專利名稱：H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體或其結(jié)合活性片段及其用途的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本發(fā)明申請(qǐng)要求源自2006年1月26日遞交的中國(guó)發(fā)明申請(qǐng)200610002312.1的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容包含于本發(fā)明申請(qǐng)之中。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及可特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之單克隆抗體，及其保守性變異體或活性片段，或其多肽或多肽類似物的相關(guān)編碼序列，或產(chǎn)生所述單克隆抗體的細(xì)胞株，及應(yīng)用該抗體或片段用于診斷與治療的方法。

背景技術(shù)：

自H5型禽流感于1996年首先在我國(guó)廣東省農(nóng)場(chǎng)的鵝群暴發(fā)以來(lái)(Xu，X.et al.，1999，Virology)，由此病毒演生出來(lái)的另一株H5病毒在香港的禽鳥(niǎo)農(nóng)場(chǎng)(1997年4月)及市場(chǎng)(1997年11月)暴發(fā)，引起了歷史上禽流感病毒第一次直接由禽傳人事件，前后共18例確診病例中有6人死亡。2003年以來(lái)，H5病毒株在整個(gè)東亞及東南亞國(guó)家的相繼暴發(fā)，WHO及流感專家預(yù)測(cè)H5禽流感病毒將最有可能成為下一次人類大流感暴發(fā)的流行株。2004年初，H5型高致病性禽流感也先后在我國(guó)十幾個(gè)省暴發(fā)，并在中國(guó)香港、泰國(guó)、荷蘭等發(fā)現(xiàn)H5型禽流感傳染雞、鴨、蒼鷺、虎、貓等多種動(dòng)物的事件。更令人擔(dān)憂的是，在泰國(guó)已經(jīng)出現(xiàn)疑似人傳染人事件，馬來(lái)西亞也有多例報(bào)道。進(jìn)入2005年，羅馬尼亞、俄羅斯、土耳其等歐洲國(guó)家相繼發(fā)現(xiàn)禽類感染H5型禽流感病毒致死事件，專家認(rèn)為此乃帶毒候鳥(niǎo)遷移的結(jié)果，這使得控制高致病性H5型禽流感病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散傳播變得更為困難。專家預(yù)測(cè)，隨著侯鳥(niǎo)的傳播，H5型禽流感病毒有可能通過(guò)歐亞、亞非大陸橋進(jìn)一步傳播到衛(wèi)生條件極差的非洲國(guó)家，使得H5型禽流感病毒獲得和其它人流感病毒充分重組的機(jī)會(huì)和時(shí)間，屆時(shí)將很可能形成一種對(duì)人類高度致命的全新流感病毒，其給人類帶來(lái)的各種損失將難以估計(jì)。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)結(jié)果，截止2006年1月19日，全球因感染H5N1病毒死亡的人類個(gè)案已達(dá)80例，給全球公共衛(wèi)生安全帶來(lái)極大的考驗(yàn)。

最新研究結(jié)果(Li，K.S.et al.，2004，Nature)表明，華南水禽(家鴨)為H5型禽流感病毒的主要攜帶者及傳播者，H5型禽流感的爆發(fā)有明顯的季節(jié)性，并伴隨著生物多態(tài)型(多種基因型)的演變。然而，分子流行病學(xué)研究表明，目前鴨群種大約有30％的陽(yáng)性感染并無(wú)任何癥狀，雞群中也有達(dá)10％的流行且無(wú)癥狀帶毒。這些受感染的動(dòng)物又能夠不斷使人受到新的感染，對(duì)人類的健康構(gòu)成巨大的威脅。有關(guān)專家一致認(rèn)為要控制好H5型高致病性禽流感病毒在整個(gè)東亞、東南亞以及歐洲各國(guó)的流行，早期診斷是先決條件，然后才能做到早隔離、早處理，對(duì)人做到早治療。

采用傳統(tǒng)的病毒分離及血清診斷方法診斷禽流感病毒需時(shí)4—5天，且目前大部分人及動(dòng)物疾控系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室缺乏三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室，故東南亞各國(guó)及地區(qū)對(duì)H5暴發(fā)的診斷明顯滯后。常見(jiàn)的情況是大量雞只死亡和撲殺行動(dòng)完成后仍未有實(shí)驗(yàn)室的確診報(bào)告，給控制病毒的暴發(fā)帶來(lái)很大不便。另外，因少數(shù)禽類(特別是水禽，如家鴨)存在著無(wú)癥狀帶毒情況，檢疫系統(tǒng)又無(wú)有效的檢測(cè)手段，這種情況的持續(xù)發(fā)展，引起了該病毒在多個(gè)國(guó)家地區(qū)反復(fù)暴發(fā)，遷延不斷的局面。

同時(shí)，由于H5型禽流感病毒(其中Goose/Guangdong/1/96為代表株)屬高致病性病毒，對(duì)目前常用的動(dòng)物模型均有致死性，而采用基因工程方法表達(dá)的血凝素蛋白(HA)又不能完整取得抗原性，世界上多個(gè)著名實(shí)驗(yàn)室先后嘗試制備針對(duì)該病毒系的單克隆抗體均未獲成功。目前對(duì)該病毒抗原性分析不得不采用特異性及反應(yīng)性均明顯達(dá)不到診斷試劑要求的由A/chicken/Pennsylvania/1370/83(H5N2)和A/chicken/Pennsylvania/8125/83(H5N2)制備的單克隆抗體。

鑒于上述情形，目前迫切期望能有一種方便、快捷、實(shí)時(shí)的診斷方法和手段，從而及時(shí)把第一代跨種族傳染的病人隔離治療，防止病毒向人傳人發(fā)展，在病毒未適應(yīng)人類之前就打斷其傳播鏈，從而從根本上消除該病毒對(duì)人類的大流感威脅。

中國(guó)國(guó)內(nèi)，有關(guān)抗禽流感病毒H5亞型檢測(cè)研究已有文獻(xiàn)報(bào)道。揚(yáng)州大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院秦愛(ài)建等(秦愛(ài)建，邵紅霞，錢琨等，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，03期)研制了抗禽流感病毒H5和H9亞型血凝素特異性單克隆抗體，應(yīng)用這些單克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)被證明能在24小時(shí)內(nèi)迅速檢測(cè)出相應(yīng)的禽流感病毒。北京出入境檢驗(yàn)檢疫局利用熒光RT-PCR快速檢測(cè)高致病力禽流感病毒H5亞型，檢測(cè)時(shí)間縮短為4小時(shí)，于2005年12月10日通過(guò)臨床驗(yàn)證。郭元吉在“人禽流感研究現(xiàn)狀”一文中綜述了H5亞型毒株抗體檢測(cè)需用微量中和實(shí)驗(yàn)或特異性高的ELISA(郭元吉，中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2004，03期)，但有關(guān)利用ELISA檢測(cè)H5亞型的研究性文獻(xiàn)卻未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

國(guó)外有關(guān)利用ELISA檢測(cè)H5N1抗體的研究已有報(bào)道。Rowe等報(bào)道了應(yīng)用重組血凝素蛋白作為抗原包被，利用間接ELISA檢測(cè)H5N1抗體，其ELISA的靈敏度為80％，特異度為62％(Rowe T.et al.，J.Clin.Microbiol.，April 1999；37(4)937-43)，但該文獻(xiàn)并非針對(duì)H5N1亞型血凝素HA基因特異的單克隆抗體。Zhou等(Zhou，E.M.et al.，AvianDis.，1998，42(4):757-61)、Shafer等(Shafer，A.L.et al.，Avian Dis.，1998，42(1):28-34)采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)禽流感病毒抗核心蛋白抗體，但檢測(cè)對(duì)象均為A型禽流感所有H1-H16亞型的NP蛋白抗體，不能確定亞型。Lu報(bào)道了基于單克隆抗體的Dot-ELISA檢測(cè)禽流感病毒(AV)，該方法直接檢測(cè)AIV抗原，其特異性在于不會(huì)與其它禽類病毒發(fā)生交叉反應(yīng)(Lu H.，Avian Dis.，2003，47(2)361-9)。雖然Sala等建立了基于H7亞型表面糖蛋白特異的單克隆抗體的ELISA，但其亞型為H7；單克隆抗體為表面糖蛋白特異的單克隆抗體，并非H5亞型血凝素HA基因特異的單克隆抗體(Sala G，Cordioli P，Moreno-Martin et al.Avian Dis.2003，47(3 Suppl):1057-9)。

遺憾的是，現(xiàn)有禽流感病毒免疫學(xué)診斷手段使用的單克隆抗體大部分針對(duì)的是核蛋白(NP蛋白)，因而其檢測(cè)的是A型(也稱甲型)流感病毒，但實(shí)際上A型流感病毒包括H1～H16共16個(gè)亞型，其中相當(dāng)大的亞型均無(wú)致病性或有低致病性，只有H5亞型禽流感病毒為危害最大的高致病性禽流感病毒。因而現(xiàn)有技術(shù)遠(yuǎn)不能滿足臨床檢測(cè)的需要。

本發(fā)明的根本目的在于克服現(xiàn)有禽流感病毒免疫檢測(cè)技術(shù)的缺陷，所采用的單克隆抗體針對(duì)的為H5亞型的HA蛋白，因而能夠特異的檢測(cè)具有高致病性的H5亞型禽流感病毒。


發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了可特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之單克隆抗體，及可阻斷至少50％的單克隆抗體與H5亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白結(jié)合活性之單克隆抗體.本發(fā)明也提供了相關(guān)的雜交瘤細(xì)胞株，分離的核酸分子和短肽，以及其含該單克隆抗體的藥物組合物和醫(yī)藥診斷設(shè)備和試劑盒。本發(fā)明也提供了利用該單克隆抗體探測(cè)，診斷，預(yù)防，和治療禽流感病毒，特別是H5亞型禽流感病毒的方法.



圖1為金標(biāo)法H5亞型流感病毒HA抗原檢測(cè)試劑盒的測(cè)定結(jié)果，其中＂a＂出現(xiàn)兩條紅色線，認(rèn)定為陽(yáng)性；＂b＂只出現(xiàn)質(zhì)控線，認(rèn)定為陰性；＂c＂不出現(xiàn)紅色線，則認(rèn)定為無(wú)效。

圖2為金標(biāo)法H5亞型流感病毒anti-HA抗體檢測(cè)試劑盒的測(cè)定結(jié)果，其中＂a＂只出現(xiàn)質(zhì)控線，認(rèn)定為陽(yáng)性；＂b＂出現(xiàn)兩條紅色線，認(rèn)定為陰性；＂c＂不出現(xiàn)紅色線，則認(rèn)定為無(wú)效。

圖3為H5亞型流感病毒HA抗原檢測(cè)試劑盒的測(cè)定結(jié)果，其中，“+”表示出現(xiàn)橢圓形顯色區(qū)域，認(rèn)定為陽(yáng)性；“-”表示未出現(xiàn)橢圓形顯色區(qū)域，認(rèn)定為陰性。

圖4為6種嵌合抗體的表達(dá)質(zhì)粒圖pcDNA3.1-Ak8H5、pcDNA3.1-AH8H5、pcDNA3.1-Ak10F7、pcDNA3.1-AH10F7、pcDNA3.1-Ak4D1和pcDNA3.1-AH4D1。

圖5為三種嵌合抗體對(duì)Ck/HK/Yu22/02毒株的血凝抑制實(shí)驗(yàn)，其中，第1、2、3列PBS對(duì)照物；第4和5列10F7 cAb；第6列10F7 mAb；第7和8列4D1 cAb；第9列4D1 mAb；第10和11列8H5 cAb；第12列8H5 mAb。

圖6為嵌合抗體與表達(dá)H5血凝素的細(xì)胞反應(yīng)的免疫熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，A為cAb 4D1(DAPI)；B為cAb 4D1(FITC)；C為cAb 10F7(DAPI)；D為cAb 10F7(FITC)；E為抗-HBV cAb(DAPI)；F為抗-HBV cAb(FITC)。

圖7為噬菌體多肽的ELISA檢測(cè)值OD(450/620)的矩形圖。

圖8為pTO-T7與pTO-T7-239-123的質(zhì)粒示意圖。

圖9為pTO-T7與pTO-T7-239-125的質(zhì)粒示意圖。

圖10為融合蛋白(或重組蛋白)239-123純化樣品的SDS-PAGE電泳圖，其中，1分子重量標(biāo)簽；2表達(dá)239-123的E.coli全部溶胞產(chǎn)物；3239-123之超聲溶胞產(chǎn)物的上清；4緩沖液I中的239-123；52M尿素中的239-123純化融合蛋白；64M尿素中的239-123的純化融合蛋白；78M尿素中的239-123的純化融合蛋白。

圖11為融合蛋白239-125純化樣品的SDS-PAGE電泳圖，其中，1分子重量標(biāo)簽；2表達(dá)239-125的E.coli全部溶胞產(chǎn)物；3全部溶胞產(chǎn)物之離心分離上清；4緩沖液I中的239-125；52M尿素中的239-125的純化融合蛋白；64M尿素中的239-125的純化融合蛋白；78M尿素中的239-125的純化融合蛋白。

圖12顯示了239-123融合蛋白的結(jié)合特性其ELISA檢測(cè)值OD(450/620)的色彩強(qiáng)度矩形圖，其中，239-123融合蛋白結(jié)合到水平軸所標(biāo)識(shí)的各種毒株上。

圖13顯示了239-125融合蛋白的結(jié)合特性其ELISA檢測(cè)值OD(450/620)的色彩強(qiáng)度矩形圖，其中，239-125融合蛋白結(jié)合到水平軸所標(biāo)識(shí)的各種毒株上。

圖14為在各種mAb稀釋下，239-123融合蛋白結(jié)合到8H5mAb(三角形點(diǎn)線)或8C11mAb(方點(diǎn)線)的ELISA檢測(cè)值OD(450/620)的色彩強(qiáng)度。

圖15為pC149-mut與pC149-mut-123的質(zhì)粒圖。

圖16為pC149-mut與pC149-mut-125的質(zhì)粒圖。

圖17為小量表達(dá)的重組蛋白的全胞溶胞產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖，其中，1D123；2T123；3F123；4Q123；5D125；6T125；7F125；8Q125。

圖18為純化重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中，1D123；2T123；3F123；4Q123；5D125；6T125；7F125；8Q125。

圖19為類病毒顆粒的電鏡圖，該類病毒顆粒是由HBV cAg片段的融合蛋白和結(jié)合抗體的多肽組裝而成的。

圖20為顯示融合蛋白HBc-123/125與單抗8H5之間結(jié)合親和力的ELISA檢測(cè)值OD(450/620)的色彩強(qiáng)度矩形圖。

圖21為顯示融合蛋白HBc-Q123或HBc-D125與各種單抗之間結(jié)合親和力的ELISA檢測(cè)值OD(450/620)的色彩強(qiáng)度矩形圖；結(jié)果表明，融合蛋白HBc-Q123和HBc-D125 T特異性地結(jié)合單抗8H5。

圖22顯示了ELISA檢測(cè)HBc-123融合蛋白免疫鼠血清抗體滴度上升曲線，其中，時(shí)間為0-4周，抗體滴度通過(guò)ELISA檢測(cè)。

圖23顯示了ELISA檢測(cè)HBc-125融合蛋白免疫鼠血清抗體滴度上升曲線，其中，時(shí)間為0-4周，抗體滴度通過(guò)ELISA檢測(cè)。

圖24顯示了免疫熒光檢測(cè)免疫鼠血清與SF21細(xì)胞中表達(dá)的HA蛋白的反應(yīng)。

圖25為HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129重組蛋白組裝的類病毒顆粒的電鏡圖。

圖26為顯示融合蛋白HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129與各種單抗之間的結(jié)合親和力的ELISA檢測(cè)值OD(450/620)的色彩強(qiáng)度矩形圖；結(jié)果表明，融合蛋白HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129特異性地結(jié)合到單抗8H5。

圖27顯示了由12肽融合蛋白組裝的的類病毒顆粒與H5N1病毒競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合8H5酶標(biāo)抗體的結(jié)果，其中，縱軸是色彩強(qiáng)度(以O(shè)D(450/620)值表示)，水平軸是實(shí)驗(yàn)中所用的各種類病毒顆粒和PBS對(duì)照物。

具體實(shí)施例方式
本發(fā)明申請(qǐng)中涉及的有關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義如下
本發(fā)明中的“血凝素”一詞指禽流感病毒的包膜糖蛋白。血凝素蛋白介導(dǎo)流感病毒針對(duì)宿主細(xì)胞的吸附和進(jìn)入。禽流感病毒的血凝素蛋白有16個(gè)血清學(xué)亞型，HA1—HA16，分別對(duì)應(yīng)于16個(gè)病毒亞型，即H1—H16。

本發(fā)明中的“抗體”一詞指任意一種免疫球蛋白，包括能結(jié)合特異性抗原的單抗、多抗、雙特異性或多特異性抗體。一個(gè)完整的抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈含有一個(gè)可變區(qū)和第一、第二、第三等三個(gè)恒定區(qū)；每條輕鏈包含一個(gè)可變區(qū)和一個(gè)恒定區(qū)。抗體呈“Y”型，“Y”型結(jié)構(gòu)的頸部含有兩條重鏈的第二和第三恒定區(qū)，其通過(guò)二硫鍵結(jié)合形成。“Y”型結(jié)構(gòu)的每條臂含有其中一條重鏈的第一恒定區(qū)和可變區(qū)，和一條輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)。輕鏈和重鏈的可變區(qū)決定抗原的結(jié)合；每條鏈的可變區(qū)均含有三個(gè)高變區(qū)，稱互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(輕鏈(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重鏈(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3(其由Kabat等人命名，見(jiàn)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，F(xiàn)ifth Edition(1991)，第1-3卷，NIH Publication 91-3242，Bethesda Md)。其中，三個(gè)CDR由構(gòu)架區(qū)(FR)間隔開(kāi)。構(gòu)架區(qū)比CDR區(qū)更保守并形成一個(gè)架子狀結(jié)構(gòu)支撐超變區(qū)。重鏈和輕鏈的恒定區(qū)與抗原結(jié)合無(wú)關(guān)，但具有多種效應(yīng)功能?？贵w依據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列可以分成幾類，主要是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些類還進(jìn)一步分成亞類，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2等。

本發(fā)明中的“抗體”一詞，除特指完整的免疫球蛋白外，也指免疫球蛋白的片段(如至少是免疫球蛋白分子的一個(gè)免疫活性區(qū)段)，如Fab、Fab＇、F(ab＇)2、Fv片段、單鏈抗體分子或由含有一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的免疫球蛋白分子的任意片段形成的多特異性抗體。另外，本發(fā)明涉及的抗體也可以是由一個(gè)特定的人免疫球蛋白中的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)結(jié)合一個(gè)或多個(gè)不同的人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)形成的抗體。

抗體相關(guān)的“Fab”片段是指含有一條輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)和一條重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)經(jīng)二硫鍵結(jié)合起來(lái)的抗體分子的一部分。

“Fab"片段是指包含了部分鉸鏈區(qū)的Fab片段。

F(ab＇)2指的是Fab’的二聚體。

抗體的“Fc”指的是第一重鏈的第二、第三恒定區(qū)與第二重鏈的第二、第三恒定區(qū)經(jīng)二硫鍵結(jié)合成的抗體的一部分?？贵w的Fc段有多種不同的功能，但不參與抗原的結(jié)合。

抗體的“Fv”段指的是能結(jié)合完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體的最小片段。一個(gè)Fv片段包括一條輕鏈的可變區(qū)結(jié)合到一條重鏈的可變區(qū)。

本發(fā)明中的“單鏈Fv抗體”或“scFv”指的是由輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)直接相連或通過(guò)一個(gè)肽鏈連接而成的工程抗體(Houston 1988)。

本發(fā)明中的“單鏈抗體Fv-Fc”或“scFv-Fc”也包括scFv連接抗體的Fc段形成的工程抗體。

本發(fā)明中的“抗原決定簇”(或稱表位)指的是抗原分子中與抗體結(jié)合的那部分氨基酸或原子基團(tuán)。

發(fā)明中的“單抗”或者“MAb”或者“mAb”指的是來(lái)自一群高度同源的抗體分子中的一個(gè)抗體或抗體的一個(gè)片斷，也即除僅在少數(shù)情況下可能出現(xiàn)的自然突變外，一群完全相同的抗體分子。單抗對(duì)抗原上的單一表位具有高特異性。單抗與多抗不同，多抗是包含了識(shí)別抗原上的不同表位的抗體分子。雖然傳統(tǒng)的單抗是由雜交瘤細(xì)胞分泌的，但本發(fā)明涉及的單抗并不僅限于此制備方法。如，本發(fā)明涉及的單抗可采用Kohler等首次報(bào)道的雜交瘤技術(shù)獲得(Nature，256:495，1975)，也可采用重組DNA技術(shù)獲得(如參見(jiàn)U.S.P4,816,567)。

本發(fā)明中的“嵌合抗體”一詞指的是抗體輕鏈或/和重鏈的一部分是源自某一特定物種或?qū)倌骋惶囟贵w類或亞類的序列相同或同源的抗體，而抗體輕鏈或/和重鏈的另一部分是源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的序列相同或同源的抗體。不管怎樣，這種抗體片段仍保留了對(duì)目標(biāo)抗原的結(jié)合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly et al.；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851 6855(1984))。

本申請(qǐng)中，“人源化抗體”一詞指的是人源免疫球蛋白(受體抗體)的全部或部分CDR區(qū)被一非人源抗體(供體抗體)的CDR區(qū)替換后得到抗體或抗體片段，其中的供體抗體可以是有預(yù)期特異性、親和性和反應(yīng)性的小鼠、大鼠或兔抗體。另外，人源免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)的氨基酸序列也可被相應(yīng)的非人源抗體的氨基酸序列所替換。而且，人源化抗體的氨基酸殘基也可以既非來(lái)源于受體抗體，也非來(lái)源于供體抗體的CDR區(qū)或構(gòu)架區(qū)序列。這些人工修飾的目的是進(jìn)一步完善或優(yōu)化抗體性能?？傊?，人源化抗體是指含有至少一個(gè)、通常是兩個(gè)幾乎完整的可變區(qū)，其中對(duì)應(yīng)的所有或幾乎所有的CDR區(qū)是來(lái)自非人源抗體，其中的全部或幾乎全部的FR區(qū)是來(lái)自人源抗體。理想的人源化抗體至少含有免疫球蛋白的Fc區(qū)的一部分，通常是人源免疫球蛋白的Fc區(qū)。更多詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參閱Joneset al.，Nature，321:522 525(1986)；Reichmann et al.，Nature，332:323 329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2:593 596(1992)；and Clark，Immunol.Today 21397 402(2000)。

本申請(qǐng)涉及的“被分離”一詞，指的是天然狀態(tài)下經(jīng)人工手段獲得的。如果自然界中出現(xiàn)某一種“被分離”的物質(zhì)或成分，那么可能是其所處的天然環(huán)境發(fā)生了改變或從天然環(huán)境下離分出該物質(zhì)，或二者情況均有發(fā)生。比如，某一活體動(dòng)物體內(nèi)天然存在的某種未被分離的多聚核苷酸或多肽，而從這種天然狀態(tài)下分離出來(lái)的高純度的相同的多聚核苷酸或多肽即稱之為被分離。這里的“被分離”不排除混有人工或合成的物質(zhì)，也不排除存在不影響物質(zhì)活性的其它不純物質(zhì)。

本發(fā)明中“載體”一詞指的是，可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達(dá)的一種核酸運(yùn)載工具。載體可通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)得以表達(dá)。舉例來(lái)說(shuō)，載體包括質(zhì)粒；噬菌粒；柯斯質(zhì)粒；人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)或P1來(lái)源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動(dòng)物病毒等。用作載體的動(dòng)物病毒種類有逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達(dá)的元件，包括啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報(bào)告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點(diǎn)。載體還有可能包括有協(xié)助其進(jìn)入細(xì)胞的成分，如病毒顆粒、脂質(zhì)體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質(zhì)。

本發(fā)明中“宿主細(xì)胞”一詞指的是導(dǎo)入載體的細(xì)胞，包括如下許多細(xì)胞類型，如大腸桿菌或枯草菌等原核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或曲霉菌等真菌細(xì)胞，如S2果蠅細(xì)胞或Sf9等昆蟲(chóng)細(xì)胞，或者動(dòng)物細(xì)胞如纖維原細(xì)胞，CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，NSO細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，BHK細(xì)胞，HEK 293細(xì)胞，或人細(xì)胞。

“中和抗體”一詞指的是能清除或顯著降低目標(biāo)病毒抗原結(jié)合毒力的抗體或抗體片段。

“序列相同百分比”一詞指的是候選序列中的核酸或氨基酸分別與對(duì)應(yīng)的核酸或多肽序列中核酸或氨基酸相同性的百分比。這里涉及到的與核酸序列或者多肽序列有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“序列相似百分比”定義為候選核酸序列或氨基酸殘基序列分別與目的核酸序列或氨基酸序列的相似百分比。對(duì)于某一個(gè)序列，將它和目的序列進(jìn)行比對(duì)，必要時(shí)可跳過(guò)突變?nèi)笨?，以達(dá)到最大的基因相似百分比，而不去考慮相似序列的任意保守性突變。本領(lǐng)域的多種比對(duì)方法可用于確定核酸或氨基酸序列的相似性，如可用的計(jì)算機(jī)軟件包括BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)等。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的工作人員懂得給比對(duì)設(shè)定合適的測(cè)量參數(shù)，包括為使用最大可比性的一些運(yùn)算法則達(dá)到而全長(zhǎng)序列的比較。

“特異性結(jié)合”一詞指的是，指兩分子間的非隨機(jī)結(jié)合反應(yīng)，如抗體和產(chǎn)生該抗體的抗原間的反應(yīng)。此處，結(jié)合第一種抗原的抗體對(duì)第二種抗原的結(jié)合親和力是檢測(cè)不到或很弱。在某些實(shí)施方式中，一個(gè)某抗原特異性抗體是指以親和力(KD)≤10-5M(如10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M等)結(jié)合該抗原，其中KD指解離率與結(jié)合率的比值(koff/kon)，其可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法進(jìn)行測(cè)定。

抗體
本發(fā)明所述單抗能夠特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及能特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單抗及其相應(yīng)的抗原結(jié)合片段。

本發(fā)明所述抗H5單抗是由小鼠雜交瘤細(xì)胞株8H5，3C8，10F7，4D1，3G4和2F2所分泌的。這些單抗的名稱以其相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行命名。也就是，這些抗H5單抗分別由雜交瘤細(xì)胞株8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2產(chǎn)生，并分別命名為8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2。單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2能特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白。小鼠雜交瘤細(xì)胞株8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2已在2006年1月17日于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，Wuhan University，Wuhan，China)進(jìn)行保藏，保藏號(hào)是CCTCC—C200607(雜交瘤細(xì)胞株8H5)，CCTCC-C200605(雜交瘤細(xì)胞株3C8)、CCTCC-C200608(雜交瘤細(xì)胞株10F7)、CCTCC-C200606(雜交瘤細(xì)胞株4D1)、CCTCC-C200604(雜交瘤細(xì)胞株3G4)和CCTCC-C200424(雜交瘤細(xì)胞株2F2)。

