專利名稱：用環(huán)介導等溫擴增方法檢測河流弧菌的試劑盒及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用環(huán)介導等溫擴增方法檢測河流弧菌的試劑盒，進一步涉及一種使用該種試劑盒快速檢測河流弧菌的方法。
背景技術：
河流弧菌(Vibrio fluvialis)是廣泛分布在海洋里的一種革蘭氏陰性致病菌。該菌已引起包括海水養(yǎng)殖貝類(鮑)和牙鲆等多種水產(chǎn)動物的敗血癥、膿皰病等疾病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。該菌不僅可以感染水產(chǎn)動物，還可以通過食物傳播感染人類，主要是因進食未煮熟的污染河流弧菌的海產(chǎn)品而導致流行性腹瀉，其癥狀與由霍亂弧菌引起的霍亂極為相似，因此，河流弧菌現(xiàn)在被認為是重要的人類食源性疾病和水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病病原。
以往檢測河流弧菌主要有三種辦法1.生化鑒定法，該法費時，操作繁瑣，不能滿足病害防治的需要；2.熒光抗體檢測法，雖然該法較靈敏，但耗時也較長，且需要昂貴的熒光檢測設備；3.聚合酶鏈式反應法(PCR法)，該法較前兩種方法快速、靈敏，但需要昂貴的PCR儀。目前尚未有用環(huán)介導等溫擴增方法檢測河流弧菌的試劑盒及方法的報道。
發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種快速、特異性強、靈敏度高且成本低的用環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法檢測河流弧菌的試劑盒，并提供一種使用該試劑盒快速檢測河流弧菌的方法，從而為水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品安全提供科學的依據(jù)和指導作用。
本發(fā)明的主要原理為(1)特殊設計一組可識別靶DNA六個不同序列的兩個內(nèi)引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)和兩個外引物(上游外引物和下游外引物)，內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個內(nèi)引物首先與靶DNA雜交，隨后的鏈置換DNA合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個外引物啟動，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個內(nèi)引物和一個外引物啟動的DNA合成的模板，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA；(3)內(nèi)引物以原始的莖環(huán)DNA為模板，啟動鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA和一個新的有兩倍莖長度的莖環(huán)DNA；(4)在等溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有靶DNA反復重復序列的莖環(huán)DNA，在一小時內(nèi)該循環(huán)反應可使靶DNA累積到109拷貝，可通過熒光染料來觀察擴增結果。
本發(fā)明涉及的一種用環(huán)介導等溫擴增方法檢測河流弧菌的試劑盒，其試劑包括
(1)環(huán)介導等溫擴增(LAMP)反應液A含有10×Thermopol反應緩沖液、300-500uM dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、2-4mM硫酸鎂(MgSO4)、0.8-1.2uM上游內(nèi)引物(flu-FIP)、0.8-1.2uM下游內(nèi)引物(flu-BIP)、0.2-0.3uM上游外引物(flu-F3)、0.2-0.3uM下游外引物(flu-B3)和1-1.5M甜菜堿；其中10×Thermopol反應緩沖液含有200mM pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mM氯化鉀(KCl)、100mM硫酸銨((NH4)2SO4)、20mM硫酸鎂(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；上游內(nèi)引物(flu-FIP)為gtgccttccacatcaccaggattttggtgacctgatcgtcacac；下游內(nèi)引物(flu-BIP)為tccgcagtgactggtcgagtcttttgaagccttggctgacttgg；上游外引物(flu-F3)為 tcctgcaagacgaaatggc；下游外引物(flu-B3)為 ctcactaaacgtcggtgctc；(2)Bst DNA聚合酶B每微升含8個活性單位(8U/uL)；(3)顯色劑C為10％的熒光染料SYBR GREEN I。
上面所述環(huán)介導等溫擴增(LAMP)反應液A每管23uL的最佳組成為2.5uL 10×Thermopol反應緩沖液、1.0uL 10mM dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上游內(nèi)引物(flu-FIP)、1.0uL 20uM下游內(nèi)引物(flu-BIP)、0.25uL 20uM上游外引物(flu-F3)、0.25uL20uM下游外引物(flu-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜堿和4uL ddH2O(滅菌雙蒸水)。
使用上述環(huán)介導等溫擴增方法檢測河流弧菌的試劑盒檢測河流弧菌的方法，依次包括下列步驟(1)細菌DNA的提取A.取1.0-1.5mL過夜培養(yǎng)的菌液，置于1.5mL離心管中，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，棄上清液；B.加入1.0-1.5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，棄上清液；C.加入100-150 uL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴10-15分鐘；D.用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，取上清液至一個新的1.5mL離心管中，即為待檢模板DNA；(2)河流弧菌的環(huán)介導等溫擴增A.在裝有23uLLAMP反應液A的反應管中加入和1uL待檢模板DNA，于恒溫金屬浴上95℃放置3-5分鐘，立即置于冰上1-3分鐘；B.在反應管中加入1uL下游內(nèi)引物(para-BIP)DNA聚合酶B；C.于恒溫金屬浴上60-65℃放置45-90分鐘；
D.將金屬浴調(diào)到80-95℃中止反應，3-5分鐘后取出；(3)顯色檢測在反應管中加入1uL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢細菌不是河流弧菌，如顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品為河流弧菌。
