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法所必需的其它要素。25、M權(quán)利要求24所述的實(shí)施測量治療用抗體活性的生物測試的試劑盒，其特征在于測量所述細(xì)胞的反應(yīng)的手段為定量測量由所述細(xì)胞產(chǎn)生的至少一種細(xì)胞因子的手段。26、M權(quán)利要求25所述的實(shí)施測量治療用抗體活性的生物測試的試劑盒，其特征在于定量測量至少一種細(xì)胞因子的手段為分析所述細(xì)胞因子mRM的手段.27、賴>據(jù)權(quán)利要求24所述的實(shí)施測量治療用抗體活性的生物測試的試劑盒，其特征在于測量所述細(xì)胞的反應(yīng)的手段為測量鉤內(nèi)流、磷酸化、轉(zhuǎn)錄因子或凋亡的手段。全文摘要本發(fā)明涉及一種測量抗體制劑激活Fc受體的能力的方法，其中該方法包括如下步驟a)將所述抗體彼此聚集，b)將表達(dá)Fc受體的細(xì)胞與所述聚集的抗體相接觸，且c)測量由所述抗體的Fc區(qū)域激活所述細(xì)胞的Fc受體而導(dǎo)致的細(xì)胞反應(yīng)。文檔編號G01N33/68GK101375165SQ200680052870公開日2009年2月25日申請日期2006年12月15日優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日發(fā)明者勞倫特·西雷特,弗雷德里克·戴諾特,讓-呂克·泰勞德申請人:Lfb生物技術(shù)公司