專利名稱:鑒定對(duì)用抗ErbB2抗體處理響應(yīng)的腫瘤的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及鑒定對(duì)用抗HER2抗體處理響應(yīng)的腫瘤的方法,以及治療患有這種腫瘤的患者的方法。
背景技術(shù):
受體酪氨酸激酶的ErbB家族是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活的重要介導(dǎo)物。受體家族包括四個(gè)獨(dú)特成員,包括表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR或ErbBl)、HER2(ErbB2或pl85neu)、 HER3(ErbB3)和 HER4(ErbB4 或 tyro2)。由erbBl基因編碼的EGFR已被暗示與人的惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)。特別地,已經(jīng)在乳腺、膀胱、肺、頭部、頸和胃癌癥以及惡性膠質(zhì)瘤中觀察到EGFR表達(dá)升高。在通過自分泌刺激性路徑引起受體激活的同一腫瘤細(xì)胞中,EGFR受體表達(dá)升高通常與EGFR配基一轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 α (TGF-a )--的生成增多相關(guān)。Baselga 和 Mendelsohn Pharmac. Ther. ,64 127-154(1994)。此外,表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)蛋白(ERRP)已經(jīng)被描述,其中1583bp的 cDNA片段克隆與小鼠EGFR和截短的大鼠EGFR具有90-95 %的序列同源性(美國(guó)專利號(hào) 6,399,743 ;和美國(guó)公開號(hào)2003/0096373)。針對(duì)EGFR或其配基,TGF-α和EGF的單克隆抗體已經(jīng)被評(píng)價(jià)為在治療這種惡性腫瘤中作為治療劑。參見,例如Baselga和Mendelsohn., 同上文;Masui et al. , Cancer Research, M 1002-1007 (1984);禾口 Wu et al.,J Clin. Invest. ,95 :1897-1905(1995)。ErbB家族的第二個(gè)成員pl85neu最早被鑒定為來自化學(xué)處理的大鼠的成神經(jīng)細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)物。Neu原癌基因的活化形式由所編碼蛋白的跨膜區(qū)域中的點(diǎn)突變(纈氨酸變?yōu)楣劝彼?而產(chǎn)生。在乳腺和卵巢癌中觀察到neu的人同系物(HER2)發(fā)生擴(kuò)增,這與不理想的預(yù)后相關(guān)(Slamon et al. , Science, 235 177-182 (1987) ;Slamon et al, Science, 244 =707-712(1989);和美國(guó)專利號(hào)4,968,603)。迄今,還沒有報(bào)道在人的腫瘤中具有與neu原癌基因中的點(diǎn)突變類似的點(diǎn)突變。ErbB2的過度表達(dá)(常常,但不是一律由于基因擴(kuò)增)也在其他癌癥中觀察到,包括胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、 腎癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌和膀胱癌。參見,以及其它文獻(xiàn),King et al. , Science, 229 :974(1985) ;Yokota et al. , Lancet,! :765-767(1986) ;Fukushigi et al. , Mol Cell Biol. ,6 :955-958(1986) ;Geurin et al.,Oncogene Res. ,3 :21-31(1988) ;Cohen et al., Oncogene, 4 :81-88(1989) ;Yonemura et al. , Cancer Res. ,M :1034(1991) ;Borst et al.,Gynecol. Oncol. ,38 :364(1990) ;Weiner et al.,Cancer Res. ,50 :421-425(1990); Kern et al.,Cancer Res. ,50 :5184(1990) ;Park et al.,Cancer Res. ,49 :6605(1989); Zhau et al. , Mol. Carcinog. ,3 :354-357(1990) ;Aasland et al. , Br. J. Cancer, 57 358-363(1988) ;Williams et al., Pathiobiology, 59 :46-52(1991);和 McCann et al., Cancer,65 :88-92(1990) ErbB2 可能在前列腺癌中過度表達(dá)(Gu et al.,Cancer Lett., 99 :185-9(1996) ;Ross et al.,Hum. Pathol. ,28 :827-33(1997) ;Ross et al. ,Cancer,79 2162-70(1997);和 Sadasivan et al.,J. Urol.,丄迎U6-31 (1993))。ErbB2 的過度表達(dá)可能會(huì)通過不依賴于配基地激活ErbB2或ErbB2同型二聚體,引起腫瘤生長(zhǎng)。針對(duì)大鼠pl85neu和人ErbB2蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體已經(jīng)被描述。Drebin及其同事已經(jīng)制備出抗大鼠neu基因產(chǎn)物pl85neu的抗體。參見,例如Drebin et al. , Cell,41 695-706(1985) ;Myers et al. ,Meth. Enzym. , 198 :277-290(1991);和 W094/22478。Drebin et al.,Oncogene, 2 :273-277(1988)報(bào)道,與pl85neu的兩個(gè)不同區(qū)域反應(yīng)的抗體的混合物對(duì)被植入裸鼠的neu轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤作用。還參見1998年10月 20日授權(quán)的美國(guó)專利5,824,311。Hudziak 等,Mol. Cell. Biol. ,93 :1165-1172 (1989)描述了一系列抗 ErbB2 抗體的制備,采用人乳腺腫瘤細(xì)胞系SK-BR-3對(duì)其進(jìn)行鑒定。通過在72小時(shí)后對(duì)單細(xì)胞層進(jìn)行結(jié)晶紫染色,測(cè)定了 SK-BR-3細(xì)胞在暴露于抗體后的相對(duì)細(xì)胞增殖。采用這種測(cè)定法, 用稱為4D5的抗體獲得最大抑制作用,其抑制了 56%的細(xì)胞增殖。在該測(cè)定中,該系列的其他抗體在較小程度降低細(xì)胞增殖。還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抗體4D5能夠使過度表達(dá)ErbB2的乳腺腫瘤細(xì)胞系對(duì)TNF-α的細(xì)胞毒性作用變得敏感。還參見1997年10月14日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)5,677,171。在Hudziak et al中被討論的抗ErbB2抗體還在i^endly et al., Cancer Research,迎1550-1558(1990) ;Kotts et al. , In Vitro,26(3) :59A(1990); Sarup et al. , Growth Regulation,丄72-82 (1991) ;Shepard et al. , J Clin. Immunol., 11 (3) :117-127(1991) ;Kumar et al. , Mol. Cell Biol. ,11(2) :979-986(1991) ;Lewis et al.,Cancer Immunol. Immunother. ,37 :255-263(1993) ;Pietras et al.,Oncogene,9 1829-1838(1994) ;Vitetta et al.,Cancer Research,M :5301-5309(1994) ;Sliwkowski et al.,J. Biol. Chem. ,269(20) :14661-14665(1994) ;Scott et al.,J. Biol. Chem.,266 14300-5(1991) ;D' souza et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. ,91 :7202-7206 (1994) ;Lewis et al. , Cancer Research, 56 :1457-1465(1996);禾口 Schaefer et al. , Oncogene,15 1385-1394(1997)中被進(jìn)一步表征。重組的人源化鼠抗ErbB2 抗體 4D5 (huMAb4D5_8,rhuMAb HER2 或HERCEPTIN ; 美國(guó)專利號(hào)5,821,337)在過度表達(dá)ErbB2的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者中具有臨床活性,這些患者接受了廣泛的預(yù)先抗癌治療(Baselga et al.,J Clin Oncol. ,14 =737-744(1996)) 1998年9月25日HERCEPTIN 獲得美國(guó)食品和藥品管理局的銷售許可,用于治療患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者,其腫瘤過度表達(dá)ErbB2蛋白。但是,并不是所有的過度表達(dá)ErbB2的腫瘤都對(duì)HERCEPTIN 響應(yīng)。(Brockhoff et al. , Cytometry, M :338-48 (2001)) 此外,臨床前的數(shù)據(jù)暗示,HERCEPTIN 對(duì)于治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是治療上有效的。 HER2蛋白在20-66%的被切除NSCLC腫瘤中過度表達(dá),并且被證明在多個(gè)系列中預(yù)測(cè)不理想的患者結(jié)局(Azzoli,C. G. et al.,Semin. Oncol.,29 (Suppl4) :59-65 (2002))。其他具有各種性質(zhì)的抗ErbB2的抗體已經(jīng)被描述在Tagliabue et al. , Int. J. Cancer,£7 :933-937(1991) ;McKenzie et al. , Oncogene,4 :543-548(1989) ;Maier et al. , Cancer Res. ,51 :5361-5369(1991) ;Bacus et al. , Molecular Carciaogenesis, 3 350-362(1990) ;Stancovski et al.,PNAS (USA) ,88 :8691-8695(1991) ;Bacus et al., Cancer Research, 52 :2580-2589(1992) ;Xu et al. , Int. J. Cancer,53 :401-408(1993); W094/00136 ;Kasprzyk et al. , Cancer Research, 52 :2771-2776(1992) ;Hancock et al., Cancer Res. ,51 :4575-4580(1991) ;Shawver et al. ,Cancer Res. ,54 :1367-1373(1994); Arteaga et al. , Cancer Res. ,54 3758~3765(1994) ;Harwerth et al. , J. Biol. Chem., 267 :15160-15167(1992);美國(guó)專利號(hào) 5,783,186 ;和 Klapper et al.,Oncogene, H 2099-2109(1997)中。單克隆抗體2C4在WO 01/00245中描述,在此引入作為參考。已經(jīng)證明2C4破壞HER2與其他ErbB受體家族成員發(fā)生二聚化(W0 01/00245)。同源性篩選已經(jīng)鑒定了兩種其他的ErbB受體家族成員;ErbB3 (美國(guó)專利號(hào) 5,183,884 和 5,480,968,以及 Kraus et al.,PNAS (USA) ,86 :9193-9197(1989)) 和 ErbB4(歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?599,274 ;Plowman et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 1746-1750(1993);和 Plowman et al. , Nature, 366 :473-475 (1993))。這兩種受體在至少某些乳腺癌細(xì)胞系中均表現(xiàn)為表達(dá)增加。ErbB受體通常以各種組合的形式存在于細(xì)胞內(nèi),并且一般認(rèn)為異二聚化增加細(xì)胞對(duì)各種 ErbB 配基反應(yīng)的多樣性(Earp et al. ,Breast Cancer Research and Treatment, 35 :115-132(1995)) 0然而,這些受體聚集以及如何作用于信號(hào)傳遞的機(jī)制還未被充分了解(Brennan, P. J. et al.,Oncogene,:6093-6101 (2000))。EGFR 被六個(gè)不同配基結(jié)合;表皮生長(zhǎng)因子(EGF),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α (TGF-α),雙調(diào)蛋白,肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子 (HB-EGF),β-動(dòng)物纖維素(betacellulin)和上皮調(diào)節(jié)素(印 iregulin) (Groenen et al., Growth Factors, 11 :235-257 (1994)) 由對(duì)單個(gè)基因的可變剪接得到的heregulin蛋白家族是 ErbB3 和 ErbB4 的配基。Heregulin 家族包括 α、β 和 γ heregulin (Holmes et al., Science, 256 1205-1210 (1992),美國(guó)專利號(hào) 5, 641, 869 ;禾口 Schaefer et al.,Oncogene, 15 :1385-1394(1997)) ;neu分化因子(NDF),神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子(GGFs);乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(acetylcholine receptor inducing activity) (ARIA);以及感覺禾口運(yùn)動(dòng)神經(jīng)兀衍生因子(sensory and motor neuron derived factor) (SMDF)。綜述參見 Groenen et al. , Growth Factors, jj_ :235-257 (1994) ;Lemke, G. , Molec. & Cell. Neurosci. , 7 247-262(1996)和 Lee et al. , Pharm. Rev., :51-85 (1995)。最近,三種其他的 ErbB 配基被鑒定;神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白KneuregulinD (NRG-2),其被報(bào)道能結(jié)合ErbB3或ErbB4 (Chang et al. , Nature,387 :509-512(1997);禾口 Carraway et al. ,Nature,387 :512-516(1997)); 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(neuregulin-3),其結(jié)合 ErbB4 (Zhang et al.,PNAS(USA),M(18) 9562-7(1997));和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4 (neuregulin-4),其結(jié)合 ErbB4 (Harari et al., Oncogene, 18 :2681-89 (1999)) HB-EGF, β -動(dòng)物纖維素和上皮調(diào)節(jié)素也結(jié)合ErbB4。雖然EGF和TGF α不結(jié)合ErbB2,但是EGF刺激EGFR和ErbB2形成異二聚體,該異二聚體激活EGFR并導(dǎo)致ErbB2在異二聚體中發(fā)生轉(zhuǎn)磷酸作用。二聚化和/或轉(zhuǎn)磷酸作用似乎能夠激活ErbB2酪氨酸激酶。參見Earp et al.,同上文。同樣地,heregulin不與ErbB2結(jié)合,但是當(dāng)ErbB3與ErbB2共表達(dá)時(shí),形成一種活性信號(hào)傳遞復(fù)合物(Nagy et al.,Cytometry,鑒120-31(1998)。針對(duì) ErbB2 的抗體能夠破壞這一復(fù)合物(Sliwkowski et al.,J. Biol. Chem.,269 (20) 14661-14665 (1994))。 ErbB3 是酪氨酸激酶缺陷的,因此需要異二聚化,優(yōu)選與ErbB2異二聚化,來具備信號(hào)轉(zhuǎn)換能力。(Graus-Porta et al.,EMBO J. ,16 :1647-55(1995)) ο 此夕卜,當(dāng)與 ErbB2 共表達(dá)時(shí),ErbB3 對(duì) heregulin(HRG)的親合性增加至較高的親合狀態(tài)。還參見Levi et al. , Journal of Neuroscience,15 1329-1340(1995) ;Morrissey et al.,Proc. Natl.Acad. Sci. USA,92 1431-1435(1995)和 Lewis et al. ,Cancer Res.,巡1457-1465 (1996)對(duì)于ErbB2_ErbB3蛋白質(zhì)復(fù)合物的描述。 實(shí)際上,ErbB2是EGFR和ErbB3的優(yōu)選異二聚化伴侶。(Graus-Porta et al.,同上文)。 如同ErbB3 —樣,ErbB4與ErbB2形成活性信號(hào)傳遞復(fù)合物(Carraway和Cantley,Cell, 78 5-8 (1994))。ErbB2與EGFR或ErbB3的配基依賴的異二聚化可能促進(jìn)表達(dá)ErbB2的腫瘤的生長(zhǎng)。已經(jīng)在來自原發(fā)性乳腺癌患者的腫瘤樣本中和膀胱癌中研究了 ErbB受體和 heregulin 的表達(dá)以及 HER2 的磷酸化狀況(Esteva et al.,Pathol. Oncol. Res. ,7 171-177(2001) ;Chow et al.,Clin. CancerRes.,Z :1957-1962(2001))。Thor et al., J. Clin. Oncology,18 :3230-3239 (2000),禾口 DiGiovanna et al. , Cancer Res. ,62 6667-6673(2002)已經(jīng)報(bào)道了在乳腺癌中,通過Her2/neU的活躍信號(hào)傳遞與臨床病理和患者結(jié)局之間的相關(guān)性。發(fā)明概述一個(gè)方面,本發(fā)明涉及鑒定對(duì)用抗HER2抗體處理有響應(yīng)的腫瘤的方法。優(yōu)選地, 該抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基激活。在一個(gè)實(shí)施方案中,該抗體是單克隆抗體2C4,更加優(yōu)選為rhuMAb 2C4。獲得腫瘤樣本,并檢測(cè)該樣本中是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或 HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。當(dāng)檢測(cè)到這種復(fù)合物時(shí),腫瘤被鑒定為對(duì)用抗HER2抗體的處理有響應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中,通過用抗HER2抗體免疫沉淀任何含有HER2的蛋白質(zhì)復(fù)合物來檢測(cè)是否存在復(fù)合物。然后被免疫沉淀的復(fù)合物與選自由抗HER3抗體、抗HERl抗體和抗HER4抗體組成的組的抗體接觸,確定任何結(jié)合。如果確定抗HER3和/或抗HERl和/或抗HER4的抗體結(jié)合到被免疫沉淀的復(fù)合物上,即檢測(cè)到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/ 或HER2/HER4復(fù)合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中,通過將腫瘤樣本與包含第一熒光團(tuán)的抗HER2的抗體接觸來檢測(cè)是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后將腫瘤樣本與選自由抗HER3和/或抗HERl和/或抗HER4抗體組成的組的抗體接觸,其中所述抗體包含第二熒光團(tuán)。然后測(cè)定熒光共振能量轉(zhuǎn)移來確定第一熒光團(tuán)與第二熒光團(tuán)是否十分接近。如果第一熒光團(tuán)與第二熒光團(tuán)被確定十分接近,則檢測(cè)到存在HER2/HER3和/或 HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中,通過將腫瘤樣本與第一結(jié)合化合物接觸來檢測(cè)是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。第一結(jié)合化合物包含特異地結(jié)合HER2的第一靶向結(jié)合部分。第一靶向結(jié)合部分優(yōu)選是抗HER2抗體或抗體片段。 第一結(jié)合化合物進(jìn)一步包括通過可裂解接頭連接到第一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可檢測(cè)部分。將腫瘤樣本與第二結(jié)合化合物接觸。第二結(jié)合化合物優(yōu)選包含特異地結(jié)合HER3 或HERl或HER4和優(yōu)選不結(jié)合HER2的第二靶向結(jié)合部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中,第二結(jié)合化合物結(jié)合HER3或HER1,并且不結(jié)合HER2或HER4。在另一個(gè)實(shí)施方案中,第二靶向結(jié)合部分包含抗HER3或抗HERl或抗HER4的抗體或抗體片段。第二結(jié)合化合物被激活時(shí)能夠斷裂第一結(jié)合化合物的可裂解接頭,從而當(dāng)?shù)谝唤Y(jié)合化合物與第二結(jié)合化合物十分接近時(shí)產(chǎn)生游離的可檢測(cè)部分。當(dāng)鑒定到存在游離的可檢測(cè)部分時(shí),確定存在HER2/HER3或HER2/ HERl或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中,通過毛細(xì)管電泳確定是否存在游離的可檢測(cè)部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中,第一結(jié)合化合物包含特異地結(jié)合HERl或HER3或HER4的第一靶向結(jié)合結(jié)構(gòu)域,并且第二結(jié)合化合物包含特異地結(jié)合HER2的第二靶向結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在還有一個(gè)實(shí)施方案中,通過評(píng)價(jià)ErbB受體磷酸化,例如通過免疫沉淀HER2蛋白質(zhì),接著通過蛋白質(zhì)印跡免疫檢測(cè)磷酸酪氨酸,檢測(cè)HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或 HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物,以及所引起的HER2活化。用于分析是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的腫瘤樣本優(yōu)選從患有該腫瘤的患者中獲得。該樣本例如可以通過活組織檢查獲得。在另一個(gè)實(shí)施方案中,該樣本通過純化來自患者的循環(huán)的腫瘤細(xì)胞來獲得。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中,該樣本在從患者身上摘除腫瘤的手術(shù)過程中獲得。在另一個(gè)實(shí)施方案中,腫瘤樣本是從哺乳動(dòng)物而不是最先發(fā)生該腫瘤的患者之外的哺乳動(dòng)物中獲得。優(yōu)選地,該樣本得自小鼠或另一種嚙齒類動(dòng)物。更加優(yōu)選地,該腫瘤是異種移植的腫瘤。該異種移植的腫瘤優(yōu)選通過將人的腫瘤碎片移植到小鼠或另一種嚙齒類動(dòng)物來制備。在一個(gè)實(shí)施方案中,腫瘤是肺腫瘤,更加優(yōu)選是非小細(xì)胞肺癌腫瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中,腫瘤是乳腺腫瘤。在另一個(gè)方面,本發(fā)明涉及檢測(cè)對(duì)用抑制HER2與ErbB受體家族另一成員結(jié)合的抗體的處理有響應(yīng)的腫瘤細(xì)胞的方法,包括步驟(a)提供包含HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)樣本;和(b)檢測(cè)生物學(xué)樣本中的ErbB受體的磷酸化,其中所述磷酸化表明腫瘤細(xì)胞對(duì)用抗體處理有響應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中,檢測(cè)ErbB2 (HEM)受體的磷酸化。如前所述,與HER2相關(guān)的其他成員是HER3、HERl和/或HER4,例如HER2和/或 HERl。該方法還可以另外包含檢測(cè)是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4 蛋白質(zhì)復(fù)合物的步驟,基本上如上所述。