本發(fā)明涉及單抗還包括能阻斷單抗8H5，3C8，10F7，4D1，3G4或2F2結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單抗。這些單抗結(jié)合的血凝素上的表位可以與單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4或2F2所識(shí)別的表位相同。這些單抗所識(shí)別的表位也可以和單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4或2F2所識(shí)別的表位在空間上有重疊。這樣的單抗可以降低單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4或2F2與H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的結(jié)合力至少50％，或至少60％，或優(yōu)選至少70％，或更優(yōu)選至少75％，或更優(yōu)選至少80％，或更優(yōu)選至少85％，或更優(yōu)選至少90％，或更優(yōu)選95％，或最優(yōu)選99％。

可以采用常規(guī)方法如A ntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中描述的方法，測(cè)定某一未知單抗降低某一已知單抗結(jié)合H5血凝素蛋白的能力。例如，先把抗原預(yù)包被在微孔板上，然后把系列稀釋的未標(biāo)記的待測(cè)抗體和特定濃度的標(biāo)記后的已知單抗共同加入上述預(yù)包被后的微孔板中孵育，洗滌后測(cè)定不同稀釋度的待測(cè)抗體下已知抗體結(jié)合到板上的數(shù)量。待測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)已知抗體結(jié)合抗原的能力越強(qiáng)，已知抗體結(jié)合抗原的能力就越弱。通常，抗原是預(yù)包被在96孔微孔板上，并利用放射標(biāo)記法或酶標(biāo)記法測(cè)定未標(biāo)記單抗阻斷已標(biāo)記單抗的能力。

可以采用Kohler等在Nature 256495(1975)中報(bào)道的雜交瘤制備方法來(lái)制備單抗。首先將免疫原(必要時(shí)候添加佐劑)免疫注射小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物。免疫原或佐劑的注射方式通常為皮下多點(diǎn)注射或腹腔注射。免疫原預(yù)先藕聯(lián)到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆姨酶抑制劑上，可能會(huì)有助于增強(qiáng)抗原在宿主內(nèi)的免疫原性。佐劑可以利用福氏佐劑或MPL-TDM等。動(dòng)物受免疫后，體內(nèi)會(huì)有分泌特異性結(jié)合免疫原的抗體的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。另外，淋巴細(xì)胞也可以利用體外免疫獲得。收集目的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞并用合適的融合劑，如PEG，進(jìn)行融合以獲得雜交瘤細(xì)胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)。

上述制備的雜交瘤細(xì)胞可以接種到合適的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中最好含有一種或多種能夠抑制未融合的、母體骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。例如，對(duì)缺乏次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶(HGPRT or HPRT)的母體骨髓瘤細(xì)胞，在培養(yǎng)液中添加次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培養(yǎng)基)等物質(zhì)將可以抑制HGPRT-缺陷細(xì)胞的生長(zhǎng)。

優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)該具有融合率高，抗體分泌能力穩(wěn)定，對(duì)HAT培養(yǎng)液敏感等能力。其中，骨髓瘤細(xì)胞首選鼠源骨髓瘤，如MOP-21 and MC-11小鼠腫瘤衍生株(THE SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA)，和SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞株(American Type Culture Collection，Rockville，Md.USA)。另外也有研究報(bào)道利用人骨髓瘤和人鼠異源骨髓瘤細(xì)胞株制備人單抗(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。

雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)液用于檢測(cè)針對(duì)特異抗原的單抗的產(chǎn)生。測(cè)定雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗的結(jié)合特異性有免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)，如放射免疫試驗(yàn)(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。例如，利用Munson等在Anal.Biochem.107220(1980)描述的Scatchard分析法可用來(lái)測(cè)定單抗的親和力。

當(dāng)雜交瘤產(chǎn)生的抗體的特異性、親和力和反應(yīng)性確定之后，目的細(xì)胞株可以通過(guò)(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)所描述的標(biāo)準(zhǔn)的有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化。合適的培養(yǎng)液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，雜交瘤細(xì)胞還可以腹水瘤的形式在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)。

利用傳統(tǒng)的免疫球蛋白純化方法，如蛋白A瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析等，可以將亞克隆細(xì)胞分泌的單抗從細(xì)胞培養(yǎng)液、腹水或血清中分離出來(lái)。

本發(fā)明所述單抗還可以是通過(guò)基因工程重組技術(shù)獲得。利用特異性結(jié)合單抗重鏈和輕鏈基因的核酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以從雜交瘤細(xì)胞中分離得到編碼單抗重鏈和輕鏈基因的DNA分子。所得DNA分子插入表達(dá)載體內(nèi)，然后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，如E.coli細(xì)胞、猿猴COS、CHO細(xì)胞、或其它不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)并表達(dá)目標(biāo)抗體。

本發(fā)明的抗體對(duì)H5血凝素蛋白結(jié)合具有高特異性和高親和力。這些抗體對(duì)其它亞型的血凝素蛋白可能會(huì)有弱的交叉反應(yīng)性，優(yōu)選地，這些抗體對(duì)其它亞型的血凝素蛋白完全沒(méi)有交叉反應(yīng)性。一方面，本發(fā)明的抗體結(jié)合H5血凝素的KD值小于1×10-5M；優(yōu)選地，KD值小于1×10-6M；更優(yōu)選地，KD值小于1×10-7M，最優(yōu)選地，KD值小于1×10-8M。

本發(fā)明的單抗可以是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的傳統(tǒng)的“Y”型結(jié)構(gòu)狀的抗體。另外，所述抗體也可以是保持了對(duì)血凝素蛋白親和力的傳統(tǒng)的“Y”型結(jié)構(gòu)狀的抗體上的Fab片段、Fab＇、F(ab)2、Fv、或其它類型的部分片段，其結(jié)合血凝素蛋白的親和力可以高于或低于傳統(tǒng)的“Y”型結(jié)構(gòu)狀的抗體。

本發(fā)明的抗體片段可以利用水解完整的抗體分子獲得(參見(jiàn)Morimoto et al.，J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.，Science 229:81(1985))。另外，這些抗體片段也可以直接由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生(reviewed in Hudson，Curr.Opin.Immunol.11548-557(1999)；Little et al.，Immunol.Today，21364-370(2000))。比如，F(xiàn)ab＇片段可以直接從E.coli細(xì)胞中獲得或化學(xué)藕聯(lián)形成F(ab＇)2片段(Carter et al.，Bio/Technology，10:163-167(1992))。再如，F(xiàn)(ab＇)2片段可以用亮氨酸拉鏈GCN4連接獲得。另外，F(xiàn)v、Fab或F(ab＇)2片段也可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)液中直接分離得到。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完全知曉制備抗體片段的其它技術(shù)。

抗體核酸序列
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合H5血凝素蛋白的抗體或抗體片段的編碼核酸分子。編碼抗體的核酸分子可以從雜交瘤細(xì)胞中分離得到。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完全知曉利用常規(guī)技術(shù)可以測(cè)定這些分子的核酸序列。本發(fā)明涉及的抗體核酸分子也可以利用傳統(tǒng)的基因工程重組技術(shù)或化學(xué)合成方法獲得。一方面，本發(fā)明涉及的抗體核酸分子的序列包含了抗H5抗體的重鏈可變區(qū)或抗體分子的部分核酸序列。另一方面，本發(fā)明涉及的抗體核酸分子的序列也包括抗H5抗體的輕鏈可變區(qū)或抗體分子的部分核酸序列。另一方面，本發(fā)明涉及的抗體核酸分子的序列還包括重鏈或輕鏈可變區(qū)的CDR序列。

本發(fā)明的一方面涉及編碼單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的核酸分子。單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重鏈可變區(qū)序列(VH，Vh)的核酸分子分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9、SEQ ID NO16、SEQ ID NO20和SEQ ID NO24。單抗8H5、3C8、10F7、4D1和2F2輕鏈可變區(qū)序列(VK，Vk)的核酸分子分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO3、SEQ ID NO7、SEQ ID NO11、SEQID NO18和SEQ ID NO26。本發(fā)明還涉及包含了單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的核酸分子變異體或類似體。

另一方面，本發(fā)明還涉及各種分離的核酸分子的變異體，其序列與如下核酸序列相同SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQID NO11、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO24或SEQ IDNO26。具體地，核酸變異體的序列與如下核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26的相同性至少達(dá)70％、優(yōu)選至少達(dá)75％、更優(yōu)選至少達(dá)80％、更優(yōu)選至少達(dá)85％、更優(yōu)選至少達(dá)90％、最優(yōu)選至少達(dá)95％。

本發(fā)明還提供能特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒的抗體片段的編碼序列的核酸分子。

本發(fā)明更進(jìn)一步還涉及編碼抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NOs28-30、SEQ ID NOs34-36、SEQ ID NOs40-42、SEQ ID NOs46-48、SEQ ID NOs52-54和SEQ ID NOs58-60的所對(duì)應(yīng)被分離的核酸分子。本發(fā)明還涉及編碼抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NOs31-33、SEQ ID NOs37-39、SEQ ID NOs43-45、SEQ ID NOs49-51和SEQ ID NOs61-63的所對(duì)應(yīng)的核酸分子。

本發(fā)明涉及含有所述核酸分子的重組表達(dá)載體，也涉及轉(zhuǎn)化了這些分子的宿主細(xì)胞。而且，本發(fā)明還涉及利用包含了所述核酸分子的宿主細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)并分離得到發(fā)明所述抗體的方法。

抗體多肽序列
單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列可以從對(duì)應(yīng)的核酸序列中推導(dǎo)得到。單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重鏈可變區(qū)氨基酸序列分別是SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO17、SEQ ID NO21和SEQ ID NO25。單抗8H5、3C8、10F7、4D1和2F2輕鏈可變區(qū)氨基酸序列分別是SEQID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO19和SEQ ID NO27。一方面，本發(fā)明提供的抗H5單抗包含的重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQID NO10、SEQ ID NO17、SEQ ID NO21和SEQ ID NO25。另一方面，本發(fā)明提供的抗H5單抗包含的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO19和SEQ ID NO27。

另一方面，本發(fā)明提供的抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO2、SEQID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO17、SEQ ID NO21或SEQ ID NO25的序列相似性至少達(dá)70％，優(yōu)選是至少75％，優(yōu)選是至少80％，優(yōu)選是85％，再優(yōu)選是至少90％，最好的是至少95％。

另一方面，本發(fā)明提供的抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO4、SEQID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO19或SEQ ID NO27的序列相似性至少達(dá)70％，優(yōu)選是至少75％，優(yōu)選是至少80％，優(yōu)選是85％，再優(yōu)選是至少90％，最好的是至少95％。

單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2的重鏈和輕鏈可變區(qū)的CDR的氨基酸序列確定如下
單抗8H5重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ IDNos28-30。單抗8H5輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ IDNos31-33。

單抗3C8重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos34-36。單抗3C8輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos37-39。

單抗10F7重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos40-42。單抗10F7輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos43-45。

單抗4D1重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos46-48。單抗4D1輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos49-51。

單抗3G4重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos52-54。

單抗2F2重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos58-60。單抗2F2輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos61-63。

另一方面，本發(fā)明提供了抗H5單抗重鏈或片段，其含有如下CDR(i)來(lái)自SEQID NOs28-30的一個(gè)或多個(gè)CDR；(ii)來(lái)自SEQ ID NOs34-36的一個(gè)或多個(gè)CDR；(iii)來(lái)自SEQ ID NOs40-42的一個(gè)或多個(gè)CDR；(iv)來(lái)自SEQ ID NOs46-48的一個(gè)或多個(gè)CDR；(v)來(lái)自SEQ ID NOs52-54的一個(gè)或多個(gè)CDR；或(vi)來(lái)自SEQ ID NOs58-60的一個(gè)或多個(gè)CDR。在一實(shí)施方式中，抗H5單抗重鏈或片段含有三個(gè)氨基酸序列為SEQID NOs28-30的CDR。在另一實(shí)施方式中，抗H5單抗重鏈或片段含有三個(gè)氨基酸序列為SEQ ID NOs34-36的CDR。在又一實(shí)施方式中，抗H5單抗重鏈或片段含有三個(gè)氨基酸序列為SEQ ID NOs40-42的CDR。在又一實(shí)施方式中，抗H5單抗重鏈或片段含有三個(gè)氨基酸序列為SEQ ID NOs46-48的CDR。在又一實(shí)施方式中，抗H5單抗重鏈或片段含有三個(gè)氨基酸序列為SEQ ID NOs52-54的CDR。在又一實(shí)施方式中，抗H5單抗重鏈或片段含有三個(gè)其氨基酸序列為SEQ ID NOs58-60的CDR。

另一方面，抗H5單抗的重鏈或片段的CDR含有的氨基酸序列可能是在SEQ IDNOs28-30、34-36、40-42、46-48、52-54和58-60上出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的突變或增添或缺失。優(yōu)選的是，突變或添加或缺失的氨基酸不超過(guò)3個(gè)氨基酸。更優(yōu)選的是，突變或添加或缺失的氨基酸不超過(guò)2個(gè)氨基酸。最優(yōu)選的是，突變或添加或缺失的氨基酸不超過(guò)1個(gè)氨基酸。

另一方面，本發(fā)明提供了抗H5單抗輕鏈或片段含有如下CDR(i)來(lái)自SEQ IDNOs31-33的一個(gè)或多個(gè)CDR；(ii)來(lái)自SEQ ID NOs37-39的一個(gè)或多個(gè)CDR；(iii)來(lái)自SEQ ID NOs43-45的一個(gè)或多個(gè)CDR；(iv)來(lái)自SEQ ID NOs49-51的一個(gè)或多個(gè)CDR；(v)來(lái)自SEQ ID NOs61-63的一個(gè)或多個(gè)CDR。在一實(shí)施方式中，抗H5單抗輕鏈或片段含有三個(gè)其氨基酸序列為SEQ ID NOs31-33的CDR。在另一實(shí)施方式中，抗H5單抗輕鏈或片段含有三個(gè)其氨基酸序列為SEQ ID NOs37-39的CDR。在又一實(shí)施方式中，抗H5單抗輕鏈或片段含有三個(gè)其氨基酸序列為SEQ ID NOs43-45的CDR。在又一實(shí)施方式中，抗H5單抗輕鏈或片段含有三個(gè)其氨基酸序列為SEQ ID NOs49-51的CDR。在又一實(shí)施方式中，抗H5單抗輕鏈或片段含有三個(gè)其氨基酸序列為SEQ ID NOs55-57的CDR。在又一實(shí)施方式中，抗H5單抗輕鏈或片段含有三個(gè)其氨基酸序列為SEQ IDNOs61-63的CDR。

另一方面，抗H5單抗的輕鏈或片段的CDR含有的氨基酸序列可能是在SEQ IDNOs31-33，37-39，43-45，49-51和61-63上出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的突變、增添或缺失。優(yōu)選的是，突變、添加或缺失的氨基酸不超過(guò)3個(gè)氨基酸。更優(yōu)選的是，突變、添加或缺失的氨基酸不超過(guò)2個(gè)氨基酸。最優(yōu)選的是，突變、添加或缺失的氨基酸不超過(guò)1個(gè)氨基酸。

上述抗體或CDR的可變區(qū)的氨基酸發(fā)生突變、添加或缺失之后的變異體仍然保留特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒的能力。本發(fā)明也包含這樣的抗原結(jié)合片段的變異體。

本發(fā)明的單抗變異體可以通過(guò)傳統(tǒng)的基因工程方法獲得。本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全知曉利用核酸突變改造DNA分子的方法。另外，編碼重鏈和輕鏈變異體的核酸分子也可以通過(guò)化學(xué)合成獲得。

嵌合抗體、人源化抗體合融合蛋白
另一方面，本發(fā)明也提供了嵌合抗體，它是由鼠源單抗8H5，3C8，10F7，4D1，3G4或2F2或其變異體的重鏈和/或輕鏈完整的或部分的可變區(qū)結(jié)合人源單抗恒定區(qū)組成的。而且，本發(fā)明也包括了人源化抗體，它們是由鼠源單抗8H5，3C8，10F7，4D1，3G4或2F2或其變異體的的一個(gè)或多個(gè)CDR嫁接到人源抗體的框架上組成的。

另一方面，本發(fā)明還提供了藕聯(lián)了某種分子的完全或部分含有本發(fā)明所述單抗的一種融合蛋白。

嵌合抗體、人源化抗體和融合蛋白都可以利用傳統(tǒng)的基因工程技術(shù)獲得。如，編碼單抗的DNA可以通過(guò)突變的方法把人源抗體的重鏈和輕鏈的恒定區(qū)的序列替換成同源性的鼠源序列而改造成(Morrison，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.816851(1984))，或通過(guò)把整個(gè)或部分免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白編碼序列進(jìn)行共價(jià)藕聯(lián)而獲得嵌合或人源化抗體或融合蛋白。

中和抗體
另一方面，本發(fā)明提供了能夠中和H5亞型禽流感病毒之病毒活性的抗H5抗體。在一實(shí)施方式中，這種中和抗體能夠中和H5亞型禽流感病毒之病毒活性的至少60％，或至少70％，或優(yōu)選至少75％，或優(yōu)選至少80％，或優(yōu)選至少85％，或優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選至少99％。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全知曉利用傳統(tǒng)的技術(shù)方法可以測(cè)定抗體中和H5亞型禽流感病毒的病毒活性。如本發(fā)明的實(shí)施例1中所描述的中和試驗(yàn)的方法即可用于測(cè)定本發(fā)明中的某一個(gè)特定H5單抗的中和活性。

短肽
本發(fā)明還提供了一種模擬單克隆抗體識(shí)別表位的短肽。

九個(gè)含7個(gè)氨基酸的短肽由于其與單克隆抗體8H5、3C8結(jié)合而被篩選出來(lái).其中，五個(gè)與8H5單克隆抗體結(jié)合的短肽有氨基酸序列SEQ ID NOS64-68，4個(gè)與3C8單克隆抗體結(jié)合的短肽有氨基酸序列SEQ ID NOS70-73(表14)。

七肽8H5A(SEQ ID NO64)和8H5E(SEQ ID NO68)顯示了反應(yīng)活性.8H5A七肽和8H5單克隆抗體結(jié)合得非常好，但與其他單克隆抗體結(jié)合得弱.8H5E七肽和8H5單克隆抗體結(jié)合得相對(duì)較差。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了12個(gè)與單克隆抗體8H5結(jié)合有好而的特性的含12個(gè)氨基酸的短肽確(表16，SEQ ID NOS74-97)。

該12肽(SEQ ID NOS123，SEQ ID NOS125)可用于制成融合蛋白239-123和239-125，該融合蛋白分別和8C11及8H5單克隆抗體結(jié)合得很好.該12肽123或125可用于和HBVcAg制成融合蛋白，該融合蛋白和8H5單克隆抗體而非其他抗體結(jié)合有特性.融合蛋白HBc-122，HBc-124，HBc-128，HBc-129和8H5單克隆抗體而非其他抗體結(jié)合有特性.融合蛋白HBc-123，HBc-124，HBc-125，HBc-128，HBc-129還可模擬單克隆抗體識(shí)別表位而形成類似病毒顆粒的組裝。

檢測(cè)方法
本發(fā)明還提供了一種利用本發(fā)明所述單克隆抗體檢測(cè)H5型禽流感病毒標(biāo)本中的抗原和/或抗體的方法。

一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的方法，包括以下幾個(gè)步驟(i)將本發(fā)明的某一株單克隆抗體或其某個(gè)片段與上述樣品中的病毒結(jié)合而成抗體病毒或抗體片段病毒復(fù)合物；(ii)檢測(cè)該樣品復(fù)合物以確定樣品中是否有病毒。

另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中H5亞型禽流感病毒的方法，包括以下幾個(gè)步驟(i)將第一抗體吸附到固相支持物上；(ii)在上述支持物中加入可能含有H5亞型禽流感病毒的可疑待測(cè)樣品；(iii)在上述支持物中加入帶有標(biāo)記物的第二抗體；(iv)檢測(cè)該標(biāo)記物的存在從而判定H5亞型禽流感病毒是否存在。

本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種檢測(cè)樣品中H5亞型禽流感病毒的檢測(cè)方法，包括以下幾步(i)將抗體吸附到某一固相支持物；(ii)在該固相支持物中加入預(yù)混合H5血凝素標(biāo)記物的可能含有H5亞型禽流感病毒的樣品；(iii)檢測(cè)是否存在H5血凝素標(biāo)記物。

檢測(cè)方法可以使用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、酶免疫檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)、放射免疫檢測(cè)、熒光免疫檢測(cè)、免疫色譜法、競(jìng)爭(zhēng)法及類似檢測(cè)方法。利用競(jìng)爭(zhēng)法或夾心法方式，上述檢測(cè)方法可以用于檢測(cè)目標(biāo)抗原或抗體。

競(jìng)爭(zhēng)法是比較樣品中抗原和一種已知量的標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合本發(fā)明所述單克隆抗體的數(shù)量關(guān)系。開(kāi)展基于競(jìng)爭(zhēng)法的免疫學(xué)檢測(cè)是將含有未知數(shù)量的目標(biāo)抗原的樣品加入到事先用已知的物理或化學(xué)方法把本發(fā)明所述單抗包被到固相支持物上而得以進(jìn)行的。同時(shí)加入預(yù)先定量的標(biāo)記后的目標(biāo)抗原進(jìn)行反應(yīng)。孵育后，沖洗固相支持物，檢測(cè)結(jié)合到該支持物上的標(biāo)記物的活性。

在夾心法中，樣品中的目標(biāo)抗原被夾在包被單抗和標(biāo)記單抗之間，然后再加入標(biāo)記物比如酶的底物，通過(guò)底物顏色的變化檢測(cè)并判定抗原的存在。開(kāi)展基于夾心法的免疫學(xué)檢測(cè)，例如，先把含有一種未知數(shù)量目標(biāo)抗原的樣品加入到用物理或化學(xué)方法預(yù)先包被了本發(fā)明中所述單克隆抗體的固相支持物上進(jìn)行反應(yīng)。然后，加入本發(fā)明所述的標(biāo)記單抗進(jìn)行反應(yīng)。孵育后，沖洗該支持物，再對(duì)結(jié)合到該支持物上的標(biāo)記物的活性進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)記物可以是放射性同位素如125碘、酶、酶的底物、發(fā)光物質(zhì)如異魯米諾和吖啶酯、熒光物質(zhì)如熒光素和羅丹明、生物素和有色物質(zhì)如乳膠顆粒和膠體金等。標(biāo)記用的酶可以是過(guò)氧化物酶(如辣根過(guò)氧化物酶HRP)、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。對(duì)于這些反應(yīng)中合適的底物有2，2＇-連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)、魯米諾-過(guò)氧化氫、鄰苯二胺-過(guò)氧化氫(針對(duì)過(guò)氧化物酶)、對(duì)硝基苯磷酸鹽、4-甲基磷酸傘型酮、3-(2＇-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3＂-磷酰基)苯基-1，2-二乙氧基烷(針對(duì)堿性磷酸酶)、對(duì)硝基苯-β-D-半乳糖和甲基傘形酮-β-D-半乳糖(針對(duì)β半乳糖苷酶)。其它的標(biāo)記包括量子點(diǎn)標(biāo)記、生色團(tuán)標(biāo)記、酶標(biāo)記、親和配體標(biāo)記、電磁自旋標(biāo)記、重原子標(biāo)記、標(biāo)記有納米微粒光散射標(biāo)記或其它納米微粒的探針、異硫氰酸熒光素(FITC)、TRITC、羅丹明、四甲基羅丹明、R-藻紅蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy-7、得克薩斯紅、Phar-Red、異藻紅蛋白(APC)、表位標(biāo)記如FLAG或HA表位、以及酶標(biāo)記如堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、I2-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶和半抗原偶聯(lián)物如洋地黃毒苷或二硝基苯酚、或能夠形成配合物的結(jié)合配對(duì)如鏈霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗體配合物如包括兔IgG和抗-兔IgG；熒光基團(tuán)如傘形三糖(umbelliferone)、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、綠熒光蛋白、藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠、二苯乙烯、熒光黃、Cascade藍(lán)、二氯三嗪基熒光素、丹磺酰氯、藻紅蛋白、熒光鑭系絡(luò)合物如包括銪和鋱、Cy3、Cy5、分子信標(biāo)(molecular beacons)和其熒光衍生物、發(fā)光材料如魯米諾；光散射或細(xì)胞質(zhì)基因組共振材料如金或銀顆?；蛄孔影?quantumdot)或放射性材料如14C、123I、124I、131I、Tc99m、35S或3H；或球珠(spherical shell)，以及標(biāo)記有本領(lǐng)域已知的任何其它信號(hào)產(chǎn)生標(biāo)記物的探針。例如，可檢測(cè)的分子包括但不限于熒光基團(tuán)以及前面所述其它已知的，如在Joseph R.Lakowicz(Editor)所編的Principles of Fluorescence Spectroscopy，Plenum Pub Corp，第二版(July 1999)和Richard P.Hoagland的第六版的Molecular Probes Handbook所描述的。在某些實(shí)施方式中，標(biāo)記物包括半導(dǎo)體納米微晶如量子斑(即Qdots)，參見(jiàn)U.S.P 6,207,392。Qdots可從Quantum Dot Corporation購(gòu)得。用于本發(fā)明的半導(dǎo)體納米微晶包括Group II-V半導(dǎo)體的納米微晶如MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe和其混合物以及Group III-V半導(dǎo)體的納米微晶如GaAs、InGaAs、InP、InAs和其混合物。Group IV半導(dǎo)體如鍺或硅的使用，或有機(jī)半導(dǎo)體的使用，在某些條件下可能是方便可行的。半導(dǎo)體納米微晶也可以包括合金，其含有兩種或多種選自于Group III-V化合物、Group II-VI化合物、Group IV元素和其組合物的半導(dǎo)體。

