專利名稱：：登革病毒IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，尤其是涉及一種登革病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
：登革熱(DengueFever,DF)是由4個(gè)血清型登革病毒(DengueVirus,DV)引起的急性蚊媒傳染病，主要通過埃及伊蚊或白紋伊蚊叮咬傳播。登革病毒屬于黃病毒科(Flaviviridae),黃病毒屬(Flavivirus)。DF是分布最廣，發(fā)病最多，危害較大的一種蟲媒病毒性疾病，廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶的非洲、美洲、東南亞和西太平洋區(qū)的100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。據(jù)WH6估計(jì)全球約有25億人口的健康受到威脅，每年有5000萬人感染登革病毒。隨著全球氣候變暖日趨嚴(yán)重，登革熱地理分布上有蔓延的趨勢(shì)，發(fā)病率和疫情的嚴(yán)重程度也有所增加，登革熱已成為全球性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。登革熱在我國(guó)經(jīng)過了30多年靜止期后，1978年廣東佛山突然發(fā)生流行，自此，登革熱一直是廣東省重點(diǎn)防治的傳染病。登革熱疫情來勢(shì)急，擴(kuò)散快，不容易控制，對(duì)人民的生命健康產(chǎn)生巨大威脅、對(duì)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生極大影響，因而成為一項(xiàng)重大的公共衛(wèi)生問題。登革熱疑似病例的盡快確診可幫助及早發(fā)現(xiàn)疫情，盡快采取措施，在最小范圍控制疫情，因而把損失減到最少。目前我國(guó)對(duì)登革熱的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠進(jìn)口的酶聯(lián)免疫試劑，其價(jià)格昂貴，在基層醫(yī)院及市、縣級(jí)疾控中心難于普及，另外，進(jìn)口試劑采購(gòu)到貨時(shí)間長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)室有時(shí)未能及時(shí)拿到試劑，而延誤診斷。首發(fā)病人往往由于誤診，沒有及時(shí)采取有效措施，而導(dǎo)致登革熱疫情蔓延。每宗疫情在其發(fā)現(xiàn)時(shí)已陷入十分緊張和被動(dòng)的局面，進(jìn)而花費(fèi)巨大的人力物力去控制。因此，開發(fā)出簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、適宜于基層單位推廣使用的登革熱診斷試劑成為登革熱疫情控制中急需解決的難題。人感染了登革病毒后，一般經(jīng)過3-10天(通常4~5天)的潛伏期后，受感染者會(huì)出現(xiàn)以發(fā)熱、疼痛為主要癥狀的登革熱，同時(shí)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)，初次感染登革病毒，機(jī)體產(chǎn)生抗體的速度較慢，滴度也較低，IgM為最初應(yīng)答的抗體。IgG在發(fā)病的第一周末才出現(xiàn)，滴度很低，上升速度也慢。才艮據(jù)泛美衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)，到發(fā)病的第五天，80%可查到檢測(cè)水平的IgM,發(fā)病的第6-10天，93-99%可查到檢測(cè)水平的IgM，IgM可持續(xù)存在90天以上。二次感染登革病毒的病人，由于IgM抗體遠(yuǎn)低于初次感染產(chǎn)生的抗體水平，約有20~30%的病人在二次感染登革病毒后的第10天未能檢測(cè)到IgM抗體；而IgG抗體發(fā)病后1~2天可迅速上升到遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于初次感染產(chǎn)生抗體的水平，故可以通過檢測(cè)登革病毒IgG抗體對(duì)二次感染登革的病人進(jìn)行診斷，并根據(jù)抗體滴度高低對(duì)近期感染或繼往感染進(jìn)行判斷，IgG抗體可以終生維持。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種登革病毒IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，通過檢測(cè)血清中登革病毒IgG抗體，可對(duì)二次或以上多次感染登革熱的病人進(jìn)行早期診斷和對(duì)健康人群的血清流行病學(xué)調(diào)查，并可對(duì)初次感染登革熱的病人進(jìn)行最后確診(雙份血清特異性IgG抗體出現(xiàn)4倍或超過4倍的增長(zhǎng))。