在另一個(gè)方面,本發(fā)明還涉及用于預(yù)測(cè)被診斷具有HER2陽(yáng)性腫瘤的受檢者對(duì)用抑制HER2與ErbB受體家族的另一個(gè)成員結(jié)合的抗體處理的反應(yīng)的方法,通過檢測(cè)在得自該受檢者的包含HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的生物樣本中HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或 HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成和/或ErbB受體的磷酸化。存在這種蛋白質(zhì)復(fù)合物和/或所述磷酸化表明個(gè)體可能對(duì)用抗體處理有響應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中,檢測(cè)到ErbB2(HER2) 受體的磷酸化表明受檢者可能對(duì)用該抗體處理有響應(yīng)。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及通過檢測(cè)受檢者的循環(huán)的腫瘤細(xì)胞中的 ErbB受體的磷酸化,鑒定對(duì)用抗HER2抗體處理有響應(yīng)的受檢者。存在這種磷酸化表明受檢者可能對(duì)用抗HER2抗體的處理有響應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中,檢測(cè)ErbB2 (HEM)磷酸化。在另一個(gè)實(shí)施方案中,受檢者是人。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中,該方法還包含用抗HER2抗體治療受檢者,優(yōu)選使用rhuMAb 2C4。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供一種制品,其包含含有結(jié)合HER2的抗體的容器和關(guān)于將該抗體施用給患有腫瘤的患者中的說明書。優(yōu)選地,該腫瘤已經(jīng)被確定包含HER2/HER3 和 / 或 HER2/HER1 和 / 或 HER2/HER4 異二聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中,該容器含有阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中,該容器含有單克隆抗體2C4,更加優(yōu)選為rhuMAb 2C4。在還有一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療患者的方法,包含給患者施用治療有效量的結(jié)合HER2的抗體。優(yōu)選地,該患者患有被確定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/ HER4異二聚體的腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中,抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。在另一個(gè)實(shí)施方案中,該抗體是單克隆抗體2C4,更加優(yōu)選為rhuMAb 2C4。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療患者的方法,包含給患者施用治療有效量的結(jié)合 HER2的抗體。優(yōu)選地,該患者患有被確定具有被磷酸化的ErbB受體的腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中,被磷酸化的ErbB受體是HER2。在另一個(gè)實(shí)施方案中,抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。在另一個(gè)實(shí)施方案中,該抗體是單克隆抗體2C3, 更加優(yōu)選為rhuMAb 2C4。本發(fā)明還渉及1.鑒定對(duì)用抗HER2抗體處理響應(yīng)的腫瘤的方法,包含a)檢測(cè)所述腫瘤的樣本中HER2/HER 3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在;c)當(dāng)檢測(cè)到復(fù)合物時(shí),則將腫瘤鑒定為對(duì)用抗HER2抗體處理響應(yīng)的腫瘤。2.項(xiàng)1的方法,其中抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。3.項(xiàng)1的方法,其中抗HER2抗體是單克隆抗體2C4。4.項(xiàng)1的方法,其中抗HER2抗體是rhuMAb 2C4。5.項(xiàng)1的方法,其中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在通過如下步驟檢測(cè)a)用抗HER2抗體免疫沉淀任何包含HER2的蛋白質(zhì)復(fù)合物;b)用選自由抗HER3抗體和抗HERl抗體組成的組中的抗體與被免疫沉淀的復(fù)合物接觸;和c)確定抗HER3和/或抗HERl抗體是否與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合,其中如果確定抗HER3和/或抗HERl抗體與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合,則檢測(cè)到 HER2/HER3 和 / 或 HER2/HER1 復(fù)合物。6.項(xiàng)1的方法,其中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在通過如下步驟檢測(cè)a)將腫瘤樣本與包含熒光團(tuán)的抗HER2抗體接觸;b)將腫瘤樣本與選自由抗HER3和抗HERl抗體組成的組中的抗體接觸,其中所述抗體包含第二熒光團(tuán);c)通過測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移確定第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)是否十分接近,其中如果第一和第二熒光團(tuán)被確定十分接近,則檢測(cè)到HER2/HER3和/或HER2/ HERl蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。7.項(xiàng)1的方法,其中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在是通過如下步驟檢測(cè)的
a)將腫瘤樣本與第一結(jié)合化合物接觸,其中所述第一結(jié)合化合物包含特異結(jié)合 HER2的第一靶向結(jié)合部分,并且還進(jìn)一步包含通過可裂解接頭連接到第一靶向結(jié)合部分的可檢測(cè)部分;b)將腫瘤樣本與第二結(jié)合化合物接觸,其中該第二結(jié)合化合物包含特異結(jié)合 HER3或HERl的第二靶向結(jié)合部分和可活化的裂解劑;c)激活裂解劑,使得如果第一結(jié)合化合物和第二結(jié)合化合物十分接近,第二結(jié)合化合物斷裂第一結(jié)合化合物中的可裂解接頭來產(chǎn)生游離的可檢測(cè)部分;和d)鑒定游離的可檢測(cè)部分的存在,其中當(dāng)鑒定到游離的可檢測(cè)部分時(shí),檢測(cè)到HER2/HER3或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
靶向結(jié)合部分包含抗HER2抗體或者抗體片段。 靶向結(jié)合部分包含HER2受體的配體。 二靶向結(jié)合部分包含抗HER3抗體或者抗體片段。 二靶向結(jié)合部分包含HER3受體的配體。 二靶向結(jié)合部分包含抗HERl抗體或者抗體片段。 二靶向結(jié)合部分包含HERl受體的配體。 項(xiàng)7的方法,其中樣本從患有該腫瘤的患者中獲得。 項(xiàng)14的方法,其中樣本通過腫瘤的活組織檢查獲得。 項(xiàng)14的方法,其中樣本通過純化來自患者血液的循環(huán)的腫瘤細(xì)胞來獲得。 項(xiàng)14的方法,其中樣本是在手術(shù)從患者中去除腫瘤的過程中獲得。 項(xiàng)1的方法,其中腫瘤樣本從小鼠中獲得。 項(xiàng)18的方法,其中腫瘤是異種移植的腫瘤。
項(xiàng)19的方法,其中異種移植的腫瘤是通過將人腫瘤碎片移植到小鼠中來制
備。
8.項(xiàng)7的方法,其中第一
9.項(xiàng)7的方法,其中第一
10.項(xiàng)7的方法,其中第: 項(xiàng)7的方法,其中第: 項(xiàng)7的方法,其中第: 項(xiàng)7的方法,其中第:
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21.項(xiàng)1的方法,其中腫瘤是肺腫瘤。
22.項(xiàng)1的方法,其中腫瘤是乳腺腫瘤。
23.鑒定對(duì)用抑制HER2與ErbB受體家族的另一成員結(jié)合的抗體處理響應(yīng)的腫瘤細(xì)胞的方法,包含a)提供包含HER2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)樣本;和b)檢測(cè)在所述生物學(xué)樣本中的ErbB受體的磷酸化,其中所述磷酸化指示所述腫瘤細(xì)胞對(duì)用所述抗體處理響應(yīng)。24.項(xiàng)23的方法,其中ErbB2 (HER2)受體磷酸化被檢測(cè)。25.項(xiàng)23的方法,其中其他成員選自由HER3、HERl和HER4組成的組。26.項(xiàng)23的方法,其中抗體結(jié)合HER2。27.項(xiàng)沈的方法,其中抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。28.項(xiàng)27的方法,其中抗體是rhuMAb 2C4。29.項(xiàng)25的方法,其中抗體結(jié)合HER3。30.項(xiàng)25的方法,其中抗體結(jié)合HERl。31.項(xiàng)25的方法,其中抗體結(jié)合HER4。
32.項(xiàng)23的方法,另外還包含檢測(cè)樣本中至少一種選自由HER2/HER3、HER2/HER1 和HER2/HER4組成的組中的蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。33.項(xiàng)32的方法,其中通過如下來檢測(cè)所述蛋白質(zhì)復(fù)合物或多個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)用抗HER2抗體免疫沉淀任何包含HER2的蛋白質(zhì)復(fù)合物;b)將被免疫沉淀的復(fù)合物與選自由抗HER3、抗HERl和抗HER4抗體組成的組中的至少一種抗體接觸;和c)確定所述抗HER3和/或抗HERl和/或抗HER4抗體是否與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合,其中如果確定抗HER3和/或抗HERl和/或抗HER4抗體與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合,則檢測(cè)到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4復(fù)合物。34.項(xiàng)32的方法,其中通過如下檢測(cè)所述蛋白質(zhì)復(fù)合物或多個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)將腫瘤樣本與包含熒光團(tuán)的抗HER2抗體接觸;b)將腫瘤樣本與選自由抗HER3、抗HERl和抗HER4抗體組成的組中的抗體接觸, 其中所述抗體包含第二熒光團(tuán);c)通過測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移確定第一熒光團(tuán)與第二熒光團(tuán)是否十分接近,其中如果第一與第二熒光團(tuán)被確定十分接近,則檢測(cè)到存在HER2/HER3和/或 HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。35.項(xiàng)32的方法,其中通過如下檢測(cè)所述蛋白質(zhì)復(fù)合物或多個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)將腫瘤樣本與第一結(jié)合化合物接觸,其中所述第一結(jié)合化合物包含特異結(jié)合 HER2的第一靶向結(jié)合部分,還進(jìn)一步包含通過可裂解接頭被連接到第一靶向結(jié)合部分的可檢測(cè)部分;b)將腫瘤樣本與第二結(jié)合化合物接觸,其中第二結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER3 或HERl或HER4的第二靶向結(jié)合部分和可活化的裂解劑;c)激活裂解劑,使得如果第一結(jié)合化合物和第二結(jié)合化合物十分接近,則第二結(jié)合化合物斷裂第一結(jié)合化合物的可裂解接頭來產(chǎn)生游離的可檢測(cè)部分;和d)鑒定游離的可檢測(cè)部分的存在,其中當(dāng)游離的可檢測(cè)部分被鑒定時(shí),檢測(cè)到HER2/HER3或HER2/HER1或HER2/HER4 蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。36.項(xiàng)35的方法,其中第一靶向結(jié)合部分包含抗HER2抗體或抗體片段,或HER2受體的配體。37.項(xiàng)35的方法,其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER3抗體或抗體片段,或HER3受體的配體。38.項(xiàng)35的方法,其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HERl抗體或抗體片段,或HERl受體的配體。39.項(xiàng)35的方法,其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER4抗體或抗體片段,或HER4受體的配體。
40.項(xiàng)23的方法,其中生物學(xué)樣本是從腫瘤活組織檢查中獲得的組織。41.項(xiàng)23的方法,其中生物學(xué)樣本是包含循環(huán)的腫瘤細(xì)胞和/或循環(huán)的血漿蛋白的生物學(xué)液體。42.項(xiàng)23的方法,其中該腫瘤選自由乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌組成的組。43.項(xiàng)23的方法,其中ErbB受體磷酸化通過ErbB受體的免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析來確定。44.項(xiàng)43的方法,其中ErbB受體磷酸化通過凝膠上的磷酸ErbB受體條帶的存在來指不。45.項(xiàng)43的方法,還進(jìn)一步包含用磷酸特異的抗ErbB受體抗體通過免疫組織化學(xué)來證實(shí)ErbB受體磷酸化的步驟。46.項(xiàng)23的方法,其中通過免疫組織化學(xué)確定ErbB受體磷酸化。47.用于預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)用抑制HER2與ErbB受體家族的另一成員聯(lián)合的抗體處理的反應(yīng)的方法,所述個(gè)體被診斷患有HER2陽(yáng)性腫瘤,該方法包含a)提供從所述個(gè)體獲得的生物學(xué)樣本,包含HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞;和b)檢測(cè)所述生物學(xué)樣本中的ErbB受體的磷酸化,其中所述磷酸化指示所述患者可能對(duì)用所述抗體處理有反應(yīng)。48.項(xiàng)47的方法,其中所述ErbB受體是ErbB2 (HER2)。49.項(xiàng)47的方法,其中其他成員選自由HER3、HER1和HER4組成的組。50.項(xiàng)47的方法,其中抗體結(jié)合HER2。51.項(xiàng)50的方法,其中抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。52.項(xiàng)51的方法,其中抗體是rhuMAb 2C4。53.項(xiàng)49的方法,其中抗體結(jié)合HER3。54.項(xiàng)49的方法,其中抗體結(jié)合HERl。55.項(xiàng)49的方法,其中抗體結(jié)合HER4。56.項(xiàng)47的方法,另外還包含檢測(cè)在樣本中至少一種選自由HER2/HER3、HER2/ HERl和HER2/HER4組成的組中的蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。57.項(xiàng)56的方法,其中通過如下檢測(cè)所述蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)用抗HER2抗體免疫沉淀任何包含HER2的蛋白質(zhì)復(fù)合物;b)將被免疫沉淀的復(fù)合物與選自由抗HER3、抗HERl和抗HER4抗體組成的組中的抗體接觸;和c)確定抗HER3和/或抗HERl和/或抗HER4抗體是否與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)
η j其中如果確定抗HER3和/或抗HERl和/或抗HER4抗體與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合,則檢測(cè)到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4復(fù)合物。58.項(xiàng)56的方法,其中通過如下檢測(cè)HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/ HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)將腫瘤樣本與包含熒光團(tuán)的抗HER2抗體接觸;b)將腫瘤樣本與選自由抗HER3、抗HERl和抗HER4抗體組成的組中的抗體接觸,其中所述抗體包含第二熒光團(tuán);c)通過測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移確定第一熒光團(tuán)與第二熒光團(tuán)是否十分接近,其中如果第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)被確定十分接近,則檢測(cè)到HER2/HER3和/或 HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。59.項(xiàng)56的方法,其通過如下檢測(cè)HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4 蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)將腫瘤樣本與第一結(jié)合化合物接觸,其中所述第一結(jié)合化合物包含特異結(jié)合 HER2的第一靶向結(jié)合部分,還進(jìn)一步包含通過可裂解接頭連接到第一靶向結(jié)合部分的可檢測(cè)部分;b)將腫瘤樣本與第二結(jié)合化合物接觸,其中第二結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER3、 HERl或HER4的第二靶向結(jié)合部分和可活化的裂解劑;c)激活裂解劑使得如果第一結(jié)合化合物與第二結(jié)合化合物十分接近,第二結(jié)合化合物斷裂第一結(jié)合化合物中的可裂解接頭來產(chǎn)生游離的可檢測(cè)部分;和d)鑒定游離的可檢測(cè)部分的存在,其中當(dāng)鑒定到游離的可檢測(cè)部分時(shí),則檢測(cè)到HER2/HER3或HER2/HER1或HER2/ HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。60.項(xiàng)59的方法,其中第一靶向結(jié)合部分包含抗HER2抗體或抗體片段,或HER2受體的配體。61.項(xiàng)59的方法,其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER3抗體或抗體片段,或HER3受體的配體。62.項(xiàng)59的方法,其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HERl抗體或抗體片段,或HERl受體的配體。63.項(xiàng)59的方法,其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER4抗體或抗體片段,或HER4受體的配體。64.項(xiàng)47的方法,其中生物學(xué)樣本是從腫瘤活組織檢查中獲得的組織。65.項(xiàng)47的方法,其中生物學(xué)樣本是包含循環(huán)的腫瘤細(xì)胞和/或循環(huán)的血漿蛋白的生物學(xué)液體。66.項(xiàng)47的方法,其中腫瘤選自由乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌組成的組。67.項(xiàng)47的方法,其中ErbB受體磷酸化通過ErbB受體的免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析來確定。68.項(xiàng)67的方法,其中ErbB受體磷酸化通過凝膠上存在磷酸ErbB受體條帶來指69.項(xiàng)67的方法,還進(jìn)一步包含采用磷酸特異性抗ErbB受體抗體通過免疫組織化學(xué)來證實(shí)ErbB受體磷酸化的步驟。70.項(xiàng)47的方法,其中ErbB受體磷酸化通過免疫組織化學(xué)確定。71.用于鑒定對(duì)用抗HER2抗體處理響應(yīng)的個(gè)體的方法,包含a)檢測(cè)所述個(gè)體的循環(huán)的腫瘤細(xì)胞中的ErbB受體磷酸化,和b)如果檢測(cè)到所述磷酸化,則確定所述個(gè)體可能對(duì)用抗HER2抗體處理有反應(yīng)。
72.項(xiàng)71的方法,其中ErbB2(HER2)磷酸化被檢測(cè)。73.項(xiàng)72,其中所述個(gè)體是人。74.項(xiàng)73的方法,還進(jìn)一步包含用抗HER2抗體處理所述個(gè)體。75.項(xiàng)74的方法,其中所述抗HER2抗體是rhuMAb 2C4。76.一種治療患者的方法,包含給患者施用治療有效量的結(jié)合HER2的抗體,其中該患者患有已被確定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體的腫瘤。77.項(xiàng)76的方法,其中抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。78.項(xiàng)77的方法,其中抗體是單克隆抗體2C4。79.項(xiàng)77的方法,其中抗體是rhuMAb 2C4。80.一種制品,包含含有結(jié)合HER2的抗體的容器和用于施用抗體給患有腫瘤的患者的說明書,其中腫瘤已被確定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體。81.項(xiàng)80的制品,其中抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。82.項(xiàng)81的制品,其中容器包含單克隆抗體2C4。83.項(xiàng)81的制品,其中容器包含rhuMAb 2C4。84.治療患者的方法,包含給患者施用治療有效量的結(jié)合HER2的抗體,其中患者患有已被確定具有磷酸化ErbB受體的腫瘤。85.項(xiàng)84的方法,其中ErbB受體是HER2。86.項(xiàng)84的方法,其中抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。87.項(xiàng)84方法,其中抗體是單克隆抗體2C4。88.項(xiàng)87的方法,其中抗體是rhuMAb 2C4。
附圖簡(jiǎn)介附圖IA和IB描述鼠單克隆抗體2C4的輕鏈可變區(qū)(VL)(附