在某些實(shí)施方式中，熒光能量受體連接到檢測(cè)探針作為標(biāo)記物。在一實(shí)施方式中，熒光能量受體可以通過(guò)化合物與單線態(tài)氧反應(yīng)形成熒光化合物而形成，或通過(guò)化合物與一輔助化合物反應(yīng)并將其轉(zhuǎn)化為熒光化合物而形成。這類化合物可以包括于本發(fā)明裝置中的緩沖液中。在其它的實(shí)施方式中，熒光能量受體可以是包括化學(xué)發(fā)光劑或基團(tuán)的化合物的一部分，例如，熒光能量受體可以包括稀土金屬如銪、釤、碲等金屬絡(luò)合物。這些材料因其具有尖銳的發(fā)光譜帶而特別具有吸引力；而且，鑭系標(biāo)記物如銪(III)可以提供有效的長(zhǎng)時(shí)間的信號(hào)發(fā)射，同時(shí)不易光漂白，因而可以使得含有處理/反應(yīng)樣品的測(cè)試裝置在需要的情況下可以放置較長(zhǎng)一段時(shí)間。在各種異源和同源免疫測(cè)定法中，已經(jīng)使用長(zhǎng)壽命的熒光銪(III)絡(luò)合物納米微粒作為標(biāo)記物，例如可以參見(jiàn)Huhtinen et al.Clin.Chem.2004 Oct；50(10)1935-6。但這些內(nèi)部標(biāo)記的納米微粒與時(shí)間分辨熒光檢測(cè)一起使用時(shí)，測(cè)定性能可以改善。在異源測(cè)定中，低濃度下測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍可以擴(kuò)展；而且，通過(guò)使用檢測(cè)抗體涂敷的高特異活性納米微粒標(biāo)記物，而不是使用常規(guī)標(biāo)記的檢測(cè)抗體，測(cè)定的動(dòng)力學(xué)特性也可以改善。在同源測(cè)定中，對(duì)于熒光共振能量轉(zhuǎn)移來(lái)說(shuō)，銪(III)納米微粒是很有效的供體，從而可以進(jìn)行簡(jiǎn)單、快速和高效的篩選。在一實(shí)施方式中，標(biāo)記物如此處披露的熒光標(biāo)記物，包括與生物分子偶聯(lián)的納米微粒標(biāo)記物。換句話說(shuō)，納米微粒可以用作檢測(cè)或捕捉探針。例如，本發(fā)明中，可以利用連接到單抗或鏈霉抗生物素蛋白(SA)的銪(III)-標(biāo)記的納米微粒來(lái)檢測(cè)樣品中特定的分析物，如納米微?；拿庖邷y(cè)定。納米微粒可以作為附著特定結(jié)合劑的底物，這些特定結(jié)合劑是針對(duì)分析物和檢測(cè)(如標(biāo)記物)或捕捉成分的。有關(guān)標(biāo)記物的實(shí)例可以參見(jiàn)U.S.P 4,695,554；4,863,875；4,373,932；和4,366,241。U.S.P 4,313,734和4,373,932中則披露了膠體金屬和染色顆粒。而U.S.P 4,954,452中則披露了如何制備和使用非金屬的膠體；U.S.P 4,252,459中披露了用作標(biāo)記物的有機(jī)聚合物乳膠顆粒。

把標(biāo)記物結(jié)合到抗原或抗體上的方法，可以通過(guò)順丁烯二酰亞胺法(J.Biochem.(1976)，79,233)、生物素活化法(J.Am.Chem.Soc.(1978)，100，3585)、疏水結(jié)合法、酯活化法或異氰酸酯法(＂Enzyme免疫測(cè)定techniques＂，published in 1987 by IgakuShoin)。

如果上述標(biāo)記物為放射性同位素，則需使用好的防輻射的工作臺(tái)面或液體防護(hù)設(shè)備。如果上述標(biāo)記物為酶，需加入底物，酶的活性通過(guò)比色法或熒光計(jì)測(cè)定。如果上述標(biāo)記物為熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)或有色物質(zhì)，測(cè)定方法可以相應(yīng)的使用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行測(cè)定。

本發(fā)明中，用于檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的樣品包括但不限于動(dòng)物或病人的排泄物、口腔和鼻腔分泌物、雞胚培養(yǎng)中的全病毒或裂解病毒等。

檢測(cè)裝置和試劑盒
本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)H5亞型禽流感病毒感染的診斷試劑盒，尤其是檢測(cè)樣品中H5亞型禽流感病毒抗原或抗體的診斷試劑盒。本發(fā)明所述診斷試劑盒包含至少一種本發(fā)明所述單克隆抗體。本發(fā)明所述診斷試劑所使用的本發(fā)明所述單克隆抗體并不做特別限制，可以是任何一株識(shí)別H5血凝素抗原的單抗，也可以是本發(fā)明所述的具抗原特異性的任一單抗的抗體片段，如F(ab＇)2、Fab＇、Fab等。

一方面，本發(fā)明涉及兩種檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的試劑盒，這些試劑至少包括一種單抗或者是它們的活性片段或者是突變體。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包含適合檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)試劑。

另一方面，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)抗H5亞型禽流感病毒抗體的試劑盒，它包括至少一種本發(fā)明所述單抗或其活性片段或其突變體。優(yōu)選地，本發(fā)明中所述試劑盒包含適合檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)試劑。

本發(fā)明的診斷試劑盒中涉及的固體支持物或固相支持物包括但不限于微孔板、磁微粒、免疫色譜用濾紙、聚合體例如聚苯乙烯、玻璃珠、玻璃濾器和其它不溶的載體。在一實(shí)施例中，一個(gè)包含多個(gè)隔間或區(qū)域的固相支持物中，至少有一個(gè)隔間用本發(fā)明的抗體所涂蓋。優(yōu)選的是，至少一個(gè)隔間(或第一個(gè)隔間)用本發(fā)明的抗體所涂蓋，并且至少一個(gè)剩余的隔間(或第二個(gè)隔間)用可以和禽流感病毒除H5以外的亞型(例如，H1，H2，H3，H4，H6，H7，H9，H10，H11，H12，H13，H13，H14，H15orH16)可以特異性地結(jié)合的抗體所涂蓋，優(yōu)選的是亞型H1，H3，H7，H9。

本發(fā)明的診斷試劑還包含一些其它成分，包括但不限于標(biāo)記用的酶、相應(yīng)底物、放射性同位素、反光物質(zhì)、熒光物質(zhì)、有色物質(zhì)、緩沖液和板條以及前面提到的諸如此類的物質(zhì)。

本發(fā)明的診斷試劑中，所使用的發(fā)明單抗必須預(yù)先包被在固相支持物上。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)包被的單抗進(jìn)行方向定位會(huì)有助于提高抗原抗體結(jié)合效率。TaeWoonCha等(Proteomics 5,416-419(2005))已證實(shí)控制預(yù)包被蛋白分子的構(gòu)象及設(shè)計(jì)固相支持物表面理想的化學(xué)環(huán)境將有助于保持和提高固相化蛋白的反應(yīng)活性及效價(jià)。文獻(xiàn)已報(bào)道過(guò)多種方法能夠把抗體按預(yù)定構(gòu)象方向結(jié)合在固相支持物上。Shawn Weng等(Proteomics 2，48-57(2002))曾報(bào)道過(guò)利用核酸連接蛋白的方法使蛋白分子以相同的空間定位結(jié)合在某個(gè)表面上。Soellner，M等(J.AM.CHEM.SOC.125，11790-11791(2003))報(bào)道了一種能把包括抗體和抗原在內(nèi)的蛋白通過(guò)Staudinger連接反應(yīng)而以一種相同的方式結(jié)合到某個(gè)表面上的方法。在Staudinger反應(yīng)中，疊氮化合物和磷硫酯反應(yīng)形成一種氨基化合物。HairongZhang等(Anal.Chem，78,609-616(2006))報(bào)道了一種通過(guò)抗體Fab＇片段上的自由硫醇反應(yīng)將鍍金的磁珠上抗體定位到顆粒表面的方法，依據(jù)這個(gè)，所有抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)都定位于一個(gè)理想的構(gòu)象上。Hai Xu等(J.Phys.Chem.B，110，1907-1914(2006))曾報(bào)道將抗體吸附到親水硅氧化物/水表面的方法。Seung-yong Seong等(Proteomics，3，2176-2189(2003))概括了定向地將蛋白固定到某個(gè)表面的方法以及在這些方法中所用到的蛋白分子。所有這些參考文獻(xiàn)都被完整地歸納在這里。

本發(fā)明的診斷試劑盒中，所使用的單抗或抗原必須事先用上述提到的標(biāo)記物標(biāo)記。

本發(fā)明還涉及一種可自動(dòng)化檢測(cè)樣品中的禽流感病毒的自動(dòng)化檢測(cè)裝置。

現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開(kāi)了各種利用免疫化學(xué)檢測(cè)生物液樣品中是否存在分析物的裝置。這類裝置可以利用所謂的“夾心法”測(cè)定，例如，目標(biāo)分析物如抗原夾在標(biāo)記的抗體和固定在固相支持物的抗體之間。通過(guò)觀察是否存在結(jié)合的抗原標(biāo)記的抗體復(fù)合物和/或其數(shù)量而進(jìn)行測(cè)定。這類裝置也可以采用競(jìng)爭(zhēng)法免疫測(cè)定，其中，將結(jié)合于固相表面的抗體與含有未知數(shù)量抗原分析物的樣品以及與同樣類型的標(biāo)記抗原進(jìn)行接觸。然后，測(cè)定結(jié)合于固相表面的標(biāo)記的抗原的數(shù)量，從而為樣品中抗原分析物的數(shù)量提供間接的測(cè)量。不同的測(cè)定可以利用適于測(cè)定不同分析物的裝置，例如，將不同的抗體或抗原結(jié)合于測(cè)試底物的設(shè)計(jì)區(qū)或可尋址區(qū)(如吸水或非吸水膜)。由于這些方法以及下面討論的其它的方法既可以檢測(cè)抗體，也可以檢測(cè)抗原，它們通常稱作免疫化學(xué)配體-受體測(cè)定或簡(jiǎn)稱免疫測(cè)定法.
固相免疫測(cè)定裝置，無(wú)論是夾心法類型還是競(jìng)爭(zhēng)法類型，都可以對(duì)生物液樣品如血液或尿液中的分析物提供靈敏的檢測(cè)。固相免疫測(cè)定裝置包括固相支持物，其中，配體-受體對(duì)中的一員，通常是抗體、抗原或半抗原，結(jié)合于該固相支持物上。通常，早期的固相支持物的形式為平板、試管或聚苯乙烯珠，這在放射免疫測(cè)定和酶免疫測(cè)定中是熟知的。最近，人們采用各種多孔材料如尼龍、硝化纖維素、乙酸纖維素酯、玻璃纖維和其它的多孔聚合物作為固相支持物。人們也公開(kāi)了許多自身帶免疫測(cè)定的試劑盒，其采用多孔材料作為免疫化學(xué)成分如抗原、半抗原或抗體的固相載體。通常這些試劑盒在設(shè)計(jì)上可以采用纖維素試紙、流通或或遷移。本發(fā)明中可以采用任何常規(guī)的、已知的裝置來(lái)完成免疫測(cè)定或特異性結(jié)合測(cè)定，以檢測(cè)流感。

在某些方面，本發(fā)明包括檢測(cè)由各種流感病毒或其亞型引起的感染H3的裝置。在某些實(shí)施方式中，將含有一種或多種流感病毒或抗流感病毒抗體的樣品送入裝置中，以測(cè)定樣品是否被一種或多種流感病毒或其亞型感染的主體。包含固相支持物的裝置可以包括置于其上的抗流感病毒抗體或流感病毒抗原，從而可以對(duì)懷疑含有流感病毒、流感病毒蛋白或抗流感病毒抗體的樣品進(jìn)行測(cè)定。在許多實(shí)施方式中，本發(fā)明裝置中所使用的抗體包括但不限于多抗、單抗(MAb)或其保守性或功能性變體、嵌合抗體、變形抗體、人源化抗體、其生物活性片段或這些抗體的任意組合；此處功能性抗體或其片段，從整體上講就是指抗體。本發(fā)明的抗體可以適應(yīng)任何裝置，以檢測(cè)流感病毒。例如，H5禽流感病毒可以通過(guò)靶定樣品中的H5蛋白或抗H5亞型抗體而予以檢測(cè)。在一實(shí)施方式中，H5是來(lái)自禽流感病毒(AIV)。

市場(chǎng)上購(gòu)得的許多裝置可以很容易地安裝(或附加)此處所公開(kāi)的抗體或抗原。這些裝置可以包括檢測(cè)方法中所使用的固相底物，包括但不限于微孔板、磁珠、免疫色譜用的濾紙、聚合物如聚苯乙烯、玻璃珠、玻璃濾器和其它不溶性的載體。底物通?？梢允堑幌抻谙铝行螤顜睢鍫?、芯片、球狀、珠狀、孔狀如微滴定板上的孔、或任何其它合適的形狀。而且，結(jié)合其配合搭檔(即抗原或抗體)的可以是任何形狀，例如，微滴定盤、試管、纖維素試紙、微離心管、珠、自旋盤等等。合適的材料包括玻璃、塑料(如聚乙烯、PVC、聚丙烯、聚苯乙烯等)、蛋白、紙、碳水化合物和其它的固相支持物。其它可以使用的材料包括陶瓷、金屬、metalloids、半導(dǎo)體材料、水泥等。在某些實(shí)施方式中，免疫測(cè)定法(如ELISA)微滴定板包括96孔、384孔板或1536孔的形式，或更多的孔，如其它商用板。

一些可以使用的裝置包括纖維素試紙、側(cè)流裝置、cartridge、多重裝置、微滴定板、微流裝置、板或陣列或高通量的平臺(tái)，如在下列美國(guó)專利中所公開(kāi)的U.S.專利號(hào)6,448,001；4,943,522；6,485,982；6,656,744；6,811,971；5,073,484；5,716,778；5,798,273；6,565,808；5,078,968；5,415,994；6,235,539；6,267,722；6,297,060；7,098,040；6,375,896；7,083,912；5,225,322；6,780,582；5,763,262；6,306,642；7,109,042；5,952,173和5,914,241。例如，微流裝置可以是U.S.P 5,707,799和WO2004/029221中所公開(kāi)的。

纖維素試紙
在一些很平常的纖維素試紙測(cè)定中，如家用懷孕和排卵檢測(cè)試劑盒中，免疫化學(xué)成分如抗體是結(jié)合在固相上。檢測(cè)裝置在懷疑含有未知抗原分析物的樣品中蘸一下，然后保溫培育?；蛘咭部蓪⑸倭康臉悠分糜跇悠方邮軈^(qū)中。然后加入標(biāo)記的抗體，并檢測(cè)標(biāo)記物，作為感興趣的分析物是否存在的指示。在某些情況下，標(biāo)記物是酶，這樣，需要加入酶標(biāo)記的抗體，其可同時(shí)加入或在保溫培育后加入。然后，清洗裝置，并將其再插入到含有酶的底物的第二溶液中。如果存在酶標(biāo)記，其會(huì)與底物發(fā)生相互作用，使得產(chǎn)生帶色的產(chǎn)物，該產(chǎn)物要么作為沉淀物沉積到固相上，要么在底物溶液中產(chǎn)生可見(jiàn)光的變化。Baxter等在EP-A 0 125 118中公開(kāi)了這樣的夾心形纖維素試紙的免疫測(cè)定.Kali et等在EP-A 0282 192中公開(kāi)了一種可以用于競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定的纖維素試紙裝置。T纖維素試紙的材料、形式以及標(biāo)記物是已知的，而且可以用于流感檢測(cè)中。纖維素試紙裝置的實(shí)例包括U.S.P4,235,601、5,559,041、5,712,172和6,790,611中所描述的。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體可以置于纖維素試紙裝置上。例如，可以使用固相支持物纖維素試紙，檢測(cè)樣品中的抗H5亞型AIV抗體，其中可以在一處或多處基質(zhì)(matrix)點(diǎn)位安裝該試紙。一處基質(zhì)可附著有非特異性控制的抗體或其功能性片段。這些基質(zhì)點(diǎn)位可以是蛋白結(jié)合位和/或抗原結(jié)合位，而且通常是由硝化纖維素制得的，但也可以使用本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)拿劫|(zhì)，如某些尼龍和聚偏乙烯類。在某些實(shí)施方式中，可以在固相支持物附著多中基質(zhì)，每一基質(zhì)含有針對(duì)多種亞型流感病毒的抗原或抗體。

連續(xù)流
連續(xù)流型免疫測(cè)定裝置的設(shè)計(jì)可以避免纖維素試紙測(cè)定中所需要的大量的培育和清洗。Valkirs等在U.S.P 4,632,901中公開(kāi)了一種包括抗體(對(duì)目標(biāo)抗原分析物具有特異性)的裝置，該抗體結(jié)合于多孔性膜或?yàn)V器中，而該裝置中加入液體樣品。由于液體流經(jīng)或連續(xù)流過(guò)膜中，目標(biāo)分析物結(jié)合到抗體上。在加入樣品之后，可以再加入標(biāo)記的抗體。標(biāo)記抗體的目視檢測(cè)可以指出樣品中是否存在目標(biāo)抗原分析物。Korom et等在EP-A 0 299359中公開(kāi)了一種在連續(xù)流裝置上的改進(jìn)，其中，標(biāo)記的抗體附載到一膜中，該膜起到試劑傳送體系的作用。這樣的裝置可以包括對(duì)樣品中的成分起過(guò)濾器作用的層，并包括檢測(cè)中所使用的試劑。當(dāng)樣品從一層流向另一層時(shí)，其與特定的結(jié)合試劑接觸并發(fā)生反應(yīng)，在某些情況下，標(biāo)記體系中的組分可以提供是否存在目標(biāo)分析物的指示。

免疫過(guò)濾裝置
免疫過(guò)濾裝置可以從市場(chǎng)上購(gòu)得(如Pierce，Rockford，IL)，而且可以很容易地進(jìn)行改造，以附載本發(fā)明的抗體。在酶聯(lián)免疫流動(dòng)測(cè)定法(ELIFA)中，在96孔樣品板和真空室之間使用硝化纖維素膜。反應(yīng)劑加到樣品板上，真空使得反應(yīng)劑通過(guò)該硝化纖維素膜。套管將沒(méi)有結(jié)合的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到收集室中。為了進(jìn)行檢測(cè)，在添加酶底物前，在收集室中放置一微量培養(yǎng)板(微孔板)。真空使得帶色的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到微量培養(yǎng)板的孔中，以便在自動(dòng)化的微量培養(yǎng)板讀取裝置上進(jìn)行分析。ELIFA體系包括精確切割的聚甲基丙烯酸甲酯有機(jī)玻璃，并帶有密封墊圈，從而能夠提供從一個(gè)孔到另一個(gè)孔之間恒定的流率。套管可以精確地將帶色的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到微量培養(yǎng)板的孔中，以便進(jìn)行分析。本發(fā)明的捕捉抗體基本上是點(diǎn)在底物上(如微滴定板、膜或芯片)。施加懷疑帶有流感病毒或流感病毒抗原的生物樣品并進(jìn)行孵育，使得捕捉抗體與其結(jié)合。隨后，加入檢測(cè)抗體。U.S.專利申請(qǐng)2003/0108949公開(kāi)了一種高通量的免疫過(guò)濾裝置。這樣的裝置可以包括起過(guò)濾器作用的層和/或包括檢測(cè)中所用的試劑。當(dāng)樣品與特定的結(jié)合試劑發(fā)生反應(yīng)，在某些情況下，標(biāo)記體系中的組分就可以提供是否存在某一分析物的指示。

側(cè)流裝置
在側(cè)流測(cè)定中，利用某些或全部的檢測(cè)用試劑來(lái)浸漬膜。提供分析物檢測(cè)區(qū)，并在該區(qū)檢測(cè)標(biāo)記的分析物。例如，可以參見(jiàn)Tom等的U.S.P 4,366,241和Zuk的EP-A O143 574。已知對(duì)于側(cè)流檢測(cè)裝置可以進(jìn)行許多改進(jìn)。這類裝置可以包含某些特異性結(jié)合檢測(cè)中的試劑(樣品在施加到側(cè)流帶之前可以與某些試劑反應(yīng)，或者可以依次地在側(cè)流帶上添加額外的試劑)，或者側(cè)流帶可以包含用于特異性結(jié)合檢測(cè)的所有必須的試劑。側(cè)流裝置經(jīng)常包含試劑，這些試劑可以附著在彩色標(biāo)記上，從而可以直接觀察到檢測(cè)結(jié)果，而不需要進(jìn)一步添加其它物質(zhì)。例如，可以參見(jiàn)Bernstein的U.S.P 4,770,853、May等人的WO88/08534和Ching等人的EP-A 0 299 428。這類裝置通常如此構(gòu)建，使其包括施加樣品的位置、試劑區(qū)和檢測(cè)區(qū)。此類裝置通常是由吸水材料制得的，這樣可以使得樣品從樣品施加區(qū)經(jīng)試劑或反應(yīng)區(qū)連續(xù)流至檢測(cè)區(qū)。盡管某些反應(yīng)在樣品施加到帶上之前可能就已發(fā)生，在某些實(shí)施方式中，反應(yīng)區(qū)包括用于免疫測(cè)定的試劑。一種特異性結(jié)合試劑如抗體，其可以擴(kuò)散性地結(jié)合到樣品施加區(qū)或反應(yīng)區(qū)的帶上，使得其能夠結(jié)合樣品中的抗原，并與樣品一起沿帶流動(dòng)。在檢測(cè)區(qū)，可以直接用抗原或抗體的另一特異性結(jié)合搭檔，捕捉抗原-抗體復(fù)合物，或者，也可以用另外的特異性結(jié)合搭檔，如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白和生物素，間接地予以捕獲。類似地，標(biāo)記物可以直接地或間接地附著在抗原或抗體上。側(cè)流裝置的實(shí)例可參見(jiàn)U.S.P 4,818,677，4,943,522，5,096,837(RE 35,306)，5,096,837，5,118,428，5,118,630，5,221,616，5,223,220，5,225,328，5,415,994，5,434,057，5,521,102，5,536,646，5,541,069，5,686,315，5,763,262，5,766,961，5,770,460，5,773,234，5,786,220，5,804,452，5,814,455，5939，331和6,306,642。而U.S.P 4,703,017，6,187,598，6,352,862，6,485,982，6,534,320和6,767,714中則公開(kāi)了其它的側(cè)流裝置，其可以改進(jìn)，以便用于檢測(cè)液體樣品中的多個(gè)分析物。

常規(guī)技術(shù)中，可以在一單一的測(cè)試帶中為每個(gè)分析物建立單獨(dú)的檢測(cè)區(qū)，從而可以檢測(cè)一個(gè)樣品中的多個(gè)分析物。通過(guò)使用不同的標(biāo)記物或者在不同檢測(cè)區(qū)檢測(cè)同一標(biāo)記物，可以區(qū)分不同的分析物?？梢圆捎萌魏纬Ｒ?guī)的裝置，完成對(duì)多個(gè)分析物的測(cè)定。

免疫測(cè)定利用免疫體系的機(jī)制，其中，當(dāng)存在致病的抗原或外來(lái)異物時(shí)，肌體就會(huì)作出反應(yīng)，產(chǎn)生抗體。這些抗體和抗原，也即免疫反應(yīng)物，能夠彼此結(jié)合，從而產(chǎn)生一種高特異性的反應(yīng)機(jī)制，該機(jī)制可以用來(lái)確定測(cè)試樣品中是否存在特定的抗原以及其濃度。

這樣的側(cè)流裝置通常包括一多孔性膜，其任選地負(fù)載于剛性材料上。一般地，該多孔性膜可由許多材料制得，其能夠允許流體通過(guò)即可。例如，用于形成多孔性膜的材料包括但不限于天然材料、合成材料、或自然存在但經(jīng)合成改性的材料如多糖(如纖維素材料如紙、纖維素衍生物如乙酸纖維素酯、硝化纖維素)；聚醚砜；聚乙烯；尼龍；PVDF；聚酯；聚丙烯；二氧化硅；無(wú)機(jī)材料如滅活氧化鋁，硅藻土，亞硫酸鎂，或其他無(wú)機(jī)微細(xì)材料，這些材料均勻地分布于多孔聚合物基體中，聚合物如氯乙烯，乙烯氯丙烯共聚物，乙烯氯乙烯醋酸鹽共聚物，自然生成的織物(如棉花)或合成的(如尼龍或人造纖維)；多孔滲水膠質(zhì)，如硅膠，瓊脂糖，右旋糖苷和凝膠；聚合薄膜，如聚丙烯酰胺或其類似物。在一個(gè)特別實(shí)施方式中，所述多孔滲水膜有硝化纖維素和/或聚醚砜材料形成。應(yīng)該理解的是所述術(shù)語(yǔ)“硝化纖維素”指纖維素硝酸酯，它可以只是硝化纖維素或是它與硝酸酯或其他酸酯的混和物，如帶有1-7個(gè)碳原子的脂族羧酸。

這樣的設(shè)備也可包括一個(gè)含有吸收襯墊的條帶，此條帶處于所述測(cè)試/檢測(cè)或?qū)φ諈^(qū)的上游或下游。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，所述吸收襯墊可幫助促進(jìn)毛細(xì)管作用力式液體流通過(guò)所述膜。在某些實(shí)施方式中，吸收襯墊可含有可移動(dòng)的免疫測(cè)定試劑(如，抗體)。當(dāng)然，需要理解的是，所述可移動(dòng)或固定的免疫測(cè)定試劑也可以被處理在所述測(cè)試/檢測(cè)或?qū)φ諈^(qū)的上游的任何位置，就像在檢測(cè)系統(tǒng)的單獨(dú)組分中一樣。

在許多實(shí)施方式中，有些合適的材料可被用于形成所述樣品襯墊，包括但不限于，硝化纖維素，纖維素，多孔聚乙烯襯墊，纖維玻璃試紙。如果需要，樣品襯墊也可包括一種或多種預(yù)處理的分析試劑，它們或共價(jià)地或非共價(jià)地結(jié)合到襯墊上。所述待測(cè)樣品從樣品襯墊上轉(zhuǎn)移到與樣品襯墊一端連通的結(jié)合襯墊上。所述結(jié)合襯墊由一種可供液體流通的材料形成。例如，在一實(shí)施方式中，所述結(jié)合襯墊有纖維玻璃形成。應(yīng)當(dāng)理解的是其他結(jié)合襯墊也可用于本發(fā)明?？蛇x擇地，在某些實(shí)施方式中，結(jié)合物或其他免疫試劑可被包括在一個(gè)組分內(nèi)，所述組分在應(yīng)用到檢測(cè)帶之前與樣品混合。

為方便檢測(cè)待測(cè)樣品中被分析的存在與否，可在所述結(jié)合襯墊上應(yīng)用多種檢測(cè)探針。當(dāng)這些檢測(cè)探針在結(jié)合襯墊上，當(dāng)被分析物從樣品襯墊流到結(jié)合襯墊時(shí)(或在流體狀態(tài))，這些探針仍然可供被分析物結(jié)合。一旦結(jié)合到被分析物，檢測(cè)探針隨后被用來(lái)識(shí)別被分析物的存在與否。檢測(cè)探針既可用于檢測(cè)又可用于校正。但在另一個(gè)實(shí)施方式中，單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)探針可被應(yīng)用到結(jié)合襯墊上，以與所述檢測(cè)探針結(jié)合以便同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)化并檢測(cè)，所以可以消除常規(guī)分析標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)通常導(dǎo)致的錯(cuò)誤。然而，需要理解的是檢測(cè)探針和校正探針可以同時(shí)或分別應(yīng)用在檢測(cè)中任何一個(gè)位置，并且不需要使用結(jié)合襯墊。此外，檢測(cè)探針和校正探針也可以應(yīng)用在相同或不同的結(jié)合襯墊上?；蛘?，檢測(cè)探針和校正探針也可以安置在診斷檢測(cè)單元的不同區(qū)域，例如在自帶性檢測(cè)設(shè)備上，如在液體，流動(dòng)水槽或擦拭子上。