本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明建立了河流弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法，本試劑盒根據(jù)河流弧菌的基因保守區(qū)的六個序列設計了兩個特異性內(nèi)引物和兩個特異性外引物，以保證檢測不同來源河流弧菌株的可靠性。本發(fā)明采用環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術，該技術特異性強，與PCR檢測方法有相同的高靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需普通的金屬浴或水浴鍋即可，且結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀察即可，簡單而快速。可用于河流弧菌的檢測，特別適合于基層醫(yī)療機構以及養(yǎng)殖現(xiàn)場應用。
具體實施例方式
下列實例是進一步對本發(fā)明的說明，不應該當作對本發(fā)明的限制。
按下列配方制作河流弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒(1)LAMP反應液A2.5uL10×Thermopol反應緩沖液、1.0uL 10mM dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上游內(nèi)引物(flu-FIP)、1.0uL 20uM下游內(nèi)引物(flu-BIP)、0.25uL 20uM上游外引物(flu-F3)、0.25uL 20uM下游外引物(flu-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜堿和4uL ddH2O(滅菌雙蒸水)。
(2)Bst DNA聚合酶B濃度為8U/uL。
(3)顯色劑C10％的SYBR GREEN I。
按照以下程序進行檢測(1)細菌DNA的提取A.取1.0mL過夜培養(yǎng)的菌液，置于1.5mL離心管中，用臺式離心機12000轉/分離心5分鐘，棄上清液；B.加入1.0mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機12000轉/分離心5分鐘，棄上清液；C.加入100uL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴10分鐘；D.用臺式離心機12000轉/分離心10分鐘，取上清液至一個新的1.5mL離心管中，即為待檢模板DNA。
(2)河流弧菌的環(huán)介導等溫擴增A.在裝有23uLLAMP反應液A的反應管中加入1uL待檢模板DNA，于恒溫金屬浴上95℃放置5分鐘，立即置于冰上1分鐘；B.在反應管中加入1uL Bst DNA聚合酶B；C.于恒溫金屬浴上65℃放置1小時；
D.將金屬浴調(diào)到80℃中止反應，3分鐘后取出。
(3)顯色檢測在反應管中加入1uL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢細菌不是河流弧菌，如顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品為河流弧菌。
權利要求
1.一種用環(huán)介導等溫擴增方法檢測副溶血弧菌的試劑盒，其試劑包括(1)環(huán)介導等溫擴增反應液A含有10×Thermopol反應緩沖液、300-500uM dNTP、2-4mM硫酸鎂、0.8-1.2uM上游內(nèi)引物、0.8-1.2uM下游內(nèi)引物、0.2-0.3uM上游外引物、0.2-0.3uM下游外引物和1-1.5M甜菜堿；其中10×Thermopol反應緩沖液含有200mM pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1％曲拉通X-100；上游內(nèi)引物為gtgccttccacatcaccaggattttggtgacctgatcgtcacac；下游內(nèi)引物為tccgcagtgactggtcgagtcttttgaagccttggctgacttgg；上游外引物為tcctgcaagacgaaatggc；下游外引物為ctcactaaacgtcggtgctc。
2.根據(jù)權利要求1中所述的試劑盒，其特征是，環(huán)介導等溫擴增反應液A每管23uL的組成為2.5uL10×Thermopol反應緩沖液、1.0uL 10mM dNTP、1.0uL 20uM上游內(nèi)引物、1.0uL 20uM下游內(nèi)引物、0.25uL 20uM上游外引物、0.25uL 20uM下游外引物、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜堿和4uL ddH2O。
3.一種使用權利要求1或2中用環(huán)介導等溫擴增方法檢測副溶血弧菌的試劑盒檢測副溶血弧菌的方法，依次包括下列步驟(1)細菌DNA的提取A.取1.0-1.5mL過夜培養(yǎng)的菌液，置于1.5mL離心管中，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，棄上清液；B.加入1.0-1.5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，棄上清液；C.加入100-150uL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴10-15分鐘；D.用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，取上清液至一個新的1.5mL離心管中，即為待檢模板DNA。(2)副溶血弧菌的環(huán)介導等溫擴增A.在裝有23uL環(huán)介導等溫擴增反應液A的反應管中加入1uL待檢模板DNA，于恒溫金屬浴上95℃放置3-5分鐘，立即置于冰上1-3分鐘；B.在反應管中加入1uL下游內(nèi)引物DNA聚合酶B；C.于恒溫金屬浴上60-65℃放置45-90分鐘；D.將金屬浴調(diào)到80-95℃中止反應，3-5分鐘后取出；(3)顯色檢測在反應管中加入1uL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢細菌不是副溶血弧菌，如顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品為副溶血弧菌。
全文摘要
涉及一種用環(huán)介導等溫擴增方法檢測河流弧菌的試劑盒及方法，試劑盒包括(1)LAMP反應液A，其中上游內(nèi)引物為gtgccttccacatcaccaggattttggtgacctgatcgtcacac；下游內(nèi)引物為tccgcagtgactggtcgagtcttttgaagccttggctgacttgg；上游外引物為tcctgcaagacgaaatggc；下游外引物為ctcactaaacgtcggtgctc；(2)BstDNA聚合酶B；(3)顯色劑C；檢測方法包括細菌DNA的提取、河流弧菌的環(huán)介導等溫擴增、顯色檢測；優(yōu)點是快速、特異性強、靈敏度高，且成本低。
文檔編號G01N21/25GK101020922SQ20071002639
公開日2007年8月22日 申請日期2007年1月18日 優(yōu)先權日2007年1月18日
發(fā)明者任春華, 胡超群, 羅鵬, 王青柏 申請人:中國科學院南海海洋研究所