圖1A)和重鏈可變區(qū) (VH)(附圖1B)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì)(分別為SEQ ID No. 1和2),2C4的人源化形式 574的VL和VH結(jié)構(gòu)域(分別為SEQ ID No. 3和4)以及人VL和VH的共有片段(hum κ 1, 輕鏈κ亞群I ;humlll,重鏈亞群III)(分別為SEQ ID No. 5和6)。星號(hào)表示在2C4的人源化形式574和鼠單克隆抗體2C4之間或者在2C4的人源化形式574和人框架之間的差異。 互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)在括號(hào)內(nèi)。附圖2A和2B表示在表達(dá)低水平/正常水平ErbB2的MCF7細(xì)胞(附圖2A)和表達(dá)高水平的ErbB2的SK-BR-3細(xì)胞(附圖2B)中,單克隆抗體2C4、HERCEPTIN 抗體或抗EGFR抗體對(duì)heregulin (HRG)依賴的ErbB2與ErbB3結(jié)合的影響;參見下面的實(shí)施例2。附圖3是表明在來自非小細(xì)胞肺癌異種移植外植體的蛋白質(zhì)提取物中存在HERl/ HER2和HER2/HER3異二聚體的免疫印跡。附圖4是表明在來自非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)異種移植外植體的蛋白質(zhì)提取物中存在HER2磷酸化的免疫印跡。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述本發(fā)明部分地基于對(duì)抗HER2抗體rhuMAb 2C4的響應(yīng)與腫瘤細(xì)胞中存在HER2/ HER3和/或HER2/HER1和或HER2/HER4異二聚體、和/或ErbB受體磷酸化相關(guān)的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。因此,基于存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體、和/或ErbB受體磷酸化,腫瘤可以被鑒定為對(duì)用抗HER2抗體的處理有響應(yīng),特別是具有抗HER2抗體2C4的一種或多種生物學(xué)活性的抗HER2抗體。HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體,和/或ErbB受體磷酸化可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來鑒定。通過鑒定對(duì)用抗 HER2的抗體處理響應(yīng)的特定腫瘤和腫瘤類型,可以鑒定將可能會(huì)從這種處理中最獲益的患者。此外,還可以鑒定可能無(wú)法從使用單克隆抗體2C4的治療中獲益的患者。定義"ErbB受體”是受體蛋白酪氨酸激酶,其屬于ErbB受體家族,包括EGFR(ErbBl)、 ERRP, ErbB2、ErbB3和ErbB4受體以及將來將被鑒定的該家族的其他成員。ErbB受體通常包含可能結(jié)合ErbB配基的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域;親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域;保守的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域;和具有多個(gè)可以被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基端信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。ErbB受體可以是 “天然序列”的ErbB受體或其“氨基酸序列變體”。優(yōu)選地,ErbB受體是天然序列的人ErbB 受體。因此,“ErbB受體家族成員”是EGFR(ErbBl)、ErbB2、ErbB3、ErbB4或任何其他目前已知或者將來將被鑒定的ErbB受體。優(yōu)選地,該成員是EGFR (ErbB 1)、ErbB2、ErbB3、或ErbB4。術(shù)語(yǔ)“ErbBl”、“表皮生長(zhǎng)因子受體”、“EGFR”和“HER1”在此被互換使用,是指被公開在如 Carpenter et al. , Ann. Rev. Biochem. ,56 :881-914(1987)中的 EGFR,包括其天然存在的突變形式(例如Humphrey et al. , PNAS(USA) ,87 =4207-4211 (1990)中的缺失突變EGFR)。erbBl是指編碼EGFR蛋白產(chǎn)物的基因。抗HERl的抗體被描述在例如Murthy et al.,Arch. Biochem. Biophys. ,252 :549-560(1987)和 WO 95/25167 中。術(shù)語(yǔ)“ERRP”、“EGF受體相關(guān)蛋白”、“EGFR相關(guān)蛋白”和“表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)蛋白”在此被互換使用,是指公開在例如美國(guó)專利號(hào)6,399,743和美國(guó)公開號(hào)2003/0096373 中的ERRP。表達(dá)法“ErbB2”和“HER2”在此被互換使用,是指在例如%毗3 et a 1.,PNAS (USA), 82 :6497-6501(1985)和 Yamamoto et al.,Nature, 319 :230-234 (1986) (Genebank 登錄號(hào) X03363)中被描述的人HER2蛋白。術(shù)語(yǔ)“erbB2”是指編碼人ErbB2的基因,而“neu”是指編碼大鼠pl85neu的基因。優(yōu)選的ErbB2是天然序列的人ErbB2。“ErbB3” 和 “HER3” 是指如在美國(guó)專利號(hào) 5,183,884 和 5,480,968 以及 Kraus et al.,PNAS (USA), 86 :9193-9197(1989)中公開的受體多肽??笶rbB3的抗體在本領(lǐng)域是已知的,被描述在例如美國(guó)專利號(hào)5,183,884,5, 480,968和W097/35885中。術(shù)語(yǔ)“ErbB4”和“HER4”在此是指在如歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?99,274 ;Plowman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :1746-1750(1993)禾口 Plowman et al.,Nature,366 473-475(1993)中所描述的受體多肽,包括其同種型,例如被公開在1999年4月22日公開的TO 99/19488中??笻ER4的抗體被描述在例如WO 02/18444中。ErbB受體的抗體可以從許多地方購(gòu)買得到,包括例如Santa Cruz Biotechnology, Inc. , California, USA 有限公司。所用“ErbB配基”是指結(jié)合和/或激活ErbB受體的多肽。ErbB配基是天然序列的人ErbB配基,例如表皮生長(zhǎng)因子(EGF) (Savage et al.,J. Biol. Chem., 247 :7612-7621 (1972));轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 α (TGF- α ) (Marquardt et al.,Science, 223 :1079-1082(1984));雙調(diào)蛋白也稱作雪旺氏瘤(sctiwanoma)或角質(zhì)細(xì)胞自分泌生長(zhǎng)因子(keratinocyte autocrine growth factor) (Shoyab et al. , Science,243 1074-1076(1989) ;Kimura et al.,Nature, 348 :257-260(1990);和 Cook et al.,Mol. Cell. Biol. ,11 :2547-2557(1991)) ;β-動(dòng)物纖維素(Shing et al. , Science, 259 1604-1607(1993);禾口 Sasada et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun. ,190 :1173(1993)); 肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF) (Higashiyama et al.,Science, 251 :936-939(1991)); 上皮調(diào)節(jié)素 CToyoda et al. , T. Biol. Chem. ,270 :7495-7500(1995)和 Komurasaki et al.,Oncogene, 15 :2841-2848(1997)) ;heregulin (參見下面);神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2 (NRG-2) (Carraway et al. , Nature, 387 :512-516(1997))神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3 (NRG-3) (Zhang et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. ,94 :9562-9567(1997));神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白 _4(NRG_4) (Harari et al. , Oncogene, 18 :2681-89(1999)) cripto(CR-I)(Kannan et al. , J. Biol. Chem., 272(6) :3330-3335(1997)) ο 結(jié)合 EGFR 的 ErbB 配基包括 EGF、TGF-α、雙調(diào)蛋白、β -動(dòng)物纖維素、HB-EGF和上皮調(diào)節(jié)素。結(jié)合ErbB3的ErbB配基包括heregulin。能夠結(jié)合ErbB4 的ErbB配基包括β-動(dòng)物纖維素、上皮調(diào)節(jié)素、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和heregulin。 ErbB配基還可以是合成的ErbB配基。合成的配基可以特異于特定的ErbB受體,或者能夠識(shí)別特定的ErbB受體復(fù)合物。合成配基的一個(gè)例子是合成的heregulin/egf嵌合雙調(diào)素 (biregulin)(參見,例如 Jones et al. ,FEBS Letters,447 :227-231 (1999),在此引入作為參考)。在此所用的“Heregulin”(HRG)是指由在美國(guó)專利號(hào)5,641,869或Marchionni et al. ,Nature, 362 :312-318(1993)中公開的 heregulin 基因產(chǎn)物所編碼的多肽。Heregulin 的例子包括 heregulin- α、heregulin-β 1、heregulin-β 2 禾口 heregulin-β 3 (Holmes et al.,Science, 256 :1205-1210(1992);和美國(guó)專利號(hào) 5,641,869) ;neu 分化因子(NDF) (Peles et al.,Cell,型205-216(1992));乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA) (Falls et al., Cell,72 :801-815(1993));神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子(GGF) (Marchionni et al.,Nature, 362 312-318(1993));感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衍生因子(SMDF) (Ho et al.,J. Biol. Chem.,270 14523-14532(1995)) ; y-heregulin(Schaefer et al. ,Oncogene, 15 :1385-1394(1997)) 該術(shù)語(yǔ)包括天然序列的HRG多肽的生物學(xué)活性片段和/或氨基酸序列變體,例如其EGF樣結(jié)構(gòu)域片段(例如,HRG β 1177-244)?!癊rbB異低聚物”在此是包含至少兩種不同ErbB受體的非共價(jià)結(jié)合的低聚體。 "ErbB 二聚體”是包含兩種不同ErbB受體的非共價(jià)結(jié)合的低聚體。當(dāng)表達(dá)兩種或更多種ErbB受體的細(xì)胞被暴露于ErbB配基時(shí),形成這種復(fù)合物。ErbB低聚體,例如ErbB 二聚體,可以通過免疫沉淀來分離并通過例如在Sliwkowski et al. , J. Biol. Chem., 269(20) :14661-14665(1994)中描述的SDS-PAGE來分析。這種ErbB異低聚體的例子包括 EGFR-ErbB2 (也稱作為 HER1/HER2),ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3)和 ErbB3_ErbB4 (HER3/HER4) 復(fù)合物。此外,ErbB異低聚體可以包含兩個(gè)或更多個(gè)與不同ErbB受體例如EAB3、ErbB4 或EGFR(ErbBl)結(jié)合的ErbB2受體。其他蛋白質(zhì),例如細(xì)胞因子受體亞單位(例如gpl30) 可以被包括在異低聚體中。"ErbB受體的配基活化”是指受結(jié)合到包含目的ErbB受體的ErbB異低聚體上的 ErbB配基調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如由ErbB受體的細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化ErbB受體或底物多肽中的酪氨酸殘基所引起的)。一般地,這涉及ErbB配基結(jié)合到ErbB異低聚體上,激活異低聚體中的一個(gè)或多個(gè)ErtB受體的激酶結(jié)構(gòu)域,從而導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)ErbB受體的中的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化和/或在額外的底物多肽中的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化。可以采用各種酪氨酸磷酸化分析來量化ErbB受體活化?!疤烊恍蛄小倍嚯氖蔷哂信c來自自然界的多肽(例如ErbB受體或ErbB配基)相同的氨基酸序列的多肽。這種天然序列多肽可以從自然界中分離或者可以通過重組或合成方法制備。因此,天然序列的多肽具有天然發(fā)生的人多肽、鼠多肽或來自任何其他哺乳動(dòng)物物種的多肽的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列變體”是指具有在一定程度上與天然序列多肽有區(qū)別的氨基酸序列的多肽。通常,氨基酸序列變體將與天然ErbB配基的至少一個(gè)受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者與天然ErbB受體的至少一個(gè)配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有至少約70%同源性,和優(yōu)選地至少約80%, 更加優(yōu)選地,與這種受體或配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域至少約90%同源。氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列中的某些位點(diǎn)上具有取代、缺失和/或插入?!巴葱浴北欢x為在必要時(shí)進(jìn)行序列比對(duì)和引入缺口以獲取最大的百分比同一性后氨基酸序列變體中的相同殘基的百分比。用于比對(duì)的方法和計(jì)算機(jī)程序在本領(lǐng)域是已熟知的。一種這種計(jì)算機(jī)程序是“Align 2”,由Genentech, Inc.創(chuàng)作,已經(jīng)在1991年12月 10日在華盛頓,DC 20559,美國(guó)版權(quán)局與用戶文檔(user documentation) 一起提交。術(shù)語(yǔ)“抗體”在此以最廣泛的意義被使用,特別地涵蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多重特異性抗體(例如雙特異性抗體),和抗體片段,只要其具有期望的生物學(xué)活性。如在此所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從基本上同型的抗體的群體中獲得的抗體,即包含群體的各個(gè)抗體除了以少量存在的可能天然發(fā)生的突變外,是相同的。單克隆抗體是高度特異的,針對(duì)單一的抗原位點(diǎn)。此外,與包含針對(duì)不同抗原決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑形成對(duì)比的是,各個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一抗原決定簇。除了其特異性外,單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)在于可以不受其他抗體污染地被合成。修飾語(yǔ)“單克隆”表示從基本上同型的抗體群體中獲得的抗體的特征,而不被解釋為需要通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如,根據(jù)本發(fā)明將被使用的單克隆抗體可以通過最早由Kohler et al.,Nature, 256 =495(1975)所描述的雜交瘤方法來制備,或者通過重組DNA方法(參見例如美國(guó)專利號(hào)4,816,567)來制備。還可以采用在例如Clackson et al.,Nature, 352 624-628(1991)和 Marks et al.,J. Mol. Biol. , 222 :581-597 (1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)中分離“單克隆抗體”。單克隆抗體在此特別地包括“嵌合”抗體,其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種或者屬于特定的抗體種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源,而該鏈的剩余部分與來自另一物種或者屬于另一抗體種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或相似,以及這種抗體的片段,只要這些片段展示出期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專利號(hào)4,816,567 ;和Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)) 在此的目的嵌合抗體包括含有衍生自非人靈長(zhǎng)類(例如舊大陸猴(Old World Monkey),猿等)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人的恒定區(qū)序列的“靈長(zhǎng)類化”抗體?!翱贵w片段”包含完整抗體的一部分,優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)??贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2、和Fv片段;微型雙功能抗體(diabodies);線性抗體;單鏈抗體分子;和由抗體片段形成的多重特異性抗體。“完整的”抗體是包含抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CH1,CH2和CH3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列的恒定結(jié)構(gòu)域(例如人天然序列的恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地,完整的抗體具有一種或多種效應(yīng)子功能。抗體的“效應(yīng)子功能”是指那些可歸結(jié)于抗體的Fc區(qū)域(天然序列的Fc區(qū)域或氨基酸序列變體的Fc區(qū)域)的生物學(xué)活性??贵w效應(yīng)子功能的例子包括Clq結(jié)合;補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性;Fc受體結(jié)合;抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用;細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體;BCR)的下調(diào)等。根據(jù)重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列,完整抗體抗原被分成不同“種類”。有五個(gè)主要的完整抗體的種類IgA、IgD、IgE、IgGjP IgM,并且這些中的部分還抗原進(jìn)一步分成 “亞類”(同種型),例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAjP IgA2。對(duì)應(yīng)于不同抗體種類的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱為α、δ、ε、Y和μ。不同種類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是已熟知的。“抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”和“ADCC”是指一種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng),其中表達(dá) Fc受體(FcR)的非特異性的細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞,嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體,并隨后引起靶細(xì)胞的溶解。用于介導(dǎo)ADCC的初級(jí)細(xì)胞 NK細(xì)胞僅表達(dá)Fc YRIII,而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI,F(xiàn)CYR II和FCYRIII。造血細(xì)胞上的 FcR 表達(dá)被總結(jié)在 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Immunol. ,9 :457-92 (1991)的第 464 頁(yè)的表3中。為了評(píng)價(jià)目的分子的ADCC活性,進(jìn)行例如在美國(guó)專利號(hào)5,500, 362或5,821,337 中描述的體外ADCC分析。可用于這種分析的有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC) 和天然殺傷(NK)細(xì)胞??蛇x擇地或者另外地,可以在體內(nèi)評(píng)價(jià)目的分子的ADCC活性,例如在如 Clynes et al. , PNAS(USA) ,95 =652-656 (1998)中披露的動(dòng)物模型中。“人的效應(yīng)細(xì)胞”是白細(xì)胞,其表達(dá)一種或多種FcR并且行使效應(yīng)子功能。優(yōu)選地, 該細(xì)胞至少表達(dá)Fc y RIII并且行使ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞; 而PBMC和NK細(xì)胞是優(yōu)選的。效應(yīng)子細(xì)胞可以從其天然來源中分離,例如如在此描述地來自血液或PBMC。術(shù)語(yǔ)“Fe受體”或“FcR”用于描述一種結(jié)合到抗體的Fc區(qū)域的受體。優(yōu)選的FcR 是人FcR的天然序列。此外優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR (γ受體),包括Fc γ RI、 FcyRII和Fc γ RIII亞類的受體,包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcyR II受體包括Fc YR II Α( “活化受體”)^P Fc y RIIB ( “抑制受體”),具有相似的氨基酸序列,主要區(qū)別在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。活化受體Fc γ R IIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有一個(gè)以免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的活化基序(an immunoreceptor tyrosine-based activation motif) (ITAM)。抑制受體Fc γ R II B在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有一個(gè)免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的抑