在一些情況下，可能需要以某種方式修飾所述檢測(cè)探針以便它們更容易結(jié)合到被分析物上。在這種情況下，所述檢測(cè)探針可被特定的特異性結(jié)合元件所修飾，所述特異性結(jié)合元件粘合到檢測(cè)探針上以形成結(jié)合探針。特異性結(jié)合元件一般指特異性結(jié)合配對(duì)的一個(gè)元件，如，兩種不同的分子，其中一個(gè)分子化學(xué)性和/或物理性地結(jié)合于另一個(gè)分子上。例如，免疫反應(yīng)性特異結(jié)合元件可包括抗原、半抗原、配合體、抗體(初級(jí)的或二級(jí)的)和它們的腐惡貨物，包括那些由重組DNA方法或合成肽方法形成的物質(zhì)?？贵w可以是單克隆抗體或多克隆抗體，重組蛋白或它們的混和物或片斷，或抗體于其他特異性結(jié)合元件的混和物。準(zhǔn)備這樣的抗體的細(xì)節(jié)及它們作為特異性結(jié)合元件使用的合適性在此公開(kāi)。其他普通特異性結(jié)合配對(duì)包括但不限于，生物素和抗生物素蛋白(或其衍生物)，生物素和鏈鎖狀球菌抗生物蛋白，糖類和血凝素，補(bǔ)充的核苷酸序列(包括探針和在檢測(cè)目標(biāo)核酸序列的DNA雜交測(cè)定中使用的捕獲核酸序列)，補(bǔ)充的肽序列，包括那些由重組方法形成的肽序列，效應(yīng)分子和受體分子，激素和激素結(jié)合蛋白，酶輔因子和酶，酶抑制物和酶，等等。而且，特異性結(jié)合配對(duì)包括與原始特異性元件相似的元件。例如，被分析物的衍生物或片斷，例如，被分析物類似物，都可被應(yīng)用，只要它含有至少一個(gè)與被分析物相同的表位。

例如，在一實(shí)施方式中，含有檢測(cè)樣品的流體被運(yùn)送到金標(biāo)墊，在金標(biāo)墊處分析物和被一種特殊結(jié)合元件修飾過(guò)的檢測(cè)探針混合以形成分析物復(fù)合物。因?yàn)榻饦?biāo)墊與多孔滲水膜之間流動(dòng)暢通，所以，所述復(fù)合物可以從金標(biāo)墊出轉(zhuǎn)移至多孔滲水膜上的檢測(cè)區(qū)。或者，可以通過(guò)整合不同抗原(如，不同流感病毒或來(lái)自不同流感病毒的病毒抗原)的特異抗體來(lái)利用多個(gè)檢測(cè)區(qū)域。所述檢測(cè)區(qū)域可含有固定劑，所述固定劑一般可以和分析物和/或分析物復(fù)合物(如，分析物和檢測(cè)探針的復(fù)合物)形成化學(xué)或物力連接。在某些實(shí)施方式中，所述試劑可以是一種生物試劑，如本文公開(kāi)的抗體。其他生物試劑已為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，它們包括但不限于，抗原、半抗原、抗體、蛋白質(zhì)A或G、抗生物素蛋白、鏈霉抗生素蛋白或它們的復(fù)合物。在某些情況，人們希望這些生物試劑具有和分析物和/或分析物與檢測(cè)探針的復(fù)合物結(jié)合的能力。

這些試劑用于檢測(cè)探針/分析物復(fù)合物的固定結(jié)合位點(diǎn)。在某些情況下，分析物，如抗體、抗原等，含有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。一旦到達(dá)檢測(cè)區(qū)，其中的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)被復(fù)合探針的特異結(jié)合元件占據(jù)。但是，分析物的未被占據(jù)的位點(diǎn)可以和固定劑結(jié)合。一旦和固定劑結(jié)合，復(fù)合探針就形成一種新的三重夾心式復(fù)合物。

檢測(cè)或測(cè)試區(qū)一般可以提供任意數(shù)量的不同檢測(cè)區(qū)域，以便使用者可以更好地決定待測(cè)樣品中特定分析物的存在與否。每個(gè)區(qū)域都含有相同的試劑或含有固定多種分析物的不同試劑。例如，檢測(cè)區(qū)可能包括兩個(gè)或更多的不同檢測(cè)區(qū)域(如，線狀、點(diǎn)狀等)。檢測(cè)區(qū)域可能被處理成線狀的形式，其方向與待測(cè)樣品流動(dòng)通過(guò)分析裝置的方向?qū)嵸|(zhì)上垂直。同樣，在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)區(qū)域可能被處理成線狀的形式，其方向與待檢測(cè)樣品流動(dòng)通過(guò)分析裝置的方向?qū)嵸|(zhì)上平行。

在某些情況下，所述膜也可以確定一個(gè)對(duì)照區(qū)(未示)，它可用來(lái)給使用者一個(gè)分析正常進(jìn)行的信號(hào)。例如，所述對(duì)照區(qū)(未示)可以含有一種固定劑，所述固定劑一般具有和探針或固定在探針上的試劑化學(xué)和/物理結(jié)合的能力。這種試劑包括但不限于，例如，抗原、半抗原、抗體、蛋白質(zhì)A或G、抗生物素蛋白、鏈霉抗生素蛋白、二級(jí)抗體或它們的復(fù)合物。另外，也可能希望使用各種不同的非生物材料作為對(duì)照區(qū)試劑。例如，在某些實(shí)施方式中，所述對(duì)照區(qū)試劑可能包括一種聚合電解質(zhì)，如上所述的，可能結(jié)合到未被固定的探針上。因?yàn)樗鰧?duì)照區(qū)的試劑只對(duì)探針是特異性的，無(wú)論分析物是否存在都會(huì)有信號(hào)形成。所述對(duì)照區(qū)可以被放置在沿著膜的任何位置，但優(yōu)選位于檢測(cè)區(qū)的上游。

使用這種分析裝置檢測(cè)某種分析物是否存在可以使用各種不同的形式。例如，在上述實(shí)施方式中，利用了一種夾心式的方式。其他利用此夾心式測(cè)定的例子參見(jiàn)Grubb等人的美國(guó)專利第4,168,146號(hào)，以及Tom的美國(guó)專利第4,366,241號(hào)，這些文獻(xiàn)在此被完全飲引用。另外，也可使用其他方式，如競(jìng)爭(zhēng)式。在競(jìng)爭(zhēng)式分析中，標(biāo)記探針通常和一個(gè)與分析物相同或相似的分子配對(duì)。所以，標(biāo)記探針就和待測(cè)分析物競(jìng)爭(zhēng)可以利用的試劑。在檢測(cè)分析物如半抗原時(shí)通常用競(jìng)爭(zhēng)式測(cè)定，每個(gè)單價(jià)半抗原只可結(jié)合一個(gè)抗體分子。競(jìng)爭(zhēng)式免疫測(cè)定的例子參見(jiàn)Deutsch等人美國(guó)專利第4,235,601號(hào)，Liotta的第4,442,204號(hào)及Buechler的第5,208,535號(hào)專利，在此這些文獻(xiàn)被完全引用。其他形式的設(shè)備參見(jiàn)Lambofte等人的第5,395,754號(hào)專利、Jou等人的第5,670,381號(hào)專利及Malick等人的第6,194,220號(hào)專利。這些專利文獻(xiàn)在此被完全引用。

微流控制裝置
在本發(fā)明的某些方面，本文所公開(kāi)的抗體可被整合到一個(gè)微流控器件中。此設(shè)備是一個(gè)微流體流動(dòng)系統(tǒng)，可以結(jié)合一個(gè)或更多分析物。結(jié)合上的分析物可直接在設(shè)備上分析或從設(shè)備上分離下來(lái)，例如作更進(jìn)一步的分析或處理?？蛇x擇的，未結(jié)合到設(shè)備上的分析物可被收集起來(lái)，例如，作進(jìn)一步的處理或分析。

示范性的設(shè)備是一種帶有可供樣品流通的平板通道的流動(dòng)式儀器。此類設(shè)備參見(jiàn)美國(guó)專利第5,837,115號(hào)。樣品可以通過(guò)重力、毛細(xì)管或一種主動(dòng)力被轉(zhuǎn)移到此設(shè)備中，如通過(guò)輸液泵將一種樣品如血液灌輸?shù)轿⒘骺仄骷小Ｆ渌阎斔头椒ㄒ部梢允褂?。微流控器件可任意地依靠設(shè)備中的一排結(jié)構(gòu)體來(lái)固定分析物。所述結(jié)構(gòu)體可通過(guò)多種方法制造，包括但不限于，激光照射、壓紋、x光微影(LIGA)、電鍍、電鑄、影印石版術(shù)、活性離子蝕刻、離子束處理法、壓縮模塑法、鑄造、動(dòng)力噴射造型法、噴射造型法、顯微機(jī)械加工材料。需了解的是，制造本發(fā)明設(shè)備所使用的方法不是關(guān)鍵的，只要所用方法導(dǎo)致大量的同樣的結(jié)構(gòu)體和設(shè)備。而且，這種方法必須導(dǎo)致所述結(jié)構(gòu)體的大表面積且相互排列緊密以產(chǎn)生一個(gè)狹窄的通道。所述通道允許分析物在液體中分散以提高在固定位點(diǎn)固定分析物和/或標(biāo)記試劑的效率。

所述大批量生產(chǎn)的結(jié)構(gòu)體優(yōu)選由任意數(shù)量的聚合材料制成。這些材料包括，但不限于，聚烯烴類如聚丙烯、聚乙稀，聚酯如聚乙稀對(duì)苯二酸酯，含聚合物的苯乙烯如聚苯乙烯、苯乙烯丙烯腈、丙烯腈丁二烯乙烯苯均聚物，聚碳酸酯，丙烯酸聚合物如聚甲基丙烯酸甲酯和聚丙烯酸腈，含聚合物的氯化物如乙稀聚合物的氯化物和聚偏二氯乙烯，乙縮醛同質(zhì)聚合物和共聚物，纖維素及其酯類，纖維素硝酸鹽，含聚合物的氟化物如聚偏二氟乙烯，聚四氟乙烯，聚酰胺，酰亞胺，聚醚醚酮，含聚合物的硫化物如聚亞苯基硫化物和聚醚硫化物，聚亞安酯，含聚合物的硅化物如聚二烷基硅氧烷。另外，所述結(jié)構(gòu)體可由共聚物、上述材料的混合物和/或碾壓物、金屬箔如鋁箔、金屬處理的膜或沉積在上述材料的金屬制成，也可由玻璃或陶瓷材料制成。在其中的一種方法中，一種激光如受激準(zhǔn)分子激光器可被用來(lái)照射光掩膜，以便從光掩膜穿過(guò)的光融化底層材料以在材料基層形成通道(Sercel，J.，et al.，SPIE Proceedings，Vol.998，September，1988)。

通常，微流控器件可包括一個(gè)供待測(cè)樣品進(jìn)入的入口。通常所述通道為毛細(xì)管，用來(lái)轉(zhuǎn)移所述待測(cè)樣品從進(jìn)口到設(shè)備中，還包括一排結(jié)構(gòu)體用來(lái)提供固定位點(diǎn)，以及一個(gè)通口，如排放氣體的出口。另外，定制此設(shè)備時(shí)還可以增加反應(yīng)槽(chambers)和額外的毛細(xì)管。通常，待測(cè)樣品依靠毛細(xì)管作用力移動(dòng)通過(guò)設(shè)備。另外，可以使用一個(gè)或多個(gè)毛細(xì)管帶動(dòng)待測(cè)樣品從進(jìn)口到通道中。此外，可以使用一個(gè)或多個(gè)毛細(xì)管脫離設(shè)備的結(jié)構(gòu)體面積(structures area)。但是，也可使用不同壓力驅(qū)動(dòng)液體在設(shè)備中流動(dòng)，以此來(lái)代替或增加毛細(xì)管動(dòng)力。

可供液體流動(dòng)的通道由相鄰結(jié)構(gòu)體之間產(chǎn)生。通道和結(jié)構(gòu)體設(shè)計(jì)對(duì)于優(yōu)化結(jié)構(gòu)體表面和流體分子的接觸是重要的。代表性地，通道的深度約從1μm到1mm。通道的平均寬度一般約從0.02μm到20μm。通道可以包括各種形狀的結(jié)構(gòu)體，包括菱形、六邊形、環(huán)形或方形，其高度一般約從1mu.m到1mm，平均寬度約從1μm到1mm。

固定劑可以像在毛細(xì)管和/或反應(yīng)槽里一樣共價(jià)地或非共價(jià)地結(jié)合到結(jié)構(gòu)體的表面。所述試劑可以是限時(shí)釋放試劑，空間隔離試劑，或被包被和干燥于表面。放置固定劑到所述表面的技術(shù)已為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述固定劑是本文所公開(kāi)的以流感病毒抗原(如H5 AIV)為靶標(biāo)的抗體。

使用本發(fā)明設(shè)備的方法包括利用特異性結(jié)合元件。檢測(cè)的方法包括與有色標(biāo)記物入熒光染色劑獲有色顆粒的結(jié)合?？蛇x擇地，檢測(cè)步驟可包括與一種可產(chǎn)生有色產(chǎn)物的酶的結(jié)合。

本發(fā)明的設(shè)備中可以使用一個(gè)或多個(gè)代替的流動(dòng)途徑。毛細(xì)管從進(jìn)口運(yùn)輸待測(cè)樣品后分支成不同的通路通向結(jié)構(gòu)體的主要通路和代替通路。代替通路可以允許多個(gè)固定位點(diǎn)的存在，且允許在單個(gè)測(cè)試位點(diǎn)上同時(shí)實(shí)現(xiàn)分析物的存在與否或多個(gè)分析物的數(shù)量。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在檢測(cè)設(shè)備中多個(gè)分析物(不同流感亞型)被確定。

替代通路可包括混合所述試劑盒待測(cè)樣品的區(qū)域。例如，反應(yīng)槽可作為添加試劑的區(qū)域。另外，此設(shè)備通道中也可包括誘捕設(shè)備(trapping device)用以清除一定尺寸以上的流體成分。例如，在本發(fā)明的設(shè)備中可包括一個(gè)分離器，例如從全血中分離出血漿或血清。例如，一種疏水燒結(jié)多孔滲水材料的粘合物質(zhì)(matrix)可使一種血紅細(xì)胞粘合劑應(yīng)用到其表面上。所述粘合物質(zhì)可被放置在設(shè)備中所述結(jié)構(gòu)體的前面。全血樣品中的血紅細(xì)胞陷入到所述粘合物質(zhì)的空隙中，而實(shí)質(zhì)性的血細(xì)胞自由的血漿和血清穿過(guò)所述粘合物質(zhì)，并被毛細(xì)管作用力輸送到設(shè)備中的結(jié)構(gòu)體上。此處全盤引用美國(guó)專利第4933092號(hào)。

自動(dòng)化
本發(fā)明的抗體很容易適應(yīng)自動(dòng)化免疫化學(xué)分析儀。為方便本發(fā)明方法的自動(dòng)化，以及減少轉(zhuǎn)變時(shí)間，本發(fā)明的免疫測(cè)定中的一個(gè)固定抗體需和磁性顆粒結(jié)合。

通過(guò)可獲得的商業(yè)方法將抗體與這樣的磁性珠結(jié)合，如Dynal公司[LakeSuccess，N.Y.(USA)]的M-280羊抗兔IgG包被的Dynabeads和目標(biāo)蛋白的兔抗體，或使用Dynal公司的M-450 Tosylactivated Dynabeads，公家結(jié)合上一個(gè)相關(guān)抗體?？蛇x擇地，試劑如戊二醛可用來(lái)使目標(biāo)抗體共價(jià)結(jié)合到一個(gè)固體支持物上，優(yōu)選磁性珠。代表性的結(jié)合試劑可包括有機(jī)化合物如硫脂，碳化二酰亞胺，琥珀酰亞胺酯，二異氰酸酯，戊二醛，重氮苯，六亞甲基二胺。

優(yōu)選的自動(dòng)化的/免疫分析系統(tǒng)是ACS180.RTM.自動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)[美國(guó)紐約塔里敦和馬薩諸塞州馬菲爾德拜耳公司；包括ACS:180 PLUS系統(tǒng)；ACS:180 SE系統(tǒng)和ACSCENTAUR.RTM.系統(tǒng)]。ACS:180.RTM.自動(dòng)免疫測(cè)定系統(tǒng)參見(jiàn)文獻(xiàn)Dudley，B.S.，J.Clin.immunoassay，14(2)77(Summer 1991)。此系統(tǒng)利用化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物作為示蹤劑以及順磁性顆粒(PMP)作為固相試劑。ACS:180系統(tǒng)提供競(jìng)爭(zhēng)式結(jié)合和夾心式結(jié)合兩種測(cè)定方式，其中每個(gè)步驟都是自動(dòng)化的。ACS:180系統(tǒng)使用微米級(jí)順磁性顆粒以使可用的表面積最大化，而且提供一種不需離心就可從未結(jié)合的示蹤劑中快速磁分離已結(jié)合的示蹤劑的方法。試劑可被同時(shí)加入或稍后加入。其他標(biāo)記物，如酶標(biāo)物，也可代替如吖啶酯等化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物使用。優(yōu)選用光度計(jì)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)。優(yōu)選使用拜耳公司的免疫1.TM.免疫測(cè)定系統(tǒng)。其他可適應(yīng)使用本發(fā)明的抗體的運(yùn)行免疫測(cè)定法的示范性自動(dòng)化設(shè)備包括美國(guó)專利第5,807,522號(hào)和第6,907,722號(hào)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗流感抗體可被整合到自動(dòng)多孔板以便使用免疫測(cè)定方法。多孔分析模具(如平板)可適應(yīng)于在多孔分析模具的一個(gè)或多個(gè)孔或反應(yīng)槽(如，多孔分析板的孔)內(nèi)的誘導(dǎo)的基于化學(xué)發(fā)光的測(cè)定。多孔分析板可包括幾個(gè)元件，包括例如，平板頂部，平板底部，孔，工作電極，計(jì)算電極，參考電極，絕緣材料，電連接的接觸面，電連接所述電極和接觸面的傳導(dǎo)通孔，粘合劑，分析試劑，識(shí)別標(biāo)記或記號(hào)。平板上的孔可以是平板頂部的開(kāi)口，開(kāi)口的內(nèi)壁可以是孔壁。平板底部可與頂部粘合在一起(可以直接粘合或借助其他成分粘合)作為孔的底部。

所述多孔分析模具(如平板)可含有任意數(shù)量、任意形狀或尺寸、以任意形狀或構(gòu)象排列及有多種不同材料組成的孔和/或反應(yīng)槽。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)時(shí)方式中，所述多孔分析板為利用工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)的多孔板，具有標(biāo)準(zhǔn)形式的平板和孔的數(shù)量、大小、形狀和構(gòu)象。標(biāo)準(zhǔn)式樣實(shí)例包括96-，384-，1536-和9600-孔板，所述孔以二維排列。其他式樣包括單孔，雙孔，6-孔和24-孔和6144-孔板。優(yōu)選地，所述孔和/或反應(yīng)槽至少有一個(gè)整合在其中的第一電極，更優(yōu)選地，包括至少一個(gè)第二電極。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)時(shí)方式，所述孔和/或反應(yīng)槽至少含有一個(gè)整合在其中的工作電極，更優(yōu)選地也包括至少一個(gè)計(jì)算電極。根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，工作電極、計(jì)算電極，和任選地，參考電極都被整合到孔和/或反應(yīng)槽中。所述分析平板優(yōu)選平坦的，但也可以是彎曲的(不平坦的)。

而且，孔中、反應(yīng)槽中和/或分析模具的分析區(qū)域中(例如，在多孔分析板的孔中)可包含一種或多種分析試劑。例如，在微滴板的不同區(qū)域可使用含有不同流感病毒抗體或一種流感病毒多肽的不同表型抗體的分析試劑。這些分析試劑可以被固定或被放置在一個(gè)或多個(gè)孔和/或反應(yīng)槽的表面(優(yōu)選在電極的表面，最優(yōu)選在工作電極的表面)，并且可被固定于或被放置在一個(gè)或多個(gè)分析區(qū)域中(例如，以一定式樣排列的試劑被固定于或被放置在一個(gè)或多個(gè)孔和/或反應(yīng)槽的表面，優(yōu)選在工作電極和/或計(jì)算電極的表面，最優(yōu)選在工作電極的表面)。所述分析試劑也可通過(guò)所述孔和/或反應(yīng)槽的輪廓而被包含或定位在其內(nèi)。例如，一定式樣的絕緣材料可限定或定位流體。

在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的儀器可被用于促使并測(cè)量在分析模具中的發(fā)光，優(yōu)選的是多孔分析板?？梢哉显谝黄鸬挠?，例如，一個(gè)或多個(gè)光子偵測(cè)器；不透光外殼；用于接觸分析模具的電連接器；傳送多孔分析模具進(jìn)出儀器的機(jī)械裝置(更具體地，是進(jìn)出不透光外殼的機(jī)械裝置)；聯(lián)合并定位多孔分析模具和光子偵測(cè)器以及電連接器的機(jī)械裝置。觀察和辨別模具的裝置(如，一個(gè)或多個(gè)條形碼掃描器(如，一個(gè)條形碼掃描器掃描平板或模具的一側(cè)，另一個(gè)掃描平板或模具的另一側(cè)))；方位傳感器；使與模具有電連接器的機(jī)械設(shè)備，一個(gè)或多個(gè)引導(dǎo)在模具中發(fā)光的電源；和合適的電子裝置和軟件。

所述儀器也可包括儲(chǔ)存、堆放、移動(dòng)和/或分布一個(gè)或多個(gè)分析模具的機(jī)械設(shè)備(如，多孔板棧式存儲(chǔ)器)。所述儀器可以方便地使用光子偵測(cè)器陣列(例如，光電二極管陣列)或成像光子偵測(cè)器陣列(例如，CCD照相機(jī))以測(cè)量發(fā)光。這些探測(cè)器允許這些儀器測(cè)量從多孔(和/或反應(yīng)槽)中發(fā)出的光，同時(shí)也/或使從單個(gè)孔(和/或反應(yīng)槽)中發(fā)出的光的強(qiáng)度和空間分布成像。

優(yōu)選地，所述儀器可以測(cè)量從分析模具的一個(gè)或多個(gè)區(qū)發(fā)出的光，優(yōu)選的分析模具為多孔分析板。在某些實(shí)施方式中，一個(gè)區(qū)包括一群孔(和/或反應(yīng)槽)，數(shù)量從一個(gè)到少于分析模具總孔(和/或反應(yīng)槽)數(shù)(例如，一個(gè)多孔板中孔的一行，一列或二維子陣)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，一個(gè)區(qū)包括多孔板孔數(shù)的4％-50％的孔。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，多孔分析板被分成柱狀部面(例如，一個(gè)區(qū)有一行或一列孔)或方形部面(例如，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)尺寸的多孔板杯分成六個(gè)等尺寸的方形部面)。在某些實(shí)施方式中，一個(gè)區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)孔并在孔中有不止一個(gè)的流體容納區(qū)域。所述儀器，優(yōu)選地，可以在一個(gè)給定的模具(優(yōu)選平板)中逐步誘導(dǎo)ECL并/或逐步測(cè)量從所述區(qū)中而來(lái)的ECL。

所述儀器也可整合微處理器和電腦來(lái)控制器具中的某些功能，以及幫助存儲(chǔ)，分析和顯示數(shù)據(jù)。這些微處理器和電腦可位于儀器之內(nèi)，或位于遠(yuǎn)處而和儀器相連(例如通過(guò)網(wǎng)絡(luò)連接)。

膜/表面
在本發(fā)明的諸多方面，整合了流感病毒抗原或抗流感病毒抗體的設(shè)備包括一個(gè)表面或膜。多種表面或膜可以為各種普通免疫測(cè)定設(shè)備提供一個(gè)表面，在其上抗體或抗原被固定或被處理。這樣，膜可以提供包括檢測(cè)區(qū)域和使用免疫試劑使檢測(cè)結(jié)果(例如，無(wú)論樣品含一中或多種病毒)可視化的對(duì)照區(qū)域。在多種實(shí)施方式中，含有流感病毒抗原或在其上處理有抗流感病毒抗體的膜被依次處理到固體支持物上(例如側(cè)向流動(dòng)或纖維素試紙裝置)。

抗原/抗體可以結(jié)合到其上的膜或表面由一種材料組成，此材料包括但不限于纖維素、硝化纖維、尼龍、帶有一個(gè)四價(jià)氨基的陽(yáng)離子尼龍(Zata探針)，被轉(zhuǎn)換成DPT的氨苯基硫醚(aminophenylthioether，APT)試紙，疊氮衍生物(和酶檢測(cè)標(biāo)記物使用時(shí)不被染色)或親水聚偏二乙烯氟化物(PVDF)(可由Mass.，Billerica，Millipore得到)。術(shù)語(yǔ)“消化纖維”指任何纖維素的硝酸酯。所以合適的材料可包括與纖維素的羧酸酯結(jié)合的硝化纖維。硝化纖維膜的孔徑可有很大的變化，但通常是約在5-20微米，優(yōu)選約8-15微米。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可預(yù)期其他所熟知材料也可被使用。在某些實(shí)施方式中，所述測(cè)試區(qū)域包括由Millipore生產(chǎn)的被積壓到一個(gè)光亮的聚酯薄膜背襯的硝化纖維卷制成的硝化纖維網(wǎng)狀組件。在另一個(gè)實(shí)施方式中，此含有抗原/抗體區(qū)域(或“測(cè)試區(qū)域”)由尼龍制成。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述測(cè)試區(qū)域包括一種可以固定橡膠或其他可以攜帶另一個(gè)可特異性結(jié)合分析物的試劑的顆粒，因此可以確定一個(gè)測(cè)試區(qū)，例如壓制的尼龍粉末，或玻璃纖維。在某些實(shí)施方式中，所述測(cè)試區(qū)域包括一種在干燥狀態(tài)不透明而在潮濕狀態(tài)透明的材料。

測(cè)試和對(duì)照區(qū)
設(shè)備可包括含有測(cè)試和對(duì)照區(qū)的膜或表面，測(cè)試區(qū)域可由上述材料的任何一種構(gòu)成。通常測(cè)試區(qū)和對(duì)照區(qū)可確定測(cè)試區(qū)域的成分。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述測(cè)試和對(duì)照區(qū)包括和測(cè)試區(qū)域相同的材料。通常，術(shù)語(yǔ)“測(cè)試區(qū)域”在此用來(lái)解釋在設(shè)備中/上包括至少一個(gè)測(cè)試和對(duì)照區(qū)的區(qū)域。在有些實(shí)施方式中，設(shè)備使用吸水材料而在某些實(shí)施方式中，為提供非吸水性的流體，這些材料要被終止液處理以打斷造成吸水膜吸水性的作用力。合適的終止液包括牛血清白蛋白，甲基化的牛血清白蛋白，動(dòng)物的全血清，酪蛋白，脫脂奶粉，大量的清潔劑和聚合物，例如，PEG，PVA及其類似物。在某些實(shí)施方式中，在未處理的吸水膜上的干擾位點(diǎn)由于終止液的存在而完全破壞已允許費(fèi)吸水性流體可以通過(guò)。如此處指出的，本發(fā)明的測(cè)試設(shè)備是一個(gè)帶有多個(gè)測(cè)試和對(duì)照區(qū)的設(shè)備。