本發(fā)明所述的'一種登革病毒IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，包括酶標(biāo)記板、陰性對(duì):瞎血清、陽(yáng)性對(duì)照血清、酶標(biāo)記物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、封板膠，所述酶標(biāo)記物包含羊抗人IgG-HRP,即羊抗人IgG-辣根過氧化物酶；所述酶標(biāo)記板上的包被抗原為基因工程重組表達(dá)的登革病毒包膜蛋白特異性抗原，所述抗原包括氨基酸序列為SEQIDNo.l的重組1型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.3的重組2型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基S交序列為SEQIDNo.5的重組3型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.7的重組4型登革病毒包膜蛋白特異性抗原。所述重組1型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.2的DNA序列所編碼的；所述重組2型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.4的DNA序列所編碼的；所述重組3型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.6的DNA序列所編碼的；所述重組4型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.8的DNA序列所編碼的。所述的陽(yáng)性對(duì)照血清是在含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mM的pH7.4的PBS中，加入確定濃度的陽(yáng)性血清制成，陽(yáng)性對(duì)照的A值應(yīng)大于1.5;陰性對(duì)照血清是在含20%山羊血清和0.02。/。疊氮鈉的10mM的pH7.4PBS中，按5%的比例加入混合好的陰性血清制成，陰性對(duì)照的A值應(yīng)小于0.1。所述酶標(biāo)記板的制備方法是將所述的基因工程重組表達(dá)的登革病毒包膜蛋白特異性抗原按確定的濃度用0.05M的pH9.6的CP即碳酸鹽緩沖液稀釋后，按O.lml/孔包被到微孔板內(nèi)，在2°C~8。C吸附24~26小時(shí)后，用10mMPBST即吐溫磷酸緩沖液按0.25ml/孔洗板，再用封閉液按0.15ml/孔在2。C8。C封閉18-20小時(shí)，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后用鋁膜袋密封，置28。C保存。所述的封閉液的組成為含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的pH7.4的10mM磷酸緩沖液即PBS。所述的酶標(biāo)記物是用酶標(biāo)稀釋液按工作濃度配制的羊抗人IgG-HRP工作液，所述的酶標(biāo)稀釋液的組成為pH7.4的10mMPBS即磷酸緩沖液，其中含10%山羊血清、0.2%吐溫-20和0.02%疊氮鈉。登革病毒為單股正鏈RNA病毒，長(zhǎng)度約為11Kb,編碼3400個(gè)氨基酸，分子量為4200KDa。基因組含有一個(gè)長(zhǎng)的開放讀碼框架，編碼病毒的全部蛋白包括3種結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白。其中E結(jié)構(gòu)蛋白是一種包膜糖蛋白，亞群特異和型特異的抗原決定簇及中和、血'凝抑制作用的主要抗原表位均位于包膜蛋白E上，因此E結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)'病原診斷具有重要意義。本發(fā)明所述的登革病毒IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒采用重組登革病毒1-4型E蛋白B區(qū)的型特異性抗原(約120個(gè)氨基酸)，避免與黃熱病毒、乙型腦炎病毒抗原產(chǎn)生交叉反應(yīng)。國(guó)外商品化登革病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑多采用純化的全病毒抗原，這些試劑缺點(diǎn)是本底高，與黃病毒科病毒存在交叉反應(yīng)，最常見者為乙型腦炎病毒與黃熱病毒。本發(fā)明研制的試劑盒克服了國(guó)外試劑的缺點(diǎn)。與國(guó)內(nèi)外同類產(chǎn)品比較在國(guó)內(nèi)尚無檢測(cè)登革病毒抗體的酶免試劑。在國(guó)外，常用的登革熱酶聯(lián)免疫診斷試劑全部采用細(xì)胞培養(yǎng)后純化的全病毒抗原。如目前唯一獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)文號(hào)的澳大利亞PanBio公司生產(chǎn)的DengueIgGELISA診斷試劑盒，其不足在于本底高，因而需要借助酶標(biāo)比色儀檢測(cè)，閾值(cut-off值)為0.4-0.65,與黃病毒科病毒如乙型腦炎病毒存在交叉反應(yīng)。