基序(an immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) (ITIM)。(參見綜述, Μ. Daeron, Annu. Rev. Immunol. ,15 :203-234 (1997))。FcR在 Ravetch 禾口 Kinet, Anne. Rev. Immunol. ,9 :457-92(1991) ;Capel et al. ,, Immunomethods,4 :25-34(1994);禾口 de Haas et al.,J. Lab. Clin. Med. ,126 :330-41 (1995)中被評(píng)述。其他的FcR,包括將來將被鑒定的那些,都被包含在此處的術(shù)語(yǔ)“FcR”中。該術(shù)語(yǔ)還包括新生兒的受體,F(xiàn)cto,其負(fù)責(zé)將母體的 IgG轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒(Guyer et al.,J. Immunol. ,117 :587(1976)禾口Kim et al.,J. ImmunoL, 24 :249(1994))?!把a(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性”或者“CDC”是指存在補(bǔ)體時(shí),分子溶解靶點(diǎn)的能力。補(bǔ)體活化路徑由補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)結(jié)合到與關(guān)聯(lián)抗原復(fù)合的分子(例如,一種抗體) 上起始。為了i平價(jià)補(bǔ)體活化,可進(jìn)行如在Gazzano—Santoro et al. , J. Immunol. Methods, 202 :163(1996)中描述的CDC分析?!疤烊豢贵w”通常是約150,000道爾頓的由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈 (H)組成的異四聚糖蛋白。每條輕鏈通過共價(jià)二硫鍵連接到重鏈上,而且二硫鍵的數(shù)量隨著不同免疫球蛋白同種型的重鏈而變化。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)則的間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。 每條重鏈在其一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VH),隨后是大量的恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在其一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VL),并在另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域。輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域?qū)?zhǔn)(align)重鏈的第一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域,而輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)?zhǔn)重鏈的可變結(jié)構(gòu)域。一般認(rèn)為,特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間形成一個(gè)界面。術(shù)語(yǔ)“可變的”是指可變結(jié)構(gòu)域的某些部分在抗體的序列中廣泛地變化,被用于每一特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。但是,可變性不是均勻地分布在抗體的可變結(jié)構(gòu)域中。其集中在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域上的稱為高變區(qū)(hypervariable region)的三個(gè)片段上??勺兘Y(jié)構(gòu)域的更加高度保守部分稱作骨架區(qū)(framework region) (FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域每個(gè)都包含四個(gè)FR,大部分采用β片層構(gòu)型,由三個(gè)高變區(qū)連接, 形成環(huán)狀連接,有時(shí)形成β片層結(jié)構(gòu)的一部分。各條鏈中的高變區(qū)通過FR被緊密地固定在一起,并與其他鏈的高變區(qū)一起導(dǎo)致抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見Kabat et al.,具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列(Sequences of Proteins of immunological Interest),第 5 片反.Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, MD. (1991))。 恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與將抗體與抗原的結(jié)合,但是具有各種效應(yīng)子功能,例如參與抗體在抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)中的作用。當(dāng)用于本文時(shí),術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”是指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如,輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基 24-34 (Li) ,50-56 (L2)和 89-97 (L3),以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的 31-35 (Hl),50-65 (H2) 和95_102(H3) ;Kabat et al.,具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列,第5版.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))禾口 / 或來自“高變區(qū)環(huán)” ("hypervariable loop”)的那些殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基沈_32 (Li), 50-52 (L2),91-96 (L3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的 26-32 (Hl),53-55 (H2)和 96-101 (H3); Chothia 和 Lesk, J. Mol. Biol.,皿=901-917 (1987))?!肮羌軈^(qū)”或 “FR” 殘基是那些如在此所定義的高變區(qū)殘基之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基。木瓜蛋白酶消化抗體生成兩種相同的抗原結(jié)合片段,稱作“Fab”片段,每個(gè)片段具有一個(gè)單一的抗原結(jié)合位點(diǎn)和殘余的“Fe”片段,其名稱反映其很容易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理生成具有兩抗原結(jié)合位點(diǎn)的F (ab' ) 2片段,并且仍能夠與抗原交聯(lián)?!癋v”是最小的抗體片段,其含有完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)。該區(qū)域由以緊密和非共價(jià)連接的由一條重鏈和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域組成的二聚體組成。是在這一構(gòu)型中,各個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)高變區(qū)相互作用來確定VH-VL 二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。總的來說,六個(gè)超變區(qū)將抗原結(jié)合特異性賦予給抗體。但是,即使是單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或者僅包含三個(gè)特異于抗原的高變區(qū)的Fv的一半)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力,雖然其親合性低于完整結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段還含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域以及重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CHl)。Fab'片段與Fab片段的不同在于在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基端增加少數(shù)殘基,包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab' -SH在此是指恒定結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基帶有至少一個(gè)游離巰基的Fab'。F(ab' ) 2抗體片段最初以一對(duì)之間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab'片段生成。 抗體片段的其他化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。根據(jù)恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列,來自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體的“輕鏈”被劃歸入兩種明顯區(qū)別的種類之一,稱作kappa (κ )和lambda (λ )?!皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域,其中這些結(jié)構(gòu)域在單一的多肽鏈中存在。優(yōu)選地,F(xiàn)v多肽還包含VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭,使scFv形成期望的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。對(duì)scFv的綜述,參見PlUckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113 中的文章,Rosenburg 禾口 Moore 編輯,Springer-Verlag, New York, 269-315(1994)??笶rbB2抗體的scFv片段被描述在WO 93/16185 ;美國(guó)專利號(hào)5,571,894 ; 和美國(guó)專利號(hào)5,587,458中。術(shù)語(yǔ)“微型雙功能抗體”是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段,該片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)上連接到可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(VL)的可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH)。通過使用接頭,該接頭非常之短,以致于無(wú)法使同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域配對(duì),結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì),產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。微型雙功能抗體在例如EP404,097 ;WO 93/11161 ;和 Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :6444-6448 (1993)中被更充分地描述。非人(例如嚙齒類動(dòng)物)抗體的“人源化”形式是含有來自非人類的免疫球蛋白的最短序列的嵌合抗體。人源化抗原的大部分是人的免疫球蛋白(受體抗體),其中來自受體的高變區(qū)的殘基被來自具有期望特異性、親合性和能力的非人類物種的高變區(qū)(供體抗體)的殘基替代,非人類物種例如小鼠、大鼠、兔或非人類的靈長(zhǎng)類。在某些情況下,人免疫球蛋白的骨架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人類的殘基替代。此外,人源化抗體可能包含不存在于受體抗體或供體抗體中的殘基。進(jìn)行這些修飾來進(jìn)一步改善抗體性能。一般地,人源化抗體將包含至少一個(gè),和典型地兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部,其中對(duì)應(yīng)于非人類的免疫球蛋白的高變區(qū)環(huán)的全部或基本上全部和FR的全部或基本上全部是人的免疫球蛋白序列的那些部分。人源化抗體可選擇地還包含至少免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe),通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的一部分。更加詳細(xì)的描述,參見Jones et al. ,Nature, 321 =522-525(1986); Riechmann et al.,Nature,332 :323-329(1988);禾口 Presta,Curr. Op. Struct. Biol. ,2 593-596(1992)。人源化的抗ErbB2的抗體包括在美國(guó)專利號(hào)5,821,337的表3中描述的 huMAb4D5-l, huMAb4D5_2,huMAb4D5_3,huMAb4D5_4,huMAb4D5_5,huMAb4D5_6,huMAb4D5_7
和huMAb4D5-8 (HERCEPTIN ),在此明確引入作為參考;在下面描述的人源化520C9(W0
93/21319)和人源化2C4抗體?!胺蛛x的”抗體是從其天然環(huán)境的組分中鑒定和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染物組分是妨礙該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì),可能包括酶、激素和其他蛋白的或非蛋白溶解物。在優(yōu)選實(shí)施方案中,抗體被純化(1)如通過Lowry方法所測(cè)定的,至超過95%的抗體重量,最優(yōu)選重量超過99%,(2)以達(dá)到足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)N-末端殘基或內(nèi)在氨基酸序列的程度,或(3)以在還原或非還原條件下采用考馬斯蘭或者優(yōu)選銀染通過SDS-PAGE測(cè)定達(dá)到均一性。被分離的抗體包括在重組細(xì)胞中的原位抗體,這是由于抗體天然環(huán)境中的至少一個(gè)組分將不存在。但是,一般地,被分離的抗體將通過至少一個(gè)純化步驟來制備?!敖Y(jié)合”目的抗原例如ErbB2抗原的抗體,是能夠以足夠的親合性結(jié)合該抗原使得該抗體可用于靶向表達(dá)該抗原的細(xì)胞的抗體。如果抗體是結(jié)合ErbB2的抗體,該抗體通常將優(yōu)先地結(jié)合ErbB2而不是其他ErbB受體,并且是不會(huì)顯著地與其他蛋白例如EGFR,ErbB3 或ErbB4交叉反應(yīng)的抗體。在這樣的實(shí)施方案中,通過熒光激活細(xì)胞分選(FACQ分析或放射免疫沉淀(RIA),抗體與這些非ErbB2蛋白質(zhì)的結(jié)合程度(例如與內(nèi)源受體的細(xì)胞表面結(jié)合)將小于10%。有時(shí),抗ErbB2的抗體不會(huì)顯著地與大鼠neu蛋白發(fā)生交叉反應(yīng),例如在 Schecter et al. ,Nature, 312 :513(1984)禾口 Drebin et al. ,Nature, 312 :545-548(1984) 中所描述。阻斷ErbB受體的配基活化的抗體是降低或阻止上文定義的這種活化的抗體,其中該抗體實(shí)質(zhì)上能夠比單克隆抗體4D5更加有效地阻斷ErbB受體的配基活化,例如,與單克隆抗體7F3或2C4或其Fab片段大約一樣有效,和優(yōu)選地與單克隆抗體2C4或其Fab片段大約一樣有效。例如,阻斷ErbB受體的配基活化的抗體是在阻斷ErbB異低聚體形成上比4D5有效約50-100%的抗體。阻斷ErbB受體的配基活化可以通過任何手段發(fā)生,例如, 通過干擾配基結(jié)合ErbB受體、ErbB復(fù)合物形成、ErbB復(fù)合物中ErbB受體的酪氨酸激酶活性和/或ErbB中或者通過ErbB受體的酪氨酸激酶殘基的磷酸化。阻斷ErbB受體的配基活化的抗體的例子包括單克隆抗體2C4和7F3 (其阻斷ErbB2/ErbB3和ErbB2/ErbB4異低聚體的HRG活化;和EGFR/ErbB2異低聚體的EGF,TGF- α,雙調(diào)蛋白,HB-EGF和/或上皮調(diào)節(jié)素活化);和 I^6,L96 和 L288 抗體(Klapper et al. , Oncogene, 14 :2099-2109 (1997)), 其阻斷EGF和NDF結(jié)合到表達(dá)EGFR,ErbB2, ErbB3和ErbB4的!"470細(xì)胞上。具有指定抗體例如稱作2C4的單克隆抗體的“生物學(xué)特征”的抗體,是具有一種或多種使其區(qū)別于結(jié)合到相同抗原(例如ErbB2)上的其它抗體的生物學(xué)特征的抗體。例如具有2C4的生物學(xué)特征的抗體,可能阻斷包含ErbB2和ErbB3,ErbBl或ErbB4的ErbB異低聚體的HRG活化;阻斷包含EGFR和ErbB2的ErbB受體的EGF,TGF- α,HB-EGF,上皮調(diào)節(jié)素和/或雙調(diào)蛋白的活化;阻斷MAPK的EGF,TGF- α和/或HRG介導(dǎo)的活化;和/或結(jié)合到ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的被2C4結(jié)合的相同表位上,(例如阻斷單克隆抗體2C4結(jié)合到 ErbB2上的抗體)。除非另外指出,用語(yǔ)“單克隆抗體2C4”是指具有下面的實(shí)施例的鼠2C4抗體的抗原結(jié)合殘基的或衍生自該鼠2C4抗體的抗體。例如,單克隆抗體2C4可以是鼠單克隆抗體 2C4或其變體,例如人源化抗體2C4,具有鼠單克隆抗體2C4的抗原結(jié)合氨基酸殘基。人源化2C4抗體的例子在本文和WO 01/00245中提供,WO 01/00245在此全文引入作為參考。除非另外指出,在此所用的用語(yǔ)“rhuMAb 2C4”是指包含被融合到任選由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO) 細(xì)胞表達(dá)的人輕鏈和重鏈IgGl (非A同種異型)恒定區(qū)序列的,分別為SEQ ID No. 3和4的可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)序列的抗體。除非另外指出,術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體4D5”是指具有鼠4D5抗體(ATCC CRL10463) 的抗原結(jié)合殘基的或者衍生自該抗體的抗體。例如,單克隆抗體4D5可以是鼠單克隆抗體4D5或其變體,例如具有鼠單克隆抗體4D5的抗原結(jié)合殘基的人源化4D5。示例性的人源化 4D5 抗體包括在美國(guó)專利號(hào) 5,821,337 中的 huMAb4D5_l,huMAb4D5_2,huMAb4D5_3, huMAb4D5-4, huMAb4D5_5,huMAb4D5_6,huMAb4D5_7 禾口 huMAb4D5_8 (HERCEPTIN ), huMAb4D5-8 (HERCEPTIN )是優(yōu)選的人源化4D5抗體。“生長(zhǎng)抑制劑”用于此是指在體外或體內(nèi)抑制細(xì)胞,特別是表達(dá)ErbB的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的化合物或組合物。因此,生長(zhǎng)抑制劑是在S期顯著降低表達(dá)ErbB的細(xì)胞的比例的試劑。 生長(zhǎng)抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(jìn)(在S期之外的地方)的試劑,例如誘導(dǎo)Gl停滯和M期停滯的試劑。經(jīng)典M期阻斷劑包括長(zhǎng)春花堿(vincas)(長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿),紫杉烷二萜(taxane),和II型拓?fù)湟种苿?,例如阿霉素,表柔比?印irubicin),柔紅霉素,依托泊苷(etoposide)和博萊霉素。那些阻滯Gl期的試劑還延伸到S期阻滯,例如DNA烷基化試劑例如三苯氧胺,強(qiáng)的松,氮烯米胺(dacartazine),雙氯乙基甲胺,順鉬,氨甲蝶呤,5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。更加詳細(xì)的信息可見“癌癥的分子基礎(chǔ)”,Mendelsohn和Israel編輯, 第1章,由Murakami等編寫的標(biāo)題為“細(xì)胞周期調(diào)控,癌基因和抗腫瘤藥”,(WB Saunders Philadelphia, 1995),特別是第 13 頁(yè)?!吧L(zhǎng)抑制”的抗體的例子是那些結(jié)合到ErbB2并且抑制過度表達(dá)ErbB2的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制抗ErbB2的抗體以大約0. 5-30 μ g/ml的抗體濃度抑制細(xì)胞培養(yǎng)物中20%以上的SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),優(yōu)選超過50% (例如從約50%到約 100% ),其中生長(zhǎng)抑制作用是在將SK-BR-3細(xì)胞暴露于抗體6天后測(cè)定的(參見1997年 10月14日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)5,677,171)。SK-BR-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制分析在該專利和下面中被更加詳細(xì)地描述。優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制抗體是單克隆抗體4D5,例如人源化的4D5。“誘導(dǎo)細(xì)胞死亡”的抗體是使活細(xì)胞不能存活的抗體。細(xì)胞通常是表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞,特別地該細(xì)胞過度表達(dá)ErbB2受體。優(yōu)選地,該細(xì)胞是癌細(xì)胞,例如乳腺、卵巢、 胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、大腸、甲狀腺、胰腺或膀胱細(xì)胞。在體外,細(xì)胞可以是SK-BR-3, BT474, Calu 3細(xì)胞,MDA-MB-453, MDA-MB-361或SK0V3細(xì)胞??梢酝ㄟ^在缺乏補(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞的情況下測(cè)定體外細(xì)胞死亡,來區(qū)分由抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC) 或由補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)引起的細(xì)胞死亡。因此,可以采用加熱滅活血清(即缺乏補(bǔ)體)和缺乏免疫效應(yīng)細(xì)胞時(shí)進(jìn)行細(xì)胞死亡的分析。為了確定抗體是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡, 可以相對(duì)于未被處理的細(xì)胞評(píng)價(jià)膜完整性的缺失,通過碘化丙錠(PI)、臺(tái)盼蘭(參見Moore et al. , Cytotechnology, 17 1-11 (1995))或7AAD的攝取來評(píng)價(jià)膜完整性的喪失。優(yōu)選的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體是那些在BT474細(xì)胞中在PI攝取分析試驗(yàn)中誘導(dǎo)PI攝取的抗體(參見下文)?!罢T導(dǎo)凋亡”的抗體是那些誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的抗體,由膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細(xì)胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞破裂和/或膜泡形成(稱作凋亡小體)確定細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞通常是過度表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞。優(yōu)選地,細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞,例如乳腺、卵巢、 胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、大腸、甲狀腺、胰腺或膀胱細(xì)胞。在體外,細(xì)胞可以是SK-BR-3, BT474, Calu3細(xì)胞,MDA-MB-453, MDA-MB-361或SK0V3細(xì)胞。有多種方法可用于評(píng)價(jià)與凋亡相關(guān)的細(xì)胞事件。例如,通過膜聯(lián)蛋白結(jié)合檢測(cè)磷脂酰絲氨酸(PQ的轉(zhuǎn)移;通過DNA梯 (laddering)評(píng)價(jià)DNA斷裂;并且核/染色質(zhì)濃縮以及DNA斷裂可通過亞二倍體細(xì)胞中的任何增加來評(píng)價(jià)。優(yōu)選地,誘導(dǎo)凋亡的抗體是在BT474細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合分析中,引起相對(duì)于未處理細(xì)胞約2-50倍,優(yōu)選約5-50倍,和最優(yōu)選約10-50倍的膜聯(lián)蛋白結(jié)合的誘導(dǎo) (見下文)。有時(shí),前凋亡抗體(pro-apoptotic antibody)是還會(huì)進(jìn)一步阻斷ErbB受體的 ErbB配基活化的抗體(例如7F3抗體);即與單克隆抗體2C4具有共同生物學(xué)特征的抗體。 在其他情形下,抗體是不會(huì)顯著地阻斷ErbB受體的ErbB配基活化的抗體(例如7C2)。此外,抗體是如7C2的抗體,其在誘導(dǎo)凋亡時(shí),不誘導(dǎo)在S期的細(xì)胞百分率的大量減少(例如相對(duì)于對(duì)照,僅誘導(dǎo)這些細(xì)胞的百分率的0-10%的減少)。“表位2C4”是抗體2C4結(jié)合的ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域。為了篩選結(jié)合 2C4表位的抗體,可以進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷分析,例如在“抗體,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow和David Lane (1988) ”中描述的分析。此外,可進(jìn)行表位作圖來評(píng)價(jià)抗體是否結(jié)合到ErbB2的2C4表位上(例如,ErbB2的從約殘基22到約殘基584 中的任何一個(gè)或多個(gè)殘基,包括殘基22和殘基584 ;參見附圖1A-B)。“表位4D5”是抗體4D5(ATCC CRL 10463)結(jié)合的ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域。 該表位鄰近ErbB2的跨膜結(jié)構(gòu)域。為了篩選結(jié)合4D5表位的抗體,可以進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷分析,例如在“抗體,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),ColdSpring Harbor Laboratory, Ed Harlow 和 David Lane (1988),,中描述的分析。此外,可進(jìn)行表位作圖來評(píng)價(jià)抗體是否結(jié)合到ErbB2的4D5 表位上(例如,從約殘基5 到約殘基625中的任何一個(gè)或多個(gè)殘基,包括殘基5 和殘基 625 ;參見附圖1A-B)?!氨砦?H4”是抗體3H4結(jié)合的ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域。該表位包括在 ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的氨基酸序列中的從約541到約599的殘基,包括殘基Ml和殘基 599,參見附圖IA-B?!氨砦?C2/7F3”是在ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的N末端的區(qū)域,被7C2和/或7F3抗體(都保藏在ATCC中,見下文)結(jié)合。為了篩選結(jié)合到7C2/7F3表位的抗體,可以進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷分析,例如在“抗體,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow 和David Lane (1988)”中描述的分析。