檢測(cè)區(qū)域一般包括一個(gè)或多個(gè)對(duì)照區(qū)，這樣對(duì)于驗(yàn)證樣品流動(dòng)是否是預(yù)期的很有用處。每一個(gè)對(duì)照區(qū)都包括一個(gè)空間上不同的區(qū)域，在此區(qū)域里常有一個(gè)特異性結(jié)合配對(duì)的固定元件，該元件可和標(biāo)記的對(duì)照試劑反應(yīng)。在某個(gè)實(shí)施方式中，程序上的對(duì)照區(qū)包括一個(gè)待測(cè)分析物的可靠樣品，或樣品的一個(gè)片斷。在這個(gè)實(shí)施例中，使用了一種標(biāo)記試劑，所述的液態(tài)樣本攜帶標(biāo)記試劑到達(dá)測(cè)試和對(duì)照區(qū)；沒(méi)有被結(jié)合到被分析物上的標(biāo)記試劑就將結(jié)合到定位在對(duì)照區(qū)的待測(cè)被分析物的可靠樣品上。在另一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)照線含有抗體，該抗體對(duì)標(biāo)記試劑是特異性的或者為了固定的標(biāo)記試劑而提供的。在操作中，標(biāo)記試劑被限制在每一個(gè)單個(gè)的或多個(gè)的對(duì)照區(qū)，即使在待測(cè)樣本中任何一個(gè)或者所有感興趣的分析物都不存在。

在某些實(shí)施方式中，固體支持物包括一定式樣的區(qū)域，所述區(qū)域包括抗原/抗體結(jié)合粘合物質(zhì)領(lǐng)域，此領(lǐng)域可被設(shè)計(jì)成任何想要的形狀(例如，方形，橢圓形，圓形，垂線或水平線)。例如，抗原結(jié)合粘合物質(zhì)(matrix)領(lǐng)域被處理到一個(gè)固體支持纖維素試紙上，所述纖維素試紙可由塑料或聚酯薄膜材料制成。通過(guò)使用本發(fā)明，通過(guò)整合每個(gè)在單個(gè)測(cè)試帶或單個(gè)固相支持物纖維素試紙的不同位置上含有不同特異性抗原的多個(gè)方形粘合物質(zhì)，有可能在一個(gè)單獨(dú)的測(cè)試中測(cè)定到多個(gè)抗H5 AIV抗體亞型。

在各種實(shí)施方式中，含有本發(fā)明的抗體并應(yīng)用在免疫分析中的裝置可被包括在一個(gè)試劑盒中。為了特殊的形式的免疫分析應(yīng)用，該試劑盒包括了必要的反應(yīng)試劑。該試劑盒包括一個(gè)纖維素試紙和單獨(dú)的隨其應(yīng)用的試劑，其上固定了分析流感多種亞型所需的抗體的橫向流動(dòng)設(shè)備，或者任何帶有必要試劑的常規(guī)裝置。例如，通過(guò)一個(gè)纖維素試紙頻繁的浸沾一系列的在試劑盒中提供的試劑的過(guò)程，在樣本中有或沒(méi)有特定的抗-亞型流感病毒(例如，H5 AIV抗體)或者流感病毒抗原(例如，H5抗原)可以被簡(jiǎn)單快速地確定。該試劑盒適合專家或業(yè)內(nèi)人員使用。利用本發(fā)明的試劑盒可以快速進(jìn)行從體液獲得的流感病毒(例如，AIV)的血清診斷，體液可以是血液、尿液、唾液、精液、糞便，唾液、膽汁、腦脊液，鼻涕、泌尿生殖器的液體、鼻呼氣，脊髓液，等等。

在另一實(shí)施方式中，固相的支持纖維素試紙或者橫向流動(dòng)裝置安置在一個(gè)測(cè)試試管或者類似的容器中，該測(cè)試管或者類似容器添加了被懷疑感染了流感病毒(例如，AIV)的病人或者動(dòng)物樣本。樣本和結(jié)合在纖維素試紙中的抗原/抗體反應(yīng)。然后取出纖維素試紙并輕輕地清洗。固相支持纖維素試紙被從清洗液中取出并被放入另一個(gè)試管中，該試管含有高度稀釋的，經(jīng)親和分離純化的免疫球蛋白，該免疫球蛋白對(duì)從其中獲得樣本的物種是特異性的，并可和堿性磷酸酶或者其他適宜的酶結(jié)合。接著纖維素試紙從第二抗體溶液取出并放入一個(gè)帶有清洗液的容器中。一旦纖維素試紙從清洗液中取出就被放入帶有顯色劑或者其他合適的底物溶液的最終的試管中。陽(yáng)性反應(yīng)可以通過(guò)簡(jiǎn)單的觀測(cè)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)(上面的線)和陽(yáng)性線(下面的線)的比較而評(píng)定出來(lái)。如果陽(yáng)性線顏色比標(biāo)準(zhǔn)線深，那么檢測(cè)結(jié)果就是陽(yáng)性。共價(jià)連接到經(jīng)親和純化的免疫球蛋白的酶和底物反應(yīng)，所述底物在酶-底物反應(yīng)的結(jié)束時(shí)產(chǎn)生一個(gè)有色反應(yīng)產(chǎn)物。通過(guò)這種方式連接的密切相關(guān)的純化的免疫球蛋白就可以很容易的檢測(cè)出來(lái)，該檢測(cè)顯示在樣品中存在對(duì)流感病毒(如，H5抗體)特異性的抗體。這個(gè)技術(shù)整合了已知的ELISA技術(shù)，在此處也有揭露。

應(yīng)到理解的是，選擇合適的酶和底物和合適的反應(yīng)條件的技術(shù)已為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。這些酶在和免疫球蛋白結(jié)合后要仍然有活性。每個(gè)酶-底物配對(duì)的化學(xué)反應(yīng)都要得到一個(gè)有顏色的產(chǎn)物。另外，有多種可選擇的配對(duì)方式，其中酶和底物都可以和經(jīng)親和純化的免疫球蛋白結(jié)合，但是只有在純化的免疫球蛋白已經(jīng)連接到樣本抗體之后，酶和底物的反應(yīng)才能產(chǎn)生有顏色的反應(yīng)產(chǎn)物。

當(dāng)然，通過(guò)使用不同的抗體/抗原，樣本可以很容易的篩選出一組不同的病毒和不同的亞型。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，通過(guò)這里描述的免疫測(cè)定法需分析不同的組。參見(jiàn)CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY(Coligan，John E.et.al.，eds.1999)。

陣列
本發(fā)明的抗體可以很容易的被應(yīng)用在設(shè)備中，用該設(shè)備檢測(cè)分析物的方法是一種快速檢測(cè)方法，該方法包括檢測(cè)樣本中的一個(gè)或多個(gè)流感病毒蛋白(例如，H5)或者一個(gè)或多個(gè)的抗-流感病毒抗體。這種方法包括抗體以含其他抗體的陣列的形式展示的實(shí)施方式，所述其他抗體其以多種不同的病毒如其他的流感病毒亞型(如，AIV)為靶標(biāo)。在其他的實(shí)施方式中，抗體可以以相同的抗原為目標(biāo)或者特異性的和一個(gè)既定的多肽上的不同的抗原決定基結(jié)合。

在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，抗體的陣列包括底物，大量的離散排列的小片段(patch)，在底物表面部分的已知區(qū)域上，其中(i)每一個(gè)片段包括固定在底物上的抗體，其中所述既定片段中抗體可結(jié)合特定的病毒表達(dá)產(chǎn)物、產(chǎn)物的片斷，或者宿主蛋白，例如抗病毒抗體，和(ii)陣列包括很多不同的抗體，每一個(gè)抗體都可以結(jié)合不同的病毒表達(dá)產(chǎn)物、病毒產(chǎn)物片斷，或者宿主蛋白，如抗病毒抗體。

優(yōu)選地，抗體共價(jià)地固定在陣列的片斷上，可以直接固定也可以間接固定。在多數(shù)情況下，陣列至少包括10個(gè)片斷。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，陣列至少包括50個(gè)片段。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施例中，陣列包括至少100個(gè)片段。在一個(gè)選擇性的優(yōu)選實(shí)施例中，抗體陣列可以包括超過(guò)103，104，或者105個(gè)片段。

被每一個(gè)片段覆蓋的底物表面區(qū)域優(yōu)選不超過(guò)0.25mm2。優(yōu)選地，每個(gè)片段覆蓋的底物表面區(qū)域在大約1μm2到1000μm2。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施例中，每個(gè)片段覆蓋的底物表面區(qū)域在大約1μm2到2500μm2。在一個(gè)可選擇的實(shí)施例中，在陣列上的一個(gè)片段可覆蓋底物表面的面積有2500nm2這么小，雖然如此小的片段在陣列的應(yīng)用當(dāng)中一般是沒(méi)有必要的。

陣列中的片段可以是任何幾何形狀。例如，片段可以是矩形的，圓形的。陣列中的片段也可以是不規(guī)則的形狀。片段也可以隨意的從下層底物中間布局(median plan)開(kāi)始增加。

隔開(kāi)陣列上的片段的距離可以是不同的。優(yōu)選地，陣列上的片段間相鄰之間的距離大約1μm到500μm。典型地，如果片段的直徑大于10μm，隔開(kāi)陣列上片段的距離約與片段的直徑或側(cè)面長(zhǎng)度成比例。如果片段比較小，這時(shí)隔開(kāi)片段的距離一般都比片段本身的直徑要大。

在陣列的一特別實(shí)施方式中，陣列的所有片段都被包含在底物表面上大約1cm2或更小的區(qū)域。因此在一個(gè)優(yōu)選的陣列的實(shí)施例中，陣列在底物表面上總面積大約1cm2或更小的區(qū)域內(nèi)包括了100個(gè)或更多片段?？蛇x擇地，一個(gè)特別優(yōu)選的陣列在底物表面上總面積大約1cm2或更小的區(qū)域內(nèi)包括了103個(gè)或更多的片段。優(yōu)選的陣列在底物表面上總面積大約1cm2或更小的區(qū)域內(nèi)，甚至可以隨意包括104或者105或者更多的片段。在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，所有的陣列的片段都包含在底物的表面上面積大約為1mm2或更小的區(qū)域內(nèi)。

代表性地，在陣列的一個(gè)片段上只有一個(gè)抗體。如果在一個(gè)片段上不止一個(gè)的抗體，那么在那個(gè)片段上的所有的抗體必須共用一個(gè)普通的結(jié)合伙伴。例如，一個(gè)片段可包括很多種流感病毒蛋白的抗體(雖然，抗體潛在地可以結(jié)合既定流感病毒上的不同抗原決定基)。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述流感病毒蛋白/抗原是H5且流感病毒是AIV。

本發(fā)明中的陣列可以含有日呢以數(shù)量的不同的抗體。典型地，所述陣列包括至少10種不同的抗體。優(yōu)選地，所述陣列包括至少50種不同抗體。更優(yōu)選地，所述陣列包括至少100種抗體。可選擇的優(yōu)選陣列包括超過(guò)103種不同抗體或者超過(guò)104種不同抗體。所述陣列甚至可隨意包括超過(guò)105種不同抗體。

在陣列的一個(gè)實(shí)施例中，陣列的每一個(gè)片段包括一種不同的抗體。例如，一個(gè)陣列包括大約100個(gè)片段可以包括大約100個(gè)不同的抗體。類似地，一個(gè)含約10000個(gè)片段的陣列溘包括大約10000種不同抗體。然而，在一個(gè)可選擇的實(shí)施例中，每一個(gè)不同的抗體被固定在陣列的多個(gè)片段上。例如，每一個(gè)不同的抗體可以隨意的在2-6個(gè)不同的片段中出現(xiàn)。因此，本發(fā)明的一個(gè)陣列，可包括大約3000抗體片段，但僅包括大約1000種不同的抗體，因?yàn)槊恳粋€(gè)不同的抗體在3個(gè)不同的片段中出現(xiàn)。

典型地，可被陣列上的大量不同抗體結(jié)合的不同蛋白的數(shù)量至少有10個(gè)。然而，優(yōu)選地，在陣列上的大量不同的抗體可以用來(lái)結(jié)合大量數(shù)量的不同蛋白，例如，至少大約50或者至少大約100個(gè)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施例中，在陣列上大量不同抗體可以結(jié)合至少大約103個(gè)蛋白。

利用本實(shí)施例中的抗體陣列可隨意包含在流動(dòng)反應(yīng)槽中以每25mm2表面積1-10uL液體體積的形式放置二維陣列。覆蓋在流動(dòng)反應(yīng)槽中的陣列上的罩殼可以是透明或半透明的。在一個(gè)實(shí)時(shí)方式中，所述罩殼可包括耐熱玻璃或石英玻璃。在其他的實(shí)施方式中，所述罩殼可能是檢測(cè)系統(tǒng)的一部分，以監(jiān)測(cè)固定在陣列上的抗體與溶液，如細(xì)胞抽提液中蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)。所述流動(dòng)反應(yīng)槽應(yīng)該保持含有適當(dāng)?shù)囊后w溶液以保護(hù)抗體。鹽度、溫度和其他條件優(yōu)選與正常生理?xiàng)l件保持相似。在流體溶液中的樣品可能滲入上述流動(dòng)反應(yīng)槽中，它們肯定和固定的抗體反應(yīng)。需要提供足夠的時(shí)間以允許抗體及其結(jié)合伙伴發(fā)生結(jié)合。這所需的時(shí)間取決于抗體對(duì)其結(jié)合伙伴的親和力。流體輸送到陣列中不需要專門的微流泵、閥門或混合技術(shù)。

檢測(cè)方法
使用本發(fā)明的抗體適用的任何裝置中，可獲得很多類的檢測(cè)成分來(lái)檢測(cè)結(jié)合伙伴的存在。檢測(cè)可以是數(shù)量上的也可以是質(zhì)量上的。本發(fā)明的陣列可和光學(xué)檢測(cè)方法如可視光或紫外光的吸收、化學(xué)發(fā)光和熒光(包括有效期、偏振、熒光關(guān)聯(lián)能譜法(FCS)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET))合用。而且，其他檢測(cè)模式，如基于光波的，參見(jiàn)PCT公開(kāi)文本(WO 96/26432和美國(guó)專利第5,677,196號(hào))，基于表面胞質(zhì)團(tuán)共振分析技術(shù)(surfaceplasmon resonance)的，基于表面電荷傳感器的，基于表面作用力傳感器的都可以和本發(fā)明的許多實(shí)施方式兼容?？蛇x擇地，基于Brewster角度顯微鏡方法(Brewster Anglemicroscopy)(BAM)的(Schaaf et al.，Langmuir，3:1131-1135(1987))和橢圓光度法(U.S.Pat.Nos.5,141,311 and 5,116,121；Kim，Macromolecules，22:2682-2685(1984))的科技也可被應(yīng)用。水晶微平衡作用(microbalances)和解吸附過(guò)程(參見(jiàn)例如美國(guó)專利第5,719,060號(hào))也提供了其他適合本發(fā)明陣列某些實(shí)施方式的檢測(cè)方法。參見(jiàn)美國(guó)專利第5,313,264號(hào)可見(jiàn)一種光學(xué)生物傳感器系統(tǒng)可與本發(fā)明的一些矩陣相兼容，也可與多種未標(biāo)記的檢測(cè)方法如表面胞質(zhì)團(tuán)共振分析技術(shù)、內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRF)、Brewster角度顯微鏡方法、光波發(fā)光模式光譜法(OWLS)相兼容。

在某些實(shí)施方式中，所述整合了本發(fā)明抗體的設(shè)備可被整合到一個(gè)系統(tǒng)中，所述系統(tǒng)包括閱讀器(reader)，特別是設(shè)置在電腦中的閱讀器，如基于反射和/或熒光的閱讀器，以及包括一個(gè)使用數(shù)據(jù)還原(data reduction)和曲線擬合算法的數(shù)據(jù)處理軟件，優(yōu)選地與被訓(xùn)練的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(trained neural network)連用以準(zhǔn)確地確定在生物樣品中分析物的存在與否及其濃度。如這里所使用的閱讀器是指一種檢測(cè)和/或定量數(shù)據(jù)的工具，如在包括在使用本發(fā)明抗體的測(cè)試設(shè)備中測(cè)試帶(test strips)上。數(shù)據(jù)應(yīng)是裸眼可視的，但不需要如此。所述方法包括在病人樣品上執(zhí)行免疫測(cè)定的步驟，使用基于反射和/或熒光的閱讀器讀取數(shù)據(jù)的步驟，使用利用數(shù)據(jù)還原的數(shù)據(jù)處理軟件來(lái)處理所得數(shù)據(jù)。優(yōu)選的軟件包括曲線擬合算法，可任意地與被訓(xùn)練的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連用，以確定在待測(cè)樣品中被分析物的存在與否及其濃度。從閱讀器中獲得的數(shù)據(jù)可以被進(jìn)一步地通過(guò)醫(yī)學(xué)診斷系統(tǒng)處理輸出數(shù)據(jù)以提供風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估或醫(yī)學(xué)條件的診斷。在可擇實(shí)施方式中，所述輸出數(shù)據(jù)可被用于輸入到后續(xù)的結(jié)論支持系統(tǒng)，如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，它可被訓(xùn)練以評(píng)估這些數(shù)據(jù)。

在多各種實(shí)施方式中，所述閱讀器可以是反射閱讀器，發(fā)射閱讀器，熒光閱讀器，化學(xué)生物發(fā)光閱讀器，磁力閱讀器或電流測(cè)定閱讀器(或兩個(gè)或更多的結(jié)合)，這取決于要從設(shè)備中檢測(cè)的信號(hào)。而且，某些檢測(cè)方法一般用于傳統(tǒng)的免疫測(cè)定法，該法需要使用標(biāo)記物，這些檢測(cè)方法可應(yīng)用到本發(fā)明的陣列中。這些技術(shù)包括非競(jìng)爭(zhēng)式免疫測(cè)定法，競(jìng)爭(zhēng)式免疫測(cè)定法，雙標(biāo)記物法，比值免疫測(cè)定法。這些特定的技術(shù)主要適用在當(dāng)帶有不同特異性的不同抗體的數(shù)目很小(約小于100)時(shí)和抗體陣列一起使用的時(shí)候。在所述競(jìng)爭(zhēng)式方法中，結(jié)合位點(diǎn)的占據(jù)是間接確定的。在這種方法中，陣列的抗體被暴露在標(biāo)記的顯影試劑中，所述顯影試劑通常是帶有標(biāo)記的分析物或其類似物。所述顯影試劑與分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合在抗體上的位點(diǎn)。顯影試劑結(jié)合到單個(gè)片斷的抗體上可形成在不同片斷上抗體的少量占據(jù)。

在非競(jìng)爭(zhēng)式方法中，結(jié)合位點(diǎn)的占據(jù)是直接確定的。在這種方法中，所述列陣的片斷暴露于標(biāo)記的顯影液中，所述顯影液可以結(jié)合到被結(jié)合的分析物上或在蛋白固定試劑中的以被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)上。例如，所述顯影液可以是與被占據(jù)位點(diǎn)直接對(duì)應(yīng)的被標(biāo)記的抗體(例如，“夾心式分析”)?？蛇x擇地，雙標(biāo)記法，當(dāng)所述抗體被一種標(biāo)記物標(biāo)記，顯影液背另一個(gè)標(biāo)記物標(biāo)記時(shí)采用比值法(Ekins，et al.，Clinica Chimica Acta.，194:91-114，1990)。在前述的技術(shù)中可以使用很多不同的標(biāo)記方法，包括放射性同位素法、酶法、化學(xué)發(fā)光法和熒光法。在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選熒光檢測(cè)法。檢測(cè)的方法包括但不限于，顏色的改變、光吸收或光傳輸?shù)母淖?，PH的改變，傳導(dǎo)性的改變，熒光性的改變，物理相的變化或類似方法。

待測(cè)樣品應(yīng)提供檢測(cè)系統(tǒng)的可檢測(cè)成分或者這種成分可被加入。所述成分的差異很大，這取決于檢測(cè)系統(tǒng)的性質(zhì)。其中一種檢測(cè)方法包括使用顆粒，顆粒被用于提供散光或改變流動(dòng)速度。所述顆?？梢允牵幌抻?，細(xì)胞、不能融合于液體系統(tǒng)的多聚顆粒、橡膠顆粒、陶瓷顆粒、核酸顆粒、粘合顆?；蚱漕愃莆?。顆粒的選擇取決于檢測(cè)方法、在流體變化時(shí)分散的分布情況和穩(wěn)定性，活躍性，參與度等諸如此類。在固定位點(diǎn)分析物與特異性結(jié)合元件結(jié)合可通過(guò)檢測(cè)設(shè)備中待測(cè)樣品的壓力來(lái)隨意檢測(cè)。例如，與待測(cè)樣品連接的壓力檢測(cè)器進(jìn)入或退出通道時(shí)將能檢測(cè)到壓力降低，所述壓力降低是由于分析物的結(jié)合，它會(huì)導(dǎo)致通道內(nèi)流速放緩。

例如，為確定已存在的可檢測(cè)的標(biāo)記物(例如，抗體結(jié)合)的量，及抗原存在的量，可以使用Hazelgrove等人的方法和儀器(參見(jiàn)Anal.Biochem 150:449-456，1985)。這種方法是基于與電腦連接的電視攝影機(jī)。所述標(biāo)記通過(guò)電視攝影機(jī)成像而顯示在一個(gè)發(fā)光盒子上，且被一種數(shù)字化平板(Techmar公司)數(shù)字化。數(shù)字化后，電腦會(huì)讀取出每個(gè)標(biāo)記的位置、寬度、高度和相對(duì)面積。光密度測(cè)量也用于測(cè)定蛋白質(zhì)的絕對(duì)濃度。

在另一實(shí)施方式中，將包括Dot-ELISA測(cè)試的裝置用于檢測(cè)直接來(lái)自任何樣品的目標(biāo)蛋白。因而，本發(fā)明的抗體可以用于包括下列步驟的方法中 (a)提供一固相支持物，以便進(jìn)行單抗的測(cè)定； (b)將懷疑帶有流感病毒的樣品施加到該固相支持物上； (c)將含有有機(jī)酸如檸檬酸或乳酸的溶液施加到固相支持物上； (d)將含有溶粘液劑(mucolytic agent)和去污劑的溶液施加到該固相支持物上； (e)將該固相支持物與初級(jí)單抗(primary Mab)、嵌合單抗、其變體或片段接觸足夠的時(shí)間，使得初級(jí)單抗、嵌合單抗、其變體或片段和H5 AIV蛋白結(jié)合在一起，形成結(jié)合抗原的初級(jí)單抗； (f)將上述與酶標(biāo)記的抗-單抗綴合物(conjugate)接觸足夠的時(shí)間，使得該結(jié)合抗原的初級(jí)單抗便于結(jié)合到該綴合物上；以及 (g)將顯色試劑施加到該固相支持物上，其中，該顯色試劑被酶催化而形成帶色的標(biāo)志，從而使得能夠目視檢測(cè)樣品中是否存在H5 AIV蛋白。
美國(guó)專利申請(qǐng)2006/0246429中公開(kāi)了一種Dot-ELISA方法，此處將其整體作為對(duì)比文獻(xiàn)。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的裝置或試劑盒可以用于護(hù)理(care setting)領(lǐng)域，其中，可以利用顯色檢測(cè)系統(tǒng)如采用堿性磷酸酶的系統(tǒng)。例如，分離出若干小瓶，其含有在緩沖液、NBT或5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)中的鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶綴合物，并將其設(shè)計(jì)成可依次達(dá)到所期望的色彩，從而使其可作為試劑盒的組分。利用顯色檢測(cè)系統(tǒng)，其結(jié)果可以用肉眼觀察而不需要任何設(shè)備的幫助。在一實(shí)施方式中，檢測(cè)裝置可以利用堿性磷酸酶定量確定存在的AIV量。當(dāng)與光密度計(jì)一起使用時(shí)，這種包含堿性磷酸酶的裝置可以給出準(zhǔn)確的定量結(jié)果。

在一實(shí)施方式中，檢測(cè)H5 AIV蛋白或抗H5亞型AIV抗體的試劑盒可以包括檢測(cè)標(biāo)記物如結(jié)合在其上的鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶綴合物；含NBT或5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)的試劑；以及參比標(biāo)準(zhǔn)。

在本申請(qǐng)描述的任一實(shí)施方式中，測(cè)試樣品可能是來(lái)自但不限于生理來(lái)源?？梢杂糜诒景l(fā)明裝置的測(cè)試樣品包括懷疑帶有抗原或抗體的樣品，這些樣品可以是來(lái)自非人類的動(dòng)物體或者人體；可以用于本發(fā)明裝置的測(cè)試樣品包括但不限于生理體液如血液、血清、血漿、唾液、眼睛分泌物、腦脊液、膿、滲出液、乳汁、汗液、眼淚、耳流出物、痰、淋巴液、尿液、糞便、口鼻分泌物；組織如肺、脾和腎；雞胚培養(yǎng)中的全病毒或裂解病毒的液；以及其它懷疑含有流感病毒蛋白或抗流感病毒抗體的樣品，只有其是可溶的或可懸浮于適當(dāng)?shù)牧黧w中。測(cè)試樣品可以經(jīng)過(guò)預(yù)先處理，如萃取、添加、分離、稀釋、濃縮、過(guò)濾、蒸餾、透析等等。除了生理液之外，也可以使用其它的液體測(cè)試樣品，而且感興趣的成分既可以是液體，也可以是固體，只要該固體能被溶解或可以懸浮于一液體介質(zhì)中即可。在一實(shí)施方式中，樣品取自鼻腔。本發(fā)明的裝置通常帶有可以附著一種或多種抗原或抗體的表面。

治療方法和藥物組合物
本發(fā)明提供了一種預(yù)防和治療禽流感病毒相關(guān)病毒感染患者的方法，包括對(duì)患者干預(yù)一定量的包含了一種或多種本發(fā)明所述單抗的有藥物活性的藥物成分。本發(fā)明還提供了一種含有本發(fā)明所述的一種或多種單抗的藥物成分或在此基礎(chǔ)上得到的鹽類藥物。

本發(fā)明所述藥物成分的干預(yù)方式可以是傳統(tǒng)的干預(yù)途徑，包括口服、口腔、舌下、眼球、局部、腸胃外、直腸、葉鞘內(nèi)、內(nèi)胞漿網(wǎng)槽內(nèi)、腹股溝、膀胱內(nèi)、局部(如，粉劑、藥膏或滴劑)，或鼻腔途徑，但不僅局限于此。

適合腸胃外途徑注射的藥物成分可能含有符合藥物制備要求的無(wú)菌水或非水溶液、氣霧劑、懸浮液或乳劑，可在臨用時(shí)重懸成可注射的溶液或氣霧劑的無(wú)菌粉劑。如適合的水性和非水性載體，工具和各種稀釋液如水、乙醇、多羥基化合物(如丙烯乙二醇、聚乙烯二醇、丙三醇及其類似物)，合適的混合物，菜油(如橄欖油)，和可用于注射的有機(jī)脂，如乙烷油酸。如使用卵磷脂衣殼維持藥物的合適流動(dòng)性。如使用氣霧劑、表面活性劑以維持合適的顆粒尺寸。

本發(fā)明所述的藥物組合物還可含有一些起保護(hù)性、保濕、乳化和氣霧化的佐劑，也可以含有預(yù)防微生物污染的速溶成分，如各種抗細(xì)菌試劑、抗真菌試劑，如parabens，chlorobutanol，苯酚，山梨酸及類似物。也可以包括維持滲透壓的試劑，如糖、NaCI及其類似物。可使用延長(zhǎng)吸附的試劑來(lái)延長(zhǎng)注射用藥物成分吸附時(shí)間，如單硬脂酸鹽和凝膠等。

口服固相劑型包括膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑等。這些固相劑型中的活性成分至少混有一種傳統(tǒng)的惰性藥物賦形劑(或載體)如檸檬酸鈉、磷酸鈣，或(a)填充劑或添加劑如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(b)粘合劑，如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯樹(shù)膠；(C)濕潤(rùn)劑，如甘油；(d)碎裂劑，如瓊脂，碳酸鈣，馬鈴薯粉或木薯粉；(e)緩凝劑，如石蠟；(f)促吸收劑，如四氨基混合物；(g)保濕劑，如十六烷基醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，如高嶺土和斑脫土；(i)潤(rùn)滑劑，如滑石，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，硫酸十二烷醇鈉，或其上述物質(zhì)的混合物。在片劑和膠囊劑型中，可能還含有緩沖劑。

固相劑型可以通過(guò)做成改良釋放或脈沖釋放劑型，是在上述提到的各種直接釋放賦形劑中添加一些能改變藥物釋放速率的賦形劑而形成，可以包含在劑型中也可以做成外衣的形式。速率釋放改造劑包括羧丙基甲基纖維素，甲基纖維素，碳甲基纖維素鈉，纖維素乙烷，醋酸纖維素，聚乙烯氧化物，黃原膠糖，異丙烯酸氨共聚物，氫化調(diào)味油，巴西棕櫚蠟，石蠟，鄰苯二酸醋酸纖維素，鄰苯二甲酸羧丙基甲基纖維素，甲基丙烯酸共聚物或上述物質(zhì)的混合物。改良釋放和脈沖釋放劑型可能含有一種或一組具有改良釋放速率的賦形劑。

本發(fā)明所述藥物成分還可由快速的霧化劑或消溶劑(FDDFs)組成，包含如下成分天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，磺胺鉀，檸檬酸，croscarmellose sodium，crospovidone，抗壞血酸，乙烷基丙烯酸鹽，乙烷基纖維素，明膠，氫氧基丙基甲基纖維素，硬脂酸鎂，甘露醇，甲基乙丁烯酸鹽，調(diào)味薄荷，聚乙二醇，氣化硅膠，二氧化硅，乙醇酸淀粉鈉，硬脂酸延胡索酸鈉，山梨醇，木糖醇。這里用于描述FDDFs的“霧化和消溶”一詞，依賴于所用藥物的溶解性，如藥物是不可溶的，可制成快速的霧化劑型，如藥物是可溶的，則可制成快速的溶劑型。

類似形式的固相成分也使用諸如乳糖或牛奶糖或其它高分子量的聚乙二醇及類似的賦形劑制成軟明膠或硬明膠的填充劑型。

諸如片劑、糖衣劑、膠囊劑和顆粒劑等之類的固體劑型可以通過(guò)諸如腸衣或其它本領(lǐng)域普通人員均知曉的外包衣殼的方式制成。也可以是含有乳濁劑、也可以是含有能起緩慢、延遲、控制活性藥物釋放的類似的成分。也可以使用多聚物和石蠟等成分進(jìn)行包埋。如果合適，也可用上述一種或多種賦形劑把活性成分制成微囊的形式的劑型。

用于口服的液體劑型，包括符合藥物要求的乳狀劑、溶液、懸浮液、糖漿和西也劑等。除了活性成分，液體劑型也可含有本領(lǐng)域常用的一些惰性溶液，如水或其它溶劑，可溶性試劑和乳化劑，如乙烷基醇，異丙基醇，乙烷基碳酸鹽，苯基安息香酸鹽，丙稀乙二醇，1，3-丁烯乙二醇，油，特別是，棉籽油，落花生油，玉米油，橄欖油，調(diào)味油和芝麻油，甘油，氫糠基醇，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及上述物質(zhì)的混合物或類似的物質(zhì)。

除了這些惰性稀釋液，藥物成分也可包括保濕劑、乳化劑、懸浮劑、糖化劑、調(diào)味劑和香味劑等佐劑。另外，藥物成分還可包括乙氧基化均聚乙醇，聚氧乙烯烷基山梨醇和山梨聚糖脂，微晶纖維素，間氫氧化鋁，膨潤(rùn)土，瓊脂聚合物和黃芪膠，或這些物質(zhì)的混合物之類的懸浮劑。

本發(fā)明所述藥物成分也制成適合獸用治療的混合物，或符合獸用的鹽類，或符合獸用的溶劑或初成藥，并根據(jù)普通獸醫(yī)和獸醫(yī)從業(yè)者的要求制成一種最適合某種特定動(dòng)物的給藥劑量和途徑藥物的合適劑型。

本發(fā)明所述一個(gè)或多個(gè)單抗可以結(jié)合其它抗病毒試劑用于預(yù)防和或治療H5禽流感病毒感染相關(guān)疾病。單抗可以和這些抗病毒試劑同時(shí)、分開(kāi)或連續(xù)給藥。其它抗病毒試劑包括利巴韋林，金剛烷，羧基脲，IL-2，IL-12和五羧鏈胞酸，但不僅限于這些。

多肽篩選方法和抗體識(shí)別的多肽及疫苗
本發(fā)明提供了一種篩選本發(fā)明所述單抗識(shí)別的模擬表位多肽的檢測(cè)方法。而且，本發(fā)明也提供了本發(fā)明所述單抗識(shí)別的表位模擬多肽。一方面，本發(fā)明公布的短肽含有氨基酸序列SEQ ID Nos64-68、70-73、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94和96。這些多肽能夠結(jié)合本發(fā)明所述單抗。因此，這些多肽擁有和H5血凝素相同的抗原特異性。這些多肽也可用于制備H5亞型禽流感疫苗，也可以用于診斷抗H5血凝素抗體的存在。

另一方面，本發(fā)明所述的篩選方法包括如下步驟(i)在特定條件下培養(yǎng)一個(gè)適合多肽表達(dá)的多肽展示文庫(kù)；(ii)把培養(yǎng)溶液和本發(fā)明的單抗混合；(iii)篩選特異性結(jié)合上述單抗的噬菌體克隆。用于篩選的單克隆抗體不僅限于單抗8H5，3C8，10F7，4D1，2F2和/或3G4。本申請(qǐng)實(shí)施例11-13中詳細(xì)描述了一種利用噬菌體展示多肽文庫(kù)成功篩選結(jié)合本發(fā)明所述單抗的短肽檢測(cè)方法。
實(shí)施例
下面結(jié)合具體實(shí)施例與附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步加以描述，但這些描述并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1抗H5亞型禽流感病毒HA基因單克隆抗體的制備
抗原的制備
以病毒株Ck/HK/Yu22/02(H5N1)(簡(jiǎn)稱Yu22)，接種9天齡受精雞胚，30℃孵育2天后，收集雞胚液，得到擴(kuò)增后的Yu22病毒。收集活病毒，在4℃下以0.03％福馬林福爾馬林滅活，滅活病毒經(jīng)HA檢測(cè)，確定滅活病毒液的滴度(注HA滴度測(cè)定和HI檢測(cè)的具體方法參見(jiàn)WHO操作指南，我們選擇HA＝1024，該病毒株由香港大學(xué)微生物系提供)。

小白鼠
6周齡雌性Balb/c鼠購(gòu)自廈門大學(xué)抗癌中心，并在該中心飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

雜交瘤的制備
我們使用標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)免疫方式和PEG融合方法獲得單克隆抗體，詳細(xì)方法參見(jiàn)Ed Harlow et al.，“Antibodies A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory 1988.簡(jiǎn)要過(guò)程如下
小鼠免疫將上述預(yù)處理的病毒液與福氏完全佐劑(CFA)等體積混合乳化，經(jīng)四肢肌肉多點(diǎn)注射，每只每次注射300ul。首次免疫后第15天和第29天，分別用同樣劑量的病毒液加弗氏不完全佐劑(IFA)進(jìn)行加強(qiáng)免疫。第二加強(qiáng)后采血檢測(cè)HI的抑制效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)到1640后，取小鼠脾臟做融合。融合前72小時(shí)再次加強(qiáng)免疫，經(jīng)尾靜脈注射病毒液1次，50ul/只。制備10塊融合板。

融合取血清HI滴度最高的小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞相融合，先把脾臟研磨得到脾細(xì)胞懸液，然后與細(xì)胞數(shù)低十倍的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合，經(jīng)PEG1500作用1分鐘將兩種細(xì)胞融合一起，然后把融合細(xì)胞液100ml分裝到10塊96孔板中培養(yǎng)。融合培養(yǎng)基為含HAT和20％FBS的RPMI1640完全篩選培養(yǎng)基?？乖禺愋钥寺⊥ㄟ^(guò)血凝抑制(HI)實(shí)驗(yàn)篩選，經(jīng)3次克隆化后，得到穩(wěn)定的單克隆抗體細(xì)胞株。

雜交瘤的篩選融合后細(xì)胞在96孔細(xì)胞板上培養(yǎng)10天后，吸取細(xì)胞上清做血凝抑制(HI)檢測(cè)，陽(yáng)性孔繼續(xù)克隆化，直至細(xì)胞株所分泌的抗體能夠穩(wěn)定抑制Yu22株病毒與雞血發(fā)生凝集為止。

篩選結(jié)果獲得六株單克隆抗體2F2、3G4、3C8、4D1、8H5、10F7。

雜交瘤的培養(yǎng)穩(wěn)定的雜交瘤單克隆抗體細(xì)胞株先在二氧化碳培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)96孔轉(zhuǎn)移至24孔，再轉(zhuǎn)移至50ml細(xì)胞瓶經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)。然后收集細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞注射到小鼠腹腔內(nèi)，7—10天后從小鼠腹腔中吸取腹水。

單克隆抗體的純化
腹水先用50％的硫銨沉淀處理，然后對(duì)PBS，pH7.2透析，之后用DEAE柱在HPLC下純化，得到純化后的單克隆抗體，經(jīng)SDS-PAGE鑒定純化后的單克隆抗體純度。

單克隆抗體的血凝抑制實(shí)驗(yàn)活性驗(yàn)證
選用34株來(lái)源于越南、印尼、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、香港、中國(guó)和歐洲等地的屬于不同變異亞系的(Chen et al.，PNAS，103:2845，2006)H5N1病毒和14株非H5病毒(H1～H13，雞NDV)，利用血凝抑制試驗(yàn)方法(HI)鑒定所述單抗與病毒的反應(yīng)性，結(jié)果如表1和2，可見(jiàn)5株單抗均具有很好的特異性，與非H5病毒株均無(wú)反應(yīng)；而對(duì)H5病毒株的反應(yīng)，不同單抗株對(duì)不同病毒株的反應(yīng)性存在差異，除了3G4反應(yīng)譜最小外，其余的四株單抗和病毒的反應(yīng)譜基本都接近或達(dá)到100％。

表1 單抗對(duì)H5和非H5病毒的血凝抑制試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)比

表2 單抗對(duì)34株H5型病毒的血凝抑制滴度
注<，滴度小于100。

單抗對(duì)病毒的中和實(shí)驗(yàn)
利用微孔中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所述單抗對(duì)H5N1病毒的中和活性(Hulse-Post et al.PNAS，102:10682-7(，2005))，結(jié)果見(jiàn)表3，可見(jiàn)單抗8H5對(duì)所有H5N1病毒株均顯示出很好的中和活性。

表3 單抗對(duì)H5N1病毒的中和實(shí)驗(yàn)滴度

注/，無(wú)數(shù)據(jù)；<，滴度小于100
實(shí)施例2H5亞型流感病毒HA抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，ELISA)的組裝
本試劑盒使用雙抗體夾心法檢測(cè)標(biāo)本中的H5亞型流感病毒的HA抗原。首先在試劑盒的聚乙烯微孔板條上預(yù)包被抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體，當(dāng)裂解后的H5型流感病毒HA抗原加到微孔后，預(yù)包被的單克隆抗體能將其捕獲，隨后加入的酶標(biāo)單克隆抗體也能與之結(jié)合，而后通過(guò)酶催化底物顯色程度判斷結(jié)果。當(dāng)標(biāo)本中不含流感病毒抗原或不是H5型流感病毒時(shí)，底物不會(huì)顯色?？蓹z測(cè)的標(biāo)本包括排泄物、口鼻腔分泌物、雞胚培養(yǎng)的完整病毒或裂解病毒等。

酶標(biāo)板的制備
在試劑盒的聚乙烯微孔板條上預(yù)包被抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體隆抗體，單克隆抗體包被使用10mM磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.4)，在37℃下包被過(guò)夜；然后使用PBST(10mM PBS+0.05％Tween 20)洗滌一次，扣干后再加入封閉液(10mM PBS+2％明膠)，37℃封閉2小時(shí)，再扣干并真空抽干包裝成成品試劑盒酶標(biāo)板(8×12孔)。

試劑盒其它成分的配置
病毒裂解液組成 裂解液A(LB-A)6％CHAPS+2％Tween-20+1％Tween-80； 裂解液B(LB-B)100mM PMSF，使用異丙醇溶解，工作終濃度為2mM； 裂解液C(LB-C)10mM PBS，pH7.4。

酶標(biāo)試劑以HRP標(biāo)記抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體隆抗體，得到稀釋度合適的酶標(biāo)試劑
陽(yáng)性對(duì)照使用合適滴度的H5N1—Yu22株滅活病毒作為陽(yáng)性對(duì)照
陰性對(duì)照以裂解液A為陰性對(duì)照。

顯色劑A液13.4g/L Na2HPO4.12H2O+4.2g/L檸檬酸.H2O+0.3g/L過(guò)氧化氫脲； 顯色劑B液0.2mM/L四甲基聯(lián)苯胺3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine(TMB)+20mM/L二甲基甲酰胺。

終止液2M濃硫酸
濃縮洗滌液20xPBST
封板膜2張
自封袋1個(gè)
說(shuō)明書(shū)1份
檢測(cè)過(guò)程
配液將50ml濃縮液(20×)用蒸餾水或去離子水稀釋至1000ml備用
編號(hào)將樣品對(duì)應(yīng)微孔板按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照3孔，陽(yáng)性對(duì)照2孔和空白對(duì)照1孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步相同)。

樣品處理及加樣
當(dāng)樣品為液體時(shí)(包括原始標(biāo)本、雞胚培養(yǎng)標(biāo)本、細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本)按每孔需要100ul LB-A+4ul LB-B預(yù)配適量的LB-A與LB-B的混合液并振蕩混合。然后在微孔上每孔先加入100ul待測(cè)標(biāo)本，再加入100ul配好的上述裂解液進(jìn)行反應(yīng)。

當(dāng)樣品為干拭子原始標(biāo)本時(shí)取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一個(gè)標(biāo)本管中，振蕩溶解標(biāo)本，室溫靜置30分鐘后，重新振懸后，6000rpm離心5分鐘，吸取上清檢測(cè)，每孔加100ul進(jìn)行反應(yīng)。

當(dāng)樣品為干糞便原始標(biāo)本時(shí)取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一個(gè)標(biāo)本管中，將干糞便配置成10％(w/v)的糞懸液標(biāo)本，振蕩溶解標(biāo)本，室溫靜置30分鐘后，重新振懸，6000rpm離心5分鐘，吸取上清檢測(cè)，每孔加100ul進(jìn)行反應(yīng)。

每次檢測(cè)均需要設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照孔，每孔加100ul對(duì)照液。

孵育用封口膜封板后置微量振蕩器上中等速度室溫(25～28℃)震蕩60分鐘。

洗滌小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量扣干。

加酶分別在相應(yīng)孔中加入酶標(biāo)試劑100ul。

孵育用封口膜封板后，置37度溫育30分鐘。

重復(fù)步驟6
顯色每孔加入顯色劑A、B液各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色30分鐘。

測(cè)定每孔加終止液1滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)450nm(需設(shè)空白對(duì)照孔)或雙波長(zhǎng)450nm/630nm測(cè)定各孔OD值。

結(jié)果判定
a)陰性對(duì)照的正常范圍正常情況下，陰性對(duì)照孔≤0.1(陰性對(duì)照孔OD值若大于0.1應(yīng)舍棄，如果所有陰性對(duì)照孔OD值都大于0.1，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。若陰性對(duì)照孔小于0.03，則按0.03計(jì)算)。

b)陽(yáng)性對(duì)照的正常范圍正常情況下，陽(yáng)性對(duì)照孔OD值≥0.50。

c)臨界值(CUTOFF)計(jì)算陰性對(duì)照孔OD均值+0.15。

d)陽(yáng)性判定樣品OD值≥臨界值(CUTOFF)者為禽流感病毒H5型HA抗原反應(yīng)陽(yáng)性。

e)陰性判定樣品OD值<臨界值(CUTOFF)者為禽流感病毒H5型HA抗原反應(yīng)陰性。

臨床標(biāo)本測(cè)定實(shí)驗(yàn)
利用本試劑盒檢測(cè)各種H5和非H5病毒標(biāo)本，結(jié)果見(jiàn)表4，可以看出本試劑盒具有很好的檢測(cè)靈敏度和特異性。

表4 利用H5抗原ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)H5和非H5病毒標(biāo)本
注-，不確定；a，檢出陽(yáng)性數(shù)量；b，檢測(cè)樣本數(shù)量；HA滴度是計(jì)算流感病毒滴度的標(biāo)準(zhǔn)單位。

實(shí)施例3H5亞型流感病毒anti-HA抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，ELISA)的組裝
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)血清標(biāo)本中的H5型流感病毒HA抗原特異性抗體。首先在試劑盒中微孔板條上一次包被抗H5亞型流感病毒HA的單克隆抗體，二次包被H5亞型流感病毒HA基因的重組表達(dá)抗原。在加入血清標(biāo)本和酶標(biāo)單克隆抗體后，標(biāo)本中的特異性抗體與酶標(biāo)單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)板上的抗原，如果加入的血清標(biāo)本能明顯抑制酶標(biāo)單克隆抗體與抗原的結(jié)合，則表明標(biāo)本中含流感病毒H5型HA抗原的特異性抗體。當(dāng)標(biāo)本中不含流感病毒抗體或不是H5型流感病毒抗體，不會(huì)抑制酶標(biāo)單克隆抗體與抗原的反應(yīng)。

酶標(biāo)板的制備
在試劑盒的聚乙烯微孔板條上一次預(yù)包被抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體隆抗體，單克隆抗體包被使用10mM磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.4)，在37℃下包被過(guò)夜；然后使用PBST(10mM PBS+0.05％Tween 20)洗滌一次，扣干后再加入封閉液(10mMPBS+2％明膠)，37℃封閉2小時(shí)。扣干后進(jìn)行二次包被，使用10mM PBS，pH7.4溶液稀釋重組表達(dá)抗原后按每孔100ul加入到一次包被處理后的微孔板上，37℃包被2小時(shí)，洗滌一次后再37℃封閉2小時(shí)，最后扣干并真空抽干包裝成成品試劑盒酶標(biāo)板(8×12孔)。

試劑盒其它成分的配置
a)酶標(biāo)試劑以HRP標(biāo)記抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體，得到稀釋度合適的酶標(biāo)試劑。

b)陽(yáng)性對(duì)照使用合適濃度的抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。

c)陰性對(duì)照使用100％小牛血清(NBS)作為陰性對(duì)照。

d)顯色劑A液13.4g/L Na2HPO4.12H2O+4.2g/L檸檬酸水溶液+0.3g/L過(guò)氧化氫脲
e)顯色劑B液0.2mM/L四甲基聯(lián)苯胺3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine(TMB)+20mM/L二甲基甲酰胺
f)終止液2M濃硫酸
g)濃縮洗滌液20×PBST
h)封板膜2張
i)自封袋1個(gè)
j)說(shuō)明書(shū)1份
檢測(cè)過(guò)程
a)配液將50ml濃縮液(20x)用蒸餾水或去離子水稀釋至1000ml備用。

b)編號(hào)將樣品對(duì)應(yīng)微孔板按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照3孔，陽(yáng)性對(duì)照2孔和空白對(duì)照1孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步相同)。

c)加樣分別在相應(yīng)孔中加入待測(cè)樣品或陰性、陽(yáng)性對(duì)照50ul。

d)加酶在相應(yīng)孔中加入酶標(biāo)試劑50ul。

e)孵育混勻后用封口膜封板，置37度溫育60分鐘。

f)洗滌小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量扣干。

g)顯色每孔加入顯色劑A、B液各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

h)測(cè)定每孔加終止液1滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)450nm(需設(shè)空白對(duì)照孔)或雙波長(zhǎng)450nm/630nm測(cè)定各孔OD值。

結(jié)果判定
a)陰性對(duì)照的正常范圍正常情況下，陰性對(duì)照孔≥0.1。

b)陽(yáng)性對(duì)照的正常范圍正常情況下，陽(yáng)性對(duì)照孔OD值≤0.1。

c)臨界值(Cutoff值)計(jì)算Cutoff值＝陰性對(duì)照孔OD均值/2。

d)陽(yáng)性判定樣品OD值<Cutoff值判H5型流感病毒HA抗原特異性抗體陽(yáng)性。

e)陰性判定樣品OD值≥Cutoff值判H5型流感病毒HA抗原特異性抗體陰性。

臨床標(biāo)本測(cè)定實(shí)驗(yàn)
利用本H5抗體試劑盒檢測(cè)人血清和雞血清標(biāo)本，結(jié)果見(jiàn)表5，說(shuō)明本試劑盒具有很好的靈敏度和特異性。

表5 利用H5抗體ELISA試劑盒測(cè)定血清標(biāo)本
注-，未確定；a，檢出陽(yáng)性數(shù)量；b，被測(cè)樣本總數(shù)量.
實(shí)施例4H5亞型流感病毒HA抗原檢測(cè)試劑盒(金標(biāo)法)的組裝
本試紙條是采用膠體金免疫層析技術(shù)研制的新一代診斷試劑，可檢測(cè)的標(biāo)本包括排泄物、口鼻腔分泌物、雞胚培養(yǎng)的完整病毒或裂解病毒等。本品設(shè)計(jì)精巧，一次性使用，操作簡(jiǎn)便、安全、可靠、無(wú)污染，自帶質(zhì)控對(duì)照，不需任何附加試劑，顯示結(jié)果明確，反應(yīng)迅速，整個(gè)操作時(shí)間僅需30分鐘。

本試紙條分別在硝酸纖維素膜上檢測(cè)區(qū)包被anti-HA的單克隆抗體，對(duì)照區(qū)包被羊抗鼠IgG。檢測(cè)時(shí)樣品中H5型流感病毒與標(biāo)記膠體金的anti-HA單克隆抗體(Ab--Au)形成復(fù)合物(Ag-Ab-Au)，由于層析作用復(fù)合物沿膜帶移動(dòng)，可與包被在檢測(cè)區(qū)的anti-HA的單克隆抗體形成雙抗體夾心免疫復(fù)合物。如為陽(yáng)性樣品，則可分別在檢測(cè)區(qū)及對(duì)照區(qū)各凝集形成一條紅色線；如為陰性樣品，則只在對(duì)照區(qū)形成一條紅色線。

試劑盒測(cè)試條的制備同常規(guī)方法。

試劑盒組成測(cè)試條、裂解液、說(shuō)明書(shū)。

操作過(guò)程
a)樣品處理及加樣
i.樣品為液體時(shí)(包括原始標(biāo)本、雞胚培養(yǎng)標(biāo)本、細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本)
按每孔需要100ul LB-A+4ul LB-B預(yù)配適量的LB-A與LB-B的混合液并振蕩混合。然后在微孔上每孔先加入100ul待測(cè)標(biāo)本，再加入70ul配好的上述裂解液進(jìn)行反應(yīng)。

ii.樣品為干拭子原始標(biāo)本時(shí)
取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一個(gè)標(biāo)本管中，振蕩溶解標(biāo)本，室溫靜置30分鐘后，重新振懸后，6000rpm離心5分鐘，吸取上清檢測(cè)，每孔加70μl進(jìn)行反應(yīng)。

iii.樣品為干糞便原始標(biāo)本時(shí) 取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一個(gè)標(biāo)本管中，將干糞便配置成10％(w/v)的糞懸液標(biāo)本，振蕩溶解標(biāo)本，室溫靜置30分鐘后，重新振懸，6000rpm離心5分鐘，吸取上清檢測(cè)，每孔加70ul進(jìn)行反應(yīng)。

b)在加樣處緩慢加樣70ul，平置于室溫。

結(jié)果判定30分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。

出現(xiàn)兩條紅色線，認(rèn)定為陽(yáng)性；只出現(xiàn)質(zhì)控線，認(rèn)定為陰性；不出現(xiàn)紅色線，則認(rèn)定為無(wú)效，結(jié)果參見(jiàn)圖1。

實(shí)施例5H5亞型流感病毒抗·HA抗體檢測(cè)試劑盒(金標(biāo)法)的組裝
本試紙條分別在硝酸纖維素膜上檢測(cè)區(qū)包被anti-HA的單克隆抗體，對(duì)照區(qū)包被羊抗鼠IgG。玻璃纖維上凍干有anti-HA單克隆抗體標(biāo)記膠體金和H5型流感病毒重組HA表達(dá)抗原，采用競(jìng)爭(zhēng)法來(lái)檢測(cè)待測(cè)樣品中的H5型流感病毒anti-HA抗體。如樣品中含anti-H5的抗體則與anti-HA單克隆抗體標(biāo)記膠體金競(jìng)爭(zhēng)從而阻斷復(fù)合物的形成不能顯色；若為陰性，則形成復(fù)合物顯色。

試劑盒測(cè)試條的制備同常規(guī)方法。

試劑盒組成測(cè)試條、說(shuō)明書(shū)。

檢測(cè)過(guò)程
將密封袋打開(kāi)，取出所需試紙條，在加樣處緩慢加入血清樣品70ul，平置于室溫，30分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，超出30分鐘，結(jié)果無(wú)效。

結(jié)果判定
只出現(xiàn)質(zhì)控線，認(rèn)定為陽(yáng)性；出現(xiàn)兩條紅色線，認(rèn)定為陰性；不出現(xiàn)紅色線，則認(rèn)定為無(wú)效，參見(jiàn)圖2。