此外,可以進(jìn)行表位作圖來確定該抗體是否結(jié)合到 ErbB2上的7C2/7F3表位上(例如,在ErbB2的約殘基22到約殘基53的區(qū)域上的任何一個(gè)或多個(gè)殘基;參見附圖1A-B)。用于處理目的的“哺乳動(dòng)物”是指被分類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物,包括人,家養(yǎng)動(dòng)物和役使動(dòng)物,和動(dòng)物園、比賽、或?qū)櫸飫?dòng)物,例如狗、馬、貓、奶牛等。優(yōu)選,該哺乳動(dòng)物是人?!皩?duì)處理有響應(yīng)”的腫瘤在公認(rèn)的動(dòng)物模型或人臨床試驗(yàn)中,表現(xiàn)出對(duì)抗ErbB的抗體處理的響應(yīng)相對(duì)于與未處理或用安慰劑處理具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義的顯著改善,或者對(duì)抗 ErbB的抗體的最初處理有響應(yīng),但是繼續(xù)處理時(shí)仍然生長(zhǎng)。術(shù)語(yǔ)“處理”(treat)或“處理”(treatment)是指治療性處理和預(yù)防性 (prophylactic)或預(yù)防性(preventative)措施,其中目的在于防止或減緩(減輕)不期望的生理變化或紊亂,例如癌癥發(fā)生或擴(kuò)散。對(duì)于本發(fā)明的目的,有益的或期望的臨床結(jié)果包括,但是不限于,無(wú)論是可檢測(cè)的或不可檢測(cè)的,癥狀緩和,疾病程度降低,疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即,未惡化),延遲或減緩疾病進(jìn)展,改善或減輕疾病狀態(tài),和消除(無(wú)論部分地或完全地)。“處理”還指相對(duì)于未接受處理的預(yù)期存活時(shí)間,延長(zhǎng)存活。那些需要處理的包括那些已經(jīng)患有病癥或者紊亂的以及那些傾向于患有病癥或者紊亂的或者那些其中這些病癥或紊亂將被預(yù)防的?!拔蓙y”是將從本發(fā)明的處理中獲益的任何病癥。這包括慢性和急性的病癥或疾病,包括那些使哺乳動(dòng)物傾向于所述紊亂的病理癥狀。在此將被處理的紊亂的非限制性例子包括良性和惡性腫瘤;白血病和淋巴惡性腫瘤,特別是乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、 肺、腎、大腸、甲狀腺、胰腺、前列腺或膀胱癌;神經(jīng)元的、神經(jīng)膠質(zhì)的、星形膠質(zhì)的、下丘腦的和其他腺體、巨噬細(xì)胞的、上皮的、基質(zhì)的和囊胚的紊亂;和炎癥性的、血管生成的和免疫學(xué)的紊亂。按照本發(fā)明的將被處理的優(yōu)選紊亂是惡性腫瘤。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指足以有效治療哺乳動(dòng)物中的疾病或紊亂的藥物含量。在癌癥的情況下,藥物的治療有效量可能減少癌細(xì)胞的數(shù)量;降低腫瘤的大??;抑制(即減緩到一定程度和優(yōu)選阻止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)到周圍器官中;抑制(即減緩到一定程度和優(yōu)選阻止) 腫瘤轉(zhuǎn)移;在某種程度上抑制腫瘤生長(zhǎng);和/或在一定程度上減輕一種或多種與癌癥相關(guān)的癥狀。在藥物可能阻止生長(zhǎng)和/或殺死存在的癌癥細(xì)胞的程度上,它可以是抑制細(xì)胞性的和/或細(xì)胞毒性的。對(duì)于癌癥治療,例如可以通過估計(jì)疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP)和/或測(cè)定反應(yīng)率(RR)來測(cè)量效率。術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌癥的”是指或者描述哺乳動(dòng)物中的一種生理狀態(tài),其典型特征在于不受調(diào)控的細(xì)胞生長(zhǎng)。“腫瘤”包含一種或多種癌細(xì)胞。癌癥的例子包括,但是不限于癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴惡性腫瘤。這種癌癥的更加特別的例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌),肺癌包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌(“NSCLC”),肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌,腹膜癌,肝細(xì)胞癌,胃的或胃癌包括胃腸癌,胰腺癌,惡性膠質(zhì)瘤,宮頸癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,肝細(xì)胞瘤,乳腺癌,結(jié)腸癌,直腸癌,結(jié)腸直腸癌,子宮內(nèi)膜癌或子宮癌,唾液腺癌,腎臟或腎的癌,前列腺癌,陰門癌,甲狀腺癌,肝癌,肛門癌,陰莖癌,以及頭部和頸部癌?!氨磉_(dá)ErbB的癌癥”是包含細(xì)胞表面存在ErbB蛋白的細(xì)胞的癌癥。“表達(dá)ErbB2 的癌癥”是在其細(xì)胞表面生成足夠水平ErbB2的癌癥,使得抗ErbB2的抗體可以結(jié)合到那里并對(duì)該癌癥具有治療作用?!疤卣髟谟谶^度活化”ErbB受體的癌癥是在癌癥細(xì)胞中ErbB受體活化的程度顯著超過該受體在相同組織類型的非癌癥細(xì)胞中的活化水平的癌癥。這種過度活化可能由ErbB 受體的過度表達(dá)、和/或在癌癥細(xì)胞中可用于激活ErbB受體的ErbB配基高于正常水平所導(dǎo)致的。這種過度活化可能引起癌細(xì)胞的惡性狀況和/或由癌細(xì)胞的惡性狀態(tài)引起。在一些實(shí)施方案中,對(duì)癌癥進(jìn)行診斷或預(yù)測(cè)分析來確定是否發(fā)生會(huì)導(dǎo)致ErbB受體的這種過度活化的ErbB受體的增殖和/或過度表達(dá)??蛇x擇地,或另外地,對(duì)癌癥進(jìn)行診斷或預(yù)測(cè)分析來確定癌癥中是否發(fā)生會(huì)導(dǎo)致受體過度活化的ErbB配基的擴(kuò)增和/或過度表達(dá)。在這種癌癥的亞群中,受體的過度活化可能源自自分泌刺激路徑。在“自分泌”刺激路徑中,通過既生成ErbB配基也生成其關(guān)聯(lián)ErbB受體的癌癥細(xì)胞發(fā)生自我刺激。例如,癌癥可能表達(dá)或過度表達(dá)EGFR,以及還表達(dá)或過度表達(dá)EGFR配基 (例如,EGF,TGF-a或HB-EGF)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,癌癥可能表達(dá)或過度表達(dá)ErbB2,以及表達(dá)或過度表達(dá)heregulin (例如γ -HRG)?!斑^度表達(dá)”ErbB受體的癌癥是相對(duì)于相同組織類型的非癌癥細(xì)胞,在該細(xì)胞表面上具有顯著較高水平的ErbB受體,例如ErbB2。這種過度表達(dá)可能通過基因擴(kuò)增或通過轉(zhuǎn)錄或翻譯增強(qiáng)而引起。ErbB受體過度表達(dá)可以通過評(píng)價(jià)存在于細(xì)胞表面的ErbB蛋白質(zhì)水平的升高在診斷或預(yù)測(cè)分析中被確定(例如通過免疫組織化學(xué)分析;IHC)??蛇x擇地或另外地,可以測(cè)量細(xì)胞中編碼ErbB的核酸的水平,例如通過熒光原位雜交(FISH ;參見 1998年10月公開的WO 98/45479),DNA印跡,或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù),例如實(shí)時(shí)定量 PCR(RT-PCR)??梢酝ㄟ^評(píng)價(jià)患者中,例如腫瘤活組織檢查中的配基水平(或者編碼其的核酸),或通過各種診斷分析例如IHC,F(xiàn)ISH, DNA印跡,PCR或上述的體內(nèi)分析來診斷性地確定ErbB配基的過度表達(dá)。還可以檢測(cè)生物學(xué)液體例如血清中的脫落抗原(shed antigen) (例如ErbB的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)來研究ErbB受體的過度表達(dá)(參見例如1990年6月12日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)4,933,四4 ;1991年4月18日公開的WO 91/05264 ;1995年3月28日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào) 5,401,638 ;和 Sias et al. , T. Immunol. Methods, 132 :73-80 (1990))。除了上述分析,各種其他的體內(nèi)分析對(duì)熟練技術(shù)人員來說是可獲得的。例如,可以將患者體內(nèi)的細(xì)胞暴露于抗體,該抗體可選擇地用可檢測(cè)標(biāo)記,例如放射性同位素標(biāo)記,并可以評(píng)價(jià)抗體與患者體內(nèi)細(xì)胞的結(jié)合,例如通過外部掃描放射性或者通過分析從預(yù)先暴露于抗體的患者中獲得的活組織檢查。過度表達(dá)HER2的腫瘤可以通過對(duì)應(yīng)于每個(gè)細(xì)胞表達(dá)的HER2分子的拷貝數(shù)的免疫組織化學(xué)分值來估計(jì),可以從生物化學(xué)上測(cè)定0 = 0-10,000拷貝/細(xì)胞,1+ =至少約 200,000拷貝/細(xì)胞,2+ =至少約500,000拷貝/細(xì)胞,3+ =至少約2,000, 000拷貝/細(xì)胞。水平為3+的HER2的過度表達(dá)會(huì)引起酪氨酸激酶發(fā)生不依賴于配基的活化(Hudziak et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,M :7159-7163 [1987]),在大約 30% 的乳腺癌中發(fā)生,并且在這些患者中,不復(fù)發(fā)存活和總存活下降(Slamon et al.,Science, 244 :707-712「19891 ; Slamon et al.,Science,235 177—182「19871)。相反,“不具有ErbB2受體過度表達(dá)特征”的癌癥是在診斷性分析中與相同組織類型的非癌癥細(xì)胞相比不表達(dá)高于正常ErbB2受體水平的ErbB2受體的癌癥?!安灰蕾囉诩に亍钡陌┌Y是其增殖不依賴于與由癌癥中細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合的激素存在與否。在施用降低腫瘤中或附近的激素濃度的藥物或手術(shù)方案時(shí),這種癌癥不會(huì)發(fā)生臨床退化。不依賴于激素的癌癥的例子包括不依賴于雄激素的前列腺癌,不依賴于雌激素的乳腺癌,子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌。這種癌癥可能開始于激素依賴的腫瘤,并在抗激素治療后由激素敏感階段發(fā)展到激素難治的腫瘤。如在此所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性劑”是指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞破壞的一種物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)想要包括放射性同位素(例如At211,1131,1125,Y90, Rel86,Rel88, Sml53,Bi212,P32和Lu的放射性同位素),化學(xué)治療劑,和毒素例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的小分子毒素或酶活性毒素,包括其片段和/或變體。“化學(xué)治療劑”是在癌癥治療中有用的化學(xué)化合物?;瘜W(xué)治療劑的例子包括烷基化劑例如三胺磷和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN );烷基磺酸鹽例如白消安,二丙胺磺酯和哌泊舒凡;氮丙啶例如芐替哌(benzodopa),卡巴醌(carboquone),四甲尿烷亞胺(meturedopa), 和烏瑞替哌(uredopa);氮丙啶methylamelamine和包括六甲嘧胺(altretamine),曲他胺(triethylenemelamine),三亞乙基憐酉先胺,塞替哌(triethylenethiophosphaoramide)禾口三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥例如苯丁酸氮芥,萘氮芥(chlomaphazine), cholophosphamide,雌莫司汀(estramustine),異環(huán)磷酰胺(ifosfamide),雙氯乙基甲胺(mechlorethamine),鹽酸甲氧氮芥,苯丙氨酸氮芥,新氮芥,苯芥膽固醇,松龍苯芥 (prednimustine),三芥環(huán)磷酰胺,尿嘧啶芥;亞硝基脲(nitrosurea)例如亞硝基脲氮芥, 氯脲霉素,福泰氮芥(fotemustine),羅莫司丁(Iomustine),尼莫司唆(nimustine),雷尼司啶(ranimustine);抗生素例如阿克拉霉素,放射菌素,authramycin,重氮絲氨酸,博來霉素,cactinomycin,力口禾丨J車霉素,carabicin,洋紅霉素,嗜癌菌素(carzinophilin), 色霉素,放線菌素D,柔紅霉素,二乙氧醋酰阿霉素,6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸,阿霉素,表柔比星,去羥阿霉素,伊達(dá)比星,麻西羅霉素,絲裂菌素,霉酚酸,諾加拉霉素,橄欖霉素,培來霉素,potfiromycin,嘌呤霉素,quelamycin, rodorubicin,鏈黑菌素,鏈脲霉素,殺結(jié)核菌素,百士欣,新制癌素,佐柔比星;抗代謝物例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶 (5-FU);葉酸類似物例如二甲葉酸,氨甲蝶呤,蝶酰三谷氨酸,曲美沙特;嘌呤類似物例如氟達(dá)拉賓(fludarabine),6_巰基嘌呤,硫唑鳥嘌呤,硫鳥嘌呤;嘧啶類似物例如環(huán)胞苷 (ancitabine),氮雜胞苷(azacitidine),6_氮雜尿苷,卡莫氟,阿糖胞苷(cytarabine), 雙脫氧尿苷,去氧氟尿苷,依諾他賓(enocitabine),氟尿嘧啶脫氧核苷(floxuridine), 5-FU ;雄性激素例如卡魯睪酮,羥甲雄酮丙酸酯,環(huán)硫雄醇(epitiostanol),甲環(huán)硫甾烷, 睪內(nèi)脂(testolactone);抗腎上腺素例如氨基苯乙哌啶酮,米托坦(mitotane),曲洛司坦 (trilostane);葉酸補(bǔ)充物例如 frolinic acid ;醋葡內(nèi)酉旨;aldophosphamide glycoside ; 氨基乙酰丙酸;胺苯吖啶(amsacrine) ;bestrabucil ;比山群(bisantrene);依達(dá)曲沙(edatraxate) ;defofamine ;月兌 M 秋水仙喊(demecolcine);地口丫酉昆(diaziquone); elfornithine ;醋酸羥嗶咔唑;環(huán)氧甘醚;硝酸鎵;羥基脲;香菇多糖;氯尼達(dá)明 (Ionidamine);丙米月宗(mitoguazone);米托惠酉昆(mitoxantrone);莫匹達(dá)i某(mopidamol); 二胺硝吖啶;噴司他丁 ;苯來美特(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);足葉草胼;2-足葉草胼;甲基芐胼;PSK ;丙亞胺(razoxane);西作非蘭;螺旋鍺(spirogermanium); 細(xì)交鏈孢菌酮酸;三亞胺醌;2,2',2〃 -三氯乙胺;氨基甲酸乙酯(urethan);長(zhǎng)春地辛 (vindesine);氮烯米胺;甘露醇氮芥(mannomustine) ;二溴甘露醇(mitobronitol) ;二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman) ;gacytosine ;阿糖胞苷(“Ara-C");環(huán)磷酰胺;三胺硫磷;紫杉烷二萜(taxane),例如泰素(paclitaxel) ( TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)和多西他賽(docetaxel) ( TAXOTERE , Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France);苯丁酸氮芥;吉西他濱;6-硫鳥嘌呤;巰基嘌呤; 氨甲蝶呤;鉬類似物例如順鉬和卡鉬(carboplatin);長(zhǎng)春堿;鉬;依托泊甙(etoposide) (VP-16);異環(huán)磷酰胺;絲裂菌素C ;米托蒽醌;長(zhǎng)春新堿;失碳長(zhǎng)春堿(vinorelbine);異長(zhǎng)春花堿(navelbine);鹽酸米托蒽醌;替尼泊甙(teniposide);柔紅霉素;氨基蝶呤;希羅達(dá)(xeloda);伊本膦酸鈉(ibandronate) ;CPT-11 ;拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000 ;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);視黃酸;埃斯波霉素;卡培他濱(capecitabine);以及任何上述的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在該定義中還包括的是作為調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤作用的抗激素試劑,例如抗雌激素,包括例如三苯氧胺,雷洛昔芬(raloxifene),芳香酶(aromatase)抑制性4(5)-咪唑,4-羥基三苯氧胺,曲奧昔芬(trioxifene),keoxifene, LYl 17018,奧那斯酮(onapristone),和托瑞米芬(toremifene) (Fareston);和抗雄性激素的例如氟他胺 (flutamide),尼魯米特(nilutamide),比卡魯胺(bicalutamide),利普安(Ieuprolide)和性瑞林(goserelin)及其任何上述的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。如在此所用,術(shù)語(yǔ)“靶向EGFR的藥物”是指結(jié)合到EGFR和任選地抑制EGFR活化的治療劑。這種試劑的例子包括結(jié)合EGFR的抗體和小分子。結(jié)合到EGFR的抗體的例子包括 MAb 579(ATCC CRL HB 8506), MAb455(ATCC CRL HB8507), MAb 225(ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL8509)(參見美國(guó)專利4,943,533,Mendelsohn等)及其變體,例如嵌合的 225 (C225 或Cetuximab ;ERBUTIX )和改造的人 225 (H225)(參見 WO 96/40210, Imclone Systems Inc.);結(jié)合II型突變EGFR的抗體(美國(guó)專利5,212,四0);結(jié)合EGFR的人源化的和嵌合的抗體被描述在美國(guó)專利5,891,996 ;以及結(jié)合EGFR的人抗體,例如ABX-EGF (參見 WO 98/50433,AbgeniX)。抗EGFR的抗體可以與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián),從而產(chǎn)生一種免疫偶聯(lián)物 (參見,例如EP659,439A2,Merck Patent GmbH)。結(jié)合EGFR的小分子的例子包括ZD1839 或Gefitinib (IRESSA ;Astra Zeneca), CP-358774 (TARCEVA ;Genentech/OSI)和AG1478, AG1571(SU 5271 ; Sugen)?!袄野彼峒っ敢种苿笔窃谝欢ǔ潭壬弦种评野彼峒っ咐鏓rbB受體的酪氨酸激酶活性的分子。這種抑制劑的例子包括在前面的段落中指出的靶向EGFR的藥物以及喹唑啉,例如PD153035,4-(3-氯苯胺基)喹唑啉,吡啶并嘧啶(pyridopyrimidines),嘧啶并嘧啶(pyrimidopyrimidines),吡咯并嘧啶(pyrrolopyrimidines),例如 CGP 59326, CGP 60261 和 CGP 62706,和吡唑啉酮嘧啶(pyrazolopyrimidines),4-(苯胺)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶,姜黃色素(二阿魏酰甲烷,4,5_ 二(4-氟苯胺基)苯鄰二甲酰亞胺), 含有硝基噻吩成分的tyrphostines ;PD-0183805 (Warner-Lamber);反義分子(例如,那些結(jié)合到編碼ErbB的核酸上的分子);喹喔啉(美國(guó)專利5,804,396) ;tryphostins (美國(guó)專禾Ij 5, 804, 396) ;ZD6474 (Astra Zeneca) ;PTK-787 (Novartis/Schering AG); 泛-ErbB 抑制劑例如 CI-1033 (Pfizer) ;Affinitac (ISIS 3521 ;Isis/Lilly) ; Imatinib mesylate(Gleevac ;Novartis) ;PKI 166(Novartis) ;GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer) ;EKB-569 (Wyeth) ;Semaxanib(Sugen) ;ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG) ;INC-ICll (Imclone);或在任何下列專利申請(qǐng)中描述的美國(guó)專利 5,804, 396 ;WO 99/09016 (American Cyanimid) ;W098/43960 (American Cyanamid) ;WO 97/38983 (Warner Lambert) ;WO 99/06378 (Warner Lambert) ;WO 99/06396(Warner Lambert) ;WO 96/30347 (Pfizer,Inc) ;WO 96/33978(Zeneca) ;WO 96/3397(Zeneca);和 WO 96/33980(Zeneca)?!翱寡苌蓜笔侵缸钄嗷蛟谝欢ǔ潭壬细蓴_血管發(fā)育的化合物??寡苌傻囊蜃永缈梢允墙Y(jié)合到參與促進(jìn)血管生成的生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子受體上的小分子或抗體。 優(yōu)選的抗血管生成的因子在此是一種結(jié)合到血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)上的抗體。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”是由一個(gè)細(xì)胞群體釋放并作為細(xì)胞間的介體作用于另一種細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱。這種細(xì)胞因子的例子為淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。在細(xì)胞因子中所包括的有生長(zhǎng)激素例如人生長(zhǎng)激素,N-甲硫氨酰人生長(zhǎng)激素,和牛生長(zhǎng)激素; 甲狀旁腺素;甲狀腺素;胰島素;胰島素原;松弛素;松弛素原;糖蛋白激素例如促濾泡激素(FSH),促甲狀腺素(TSH),和黃體生成素(LH);肝生長(zhǎng)因子;成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子;促乳素;胎盤催乳激素;腫瘤壞死因子-α和;米勒管抑制物質(zhì);小鼠促性腺激素相關(guān)肽; 抑制素;活化素;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;整聯(lián)蛋白;血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長(zhǎng)因子例如 NGF-β ;血小板生長(zhǎng)因子;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β ;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II ;促紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factor);干擾素例如干擾素-α,"β和-Y ;集落刺激因子(CSF)例如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF);粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF);和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF);白介素(IL)例如 IL-1,IL-I α,IL-2,IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12 ;腫瘤壞死因子例如 TNF-α 或 TNF-β ;和其他的多肽因子包括LIF和試劑盒配基(kit ligand)(KL)。如在此所用,術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列的細(xì)胞因子的生物活性等價(jià)物。用在本申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)“前體藥物”是指藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生物形式,其相對(duì)于親本藥物(parent drug)對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小,能夠被酶催化激活或者被轉(zhuǎn)化為更有活性的親本藥物形式。參見,例如Wilman,“癌癥化學(xué)治療中的前體藥物”Biochemical Society Transactions,14,375-382,615th Meeting Belfast (1986)禾Π Stella 等,“前體藥物用于靶向藥物遞送的化學(xué)方法”,Directed Drug Delivery, Borchardt等編輯, 247-267, Humana Press (1985) 0本發(fā)明的前體藥物包括,但是不限于可以被轉(zhuǎn)化為更有活性的無(wú)細(xì)胞毒性的藥物的,含有磷酸鹽的前體藥物,含有硫代磷酸鹽的前體藥物,含有硫酸鹽的前體藥物,含有肽的前體藥物,D-氨基酸修飾的前體藥物,糖基化的前體藥物,含有 β -內(nèi)酰胺的前體藥物,含有任選被取代的苯氧基乙酰胺的前體藥物或者含有可選擇地被取代的苯基乙酰胺的前體藥物,5-氟胞嘧啶以及其他的5-氟尿嘧啶藥物前體??