實(shí)施例6H5亞型流感病毒HA抗原檢測(cè)試劑盒的組裝
本試劑盒在滲慮檢測(cè)裝置的硝酸纖維素膜上的樣品檢測(cè)區(qū)預(yù)包被anti-H5(HA)的單克隆抗體和在對(duì)照區(qū)包被羊抗鼠IgG。加入經(jīng)裂解的含H5亞型流感病毒HA標(biāo)本后，預(yù)包被的單抗體將其捕獲，形成抗原抗體復(fù)合物(Ab-Ag)，隨后加入酶標(biāo)單抗(Ab-HRP)與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，最終形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物(Ab-Ag-Ab-HRP)，而后通過(guò)酶催化底物顯色進(jìn)行結(jié)果判定。當(dāng)標(biāo)本中不含H5亞型流感病毒時(shí)，檢測(cè)區(qū)不顯色，只在對(duì)照區(qū)形成一個(gè)顯色點(diǎn)。

滲漏檢測(cè)裝置的制備
硝酸纖維素膜和吸水濾紙置于一平的底部支持上。一個(gè)形狀合適的蓋子蓋在底部支持之上，后而蓋子中部有一個(gè)開(kāi)口。一個(gè)形狀合適蓋子中部開(kāi)口的流量控制單位插入開(kāi)口。該流量控制單位有二個(gè)孔分別為裝載樣品和對(duì)照。流量控制單位的底部緊緊地被按在底部支持之上以限制樣品流動(dòng)使之保持在硝化纖維素膜和濾紙上?？?H5(HA)單克隆抗體被涂在流量控制單位的測(cè)試區(qū)，而goat anti-mouse IgG被涂在流量控制單位的對(duì)照區(qū)。試紙?jiān)诳諝庵酗L(fēng)干1小時(shí)，然后包裝在真空成為滲漏檢測(cè)裝置.
試劑盒組成
a)滲慮檢測(cè)裝置
b)樣品處理裝置一個(gè)瓶子由過(guò)濾器蓋帽擰緊；過(guò)濾器蓋帽中部包含過(guò)濾器使得溶液可以解過(guò)濾通過(guò).
c)酶標(biāo)試劑以HRP標(biāo)記抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體隆抗體，得到稀釋度合適的酶標(biāo)試劑。

d)裂解液3％NP40+1％Triton X—100+40mM PBS，pH7.4。

e)洗滌液2％Triton X—100+20mM EDTA+0.25％ Tween 20+0.1％ Proclin300+150mM NaCl+5mM PBS，pH7.4。

f)顯色液3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid底物System forMembranes。

g)終止液50mM檸檬酸水溶液
h)說(shuō)明書(shū)
檢測(cè)過(guò)程
a)樣品處理及加樣 每個(gè)樣品處理裝置中加入200μl待測(cè)樣品，隨后滴加8滴裂解緩沖液，充分混勻.然后，所有裂解樣品被在樣品處理器中緊壓通過(guò)過(guò)濾器蓋帽裝入檢測(cè)孔。待樣品完全吸收后(約25分鐘)，摘掉流量控制單位。

b)洗滌加入5滴洗滌緩沖液，使之完全吸收；
c)加酶滴加4滴酶標(biāo)試劑，待酶完全滲慮干凈后反應(yīng)2分鐘；
d)洗滌分2次洗滌，第一次滴入8滴洗滌液，洗液完全滲慮干凈后再滴入5滴洗滌液，讓洗滌液滲慮干凈；
e)顯色滴加2滴顯色液，待顯色液吸干后2分鐘進(jìn)行結(jié)果判定，超過(guò)5分鐘的結(jié)果無(wú)臨床意義，結(jié)果判定示意圖參見(jiàn)圖3。

臨床標(biāo)本測(cè)定實(shí)驗(yàn)利用本H5快速檢測(cè)試劑盒測(cè)定臨床標(biāo)本，獲得表6的數(shù)據(jù)結(jié)果，顯示本試劑盒具有很好的靈敏度和特異性。

表6 利用H5抗原免疫滲慮法對(duì)臨床病毒標(biāo)本的測(cè)定
注-，未確定；a，檢出陽(yáng)性數(shù)量；b，受測(cè)樣本總數(shù)量。

實(shí)施例7單克隆抗體輕鏈基因和重鏈基因可變區(qū)的分離
半貼壁培養(yǎng)107個(gè)雜交瘤細(xì)胞，吹管吹起貼壁細(xì)胞使懸浮，轉(zhuǎn)移到新的4ml離心管中，1500rpm離心3分鐘，收集沉淀的細(xì)胞，重懸于100ul無(wú)菌PBS(pH7.45)中，轉(zhuǎn)移到一新的1.5ml離心管中。加入800ul Trizol(Roche，Germany)，輕輕顛倒混勻，靜置10分鐘。加入200ul氯仿，劇烈振蕩15s，靜置10分鐘，4℃ 12000rpm離心15分鐘，轉(zhuǎn)移上層液體至一新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，靜置10分鐘。4℃12000rpm離心10分鐘，棄上清，加入600ul 75％乙醇洗滌，4℃ 12000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀于60℃真空抽干5分鐘。透明的沉淀溶于70ul DEPC H2O中，分裝成兩管。每管加入1ul反轉(zhuǎn)錄引物，其中一管加入的反轉(zhuǎn)錄引物為MVJkR(5’-CCg TTT(T/g)AT(T/C)TC CAg CTT ggT(g/C)CC-3’)，用于擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)基因，另一管加入的反轉(zhuǎn)錄引物為MVDJhR(5’-C ggT gAC Cg(T/A)ggT(C/g/T)CC TTg(g/A)CC CCA-3’)，用于擴(kuò)增重鏈可變區(qū)基因。每管再加入1ul dNTP(上海生工)，置72℃水浴10分鐘，立即放到冰浴中置5分鐘，加入10ul 5x反轉(zhuǎn)錄緩沖液，1ul AMV(10u/ul，Pormega)，1ul Rnasin(40u/ul，Promega)，混勻后于42℃將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

抗體基因可變區(qū)的分離采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法，使用根據(jù)Novagen公司的Ig-Prime kits合成的引物組以及另外設(shè)計(jì)合成的兩條下游引物MVJkR、MVDJhR(上海博亞公司合成)，MVJkR為輕鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增的下游引物，MVDJhR為重鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增的下游引物。模板即為以上合成的兩種cDNA。PCR條件為在94℃下5分鐘，在94℃下40秒，在53℃下1分鐘，在72℃下50秒，共35次循環(huán)，在72℃下15分鐘?；厥漳康钠尾⒖寺≈羛MD 18-T載體，送至上海博亞公司測(cè)序，序列經(jīng)blast比對(duì)后確定抗體可變區(qū)序列，并推測(cè)出相應(yīng)的氨基酸序列。

依上述方法從6株禽流感單抗雜交瘤細(xì)胞株中克隆出其抗體可變區(qū)基因，并推測(cè)出相應(yīng)的氨基酸序列。表7所示為所用的上游引物序列，表8所示6株單克隆抗體可變區(qū)核甘酸和氨基酸序列編號(hào)。互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)如表9所示。表7 擴(kuò)增禽流感單抗可變區(qū)基因的上游引物序列

表8 6株單克隆抗體可變區(qū)核甘酸和氨基酸序列編號(hào)
表9 6株單克隆抗體CDR氨基酸序列


實(shí)施例8 8H5單鏈抗體的表達(dá)及活性檢測(cè)
將8H5抗體基因的重鏈和輕鏈可變區(qū)通過(guò)(GGGGS)3短肽連接成單鏈抗體DNA片段。以8H5 HF1/8H5 HR1為引物對(duì)擴(kuò)增出8H5重鏈可變區(qū)片段，以8H5 KF1/8H5 KR1為引物對(duì)擴(kuò)增出8H5輕鏈可變區(qū)片段，引物序列見(jiàn)表10。分別回收兩個(gè)片段，再以這兩個(gè)片段互為引物及模板在新的PCR系統(tǒng)中進(jìn)行重疊延伸，得到少量完整單鏈抗體片段，然后以完整片段為模板，以8H5H F1/8H5 KR1為引物進(jìn)行大量擴(kuò)增，回收單鏈抗體片段，以BamH I/Sal I酶切回收到單鏈抗體片段，克隆到相同酶切的pTO-T7原核表達(dá)載體中。以ER2566大腸桿菌作為表達(dá)菌株，采用常規(guī)方法表達(dá)，結(jié)果表達(dá)的蛋白質(zhì)是以不溶性的包涵體形式存在。以常規(guī)方法洗滌純化包涵體，結(jié)果單鏈抗體主要溶解于8M尿素中。將溶解于8M尿素中的單鏈抗體蛋白逐步對(duì)1×PBS透析復(fù)性，12000rpm離心10分鐘去除沉淀，將最終得到的初步純化的單鏈抗體溶液進(jìn)行活性測(cè)定。

表10 單鏈抗體及嵌合抗體克隆用引物



采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)初步純化出的8H5單鏈抗體的活性。在聚苯乙烯板條的孔中包被禽流感多克隆抗體，并用BSA封閉，待測(cè)孔中加入50μl上述單鏈抗體溶液以及50μl禽流感H5病毒，陰性對(duì)照孔中則加入50μl 1x PBS溶液及50μl禽流感H5病毒，陽(yáng)性對(duì)照孔中加入50μl禽流感多克隆抗體及50μl禽流感H5病毒，三孔重復(fù)。各孔稍混勻后于37℃反應(yīng)1小時(shí)后，以HRP標(biāo)記的禽流感多克隆抗體為二抗再反應(yīng)半小時(shí)，加入A、B顯色液于37℃顯色15分鐘，終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀讀數(shù)。結(jié)果陰性對(duì)照平均數(shù)值為1.871，陽(yáng)性對(duì)照平均數(shù)值為0.089，待測(cè)孔平均數(shù)值為0.597，說(shuō)明初步純化出的8H5單鏈抗體蛋白具有較高的活性。

選用26株H5N1病毒，利用血凝抑制試驗(yàn)方法(HI)鑒定所述8H5單鏈抗體與病毒的反應(yīng)性。在96孔血凝板中，每孔加入25μL PBS，在第一孔中加入25ul8H5單鏈抗體溶液(0.08mg/ml)并混勻，取25μL到第二孔，如此向后倍比稀釋。取25μl病毒加入單鏈抗體中，室溫孵育30分鐘，再加入0.5％雞紅細(xì)胞50μL，室溫孵育30分鐘，觀察紅細(xì)胞凝集。結(jié)果8H5單鏈抗體對(duì)其中的16株病毒都有HI活性(表11)。

實(shí)施例9 10F7、4D1單鏈抗體的表達(dá)及活性檢測(cè)
方法如實(shí)施例8所述，將抗體基因的重鏈和輕鏈可變區(qū)通過(guò)(GGGGS)3短肽連接成單鏈抗體DNA片段。以10F7 VHF/10F7 VHR為引物對(duì)擴(kuò)增出10F7重鏈可變區(qū)片段，以10F7 VKF/10F7 VKR為引物對(duì)擴(kuò)增出10F7輕鏈可變區(qū)片段。以4D1 VHF/4D1 VHR為引物對(duì)擴(kuò)增出4D1重鏈可變區(qū)片段，以4D1 VKF/4D1 VKR為引物對(duì)擴(kuò)增出4D1輕鏈可變區(qū)片段。

以10F7 VHF/10F7 VKR為引物進(jìn)行大量擴(kuò)增重疊的10F7單鏈抗體片段，以4D1 VHF/4D1 VKR為引物進(jìn)行大量擴(kuò)增重疊的4D1單鏈抗體片段。以BamH I/SaI I酶切回收到單鏈抗體片段，克隆到相同酶切的pT0-T7原核表達(dá)載體中。同樣以ER2566大腸桿菌作為表達(dá)菌株，表達(dá)過(guò)程同上，表達(dá)的蛋白質(zhì)以不溶性的包涵體形式存在。超聲沉淀經(jīng)相同純化過(guò)程，結(jié)果單鏈抗體主要溶解于8M尿素中。將溶解于8M尿素中的單鏈抗體蛋白逐步對(duì)1xPBS透析復(fù)性，12000rpm離心10分鐘去除沉淀，將最終得到的初步純化的單鏈抗體溶液進(jìn)行活性測(cè)定。

選用26株H5N1病毒，利用血凝抑制試驗(yàn)方法(HI)鑒定所述初步純化的10F7、4D1單鏈抗體的活性。方法同上，單鏈抗體10F7的濃度為1.06mg/ml，4D1的濃度為0.34mg/ml。結(jié)果4D1單鏈抗體對(duì)其中的23株病毒都有HI活性，10F7單鏈抗體對(duì)其中的14株病毒有血凝塑活性(表11)。

表11 三種單鏈抗體對(duì)25株H5N1禽流感病毒的血凝抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果


注HI滴度為稀釋2的n次方，n為表中數(shù)值
采用中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定初步純化的10F7單鏈抗體的活性。選取7株2002年至2006年期間，在香港、印尼、青海等地，從雞、鴨及數(shù)種野生鳥(niǎo)類中分離到的毒株，利用血凝抑制實(shí)驗(yàn)鑒定所述10F7單鏈抗體于病毒的反應(yīng)性，結(jié)果該單鏈抗體對(duì)其中5株病毒都表現(xiàn)出了較好的中和活性(見(jiàn)表12)。針對(duì)Ck/HK/Yu22/02毒株，scFv經(jīng)64倍稀釋后仍然能夠抑制病毒感染細(xì)胞。

表12 10F7 scFv中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例10 嵌合抗體的表達(dá)及活性檢測(cè)
將4D1、10F7和8H5單抗的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因，分別加上信號(hào)肽序列，再克隆到含有人gamma 1重鏈和kappa輕鏈恒定區(qū)序列的真核表達(dá)質(zhì)粒中。其中pcDNA3.1-AH含有人gamma 1重鏈恒定區(qū)序列，pcDNA3.1-Ak含有人輕鏈kappa恒定區(qū)序列。

以8H58CHF1/8H5VHR為引物對(duì)擴(kuò)增出8H5部分重鏈信號(hào)肽序列及可變區(qū)片段，以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板，8H58CHF2/8H5VHR為引物對(duì)，擴(kuò)增出帶完整信號(hào)肽的8H5重鏈可變區(qū)序列，克隆至Bam H I/Xho I雙酶切的pcDNA3.1-AH質(zhì)粒，從而獲得表達(dá)人鼠嵌合重鏈的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-AH8H5。以8H58CKF1/8H5VKR1為引物對(duì)擴(kuò)增出8H5部分輕鏈信號(hào)肽序列及可變區(qū)片段，以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板，8H58CKF2/8H5VKR1為引物對(duì)擴(kuò)增出帶完整信號(hào)肽序列的8H5輕鏈可變區(qū)片段，克隆至EcoR I/Xho I雙酶切的pcDNA3.1-Ak質(zhì)粒，從而獲得表達(dá)人鼠嵌合輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Ak8H5。

以10F78CHF1/10F7VHR為引物對(duì)擴(kuò)增出10F7部分重鏈信號(hào)肽序列及可變區(qū)片段，以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板，10F78CHF2/10F7VHR為引物對(duì)，擴(kuò)增出帶完整信號(hào)肽的10F7重鏈可變區(qū)序列，克隆至Bam H I/Xho I雙酶切的pcDNA3.1-AH質(zhì)粒，從而獲得表達(dá)人鼠嵌合重鏈的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-AH10F7。以10F78CKF1/10F7VKR為引物對(duì)擴(kuò)增出10F7部分輕鏈信號(hào)肽序列及可變區(qū)片段，以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板，10F78CKF2/10F7VKR為引物對(duì)擴(kuò)增出帶完整信號(hào)肽序列的10F7輕鏈可變區(qū)序列，克隆至EcoR I/Xho I雙酶切的pcDNA3.1-Ak質(zhì)粒，從而獲得表達(dá)人鼠嵌合輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Ak10F7。

以4D1VH F1/4D1VHR為引物對(duì)擴(kuò)增出4D1部分重鏈信號(hào)肽序列及可變區(qū)片段，以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板，4D1VHF2/4D1VHR為引物對(duì)，擴(kuò)增出帶完整信號(hào)肽的4D1重鏈可變區(qū)序列，克隆至Bam H I/Xho I雙酶切的pcDNA3.1-AH質(zhì)粒，獲得表達(dá)人鼠嵌合重鏈的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-AH4D1。以4D1VKF/4D1VKR為引物對(duì)擴(kuò)增出4D1輕鏈信號(hào)肽序列及可變區(qū)片段，克隆至EcoR I/Xho I雙酶切的pcDNA3.1-Ak質(zhì)粒，從而獲得表達(dá)人鼠嵌合輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Ak4D1。

圖4為3種嵌合抗體的表達(dá)質(zhì)粒圖。

通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將含嵌合重鏈和嵌合輕鏈的雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清，經(jīng)飽和硫銨沉淀獲得初步純化的嵌合抗體(cAb)。調(diào)整嵌合抗體和鼠單抗(mAb)的初始濃度至0.7ug/ml，用Ck/HK/Yu22/02毒株進(jìn)行血凝抑制HI活性檢測(cè)，結(jié)果表明，三種嵌合抗體的HI活性均與相應(yīng)鼠單抗一致(圖5)。

選用23株H5N1病毒，利用血凝抑制試驗(yàn)方法(HI)鑒定所述初步純化的10F7、4D1嵌合抗體的活性，方法同上。結(jié)果兩種嵌合抗體對(duì)這23株病毒都有HI活性(表13)。

表13 兩種嵌合抗體對(duì)23株H5N1禽流感病毒的HI結(jié)果


進(jìn)一步采用免疫熒光方法測(cè)定cAb的活性。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中放置蓋玻片，在其中培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞SF21，通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在SF21細(xì)胞中表達(dá)禽流感病毒的HA蛋白。表達(dá)后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)PBS洗滌，4％多聚甲醛固定，山羊多抗血清封閉后，與4D1或10F7嵌合抗體室溫孵育1小時(shí)，以HBV特異的人鼠嵌合抗體為陰性對(duì)照。以熒光標(biāo)記的羊抗人抗體(Sigma，St.Louis，MO，USA)為二抗，室溫反應(yīng)半小時(shí)，取DAPI(Sigma，St.Louis，MO，USA)染細(xì)胞核，室溫10分鐘，然后制片于正置熒光顯微鏡(Nikon)下觀察。由圖6的結(jié)果可知，4D1、10F7嵌合抗體均能特異地與SF21細(xì)胞中表達(dá)禽流感病毒的HA蛋白結(jié)合。

實(shí)施例11 從噬菌體7肽庫(kù)中篩選模擬單克隆抗體識(shí)別表位的短肽
選用New England Biolabs公司的7肽噬菌體展示文庫(kù)(ph.D.C7C peptidelibrary)篩選與單克隆抗體8H5、3C8結(jié)合的7肽，按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。大體如下
吸取50μl Protein A-瓊脂糖介質(zhì)(50％的水懸液)于微量離心管中，加1ml TBS+0.1％ Tween(TBST)溶液。輕彈管壁或溫和震蕩重懸介質(zhì)。低速離心30秒，沉淀介質(zhì)，小心吸去上清。介質(zhì)重懸于1ml封阻緩沖液中，4℃作用60分鐘，偶爾混勻。在此期間，用TBS緩沖液將2×1011個(gè)噬菌體粒子(相當(dāng)于10μl的原始文庫(kù))和300ng抗體稀釋至終體積200μl，抗體終濃度為10nM。室溫作用20分鐘。封阻反應(yīng)后，低速離心沉淀介質(zhì)，并用1ml TBS洗4次，每次均需沉淀介質(zhì)。將噬菌體-抗體混合物加入洗過(guò)的介質(zhì)中，溫和混勻，室溫作用15分鐘并不時(shí)混勻。低速離心沉淀介質(zhì)，棄上清，用1ml TBTS洗10次。重懸沉淀介質(zhì)于1ml 0.2M的Glycine-HCl(pH 2.2)，1mg/ml BSA中，室溫作用10分鐘，洗脫結(jié)合的噬菌體。離心洗脫混合液1分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)入另一新的微量離心管中。立即用150μl 1M Tris-HCl，pH 9.1的緩沖液中和洗脫液。取出約1μL滴定噬菌體滴度。將剩余的噬菌體溶液加入20mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期的ER2738宿主菌液中，37℃震蕩培養(yǎng)4.5小時(shí)。將菌液移入50mL離心管中，10000rpm離心20分鐘。吸取上部80％上清，加入1/6體積的PEG/NaCl(20％PEG-8000，2.5M NaCl)溶液，4℃靜置1小時(shí)。10000rpm 4℃離心15分鐘。倒掉上清，用1mL PBS溶解沉淀噬菌體。4℃離心5分鐘，吸取上清，加入1/6體積的PEG/NaCl溶液，4℃靜置1小時(shí)。10000rpm 4℃離心15分鐘。倒掉上清，用200μL PBS溶解沉淀噬菌體，4℃保存。重復(fù)上述步驟，進(jìn)行再一輪的篩選。

將過(guò)夜培養(yǎng)的ER2738宿主菌按照1:10的比例稀釋到LB培養(yǎng)基中，并將菌液分裝到培養(yǎng)管中(1mL/管)。每種單克隆抗體挑取10個(gè)經(jīng)過(guò)3輪篩選的LB/IPTG/Xgal培養(yǎng)板上蘭色的噬菌斑單克隆，接種到上述菌液中。37℃震蕩培養(yǎng)4.5小時(shí)。將菌液移到1.5mL離心管中，10000g離心后，取200ul上清保存，余下的按照小量M13抽提純化試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)操作手冊(cè)提取ssDNA。經(jīng)上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，獲知插入的7肽序列如表14。

表14 與單克隆抗體8H5、3C8結(jié)合的7肽序列(核苷酸序列SEQ ID Nos 13，14和15分別為氨基酸序列SEQ ID Nos 64，68和70的編碼序列)。


實(shí)施例12噬菌體7肽的活性檢測(cè)
將含有8H5A、8H5E、3C8A7肽的三種噬菌體進(jìn)行大量擴(kuò)增，經(jīng)PEG沉淀后，溶于PBS，測(cè)定滴度為1011-1012之間。以5ug/ml濃度分別包被4種鼠單抗8H5、4A1、9N7、4D11，5％脫脂奶PBS封閉。將分別加入進(jìn)行梯度稀釋后的三種噬菌體，反應(yīng)1小時(shí)后，洗滌5次，加入15000羊抗M13酶標(biāo)抗體(Amersham Pharmarcia Biotech，UK)，反應(yīng)半小時(shí)后讀數(shù)。結(jié)果如表15所示，可知8H5A與8H5單抗的反應(yīng)具有較好的特異性，而與其它三種單抗的反應(yīng)性很弱。8H5E對(duì)8H5單抗的特異反應(yīng)性較差。

表15 噬菌體7肽的特異性結(jié)合活性檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例13 從噬菌體12肽庫(kù)中篩選模擬8H5識(shí)別表位的短肽
選用New England Biolabs公司的12肽噬菌體展示文庫(kù)(ph.D.12pe ptide library)篩選與單克隆抗體8H5結(jié)合的12肽，按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行篩選。具體步驟參照實(shí)施例11。

第三輪篩選后，取出約1ul洗脫下來(lái)的噬菌體進(jìn)行滴定。挑取單一噬菌體空斑至對(duì)數(shù)期的ER2738菌中，37℃培養(yǎng)4.5～5小時(shí)，離心收集噬菌體上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。包被10ug/ml濃度的鼠單抗8H5，以噬菌體上清為一抗，Anti-M13/HRP抗體(AmershamPhmarcia Biotech，UK)以1:5000稀釋為二抗，取禽流感相關(guān)抗體4D1mAb、10F7mAb以及抗HEV E2蛋白的不相關(guān)抗體8C11mAb為鼠單抗對(duì)照。圖7顯示其中較好的12個(gè)噬菌體多肽的檢測(cè)結(jié)果。由圖中結(jié)果可知，大部分噬菌體肽針對(duì)目標(biāo)抗體8H5的讀值高于對(duì)照抗體3倍以上，有較好的特異性。

根據(jù)噬菌體ssDNA抽提試劑盒(Omega，USA)的常規(guī)操作抽提DNA，以該DNA模板進(jìn)行測(cè)序(Invitrogen，Shanghai，China)，獲得以上12株噬菌體展示12肽的核苷酸及氨基酸序列(見(jiàn)表16)。

表16 與單抗隆抗體8H5結(jié)合的12肽序列


實(shí)施例14.12肽123和125與239蛋白融合表達(dá)及活性檢測(cè)
239-123和239-125融合表達(dá)載體的構(gòu)建
本實(shí)驗(yàn)室在大腸桿菌中表達(dá)了HEV ORF2的一個(gè)片段(a.a.368—606)，獲得的重組蛋白239可組裝成為類病毒顆粒，具有良好的免疫原性。我們通過(guò)PCR方法，構(gòu)建出239序列的C端融合12肽序列的原核表達(dá)載體pTO-T7-239-123(圖8)和pTO-T7-239-125(圖9)。首先，針對(duì)239序列和12肽序列設(shè)計(jì)引物(表17)，以239基因?yàn)槟０?，?yīng)用引物239-123F/239-123R1和239-125F/239-125R1進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物回收、純化后作為模板，應(yīng)用引物239-123F/239-123R2和239-125F/239-125R2進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出239-123和239-125片段。然后，分別回收PCR產(chǎn)物239-123和239-125，Nde I和EcoR I雙酶切后克隆入載體pTO-T7中。連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566，小量表達(dá)及質(zhì)粒酶切鑒定，陽(yáng)性克隆即為重組原核表達(dá)載體pTO-T7-239-123和pTO-T7-239-125。

表17 239-123和239-125克隆引物序列

239-123和239-125融合蛋白的表達(dá)和純化
挑取轉(zhuǎn)化pTO-T7-239-123或pTO-T7-239-125質(zhì)粒的ER2566單菌落，于2mL含有Kn抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600約0.5，然后按照11000的比例轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)至500mL LB(含有Kn抗性)中，培養(yǎng)至OD600約1.0時(shí)，加入IPTG 500μL，37℃誘導(dǎo)4小時(shí)。4℃下收集菌體，8000rpm離心10分鐘。棄上清，菌體沉淀用20mL/瓶的裂解液重懸。冰水浴，采用超聲破碎儀處理破碎細(xì)胞。超聲條件如下工作時(shí)間10分鐘；脈沖打2秒鐘，停5秒鐘；輸出功率70％。12000rpm離心10分鐘，保留上清，沉淀用20mL 2％Triton重懸，震蕩30分鐘。12000rpm離心10分鐘，保留上清，沉淀用20mL Buffer I重懸，震蕩30分鐘。重復(fù)Triton/Buffer I處理一次。12000rpm離心10分鐘，保留上清，沉淀用20mL 2M Urea/Buffer I重懸，震蕩30分鐘。12000rpm離心10分鐘，保留上清，沉淀用20mL 4M Urea/Buffer I重懸，震蕩30分鐘。12000rpm離心10分鐘，保留上清，沉淀用20mL 8M Urea/Buffer I重懸，震蕩30分鐘。12000rpm離心10分鐘，保留上清。各保留上清制成蛋白上樣樣品以進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖10、圖11)。由SDS-PAGE分析得知，蛋白主要溶解于8M Urea中，純度可達(dá)90％。將8M Urea中的蛋白梯度透析至PBS中(8M Urea-4M Urea-2M Urea-PBS)。