梢员谎苌鸀榍绑w藥物形式用于本發(fā)明的細(xì)胞毒性藥物的例子包括,但是不限于那些上面描述的化學(xué)治療劑?!爸|(zhì)體”是由各種類型脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小泡,其可被用于將藥物(例如在此公開的抗ErbB2的抗體和,任選地化學(xué)治療劑)遞送給哺乳動(dòng)物。脂質(zhì)體的組分通常以雙分子層的結(jié)構(gòu)排列,類似于生物膜的脂排列。術(shù)語(yǔ)“包裝插入物(package insert) ”是用于指通常包括在治療性產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說明書,其包含關(guān)于適應(yīng)癥、用法、劑量、施用方法、禁忌征候的信息和/或關(guān)于使用該治療性產(chǎn)品的警告?!靶呐K防護(hù)劑”是一種防止或減少與給患者施用藥物相關(guān)的心肌機(jī)能障礙(即心肌病和/或充血性心力衰竭)的化合物或組合物,這些藥物例如蒽環(huán)霉素抗生素和/或抗 ErbB2的抗體。心臟防護(hù)劑可能例如阻斷或降低自由基介導(dǎo)的心臟毒性作用和/或防止或減少氧化應(yīng)激損傷。包括在本定義中的心臟防護(hù)劑的例子包括鐵離子螯合劑右丙亞胺 (ICRF-187)(Seifert et al., The Annals of Pharmacotherapy, 28 1063-1072 (1994)); 降脂劑(lipid-lowering agent)和 / 或抗氧化劑例如丙丁酚(Singal et al.,J. Mol. Cell Cardiol. ,27 :1055-1063 (1995));阿米斯丁 (氨基硫羥基 2_[ (3-氨丙基)氨基] 乙硫醇-二氫磷酸酯,也稱作WR-2721,及其脫磷酸化的細(xì)胞攝取形式稱作WR-1065) 和S-3-(3-甲氨基丙氨基)丙基硫代磷酸(WR-151327),參見Green et al. , Cancer Research,M :738-741 (1994);地高辛(Bristow, Μ. R.在Bristow MR,編輯.藥物誘導(dǎo)的心臟病.紐約:Elsevier 191-215(1980)) ; β-阻斷劑例如美托洛爾(Hjalmarson et al., Drugs47 Suppl 4~ :31-9(1994);和 Shaddy et al. ,Am. Heart.T. , 129 197-9 (1995));維生素E ;抗壞血酸(維生素C);自由基清除劑例如石竹素,烏索酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC); 自旋捕獲化合物例如α -苯基-叔-丁基硝酮(PBN) ; (Paracchini et al. , Anticancer Res. ,13 :1607-1612(1993));硒代有機(jī)化合物例如 P251 (Elbesen);等。“被分離的”核酸分子是從至少一種污染物核酸分子中鑒定和分離出的核酸分子, 在該抗體核酸分子的天然來源中,該分子通常與污染物核酸分子結(jié)合在一起。被分離的核酸分子不再是其在自然界中存在的形式或狀態(tài)。因此,被分離的核酸分子區(qū)別于存在于天然細(xì)胞中的核酸分子。但是,被分離的核酸分子包括被包含在通常表達(dá)抗體的細(xì)胞中的核酸分子,在這樣的細(xì)胞中,例如,核酸分子位于與天然細(xì)胞的染色體位置不同的染色體位置上。用語(yǔ)“控制序列”是指在特定宿主生物體中表達(dá)被可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。適合于原核生物的調(diào)控序列,例如包括啟動(dòng)子,任選地操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子,聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。當(dāng)核酸與另一種核酸序列處于一種功能性關(guān)系中時(shí),被“可操縱地連接”。例如,如果用作前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA作為參與多肽分泌的蛋白前體被表達(dá),則被可操縱地連接到表達(dá)多肽的DNA上;如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄,則被可操作地連接到編碼序列上;或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被放置在促進(jìn)翻譯的位置上,則其被可操作地連接到編碼序列上。一般地,“被可操作地連接”是指被連接的DNA序列是連續(xù)的,并且在為分泌前導(dǎo)序列的情況下,是連續(xù)的并且處于閱讀狀態(tài)。但是,增強(qiáng)子不一定非得是連續(xù)的。結(jié)合是在便利的限制性位點(diǎn)上通過連接實(shí)現(xiàn)。如果不存在這種位點(diǎn),按照常規(guī)操作,使用合成的寡核苷酸連接物或接頭。如在此所用,用語(yǔ)“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”互換使用,所有這種命名都包括后代。因此,用語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”和“被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代主體(subject)細(xì)胞以及由此產(chǎn)生的不論傳遞多少次的培養(yǎng)物。還應(yīng)當(dāng)理解,由于有意的或無(wú)意的突變,所有的后代在 DNA含量上并不是完全相同的。還包括在最初轉(zhuǎn)化細(xì)胞中被篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的突變后代。當(dāng)使用不同的命名時(shí),其包括哪些內(nèi)容可以很清楚地從上下文中獲知。鑒定對(duì)用抗HER2的抗體處理有響應(yīng)的腫瘤的方法腫瘤和腫瘤細(xì)胞的來源腫瘤可以被表征為對(duì)用2C4或者功能性等價(jià)的抗體治療響應(yīng),功能性等價(jià)的抗體具有抗體2C4的一種或多種生物學(xué)特征,例如,基于作為活化的度量,在細(xì)胞表面上存在 EGFR-ErbB2和/或ErbB2_ErbB3異二聚體。通過本領(lǐng)域知曉的任何方法分析腫瘤樣本中是否存在異二聚體。優(yōu)選地,通過下文描述的一種或多種方法來確定是否存在異二聚體。由于HER2活化是受體異二聚化和磷酸化的結(jié)果,一種特別重要的用于鑒定對(duì)用 2C4或功能性等價(jià)抗體治療響應(yīng)的腫瘤的方法是檢測(cè)ErbB受體磷酸化,例如ErbB2 (HER2) 受體磷酸化,如下文所述。可被分析的腫瘤細(xì)胞的來源包括,但是不限于,腫瘤活組織檢查,循環(huán)的腫瘤細(xì)胞,循環(huán)的血漿蛋白,腹水,異種移植腫瘤以及其他腫瘤模型,原代細(xì)胞培養(yǎng)物或者從腫瘤衍生的或者展示腫瘤樣特性的細(xì)胞系,以及被保存的腫瘤樣本,例如福爾馬林固定、石蠟包埋的腫瘤樣本。本發(fā)明計(jì)劃篩選EGFR-ErbB2和/或ErbB2_ErbB3異二聚體和/或ErbB 受體磷酸化的大量不同的腫瘤細(xì)胞類型。對(duì)于與被檢測(cè)為異二聚體和/或ErbB受體如 ErbB2(HER2)受體磷酸化陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞相同類型的腫瘤細(xì)胞可用2C4治療。下面描述的腫瘤模型作為實(shí)施例被提供,而不應(yīng)該被解釋為限制本發(fā)明。在一個(gè)實(shí)施方案中,來源于正患有一種腫瘤的患者的腫瘤細(xì)胞被分析是否對(duì)用 2C4治療響應(yīng)。如果基于存在HER2/HER3和/或HER2/HER1異二聚體或者通過證實(shí)ErbB受體發(fā)生了磷酸化,確定該細(xì)胞是有響應(yīng)的,那么隨后可以用具有2C4的一種或多種生物學(xué)特征的抗體處理該患者。優(yōu)選地,用rhuMAb 2C4處理該患者。在另一個(gè)實(shí)施方案中,分析來自特定類型的腫瘤的腫瘤細(xì)胞或被認(rèn)為具有特定類型腫瘤的特征的細(xì)胞中是否存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2_ErbB3異二聚體,或者ErbB受體是否磷酸化,優(yōu)選ErbB2 (HER2)受體。如果檢測(cè)到EGFR_ErbB2和/或ErbB2_ErbB3異二聚體和/或ErbB受體磷酸化,一般認(rèn)為該類型的腫瘤是用具有2C4的一種或多種生物學(xué)特征的抗ErbB2的抗體處理的優(yōu)良的候選。然后可用這種抗體處理患有這種腫瘤的患者。細(xì)胞系異種移植可以通過將細(xì)胞直接植入到目的位點(diǎn)上來將體外繁殖的腫瘤細(xì)胞,例如在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞系,異種移植到小鼠中。這種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。 分析細(xì)胞,以鑒定是否存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2_ErbB3異二聚體,或者ErbB受體磷酸化,例如ErbB2 (HER2)受體磷酸化。在一個(gè)實(shí)施方案中,將腫瘤細(xì)胞皮下植入到小鼠中,優(yōu)選無(wú)胸腺的裸鼠。在另一個(gè)實(shí)施方案中,腫瘤細(xì)胞被植入到生理相關(guān)的位置上來建立一個(gè)適當(dāng)?shù)脑荒[瘤模型。例如,來自乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞以不同的濃度被植入到無(wú)胸腺的裸鼠的乳腺脂肪墊中來更加精確地模擬乳腺癌的生物學(xué)。可以在移植之前或之后,分析腫瘤細(xì)胞是否存在EGFR-ErbB2 或ErbB2-ErbB3異二聚體,或ErbB受體磷酸化。優(yōu)選地,在被植入的細(xì)胞已經(jīng)發(fā)育為具有預(yù)期大小的腫瘤后再分析腫瘤細(xì)胞。還用2C4或功能性等價(jià)抗體來治療小鼠,用未被處理的小鼠作為對(duì)照。還可以給任何類型的腫瘤建立類似的模型,已經(jīng)從這些腫瘤中獲得了被培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系。腫瘤類型包括,但是不限于,膀胱,腦,乳腺,大腸,食道,腎,白血病,肝,肺,黑素瘤,卵巢,胰腺,前列腺,肉瘤,胃,睪丸和子宮。在一個(gè)實(shí)施方案中,過度表達(dá)ErbB2的腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系被用于移植,而在另一個(gè)實(shí)施方案,表達(dá)正常或低于正常含量的ErbB2的腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系被用于移植。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中,不對(duì)HERCEPTIN 響應(yīng)的腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系被用于移植。在一個(gè)特定實(shí)施方案中,大約2千萬(wàn)個(gè)MDA-175乳腺腫瘤細(xì)胞被植入小鼠的生殖腺的脂肪墊中。例如通過下述的方法之一,在異種移植的細(xì)胞的表面上檢測(cè)HER2/HER1和 / 或 HER2/HER3 二聚體的表達(dá)。還可用 0,3mg/kg, 10mg/kg, 30mg/kg 或 100mg/kg 的 2C4 處理被這樣移植的小鼠。其他劑量方案可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來確定。雖然本發(fā)明適合于任何表達(dá)HER2的腫瘤的類型,固體瘤例如乳腺癌,卵巢癌,肺癌,前列腺癌和結(jié)直腸癌尤其適合遵循本發(fā)明來分析和處理。腫瘤異種移植可以獲取哺乳動(dòng)物腫瘤樣本,優(yōu)選人腫瘤樣本并植入到小鼠中,優(yōu)選無(wú)胸腺的裸鼠。可以通過任何本領(lǐng)域已知的方法來獲得腫瘤樣本。在一個(gè)實(shí)施方案中,手術(shù)切除腫瘤樣本,例如在活組織檢查中或者在外科手術(shù)中,以從哺乳動(dòng)物摘下腫瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中,通過從哺乳動(dòng)物血液中純化循環(huán)的腫瘤細(xì)胞來獲得腫瘤樣本。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中,將直徑為大約切切0. 5-lmm的人固體腫瘤切片植入無(wú)胸腺的裸鼠的脅部中,通常為每只小鼠四個(gè)切片。當(dāng)被植入的腫瘤達(dá)到10-15mm的中值直徑時(shí),通常通過使用較小的腫瘤碎片進(jìn)行連續(xù)傳代。用于生成和研究人腫瘤異種移植的方法被描述在如下參考文獻(xiàn)中,在此全文引入作為參考=Fiebig等,“人腫瘤異種移植新抗癌試劑的可預(yù)測(cè)性、表征和發(fā)現(xiàn)”,投稿于“腫瘤學(xué)用于抗癌藥物開發(fā)的腫瘤模型相關(guān)性”,F(xiàn)iebig 和 Burger 編輯(Basel, Kargerl999),vol54, 29-50 ;Berger 等,“人腫瘤異種移植在胸腺發(fā)育不全的裸鼠中的建立和表征”,在“腫瘤學(xué)中的免疫缺陷小鼠”中,F(xiàn)iebig和 Berger 編輯(Basel,Karger 1992) ,23-46 ;Fiebig和 Burger,“人腫瘤異種移植和外植體”, 在“癌癥研究模型,,中,Teicher 編輯(Humana Press 2002) 113-137。當(dāng)異種移植以固體瘤生長(zhǎng),分化,并發(fā)展出基質(zhì)、脈管系統(tǒng)和中央壞死時(shí),人異種移植被認(rèn)為對(duì)供體患者體內(nèi)的腫瘤行為具有高度預(yù)見性。在大多數(shù)情況下,異種移植物保留剛自患者獲得的腫瘤的大部分分子的、組織學(xué)的和病理生理學(xué)特征。來自含有最初或者連續(xù)傳代的腫瘤的小鼠的腫瘤細(xì)胞被分析是否存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2_ErbB3異二聚體,或ErbB受體是否發(fā)生磷酸化。還用2C4或者功能性等價(jià)抗體來治療小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中,對(duì)一組新創(chuàng)建或建立的人腫瘤異種移植進(jìn)行篩選,篩選是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2_ErbB3異二聚體,或者ErbB受體是否磷酸化。Fiebig和 Burger,同上文,描述了從多種常規(guī)癌癥類型中建立的一組300個(gè)以上的人腫瘤異種移植, 常規(guī)癌癥類型例如膀胱,腦,乳腺,結(jié)腸,食道,腎,白血病,肝,肺,黑素,卵巢,胰腺,前列腺, 肉瘤,胃,睪丸和子宮。在一個(gè)實(shí)施方案中,全組被篩選是否具有異二聚體,或ErbB受體例如ErbB2(HEM)受體是否磷酸化。還可以篩選該組的亞群是否具有異二聚體,或ErbB 受體是否磷酸化,其中該亞群是基于例如組織類型,過度、低或正常表達(dá)ErbB2,或者不對(duì)
HERCEPTIN 響應(yīng)。以這種方式,基于是否存在異二聚體,或者通過證實(shí)ErbB受體例如 ErbB2(HER2)受體發(fā)生磷酸化,腫瘤可被分類為用2C4治療的候選腫瘤。同樣地,具有如此分類的腫瘤的患者可被更迅速地認(rèn)為適合用2C4或功能性等價(jià)抗體治療。在移植之前或之后,可分析腫瘤樣本中是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2_ErbB3異二聚體,或ErbB受體是否磷酸化。在一個(gè)實(shí)施方案中,大約Ig來自最初和/或被連續(xù)傳代的異種移植的腫瘤被從分子學(xué)上進(jìn)一步表征異二聚體,或者在液氮中迅速冷凍并存儲(chǔ)在-80°C下,用于以后進(jìn)行表征。進(jìn)一步分析異種移植腫瘤還可以采用雙層軟瓊脂分析,也稱作克隆發(fā)生分析,如例如在Fiebig和Burger中,同上文中所描述。人固體腫瘤異種移植通過機(jī)械的方式和蛋白水解的方式分解為單細(xì)胞懸浮液,該細(xì)胞懸浮液被鋪板到如所述鋪了軟瓊脂的多孔平板中。腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)導(dǎo)致集落形成,可以進(jìn)一步分析該集落的分子特征,例如異二聚體,或ErbB受體磷酸化,或其他的組織化學(xué)的和形態(tài)學(xué)的特征。B.檢測(cè) EGFR-EAB2 和 ΕΑΒ2-ΕΑΒ3 異二聚體本領(lǐng)域已知的任何方法可以被用于檢測(cè)腫瘤中的EGFR-ErbB2或ErbB2_ErbB3異二聚體。幾個(gè)優(yōu)選的方法在下面進(jìn)行了描述。這些方法檢測(cè)非共價(jià)的蛋白-蛋白的相互作用或者另外表明目的蛋白之間的接近性。下面描述的方法作為實(shí)施例被提供,而不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制本發(fā)明。共免疫沉淀和免疫印跡以免疫親合為基礎(chǔ)的方法,例如免疫沉淀或ELISA,可以被用于檢測(cè)EGFR_ErbB2 或ErbB2-ErbB3異二聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中,抗ErbB2的抗體被用于免疫沉淀包含來自腫瘤細(xì)胞的ErbB2的復(fù)合物,然后通過免疫印跡檢測(cè)生成的免疫沉淀物中是否存在EGFR或 ErbB3。在另一個(gè)實(shí)施方案中,EGFR或ErbB3抗體可被用于免疫沉淀步驟,然后用ErbB2抗體檢測(cè)免疫沉淀物。在另一個(gè)實(shí)施方案中,特異于HER1,HER3,HER2/HER1復(fù)合物或HER2/ HER3復(fù)合物的ErbB配基被用于沉淀復(fù)合物,然后檢測(cè)復(fù)合物中是否存在HER2。例如,配基被用于與抗生物素蛋白偶聯(lián),并在生物素柱上純化復(fù)合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中,例如ELISA或抗體“三明治”型分析中,針對(duì)ErbB2抗體被固定在固體支持物上,與腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞裂解物接觸,洗滌,然后暴露于抗EGFR或ErbB3 的抗體中。后一種抗體的結(jié)合,該結(jié)合可以直接地或者通過偶聯(lián)到可檢測(cè)標(biāo)記上的第二種抗體來檢測(cè),表明存在異二聚體。在某些實(shí)施方案中,EGFR或ErbB3的抗體被固定,而ErbB2 抗體被用于檢測(cè)步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中,ErbB受體的配體被用于替代或者組合抗ErbB 受體的抗體。用EGFR,ErbB2,或ErbB3抗體進(jìn)行免疫沉淀后,可隨后進(jìn)行異二聚體的功能性分析,作為免疫印跡的替代或補(bǔ)充。在一個(gè)實(shí)施方案中,用ErbB3抗體進(jìn)行免疫沉淀后,分析免疫沉淀物中的受體酪氨酸激酶活性。由于ErbB3不具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性,免疫沉淀物中存在酪氨酸激酶活性表明ErbB3最有可能與ErbB2結(jié)合。Graus-Porta et al.,EMBO J. ,16 :1647-55(1997) ;Klapper et al.,Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 96 :4995-5000(1999) 該結(jié)果可通過使用ErbB2抗體的免疫印跡來證實(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,用ErbB2抗體進(jìn)行免疫沉淀后,分析EGFR受體酪氨酸激酶活性。在該分析中,免疫沉淀與放射性ATP以及模擬ErbB2被EGFR轉(zhuǎn)磷酸化的體內(nèi)位點(diǎn)的肽底物接觸。肽發(fā)生磷酸化表示共免疫沉淀,從而EGFR與ErbB2發(fā)生異二聚化。受體酪氨酸激酶活性分析在本領(lǐng)域是熟知的,包括檢測(cè)靶點(diǎn)底物的磷酸化的分析,例如,通過磷酸酪氨酸抗體和活化關(guān)聯(lián)的信號(hào)傳導(dǎo)路徑,例如MAPK 路徑。對(duì)上述方法和分析進(jìn)行的改變對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見和常規(guī)的?;瘜W(xué)的或UV交聯(lián)可以被用于共價(jià)連接活細(xì)胞表面的異二聚體。Hunter et al., Biochem. J. ,320 :847-53.化學(xué)交聯(lián)劑的例子包括二硫代雙(琥珀酰亞胺基)丙酸(DSP) 和3,3' 二硫代雙(磺基琥珀酰亞胺基)丙酸(DTSSP)。在一個(gè)實(shí)施方案中,來自化學(xué)交聯(lián)的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞提取物通過SDS-PAGE分析并用EGFR和/或ErbB3的抗體進(jìn)行免疫印跡。 由于ErbB2是EGFR和ErbB3的優(yōu)選異二聚化伴侶,合適分子量的超位移條帶最有可能代表 EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體。該結(jié)果可通過隨后用ErbB2抗體進(jìn)行免疫印跡來證實(shí)。FRET和以熒光為基礎(chǔ)的方法熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)也被用于檢測(cè)EGFR_ErbB2或ErbB2_ErbB3異二聚體。 FRET根據(jù)能量從供體熒光團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體熒光團(tuán),在體內(nèi)和體外檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)型變化和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。Selvin,Nat. Struct. Biol. ,7 :730-34(2000) 0能量轉(zhuǎn)移僅在供體熒光團(tuán)與受體熒光團(tuán)足夠相近時(shí)發(fā)生。在典型的FRET實(shí)驗(yàn)中,兩種蛋白或者單一蛋白上的兩個(gè)位點(diǎn)用不同的熒光探針標(biāo)記。探針中的一個(gè),供體探針,用特定波長(zhǎng)的入射光激發(fā)到較高的能量狀態(tài)。然后供體探針將其能量轉(zhuǎn)移到第二個(gè)探針上,即受體探針,導(dǎo)致供體熒光強(qiáng)度下降和受體熒光發(fā)射增強(qiáng)。為了測(cè)定能量轉(zhuǎn)移的程度,供體在用供體和受體探針標(biāo)記的樣本中的強(qiáng)度與其在僅用供體探針標(biāo)記的樣本中的強(qiáng)度比較。任選地,比較在供體/受體的樣本中和在僅含受體的樣本中的受體強(qiáng)度。合適的探針在本領(lǐng)域是已知的,并包括例如可透過膜的染料,例如熒光素和羅丹明,有機(jī)染料,例如花青染料,和鑭系原子。Selvin,同上文。用于檢測(cè)和測(cè)量能量轉(zhuǎn)移的方法和儀器在本領(lǐng)域也是已知的。Selvin,同上文。適合于檢測(cè)和測(cè)量單個(gè)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的以FRET為基礎(chǔ)的技術(shù)在本領(lǐng)域也是已知的。例如,供體光漂白熒光共振能量轉(zhuǎn)移(pbFRET)顯微鏡和熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)可以被用于檢測(cè)細(xì)胞表面受體的二聚化。Selvin,同上文;Gadella 和 Jovin,J. Cell Biol. ,129 :1543-58 (1995)。在一個(gè)實(shí)施方案中,pbFRET 被在“懸浮液” 中或“原位”用在細(xì)胞上來檢測(cè)和測(cè)量EGFR-ErbB2或ErbB2_ErbB3異二聚體的形成,如被描述在Nagy et al. , Cytometry, 32 =120-131 (1998)中。這些技術(shù)測(cè)量由于能量轉(zhuǎn)移造成的供體熒光壽命的縮短。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中,流式細(xì)胞計(jì)數(shù)i^oerster型FRET技術(shù) (FCET)可被用于研究EGFR-ErbB2和ErbB2-ErbB3異二聚化,如在Nagy et al.,同上文,和 Brockhoff et al. , Cytometry,M :338-48(2001)中所描述。FRET優(yōu)選與標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合使用。Kenworthy,Methods, Μ 289-96(2001)。例如,與合適的熒光染料偶聯(lián)的抗體可以被用作標(biāo)記兩種不同蛋白質(zhì)的探針。如果蛋白質(zhì)與另一蛋白質(zhì)接近,該熒光染料作為FRET的供體和受體。通過標(biāo)準(zhǔn)手段來檢測(cè)能量轉(zhuǎn)移。可以通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)手段或者通過數(shù)碼顯微鏡系統(tǒng)檢測(cè)能量轉(zhuǎn)移,例如共焦顯微鏡或連接到電荷偶聯(lián)裝置(charge-coupled device) (CCD)照相機(jī)的寬視野熒光顯微鏡。