239-123和239-125融合蛋白的活性檢測(cè)
直接ELISA法檢測(cè)
初步純化的239-123和239-125融合蛋白以10μg/mL的濃度包被96孔板，37℃2小時(shí)。洗板1次，ED封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37℃2小時(shí)后4℃過(guò)夜。去封閉液后，每孔加入100μL不同的鼠單抗，包括8C11、7H8、3C8、8H5、1A6、13E1、1D8、1G2、3G41、13A2、11H8、4D1、10HD4、14H12、6CF3、7D1、7E8、10DE2、16A12、3FC1、8E2、3D2、10D122、13E7共24株單抗。其中8C11為239蛋白特異單抗，8H5為12肽篩選所用單抗，其余22株單抗為針對(duì)禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)單抗。37℃孵育1小時(shí)。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(110000)100μL，37℃孵育30分鐘。PBST洗板5次，加入顯色液顯色10分鐘，終止液終止，酶標(biāo)儀讀值。由圖12、圖13結(jié)果可知，239-123和239-125融合蛋白只與抗體8C11和8H5反應(yīng)，與其它單抗均無(wú)反應(yīng)。說(shuō)明239-123和239-125融合蛋白的反應(yīng)特異性非常好。

實(shí)施例15 12肽123和125與HBV cAg蛋白融合表達(dá)
融合表達(dá)載體的構(gòu)建
利用HBVcAg的a.a.1-149在大腸桿菌中能以類病毒顆粒形式表達(dá)的性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)室將該149個(gè)氨基酸插入大腸桿菌表達(dá)載體pTO-T7中，并以連接子替代HBVcAg B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位區(qū)段的第79、80兩個(gè)氨基酸，構(gòu)建了突變型HBVcAg表達(dá)質(zhì)粒pC149-mut。HBVcAg有著很強(qiáng)的T細(xì)胞免疫原性，外源多肽在HBVcAg內(nèi)部MIR(mayorimmunodominant region，a.a.78-83)的融合不會(huì)改變其顆粒的多聚特性，且可使外源表位暴露于顆粒表面。

將123和125分別以1至5個(gè)拷貝插入HBcAg的第79和80位氨基酸，得到系列融合蛋白，分別統(tǒng)稱為HBc-123、HBc-125。根據(jù)12肽序列，以及pC149-mut的載體序列，分別設(shè)計(jì)含12肽序列的正向引物及通用反向引物149MRP(表18，下劃線表示插入的多肽序列)。以pC149-mut為模板，應(yīng)用引物HBc123F2/HBcR和HBc123F2/HBcR進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物回收、純化后作為模板，應(yīng)用引物HBc123F1/HBcR和HBc123F1/HBcR進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出連有12肽序列的C149 a.a.81-149，經(jīng)BgI II和EcoR I酶切后回收純化得到片段。同時(shí)以BamH I和EcoR I雙酶切載體pC149-MUT，回收載體后與片段連接。連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566進(jìn)行表達(dá)鑒定及質(zhì)粒酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒即插入了一個(gè)12肽，分別命名為pC149-mut-123和pC149-mut-125。此質(zhì)粒再用BamH I和EcoR I雙酶切得載體，與之前經(jīng)BgI II和EcoR I酶切的含有12肽序列的片斷連接，陽(yáng)性克隆即為含有2個(gè)12肽拷貝數(shù)的重組原核表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為pC149-mut-D123和pC149-mut-D125。用類似方法，構(gòu)建出分別含有3個(gè)拷貝、4個(gè)拷貝及5個(gè)拷貝數(shù)的重組原核表達(dá)載體pC149-mut-T123、pC149-mut-F123、pC149-mut-Q123和pC149-mut-T125、pC149-mut-F125、pC149-mut-Q125。構(gòu)建質(zhì)粒圖如圖15、圖16所示(僅以pC149-mut-123和pC149-mut-125為例)。

表18 123、125與HBV cAg融合蛋白表達(dá)的克隆引物序列

備注下劃線為12肽序列。

融合蛋白的表達(dá)及純化
將pC149-mut-D123、pC149-mut-T123、pC149-mut-F123、pC149-mut-Q123、pC149-mut-D125、pC149-mut-T125、pC149-mut-F125、pC149-mut-Q125表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)出來(lái)的融合蛋白分別稱為D123、T123、F123、Q123、D125、T125、F125、Q125。分別將含有八種表達(dá)質(zhì)粒的ER2566菌種，接種于2mL含有Kn抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600約0.5，然后按照11000的比例轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)至500mL LB(含有Kn抗性)中，培養(yǎng)至OD600約0.8時(shí)，加入IPTG 500μL，18℃誘導(dǎo)20小時(shí)。4℃下收集菌體，8000rpm離心10分鐘。棄上清，菌體沉淀用20mL/瓶的裂解液重懸。冰水浴，采用超聲破碎儀處理破碎細(xì)胞。超聲條件如下工作時(shí)間10分鐘；脈沖打2秒鐘，停5秒鐘；輸出功率70％。12000rpm離心10分鐘，保留上清。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，所有融合蛋白主要表達(dá)在上清中(圖17)。

由于上清表達(dá)蛋白比較雜，故需要對(duì)其進(jìn)行純化。并且此類蛋白在適宜的條件下可以自發(fā)組裝形成顆粒，所以對(duì)蛋白進(jìn)行純化的同時(shí)，應(yīng)考慮其自發(fā)組裝形成顆粒的條件。我們采用以下方法對(duì)蛋白進(jìn)行純化以及促進(jìn)蛋白自發(fā)組裝形成顆粒以總體積20％的量加入飽和硫酸銨進(jìn)行蛋白沉淀，冰浴反應(yīng)30分鐘。12000rpm離心10分鐘，棄上清。沉淀用含有5％β-巰基乙醇的CB Buffer吹起，37℃震蕩30分鐘，12000rpm離心10分鐘，上清透析至PB5.8(含有300mM NaCl和50mM EDTA)的緩沖液體系中。每8小時(shí)換液一次，換液6次后收集透析液，12000rpm離心10分鐘，上清樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定純度。此方法中，先以20％飽和硫酸銨對(duì)蛋白進(jìn)行初步純化，再以含有5％β-巰基乙醇的CB Buffer促使蛋白形成顆粒組裝引發(fā)二聚體，然后在低PH值及高鹽的條件下促進(jìn)蛋白自發(fā)組裝形成顆粒。同時(shí)此條件下，目的蛋白可以得到進(jìn)一步的純化(圖18)。

以上表達(dá)的8種融合蛋白均以上述方法初步純化后，樣品用2％磷酸鎢負(fù)染，直接進(jìn)行電鏡觀察(圖19)。組裝成功的顆粒呈均勻的空心球形(部分顆粒為實(shí)心狀)，有大小兩種，直徑分別約為35nm及20nm。

實(shí)施例16ELISA檢測(cè)HBc-123和HBc-125融合蛋白活性
將八種融合蛋白分別以10μg/mL的濃度包被96孔板，37℃2小時(shí)。洗板1次，ED封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37℃2小時(shí)后4℃過(guò)夜。每孔加入100μL8H5抗體，37℃孵育1小時(shí)。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(110000)100μL，37℃孵育30分鐘。PBST洗板5次，加入顯色液顯色10分鐘，終止液終止，酶標(biāo)儀讀值。由圖20的結(jié)果可知，八種融合蛋白均具有與8H5抗體結(jié)合的活性。

以Q123和D125蛋白為例，進(jìn)行抗體特異性的檢測(cè)。10μg/mL的蛋白濃度包被96孔板，37℃2小時(shí)。洗板1次，ED封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37℃2小時(shí)后4℃過(guò)夜。每孔加入100μL不同抗體，包括8H5、8G9、3C8、4D1、10F7、1G2、3D2、3CF1、7D1、6CF3、7H8、10DE2、13E7、16A12共14株單抗。其中8H5為12肽篩選所用單抗，其余13株單抗為針對(duì)禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)單抗，37℃孵育1小時(shí)。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(110000)100μL，37℃孵育30分鐘。PBST洗板5次，加入顯色液顯色10分鐘，終止液終止，酶標(biāo)儀讀值。對(duì)ELISA結(jié)果分析(圖21)，Q123和D125融合蛋白只與抗體8H5反應(yīng)，與其它禽流感單抗均無(wú)反應(yīng)。說(shuō)明Q123和D125融合蛋白的反應(yīng)特異性非常好。

實(shí)施例17 HBc-123和HBc-125融合蛋白的免疫源性分析
將上述經(jīng)過(guò)純化的八種HBc-123和HBc-125融合蛋白分別與等體積的福氏佐劑混合(初次免疫時(shí)與完全福氏佐劑混合，加強(qiáng)免疫時(shí)與不完全福氏佐劑混合)，以肌肉多點(diǎn)注射的方式，免疫BALB/c小鼠，每只小鼠的免疫量為100μg蛋白，3—4只小鼠為一組。初次免疫后，每隔一周加強(qiáng)免疫一次，同時(shí)采取眼球血。進(jìn)行抗血清分離將血懸液置37℃2小時(shí)，再移入4℃過(guò)夜，令血球凝集。4000g離心10分鐘，吸取上清，即得到抗血清。存放于-4℃?zhèn)溆谩?br>
以1μg/孔包被239-123和239-125融合蛋白，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為酶標(biāo)二抗，建立抗12肽123或125特異抗體檢測(cè)的間接法ELISA，用來(lái)檢測(cè)動(dòng)物抗血清的123肽或125肽特異抗體與12肽反應(yīng)性以及抗體產(chǎn)生滴度情況。HBc-123的各融合蛋白免疫血清以11000稀釋后，ELISA檢測(cè)結(jié)果如圖22。HBc-125的各融合蛋白免疫血清以12000稀釋后，ELISA檢測(cè)結(jié)果如圖23。

實(shí)施例18 免疫小鼠血清的免疫熒光檢測(cè)
在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中放置蓋玻片，在其中培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞SF21，通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞一桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在SF21細(xì)胞中表達(dá)禽流感病毒的HA蛋白。表達(dá)后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)PBS洗滌，4％多聚甲醛固定，山羊多抗血清封閉后，與1:20稀釋的T123和F125免疫鼠血清室溫孵育1小時(shí)，以HBc免疫鼠血清為陰性對(duì)照。以熒光標(biāo)記的羊抗鼠抗體(Sigma，St.Louis，MO，USA)為二抗，室溫反應(yīng)半小時(shí)，取DAPI(Sigma，St.Louis，MO，USA)染細(xì)胞核，室溫10分鐘，然后制片于正置熒光顯微鏡(Nikon)下觀察。由圖24的結(jié)果可知，T123和F125免疫鼠血清均能特異地與SF21細(xì)胞中表達(dá)禽流感病毒的HA蛋白結(jié)合。進(jìn)一步表明123和125較好的模擬了HA的抗原表位。

實(shí)施例19 12肽122、124、128、129與HBV cAg蛋白融合表達(dá)及活性檢測(cè)
4種12肽122、124、128、129，分別以兩個(gè)拷貝插入HBV cAg蛋白中，得到的融合蛋白分別稱為HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129。

HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法與HBc-123、HBc-125融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法相同，所用引物如表19。第一輪的上游引物為F3，第二輪的上游引物為F2，第三輪的上游引物為F1，下游引物均為HBcR。通過(guò)3輪PCR，將目的12肽片斷與C149-mut片段相連，并以Bg II和EcoR I雙酶切后，與BamH I和EcoR I雙酶切的pC149-mut載體連接，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒(具體方法詳見(jiàn)實(shí)施例15)。

表19 HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白克隆引物序列


HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白表達(dá)和純化與上述HBc-123、HBc-125融合蛋白的表達(dá)、純化方法相同(具體方法詳見(jiàn)實(shí)施例15)。HBc與12肽融合蛋白的表達(dá)情況以及顆粒組裝情況如表20所示。顆粒的電鏡觀察圖片如圖25。

表20 HBc與12肽融合蛋白的表達(dá)及VLP形成


間接ELISA檢測(cè)HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白活性。

HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白以10μg/mL的濃度包被96孔板，37℃ 2小時(shí)。洗板1次，ED封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37℃ 2小時(shí)后4℃過(guò)夜。每孔加入100μL不同抗體，包括8H5、8G9、3C8、1G2、3D2、3CF1、7D1、6CF3、7H8、10DE2、13E7、16A12共12株單抗。其中8H5為12肽篩選所用單抗，其余11株單抗為針對(duì)禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)單抗，37℃孵育1小時(shí)。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(110000)100μL，37℃孵育30分鐘。PBST洗板5次，加入顯色液顯色10分鐘，終止液終止，酶標(biāo)儀讀值。由圖26的結(jié)果可知，HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白只與抗體8H5反應(yīng)，與其它禽流感單抗均無(wú)反應(yīng)，說(shuō)明HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白與8H5單抗的反應(yīng)特異性非常好。

實(shí)施例20 展示12肽的類病毒顆粒與禽流感病毒的競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)
取禽流感病毒H5N1特異鼠單抗2F2以10ug/ml包板，病毒株Ck/HK/Yu22/02以1:40稀釋后加入孔板中孵育，37℃，1小時(shí)；棄去孔中病毒，將10ug初純的類病毒顆粒與1:1000稀釋的8H5/HRP共同加入孔板中孵育，37℃，30分鐘。126和127并不與H5單抗結(jié)合，但同樣展示于VLP上作為陰性對(duì)照，另又以PBS為不加VLP的陰性對(duì)照。結(jié)果如圖27所示，上述5個(gè)待測(cè)的類病毒顆粒均能與病毒競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合8H5酶標(biāo)抗體，進(jìn)一步提示這5個(gè)12肽均有可能模擬了8H5抗原表位的部分空間結(jié)構(gòu)。
序列表
<110>HX診斷公司
　　 夏寧邵
陳毅歆
葛勝祥
羅文新
張軍
<120>H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體或其結(jié)合活性片段及其用途
<130>62682.8001.WO00
<140>PCT/US2007/002491
<141>2007-01-26
<150>中國(guó)專利申請(qǐng)200610002312.1
<151>2006-01-26
<160>27
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>363
<212>DNA
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<400>1
<210>2
<211>121
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<210>3
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<211>108
<212>PRT
<213>2F2 VK Amino Acid sequence
<400>2權(quán)利要求
1、一種能特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體包括選自于如下一組的可變重鏈:
(i)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:28-30的CDR的可變重鏈；
(ii)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:34-36的CDR的可變重鏈；
(iii)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:40-42的CDR的可變重鏈；
(iv)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:46-48的CDR的可變重鏈；
(v)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:52-54的CDR的可變重鏈；以及
(vi)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:58-60的CDR的可變重鏈。
2、如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中，所述的可變重鏈包括選自于如下一組的氨基酸序列:
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:25。
3、如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其進(jìn)一步包括選自于如下一組的可變輕鏈:
(i)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:31-33的CDR的可變輕鏈；
(ii)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:37-39的CDR的可變輕鏈；
(iii)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:43-45的CDR的可變輕鏈；
(iv)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:49-51的CDR的可變輕鏈；以及
(v)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:61-63的CDR的可變輕鏈。
4、如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，其中，所述的可變輕鏈包括選自于如下一組的氨基酸序列:
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27。
5、如權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其進(jìn)一步包括選自于如下一組的可變輕鏈:
(i)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:31-33的CDR的可變輕鏈；
(ii)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:37-39的CDR的可變輕鏈；
(iii)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:43-45的CDR的可變輕鏈；
(iv)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:49-51的CDR的可變輕鏈；以及
(v)包含一個(gè)或多個(gè)、氨基酸序列為SEQ ID NOs:61-63的CDR的可變輕鏈。
6、如權(quán)利要求5所述的單克隆抗體，其中，所述的可變輕鏈包括選自于如下一組的氨基酸序列:
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27。
7、如權(quán)利要求6所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體為Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv。
8、如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體為Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
9、如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素的KD值小于1×10-5M。
10、如權(quán)利要求9所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素的KD值小于1×10-6M。
11、如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體包括非-CDR區(qū)，該非-CDR區(qū)是來(lái)自不是鼠類的物種。
12、如權(quán)利要求11所述的單克隆抗體，其中，所述的非-CDR區(qū)是來(lái)自人類的抗體。
13、如權(quán)利要求12所述的單克隆抗體，其中，所述的人類非-CDR區(qū)具有一個(gè)或多個(gè)來(lái)自鼠抗體的取代氨基酸。
14、一種能特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體包括選自于如下一組的單克隆抗體:
(i)雜交瘤細(xì)胞株8H5所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株8H5的保藏號(hào)是CCTCC-C200607；
(ii)雜交瘤細(xì)胞株3C8所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株3C8的保藏號(hào)是CCTCC-C200605；
(iii)雜交瘤細(xì)胞株10F7所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株10F7的保藏號(hào)是CCTCC-C200608；
(iv)雜交瘤細(xì)胞株4D1所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株4D1的保藏號(hào)是CCTCC-C200606；
(v)雜交瘤細(xì)胞株3G4所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株3G4的保藏號(hào)是CCTCC-C200604；以及
(vi)雜交瘤細(xì)胞株2F2所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株2F2的保藏號(hào)是CCTCC-C200424。
15、一種雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株選自于如下一組的雜交瘤細(xì)胞株:
(i)保藏號(hào)為CCTCC-C200607的雜交瘤細(xì)胞株8H5；
(ii)保藏號(hào)為CCTCC-C200605的雜交瘤細(xì)胞株3C8；
(iii)保藏號(hào)為CCTCC-C200608的雜交瘤細(xì)胞株10F7；
(iv)保藏號(hào)為CCTCC-C200606的雜交瘤細(xì)胞株4D1；
(v)保藏號(hào)為CCTCC-C200604的雜交瘤細(xì)胞株3G4；以及
(vi)保藏號(hào)為CCTCC-C200424的雜交瘤細(xì)胞株2F2。
16、一種能特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體能夠封閉所述的血凝素蛋白與選自于如下一組單克隆抗體相結(jié)合的活性的至少50％:
(i)雜交瘤細(xì)胞株8H5所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株8H5的保藏號(hào)是CCTCC-C200607；
(ii)雜交瘤細(xì)胞株3C8所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株3C8的保藏號(hào)是CCTCC-C200605；
(iii)雜交瘤細(xì)胞株10F7所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株10F7的保藏號(hào)是CCTCC-C200608；
(iv)雜交瘤細(xì)胞株4D1所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株4D1的保藏號(hào)是CCTCC-C200606；
(v)雜交瘤細(xì)胞株3G4所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株3G4的保藏號(hào)是CCTCC-C200604；以及
(vi)雜交瘤細(xì)胞株2F2所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株2F2的保藏號(hào)是CCTCC-C200424。
17、如權(quán)利要求16所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體封閉所述的血凝素蛋白結(jié)合活性的至少70％。
18、如權(quán)利要求17所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體封閉所述的血凝素蛋白結(jié)合活性的至少90％。
19、一種分離的核酸分子，其包含能夠編碼抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列，而所述的抗體重鏈可變區(qū)則包含選自于如下一組的氨基酸序列:
(i)SEQ ID NOs:28-30；
(ii)SEQ ID NOs:34-36；
(iii)SEQ ID NOs:40-42；
(iv)SEQ ID NOs:46-48；
(v)SEQ ID NOs:52-54；以及
(vi)SEQ ID NOs:58-60。
20、如權(quán)利要求19所述的分離的核酸分子，其中，所述的重鏈可變區(qū)包含選自于如下一組的氨基酸序列:
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21和SEQID NO:25。
21、如權(quán)利要求20所述的分離的核酸分子，其中，所述的核酸分子包括選自于如下一組的核酸序列:
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20和SEQID NO:24。
22、一種包含如權(quán)利要求19所述的核酸分子的表達(dá)載體。
23、一種包含如權(quán)利要求22所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
24、一種分離的核酸分子，其包含能夠編碼抗體輕鏈可變區(qū)的核酸序列，而所述的抗體輕鏈可變區(qū)則包含選自于如下一組的氨基酸序列:
(i)SEQ ID NOs:31-33；
(ii)SEQ ID NOs:37-39；
(iii)SEQ ID NOs:43-45；
(iv)SEQ ID NOs:49-51；以及
(v)SEQ ID NOs:61-63。
25、如權(quán)利要求24所述的分離的核酸分子，其中，所述的重鏈可變區(qū)包含選自于如下一組的氨基酸序列:
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27。
26、如權(quán)利要求25所述的分離的核酸分子，其中，所述的核酸分子包括選自于如下一組的核酸序列:
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:26。
27、一種包含如權(quán)利要求26所述的核酸分子的表達(dá)載體。
28、一種包含如權(quán)利要求27所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
29、一種檢測(cè)樣品中H5亞型禽流感病毒的方法，其包括如下步驟:
a)將所述的樣品與權(quán)利要求1中的單克隆抗體進(jìn)行接觸；
b)檢測(cè)所述的單克隆抗體與所述病毒的反應(yīng)。
30、如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述的單克隆抗體附著在固相上。
31、如權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述的固相選自于如下一組:微滴定板、磁顆粒、膠乳顆粒和硝化纖維素膜。
32、如權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述的單克隆抗體是按如此方向附著在所述固相上，其能夠增加所述單克隆抗體與所述樣品的結(jié)合效率。
33、如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述的單克隆抗體是通過(guò)其恒定區(qū)域而附著在所述固相上的。
34、如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述的反應(yīng)是通過(guò)酶顯色進(jìn)行測(cè)定的。
35、如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述的反應(yīng)是通過(guò)熒光進(jìn)行測(cè)定的。
36、如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述的反應(yīng)是通過(guò)化學(xué)發(fā)光進(jìn)行進(jìn)行測(cè)定的。
37、如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述的單克隆抗體為Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
38、如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述的樣品來(lái)自于鳥(niǎo)類或人類。
39、一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1所述單克隆抗體在藥學(xué)上可接受的鹽。
40、一種藥物組合物，其包含一種或多種選自于如下一組單克隆抗體的、其藥學(xué)上可接受的鹽:
(i)雜交瘤細(xì)胞株8H5所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株8H5的保藏號(hào)是CCTCC-C200607；
(ii)雜交瘤細(xì)胞株3C8所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株3C8的保藏號(hào)是CCTCC-C200605；
(iii)雜交瘤細(xì)胞株10F7所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株10F7的保藏號(hào)是CCTCC-C200608；
(iv)雜交瘤細(xì)胞株4D1所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株4D1的保藏號(hào)是CCTCC-C200606；
(v)雜交瘤細(xì)胞株3G4所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株3G4的保藏號(hào)是CCTCC-C200604；以及
(vi)雜交瘤細(xì)胞株2F2所產(chǎn)生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細(xì)胞株2F2的保藏號(hào)是CCTCC-C200424。
41、如權(quán)利要求40所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包括其它抗病毒成分在藥學(xué)上可接受的鹽。
42、如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中，所述的單克隆抗體為Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
43、一種防止或治療由禽流感病毒感染在一主體上引發(fā)的疾病的方法，其包括向所述的主體給藥有效劑量的、如權(quán)利要求39所述的藥物組合物。
44、一種用于檢測(cè)樣品中禽流感病毒的組合物，其包括附載于固相底物上的、如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
45、如權(quán)利要求44所述的組合物，其中，所述的單克隆抗體為Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv。
46、如權(quán)利要求44所述的組合物，其中，所述的單克隆抗體包含可變重鏈，該可變重鏈含有選自于如下一組的肽序列:
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21和SEQID NO:25。
47、如權(quán)利要求46述的組合物，其中，所述的單克隆抗體進(jìn)一步包含可變輕鏈，該可變輕鏈含有選自于如下一組的肽序列:
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27。
48、如權(quán)利要求44所述的組合物，其中，所述的固相底物選自于如下一組:微滴定板、磁顆粒、膠乳顆粒和硝化纖維素膜。
49、如權(quán)利要求44所述的組合物，其中，所述的固相底物為測(cè)試帶。
50、如權(quán)利要求49所述的組合物，其中，所述的測(cè)試帶具有至少一測(cè)試區(qū)和一控制區(qū)。
51、如權(quán)利要求44所述的組合物，其中，所述的單克隆抗體是按如此方向附著在所述固相底物上，其能夠增加所述單克隆抗體與所述樣品的結(jié)合效率。
52、一種用于檢測(cè)樣品中禽流感病毒的裝置，其包括固相底物，該固相底物包括復(fù)數(shù)個(gè)分隔區(qū)間，其中，一個(gè)或多個(gè)所述的分隔區(qū)間涂覆有如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
53、如權(quán)利要求52所述的裝置，其中，一個(gè)或多個(gè)所述的分隔區(qū)間涂覆有不同于能特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的所述單克隆抗體的結(jié)合試劑。
54、如權(quán)利要求53所述的裝置，其中，所述的結(jié)合試劑是能夠特異性結(jié)合H1、H3、H7或H9亞型禽流感病毒的抗體。
55、如權(quán)利要求52所述的裝置，其進(jìn)一步包括自動(dòng)化檢測(cè)裝置，該自動(dòng)化檢測(cè)裝置能夠檢測(cè)所述單克隆抗體與H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白之間的結(jié)合。
56、一種檢測(cè)樣品中禽流感病毒的試劑盒，其包括如權(quán)利要求1所述的、附著于固相底物上的單克隆抗體和可檢測(cè)的、被標(biāo)記的第二單克隆抗體。
57、如權(quán)利要求56所述的試劑盒，其中，所述的第二單克隆抗體能夠特異性地結(jié)合禽流感病毒。
58、如權(quán)利要求56所述的試劑盒，其中，所述的第二單克隆抗體能夠特異性地結(jié)合禽流感病毒血凝素蛋白。
59、如權(quán)利要求56所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括控制標(biāo)準(zhǔn)。
60、一種短肽，其包含選自于如下一組的氨基酸序列:SEQ ID NOs:64-69、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94和96。
61、一種短肽，其包含選自于如下一組的核酸序列:SEQ ID NOS:75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95和97。
62、如權(quán)利要求60或61所述的短肽，其能特異性結(jié)合8H5單克隆抗體。
63、一種短肽，其包含選自于如下一組的氨基酸序列:SEQ ID NOs:70-73。
64、如權(quán)利要求63所述的短肽，其能特異性結(jié)合3C8單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了可特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之單克隆抗體，及可阻斷至少50％的單克隆抗體與H5亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白結(jié)合活性之單克隆抗體。該單克隆抗體可用于探測(cè)，診斷，預(yù)防，和治療禽流感病毒，特別是H5亞型禽流感病毒。本發(fā)明也提供了相關(guān)的雜交瘤細(xì)胞株，分離的核酸分子和短肽，以及其含該單克隆抗體的藥物組合物和醫(yī)藥診斷設(shè)備和試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101379397SQ200780003646
公開(kāi)日2009年3月4日 申請(qǐng)日期2007年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月26日
發(fā)明者夏寧邵, 陳毅歆, 葛勝祥, 羅文新, 軍 張 申請(qǐng)人:Hx診斷公司