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,ErbB2抗體或者EGFR或ErbB3抗體直接用兩種不同熒光團(tuán)標(biāo)記,例如如在Nagy et al.,同上文中所描述。腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞裂解物與進(jìn)行區(qū)別標(biāo)記的抗體接觸,這些抗體在檢測(cè)是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2_ErbB3異二聚體的 FRET中作為供體和受體。此外,未被標(biāo)記的抗ErbB2的和或者抗EGFR或者抗ErbB3的抗體與被區(qū)別標(biāo)記來作為供體和受體的第二抗體一起使用。參見,例如Broclihoff et al.,同上文。如果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記非常接近,那么檢測(cè)到能量轉(zhuǎn)移,并確定存在異二聚體。在另一個(gè)實(shí)施方案中,特異于HER2和或者特異于HERl或者特異于HER3的ErbB 受體的配體被熒光標(biāo)記,并用于FRET研究。在本發(fā)明的還有其他實(shí)施方案中,采用標(biāo)準(zhǔn)的直接或間接免疫熒光技術(shù)和共焦激光掃描顯微鏡,通過共定位(co-1 ocal ization) ErbB2與或者EGFR或者ErbB3來證明在腫瘤細(xì)胞的表面上存在異二聚體。此外,激光掃描成像(LSI)被用于在高通量格式 (high-throughput format)例如微孔平板中,檢測(cè)抗體結(jié)合以及ErbB2與或者EGFR或者 ErbB3 共定位,如被描述在 Zuck et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 :11122-27 (1999)。在還有一個(gè)實(shí)施方案中,通過鑒定依賴于異二聚體組分的相近性的酶活性來確定存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2_ErbB3異二聚體。ErbB2抗體與一種酶偶聯(lián),而EGFR或ErbB3 抗體與第二種酶偶聯(lián)。加入用于第一種酶的第一種底物,該反應(yīng)產(chǎn)生用于第二種酶的第二種底物。這導(dǎo)致與另一種分子的反應(yīng)來生成可檢測(cè)的化合物,例如染料。另一個(gè)化學(xué)藥品的存在分解了第二種底物,使得與第二種酶的反應(yīng)被阻斷,除非第一種和第二種酶,因此也就是兩種抗體,十分接近。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中,將腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞裂解物與用葡萄糖氧化酶偶聯(lián)的ErbB2抗體,以及用辣根過氧化酶偶聯(lián)的ErbB3或ErbBl抗體接觸。將葡萄糖以及染料前體,例如DAB,和過氧化氫酶加入到反應(yīng)中。產(chǎn)生對(duì)DAB染色的顏色確定存在異二聚體。eTag 分析系統(tǒng)可以采用基于eTag 分析系統(tǒng)(Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA)的方法檢測(cè)異二聚體,如被描述在例如WO 83502和2001年12月6日公開的美國(guó)專利申請(qǐng) 2001/0049105中,兩者都清楚地全文引入作為參考。eTag 或“電泳標(biāo)記”包含可檢測(cè)的報(bào)道分子部分,例如熒光團(tuán)。其還可以包含“遷移率調(diào)節(jié)物”,遷移率調(diào)節(jié)物基本上由具有獨(dú)特的電泳遷移率的部分組成。這些部分使得可以在限定的電泳條件下,例如毛細(xì)管電泳 (CE),從復(fù)雜的混合物中分離和檢測(cè)eTag 。包含報(bào)道分子部分以及,任選的,遷移率調(diào)節(jié)物的eTag 的部分通過可裂解連接基團(tuán)被連接到第一個(gè)靶向結(jié)合部分上,生成第一種結(jié)合化合物。第一個(gè)靶向結(jié)合部分特異地識(shí)別特定的第一個(gè)靶點(diǎn),例如核酸或蛋白質(zhì)。第一個(gè)靶向結(jié)合部分無(wú)論如何是不被限制的,并且可以是例如多核苷酸或多肽。優(yōu)選地,第一個(gè)靶向結(jié)合部分是一種抗體或抗體片段。另外,第一個(gè)靶向結(jié)合部分可以是ErbB受體的配體或其具有結(jié)合能力的片段。連接基團(tuán)優(yōu)選包含可裂解部分,例如一種酶底物或在限定條件下可以被裂解的任何化學(xué)鍵。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)靶向結(jié)合部分結(jié)合到其靶點(diǎn)時(shí),裂解劑被導(dǎo)入和/或激活,而連接基團(tuán)被斷裂,從而釋放包含報(bào)道分子部分和遷移率調(diào)節(jié)物的eTag 的部分。因此,存在“游離” 的eTag 表示靶向結(jié)合部分結(jié)合到其靶點(diǎn)上。優(yōu)選地,第二種結(jié)合化合物包含裂解劑和特異地識(shí)別第二個(gè)靶點(diǎn)的第二個(gè)靶向結(jié)合部分。第二個(gè)靶向結(jié)合部分也是無(wú)論如何不是被限制的,并且可以是例如一種抗體或抗體片段或ErbB受體的配體或具有結(jié)合能力的配基片段。如果第一種結(jié)合化合物和第二種結(jié)合化合物十分接近,那么裂解劑將僅斷裂第一種結(jié)合化合物中的連接基團(tuán)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,第一種結(jié)合化合物包含eTag ,在eTag 中ErbB2抗體作為第一個(gè)靶向結(jié)合部分。第二種結(jié)合化合物包含連接到能夠斷裂eTag 的連接基團(tuán)的裂解劑上的EGFR或ErbB3的抗體。優(yōu)選地,裂解劑必須被激活以能夠斷裂連接基團(tuán)。腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞裂解物與結(jié)合到ErbB2上的eTag 接觸,和與結(jié)合到細(xì)胞表面上的EGFR或 ErbB3的被修飾的EGFR或ErbB3抗體接觸。優(yōu)選去除未被結(jié)合的結(jié)合復(fù)合物,并在需要時(shí)激活裂解劑。如果存在EGFR-ErbB2或ErbB2_ErbB3異二聚體,由于裂解劑和連接基團(tuán)相鄰近,裂解劑將會(huì)斷裂連接基團(tuán),并釋放eTag 。然后通過本領(lǐng)域已知的任何方法,例如毛細(xì)管電泳,檢測(cè)游離的eTag 。在一個(gè)實(shí)施方案中,裂解劑是可激活的作用于連接基團(tuán)的化學(xué)藥品種類。例如,可以通過將樣本暴露于光照下來激活裂解劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中,采用EGFR或ErbB3的抗體作為第一個(gè)靶向結(jié)合部分來構(gòu)建 eTag ,而用ErbB2抗體構(gòu)建第二種結(jié)合化合物。檢測(cè)ErbB受體的磷酸化
存在ErbB受體磷酸化可被用來證明HER2活化。在一個(gè)實(shí)施方案中,通過免疫沉淀一種或多種ErbB受體例如ErbB2 (HER2)受體, 以及蛋白質(zhì)印跡分析來評(píng)價(jià)ErbB受體磷酸化。例如,采用抗磷酸酪氨酸抗體來檢測(cè)被免疫沉淀的ErbB受體中的被磷酸化的酪氨酸殘基,在凝膠上存在磷酸-HER2條帶確定為陽(yáng)性??沽姿崂野彼岬目贵w可以從 PanVera (Madison,WI)或 Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY)購(gòu)買得至丨J,PanVera(Madison, WI)是 Invitrogen, Chemicon International Inc. (Temecula, CA)的子公司。缺乏該條帶確定為陰性。在另一個(gè)實(shí)施方案中,采用磷酸特異性抗HER2的抗體(克隆PN2A ;Thor et al., J. Clin. Oncol. ,18(18) :3230-3239(2000)),通過免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià) ErbB2 (HEM)受體磷酸化。用于檢測(cè)ErbB受體磷酸化的其他方法包括,但是不限于,KIRA ELISA (美國(guó)專利號(hào) 5,766,863 ;5, 891,650 ;5, 914,237 ;6, 025,145 ;和 6,287,784),質(zhì)譜法(比較磷酸化的和未磷酸化的HER2的大小),和采用抗HER2的抗體進(jìn)行e-tag鄰近性分析(例如采用購(gòu)自 Aclara Biosciences (Mountain View, CA)的 eTag 分析試劑盒)。對(duì)于 eTag 分析的詳細(xì)內(nèi)容在上文中描述??贵w制備下面的說明是關(guān)于制備按照本發(fā)明所用的治療性和診斷性抗體的示例性技術(shù)。雖然該說明總體上針對(duì)抗ErbB2的抗體的制備,本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地修改本公開來制備針對(duì)任何ErbB受體的抗體。用于制備抗體的ErbB2抗原可以是,例如含有所需表位的ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分的可溶形式?;蛘撸诩?xì)胞表面表達(dá)ErbB2的細(xì)胞(例如被轉(zhuǎn)化來過度表達(dá)ErbB2 的 NIH-3T3 細(xì)胞;或癌細(xì)胞系例如 SK-BR-3 細(xì)胞,參見 Stancovski et al.,PNAS(USA) ,88 8691-8695(1991))可以被用于生產(chǎn)抗體??捎糜谏a(chǎn)抗體的其他形式的ErbB2對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然的。多克隆抗體優(yōu)選地通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑在動(dòng)物中產(chǎn)生多克隆抗體。采用雙功能或衍生化劑,例如馬來酰亞胺苯甲酰硫代琥珀酰亞胺酯 (maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通過半胱氨酸殘基偶聯(lián)),N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基偶聯(lián)),戊二醛,琥珀酐,S0C12,或IUN = C = NR,其中R和IU是不同的烷基基團(tuán),將相關(guān)抗原偶聯(lián)到在將被免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)上是有用的,這些蛋白例如匙孔血藍(lán)蛋白,血清白蛋白,牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。通過組合例如100 μ g或5 μ g蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑,并在多個(gè)部位皮內(nèi)注射該溶液以針對(duì)抗原,免疫原性交聯(lián)物或衍生物來免疫動(dòng)物,一個(gè)月后,用1/5-1/10的最初量的溶解在弗氏完全佐劑中的肽或偶聯(lián)物在多個(gè)部位上進(jìn)行皮下注射來加強(qiáng)免疫動(dòng)物。7-14天后,給動(dòng)物放血,分析血清中的抗體滴度。加強(qiáng)免疫動(dòng)物直到該滴度達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。優(yōu)選地,用相同抗原但是偶聯(lián)到不同蛋白質(zhì)上和/ 或通過不同交聯(lián)劑偶聯(lián)的交聯(lián)物來加強(qiáng)免疫動(dòng)物。還可以蛋白質(zhì)融合的形式在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備偶聯(lián)物。此外,凝集劑例如明礬適合被用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)。單克隆抗體單克隆抗體是從實(shí)質(zhì)上均一的抗體的群體中獲得,即包含群體的各個(gè)抗體除了可能以最小量存在的可能天然發(fā)生的突變外,是相同的。因此,修飾語(yǔ)“單克隆”表示抗體的特征,即不是無(wú)聯(lián)系的抗體的混合物。例如,單克隆抗體可以通過最早在Kohler et al. ,Nature, 256 :495(1975)中描述的雜交瘤方法來制備,或者可通過重組DNA方法(如美國(guó)專利號(hào)4,816,567)來制備。在雜交瘤方法中,小鼠或其他合適的宿主動(dòng)物,例如倉(cāng)鼠如上文所描述進(jìn)行免疫來引發(fā)生產(chǎn)或能夠生產(chǎn)抗體的淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生,該抗體將特異地結(jié)合用于免疫接種的蛋白質(zhì)。或者,在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后,采用合適的融合試劑,例如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,形成雜交瘤細(xì)胞(Goding,“單克隆抗體原理和實(shí)踐”,59-103 (Academic Press,1986))。如此制備的雜交瘤細(xì)胞被接種并生長(zhǎng)在合適的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如,如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT),用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將包括次黃嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基),這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞的生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些有效融合,通過所選擇的生產(chǎn)抗體的細(xì)胞支持穩(wěn)定高水平地生產(chǎn)抗體,并且對(duì)培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞。其中,優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系,例如那些來源于從 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA獲得的M0PC-21和MPC-Il小鼠腫瘤的骨髓瘤系,和得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心Rockville, MarylandUSA的SP-2或X63_Ag8_653細(xì)胞。人骨髓瘤和小鼠人異骨髓瘤細(xì)胞系也被描述用于制備人單克隆抗體(Kozbor,J. Immunol. ,133 :3001 (1984); 和Brodeur et al.,“單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用”,51-63 (Marcel Dekker, he.,紐約, 1987))。分析其中生長(zhǎng)了雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中針對(duì)抗原的單克隆抗體的生產(chǎn)。優(yōu)選地,通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合分析,例如放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA),確定雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體的結(jié)合特異性。例如,可通過Munson et al. , Anal. Biochem. ,107 :220(1980)的斯卡查德分析來
確定單克隆抗體的結(jié)合親合力。在雜交瘤細(xì)胞被鑒定出生產(chǎn)具有所需特異性、親合力和/或活性的抗體后,通過有限稀釋操作亞克隆該克隆,并通過標(biāo)準(zhǔn)方法來生長(zhǎng)(Goding,“單克隆抗體原理和實(shí)踐”, 59-103 (Academic Press, 1986))。用于該目的的合適培養(yǎng)基包括,例如D-MEM或RPMI-1640 培養(yǎng)基。此外,雜交瘤細(xì)胞可以作為腹水腫瘤在動(dòng)物中體內(nèi)生長(zhǎng)。亞克隆分泌的單克隆抗體采用傳統(tǒng)的抗體純化操作例如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親合層析,從培養(yǎng)基、腹水液或血清中適當(dāng)分離。采用常規(guī)操作(例如通過采用能夠特異性地結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易分離和測(cè)序編碼單克隆抗體的DNA。雜交瘤細(xì)胞作為這種DNA的優(yōu)選來源。一旦被分離,DNA可被加入到表達(dá)載體中,然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中, 例如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或者不另外生產(chǎn)抗體蛋白的骨髓瘤細(xì)胞,以獲得單克隆抗體在重組的宿主細(xì)胞中的合成。關(guān)于在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的 DNA 的綜述文章包括 Skerra et al. , Curr. Opinion in Immunol. ,5 :256-262(1993) 禾口 Pliickthun,Immunol. Revs. , 130 :151-188(1992)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,可以采用在McCafferty et al.,Nature, 348 552-554(1990)中描述的技術(shù)從所生成的抗體噬菌體文庫(kù)中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson et al. , Nature, 352 :624-628 (1991)禾口 Marks et al. , J. Mol. Biol., 222 :581-597(1991)分別描述了采用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人的抗體。隨后的出版物中描述了通過鏈改組來制備高親合性(nM范圍)的人抗體(Marks et al.,Bio/Technology, 10 :779-783(1992)),以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大噬菌體文庫(kù)的策略 (ffaterhouse et al.,Nuc. Acids. Res.,紅2265-2266 (1993))。因此,對(duì)于用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)來說,這些技術(shù)是可行的替代。DNA還可以被修飾,例如通過用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列來替代同源的鼠序歹Ij (美國(guó)專利號(hào) 4,816,567 ;和 Morrison,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 6851 (1984)),或者通過將全部或部分的非免疫球蛋白多肽的編碼序列共價(jià)地連接到免疫球蛋白編碼序列上。典型地,用這種非免疫球蛋白多肽來替代抗體的恒定結(jié)構(gòu)域,或者用它們來替代抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域,以建立包含對(duì)一個(gè)抗原具有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)以及對(duì)一個(gè)不同抗原具有特異性的另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的嵌合雙價(jià)抗體。人源化抗體用于人源化非人類的抗體的方法已經(jīng)在本領(lǐng)域被描述。優(yōu)選地,人源化的抗體具有從非人來源被導(dǎo)入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。 這些非人類的氨基酸殘基通常被稱作為“輸入”殘基,其通常來自“輸入”的可變結(jié)構(gòu)域。人源化基本上可以按照Winter及其同事的方法進(jìn)行(Jones et al. , Nature, 321 522-525(1986) ;Riechmann et al. , Nature, 332 :323-327 (1988) ;Verhoeyen et al., kience,^:1534-1536(1988)),通過用高變區(qū)序列取代人抗體的相應(yīng)序列。因此,這種 “人源化”的抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利號(hào)4,816,567),其中比完整的人可變結(jié)構(gòu)域小得多的部分被來自非人類物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)際上,人源化的抗體典型地是人的抗體,其中有些高變區(qū)殘基以及可能有些FR殘基被來自嚙齒類動(dòng)物抗體的類似位點(diǎn)上的殘基取代。選擇人的輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域,以用于制備人源化的抗體對(duì)于降低抗原性是非常重要的。按照所謂的“最佳適配(best-fit)”的方法,用已知的人的可變結(jié)構(gòu)域序列的整個(gè)文庫(kù)篩選嚙齒類動(dòng)物抗體的可變結(jié)構(gòu)域的序列。然后與嚙齒類動(dòng)物最接近的人序列被接受作為人源化抗體的人的骨架區(qū)(FR) (Sims et al.,J. Immunol. ,151 =2296(1993); Chothia et al.,J. Mol. Biol.,1M :901 (1987))。另一種方法采用來自特定的輕鏈或重鏈亞群的所有人抗體的共有序列的特定骨架區(qū)。相同的骨架可以被用于幾種不同的人源化抗體(Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA,M :4285 (1992) ;Presta et al., J.Immunol. ,151 :2623 (1993))。被人源化的抗體保留對(duì)抗原的高親合力以及其他有利的生物學(xué)特性也是重要的。 為了達(dá)到這個(gè)目的,按照優(yōu)選的方法,通過采用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種構(gòu)想的人源化產(chǎn)物的過程來制備人源化的抗體。三維的免疫球蛋白模型是一般可獲得的,并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。計(jì)算機(jī)程序是可獲得的,其闡明和顯示被選擇的候選免疫球蛋白序列的很可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對(duì)這些顯示的探查可以分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用,即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。通過這種方式,可以從受體和輸入序列中選擇和組合FR殘基,來獲得期望的抗體特性, 例如增強(qiáng)對(duì)目標(biāo)抗原的親合力??傊?,高變區(qū)的殘基直接地和最實(shí)質(zhì)性地參與影響抗原結(jié)果結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配基活化的示例性人源化抗ErbB2的抗體被描述在WO 01/0M5,其在此引入作為參考。在此特別感興趣的人源化抗體基本上與鼠單克隆抗體2C4 (或其Fab片段)一樣有效地阻斷EGF,TGF- α和/或HRG介導(dǎo)的MAPK的活化,和/ 或基本上與鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效地結(jié)合ErbB2。人源化抗體在此可以例如,包含被結(jié)合到人可變重鏈結(jié)構(gòu)域的非人的高變區(qū)殘基,并且可能在選自由69H,71H 和73H組成的組中的一個(gè)位置上包含骨架區(qū)(FR)取代,采用的是在Kabat et al.,“具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列”,第 5 版,Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中給出的可變結(jié)構(gòu)域編號(hào)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中,人源化的抗體在69H,71H和73H的兩個(gè)或所有位點(diǎn)包含F(xiàn)R取代。示例性的目的人源化抗體在此包含可變的重鏈結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)決定殘基GFTFTDYTMX, 其中 X優(yōu)選是D 或 S (SEQ ID NO 7) ; DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO 8);禾口 / 或 NLGPSFYFDY(SEQ ID NO :9),任選地包含這些⑶R殘基的氨基酸修飾,例如,其中修飾基本上保持或改善抗體的親合力。例如,目的抗體變體可在上述的可變重鏈CDR序列中具有從約1個(gè)到約7個(gè)或者約5個(gè)氨基酸取代。這種抗體變體可以通過親和力成熟(affinity maturation)來制備,例如如下文所述。最優(yōu)選的人源化抗體包含SEQ ID NO :4中的可變的重鏈結(jié)構(gòu)域氨基酸序列(附圖1B)。例如,除了在前述段落中的那些可變重鏈結(jié)構(gòu)域⑶R殘基之外,人源化抗體還可以包含可變的輕鏈結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)決定殘基KASQDVSIGVA(SEQ ID NO :10) ;SASTO1X2X3,其中 Xl優(yōu)選為R或L,X2優(yōu)選為Y或E,和X3優(yōu)選為T或S(SEQ ID NO :11);和/或QQYYIYPYT(SEQ ID NO 12),這種人源化抗體任選地包含上述CDR殘基的氨基酸修飾,例如,其中修飾基本上保持或改善抗體的親合力。例如,目的抗體變體可能在上述的可變輕鏈CDR序列中具有從約1個(gè)到約7個(gè)或者約5個(gè)氨基酸取代。這種抗體變體可以通過親和力成熟來制備,例如如下文所述。最優(yōu)選的人源化抗體包含SEQ IDNO :3中的可變的輕鏈結(jié)構(gòu)域氨基酸序列 (附圖1A)。本申請(qǐng)還考慮親合力成熟的抗體,其結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配基活化。親本抗體可以是人抗體或人源化抗體,例如包含分別為SEQ ID No3和4的可變輕鏈和/或重鏈序列(即變體574;附圖IA和B)。親合力成熟的抗體優(yōu)選以高于鼠2C4或變體574的親合力結(jié)合到ErbB2受體上(如采用ErbB2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)ELISA評(píng)價(jià),例如親合力改善從約2倍或約4倍到約100倍或約1000倍)。示例性的用于取代的可變重鏈⑶R殘基包括 H28,H30, H34,H35,H64,H96,H99,或者兩個(gè)或多個(gè)的組合(如這些殘基中的2,3,4,5,6或 7個(gè))。用于改變的可變輕鏈CDR殘基的例子包括L28,L50, L53,L56,L91,L92,L93,L94, L96,L97或兩個(gè)或多個(gè)的組合(如這些殘基中的2至3、4、5或直到約10個(gè))。還考慮了各種形式的人源化抗體或親合力成熟的抗體。例如,人源化抗體或親合力成熟的抗體可以是抗體片段,例如Fab,其任選地與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)來產(chǎn)生一種免疫偶聯(lián)物?;蛘?,人源化抗體或親合力成熟的抗體可以是完整抗體,例如完整的IgGl 抗體。
人抗體作為人源化的替代,可以制備人抗體。例如現(xiàn)在能夠制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠),當(dāng)缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)物時(shí),該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠在免疫后產(chǎn)生人抗體的所有組分。例如,已經(jīng)描述,在嵌合和種系突變小鼠中純合缺失抗體重鏈連接區(qū)(heavy-chain joining region) (JH)基因?qū)е聝?nèi)源抗體生產(chǎn)的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這種種系突變小鼠,將會(huì)導(dǎo)致在抗原激發(fā)時(shí)產(chǎn)生人抗體。參見,如Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :2551 (1993) Jakobovits et al. , Nature, 362 255-258(1993) ;Bruggennann et al. , Year in Immuno.,Z :33 (1993);和美國(guó)專利號(hào) 5,591,669 ;5,589,369 和 5,545,807?;蛘撸删w展示技術(shù)(McCaffertyet al. ,Nature, 348 :552-553(1990))可以被用于體外從來自未被免疫的供體的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因所有組成中生產(chǎn)人抗體和抗體片段。按照這種技術(shù),抗體V結(jié)構(gòu)域基因按照讀框被克隆到絲狀噬菌體例如M13 或fd的主要或次要外殼蛋白基因中,并以功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面上。由于絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝,基于抗體的功能性特性的選擇還會(huì)導(dǎo)致對(duì)編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。因此,噬菌體模擬了B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以以各種形式實(shí)現(xiàn);對(duì)于此的綜述,參見如Johnson, Kevin S.和Chiswell,David J. , Current Opinion in Structural Biology,3 :564-571 (1993)。一些 V-基因區(qū)段的來源可以被用于噬菌體展示。Clackson et al. , Nature, 352 :624-628(1991)從來源于被免疫小鼠的脾臟的一個(gè)小的隨機(jī)組合V基因文庫(kù)中分離到一系列不同的抗唑酮抗體?;旧习凑?Marks et al.,J. Mol. Biol. , 222 :581-597 (1991),或 Griffith et al.,EMBO J., 12:725-734(1993)中描述的技術(shù)可以構(gòu)建來自未被免疫的人供體的V基因的所有組成成分,并且可以分離抗一系列不同抗原(包括自體抗原)的抗體。還可以參見美國(guó)專利號(hào) 5,565,332 和 5,573,905。如上所討論的,還可以通過體外激活的B細(xì)胞來產(chǎn)生人抗體(參見美國(guó)專利 5,567,610 和 5,229,275)。人抗ErbB2的抗體被描述在1998年6月30日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)5,772,997和 1997年1月3日公開的W 97/00271中。抗體片段各種技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)來生產(chǎn)抗體片段。傳統(tǒng)上,這些片段通過蛋白質(zhì)水解消化完整的抗體來獲得(參見,如Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods,M :107-117(1992);禾口Brerman et al.,Science,^:81(198 )。但是,現(xiàn)在可以通過重組宿主細(xì)胞直接地制備這些片段。 例如,可以從上面討論的抗體噬菌體文庫(kù)中分離抗體片段?;蛘?,可以從大腸桿菌中直接回收 Fab' -SH 片段,并化學(xué)偶聯(lián),來形成 F (ab' ) 2 片段(Carter et al.,Bio/Technology, 10 :163-167(1992)).按照另一種方法,可以從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中直接分離F(ab‘ )2 片段。用于生產(chǎn)抗體片段的其他技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然的。在其他實(shí)施方案中,所選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見恥93/16185;美國(guó)專利號(hào)5,571,894;和美國(guó)專利號(hào)5,587,458??贵w片段還可以是線性抗體,如,在美國(guó)專利5,641,870中所描述的。 這種線性抗體片段可以是單一特異性的或雙特異性的。
雙特異性抗體雙特異性抗體是對(duì)至少兩個(gè)不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。示例性的雙特異性抗體可能結(jié)合到ErbB2蛋白的兩個(gè)不同的表位上。其他的這種抗體可能組合ErbB2結(jié)合位點(diǎn)與EGFR,ErbB3和/或ErbB4的結(jié)合位點(diǎn)?;蛘?,抗ErbB2的臂可能與結(jié)合白細(xì)胞上的觸發(fā)分子例如T細(xì)胞受體分子(如CD2或⑶3),或者IgG的Fc受體(Fe y R),例如Fc γ R I(CD64)、FcyR II (⑶32)和Fc γ RIII (⑶16)的臂組合,來將細(xì)胞防御機(jī)制集中在表達(dá) ErbB2的細(xì)胞上。雙特異性抗體還可以被用于將細(xì)胞毒性劑定位在表達(dá)ErbB2的細(xì)胞上。 這些抗體具有ErbB2結(jié)合臂,以及結(jié)合細(xì)胞毒性劑(如皂草素,抗干擾素_α,長(zhǎng)春花生物堿,蓖麻毒蛋白A鏈,氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可以作為全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab' )2雙特異性抗體)被制備。WO 96/16673中描述了一種雙特異性抗ErbB2/抗Fc γ RIII抗體,而美國(guó)專利號(hào) 5,837,234公開了一種雙特異性的抗ErbB2/抗Fc y RI抗體。雙特異性的抗ErbB2/Fc α抗體被示于WO 98/0Μ63中。美國(guó)專利號(hào)5,821,337教導(dǎo)了一種雙特異性的抗ErbB2/抗CD3 抗體。用于制備雙特異性的抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備是基于共表達(dá)兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì),其中這兩條鏈具有不同的特異性 (Millstein et al. ,Nature, 305 :537-539 (1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈隨機(jī)分類, 這些雜交瘤(“四鏈瘤” quadromas)生成了 10種不同抗體分子的可能混合物,其中只有一種抗體分子具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親合層析步驟來純化正確的分子,是非常繁瑣的,并且產(chǎn)量很低。類似的操作被公開在WO 93/08829 JPTraunecker et al.,EMBO J. ,10 :3655-3659(1991)中。按照不同方法,具有所需結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn)) 被融合到免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域序列上。優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)、CH2、和CH3區(qū)域的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合。優(yōu)選具有在至少一個(gè)融合體中出現(xiàn)的含有輕鏈結(jié)合必需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)。編碼免疫球蛋白重鏈融合體以及,如果需要,免疫球蛋白輕鏈的DNA被插入到各自獨(dú)立的表達(dá)載體中,并被共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。當(dāng)構(gòu)建中所用的三種多肽鏈的不相等比例產(chǎn)生最佳產(chǎn)量時(shí),這給調(diào)整實(shí)施方案中三種多肽片段相互比例提供很大的靈活性。但是,當(dāng)至少兩種多肽鏈以相等比例表達(dá)獲得了高產(chǎn)量時(shí)或者當(dāng)該比例不是特別重要時(shí),有可能在一個(gè)表達(dá)載體中插入兩種或全部三種多肽鏈的編碼序列。在這種方法的優(yōu)選實(shí)施方案中,雙特異性抗體由一個(gè)臂中的具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈,以及另一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)組成。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),由于僅在雙特異性分子的一半中存在免疫球蛋白輕鏈提供了一種便捷的分離途經(jīng),這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于從不期望的免疫球蛋白鏈組合中分離期望的雙特異性化合物。這種方法被公開在WO 94/04690中。生產(chǎn)雙特異性抗體的更加詳細(xì)內(nèi)容參見, 例如 Sureshet al. , Methods in EnzymoloRy, 121 :210 (1986)。按照在美國(guó)專利號(hào)5,731,168中描述的另一方法,可以工程化改造一對(duì)抗體分子之間的界面來使異二聚體的百分比最大化,該異二聚體從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收。優(yōu)選的界面包含抗體恒定結(jié)構(gòu)域的CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在這種方法中,來自第一抗體分子界面的一條或多條小氨基酸側(cè)鏈用較大的側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)替代。通過用較小的側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸側(cè)鏈在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或類似大小的補(bǔ)償“空穴”。這提供一種機(jī)制來提高異二聚體相對(duì)于其他不需要的終產(chǎn)物, 例如同型二聚體的產(chǎn)量。雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異偶聯(lián)物”抗體。例如,異偶聯(lián)物中的抗體之一可以被偶聯(lián)到抗生物素蛋白上,另一個(gè)則偶聯(lián)到生物素上。這種抗體被建議用于例如將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不需要的細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)4,676,980),以及用于治療HIV感染(W0 91/00360,WO 92/200373 JPEP 03089)。異偶聯(lián)物抗體可以采用任何方便的交聯(lián)方法來制備。合適的交聯(lián)劑以及大量交聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的,被公開在美國(guó)專利號(hào)4,676,980中。用于從抗體片段生產(chǎn)雙特異性抗體的技術(shù)也在文獻(xiàn)中被描述。例如,雙特異性抗體可以采用化學(xué)連接制備。Brennan et al.,Science, 229 :81(1985)描述了一種操作,其中完整抗體被蛋白質(zhì)水解裂解產(chǎn)生F(ab' )2片段。這些片段在二硫酚絡(luò)合劑亞砷酸鈉的存在下被還原以穩(wěn)定鄰近的二硫酚,并防止分子間二硫化物的形成。生成的Fab'片段然后被轉(zhuǎn)化為硫代硝基苯甲酸鹽(TM)衍生物。然后通過用巰基乙胺還原,F(xiàn)ab' -TNB衍生物之一被再轉(zhuǎn)化為Fab'-硫羥,與等克分子數(shù)的其他Fab' -TNB衍生物混合來形成雙特異性抗體。生成的雙特異性抗體可以被用作選擇性固定酶的試劑。最近的進(jìn)展使得從大腸桿菌中直接回收Fab' -SH片段變得更加容易,這些片段可以被化學(xué)偶聯(lián)來形成雙特異性抗體。Shalaby et al.,J. Exp. Med.,175 :217-225 (1992) 中描述了生產(chǎn)完全人源化的雙特異性抗體F(ab' )2分子。每個(gè)Fab'片段分別從E.coli 中分泌,并在體外定向化學(xué)偶聯(lián)來形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合到過度表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常的人T細(xì)胞上,并且觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞針對(duì)人乳腺腫瘤靶點(diǎn)的裂解活性。各種用于直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備和分離雙特異性抗體片段的技術(shù)也已經(jīng)被描述。例如已經(jīng)采用亮氨酸拉鏈制備了雙特異性抗體。Kostelny et al.,J. Immunol., 148(5) :1547-1553(1992)。通過基因融合,來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽被連接到兩種不同抗體的Fab'部分上??贵w同型二聚體的鉸鏈區(qū)被還原來形成單體,然后再次被氧化形成抗體異二聚體。這種方法還可以被用于生產(chǎn)抗體同型二聚體。被描述在Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :6444-6448 (1993)中的“微型雙功能”技術(shù)給制備雙特異性抗體片段提供可供選擇的機(jī)制。該片段包含通過接頭被連接到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL) 上的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH),該接頭太短,以至同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因此,一個(gè)片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一條片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì),從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。通過采用單鏈Fv(sFv) 二聚體來制備雙特異性抗體片段的另一策略也已經(jīng)被報(bào)道。參見 Gruber et al.,J. Immunol. ,152 :5368(1994)。還考慮到具有二價(jià)以上的抗體。例如,可制備三特異性抗體。Tutt et al., J. Immunol. ,147 :60(1991)。其他的氨基酸序列修飾還考慮到抗ErbB2的抗體的氨基酸序列修飾。例如,有可能期望改善抗體的結(jié)合親合力和/或其他的生物學(xué)特性。通過將適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖円肟笶rbB2的抗體的核酸中,或者通過肽合成來制備抗ErbB2的抗體的氨基酸序列變體。這種修飾包括,例如,缺失
4和/或插入和/或取代抗ErbB2的抗體的氨基酸序列中的殘基。進(jìn)行缺失、插入和取代的任何組合來獲得最終的構(gòu)建體,只要最終的構(gòu)建體具有所需的特征。氨基酸改變也可改變抗ErbB2抗體的翻譯后加工,例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量或位置。用于鑒定作為誘變優(yōu)選位置的抗ErbB2抗體的某些殘基或區(qū)域的有用方法稱作為“丙氨酸掃描誘變”,被描述在 Cunningham 和 Wells,Science,2M :1081-1085(1989)中。 在此,鑒定殘基或目標(biāo)殘基組(如帶電荷的殘基,例如精氨酸,天冬氨酸,組氨酸,賴氨酸, 和谷氨酸),并且用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選為丙氨酸或多聚丙氨酸)替換,來影響該氨基酸與ErbB2抗原的相互作用。那些表明對(duì)取代具有功能性靈敏性的氨基酸位置通過在或?qū)θ〈稽c(diǎn)引入更多或其他變化來改善。因此,雖然用于導(dǎo)入氨基酸序列變化的位點(diǎn)被預(yù)先確定,但是不必預(yù)先確定突變本身的性質(zhì)。例如,為了分析在特定位點(diǎn)上突變的進(jìn)行,在目標(biāo)密碼子或區(qū)域上進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變,用所需活性篩選被表達(dá)的抗ErbB2 抗體變體。氨基酸序列插入包括長(zhǎng)度在一個(gè)殘基到含有上百或更多殘基的多肽的氨基和/ 或羧基末端融合,以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N 末端甲硫氨酰殘基的抗ErbB2抗體或者融合到細(xì)胞毒性多肽上的抗體??笶rbB2抗體分子的其他插入變體包括抗ErbB2抗體的N-或C-末端融合到報(bào)道分子,酶(例如ADEPT)或者延長(zhǎng)抗體的血清半衰期的多肽上。另一種類型的變體是氨基酸取代變體。這些變體在抗ErbB2抗體中具有至少一個(gè)氨基酸殘基被不同殘基取代。對(duì)取代誘變來說最感興趣的位點(diǎn)包括高變區(qū),但FR改變也被考慮在內(nèi)。保守性取代顯示在表1的“優(yōu)選取代”的標(biāo)題下。如果這種取代導(dǎo)致生物學(xué)活性的變化,那么導(dǎo)入在表1中稱作“示例性取代”或者如下文關(guān)于氨基酸分類中進(jìn)一步描述的更實(shí)質(zhì)性改變,并篩選產(chǎn)物。表 權(quán)利要求
1.重組人源化單克隆抗體2C4(rhuMAb2C4),其是固定劑量420mgrhuMAb 2C4或載入劑量840mg rhuMAb 2C4,且其中所述rhuMAb 2C4包含分別為SEQ ID NO :3和4的輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序列,及人輕鏈和重鏈IgGl (非A同種異型)恒定區(qū)序列。
2.依照權(quán)利要求1的MmMAb2C4,其是固定劑量420mg。
3.依照權(quán)利要求1的MmMAb2C4,其是載入劑量840mg。
4.依照權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的IihuMAb2C4,其在容器中。
5.依照權(quán)利要求4的MrnMAb2C4,其中所述容器是瓶子、小管、或注射器。
6.依照權(quán)利要求4的MrnMAb2C4,其中所述容器是靜脈溶液袋或具有可以被皮下注射針頭穿過的塞子的小管。
7.依照權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)的IihuMAb2C4,其中所述容器在進(jìn)一步包括標(biāo)簽或包裝插入物的制品中。
8.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的MmMAb2C4,其存在于包含藥學(xué)可接受載體的藥物組合物中。
9.在患者中治療癌癥的方法中使用的重組人源化單克隆抗體2C4(rhuMAb 2C4),其中在所述方法中每3周以420mg固定劑量施用rhuMAb 2C4,且其中所述rhuMAb 2C4包含分別為SEQ ID NO 3和4的輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序列,及人輕鏈和重鏈IgGl (非A同種異型)恒定區(qū)序列。
10.依照權(quán)利要求9使用的IihuMAb2C4,其中在所述方法中所述rhuMAb2C4治療以 840mg載入劑量開始。
11.在癌癥患者中治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌或前列腺癌的方法中使用的重組人源化抗體2C4 (rhuMAb 2C4),其中所述rhuMAb 2C4包含分別為SEQ ID NO 3和4的輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序列,及人輕鏈和重鏈IgGl (非A同種異型)恒定區(qū)序列,且其中在所述方法中每3周以420mg固定劑量施用rhuMAb 2C4。
12.依照權(quán)利要求11使用的重組人源化抗體,其中所述rhuMAb2C4是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO)細(xì)胞表達(dá)的。
13.依照權(quán)利要求11或權(quán)利要求12使用的重組人源化抗體,其中所述rhuMAb2C4治療以840mg載入劑量開始。
14.重組人源化抗體2C4(rhuMAb2C4)在制備用于在癌癥患者中治療卵巢癌、乳腺癌、 肺癌或前列腺癌的藥物中的用途,其中所述rhuMAb 2C4包含分別為SEQ ID NO :3和4的輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序列,及人輕鏈和重鏈IgGl (非A同種異型)恒定區(qū)序列,且其中在所述治療中每3周以420mg固定劑量施用rhuMAb 2C4。
15.依照權(quán)利要求14的用途,其中所述rhuMAb2C4是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞表達(dá)的。
16.依照權(quán)利要求15的用途,其中所述藥物用于治療癌癥患者,其中所述rhuMAb2C4 治療以840mg載入劑量開始。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定對(duì)用抗ErbB2抗體處理響應(yīng)的腫瘤的方法。通過在腫瘤細(xì)胞樣品中檢測(cè)HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物或者HER2磷酸化的存在來鑒定對(duì)用抗HER2抗體處理響應(yīng)的腫瘤。用抗HER2抗體,例如rhuMAb 2C4治療患有包含HER/2/HER1和/或HER2/HER3異二聚體和/或HER2磷酸化的腫瘤的患者。
文檔編號(hào)C07K16/32GK102295703SQ201110278830
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月15日
發(fā)明者伯吉特.博森梅爾, 斯蒂芬.M.凱爾西, 漢斯.科爾, 漢斯-喬基姆.米勒, 馬克.X.斯利科夫斯基 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司, 霍夫曼-拉羅奇有限公司