本發(fā)明制備的登革病毒IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑是間接法IgG-ELISA，方法簡(jiǎn)便、易操作，靈敏性高，與黃熱病毒、乙型腦炎病毒抗原不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。本發(fā)明的研究成果填補(bǔ)了我國(guó)登￥熱診斷試劑的空白，為我國(guó)登革熱的臨床診斷、血清學(xué)監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了新的技術(shù)手段，具有廣泛的推廣應(yīng)用前景。圖1為表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。圖2為登革重組抗原純化過程SDS-PAGE蛋白電泳圖鐠；1:蛋白標(biāo)準(zhǔn)P7708V;2:超聲后離心的上清；3:親和層析純化的蛋白；4:陽(yáng)離子交換純化的蛋白；5:分子篩純化的蛋白。圖3為重組蛋白WesternBlot鑒定結(jié)果；M:蛋白質(zhì)markerP7708V;1-3:WB反應(yīng)帶；4:陰性對(duì)照。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一登革抗原的克隆、表達(dá)和純化(一)材料1.標(biāo)準(zhǔn)毒抹登革l型(Hawaii抹)，簡(jiǎn)稱D1;登革2型(NGC抹)，筒稱D2;登革3型(H87褲)，簡(jiǎn)稱D3;登革4型(H241抹)，簡(jiǎn)稱D4;購(gòu)自中國(guó)藥品生物制g檢定所，由廣東省疾病預(yù)防控制中心保存。2.質(zhì)?？寺≥d體BM13質(zhì)粒購(gòu)自TaKaRa公司，表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)是Novagen產(chǎn)品。由廣東省疾病預(yù)防控制中心微生物抬r驗(yàn)所保存。3.菌抹受體菌TOP10F和表達(dá)用的大腸桿菌BL21StarTM(DE3)購(gòu)自Invitrogen公司，由廣東省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)所保存。4.酶類限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶和dNTP分別購(gòu)自New-England、Invitrogen、BOEHRINGERMANNHEIM以及大連寶生物工程有限公司等。5.其它試劑YeastExtract(酵母粉)、TRYPTONE(蛋白胨)和IPTG誘導(dǎo)劑是BBI產(chǎn)品，購(gòu)自上海生物工程有限公司。(二)方法1.病毒RNA的提取及cDNA合成釆用QIAGEN公司QIAampViralRNAminiKit。按試劑盒要求，提取病毒RNA,以隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。2.PCR擴(kuò)增基因參照上述登革病毒l-4型毒林的包膜蛋白基因序列(來自Genbank),設(shè)計(jì)引物，在引物的5'端加上EcoRI酶切位點(diǎn)，在引物的3'端加上Xhol酶切位點(diǎn)，以利于克隆入表達(dá)載體。針對(duì)登革1型包膜蛋白基因的引物為DIE-F:5'-GGAGGAATTCAAAATGGACAAACTGACTCT-3'D1E-R:5'-CCCACCTCGAGACGACGTGCACCACGGGCAGTCGC-3'針對(duì)登革2型包膜蛋白基因的引物為D2E-F:5，-GGAGGAATTCCGTATGGACAAACTACAGCT-3'D2E-R:5，-CCCACCTCGAGACGCTTCGCACCACGCATTGTTGT-3，針對(duì)登革3型包膜蛋白基因的引物為D3E-F:5'-GGAGGAATTCAAGATGGACAAATTGAAACT_3，D3E-R:5，-CCCACCTCGAGACGACGTGCACCACGGGCAGTGGC-3'針對(duì)登革4型包膜蛋白基因的引物為D4E-F:5'-GGAGGAATTCCGTATGGAGAAATTGCGTATTAAGG-3'D4E-F:5'-CCCACCTCGAGACGCTTTGCGCCACGGTATGTGGA_3，'循環(huán)程序?yàn)橛肐nvitrogen高保真酶，95°C15分鐘熱起動(dòng)，94。C史性15s,55。C退火30s,68。C延伸lmin,共22個(gè)循環(huán)，68。C再作用5min,冷卻至4。C。3.PCR片段的純化與回收采用QIAGENGelExtractionKit純化PCR片段。4.基因的克隆基本操作參照《MolecularCloning》(Sambrooketal.,1989)進(jìn)行。包括酶切和連接；質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的篩選及重組質(zhì)粒的鑒定?？寺〉幕蚱谓?jīng)序列測(cè)定確認(rèn)。將純化的PCR片段先克隆在BM13質(zhì)粒上測(cè)片段核苷酸序列，重組表達(dá)登革1-4型包膜蛋白抗原(E)分別表示為D1E-D4E，其中，D1E-D3E序列為372個(gè)核苦酸，編碼124個(gè)氨基酸，D4E序列369個(gè)核芬酸，編碼123個(gè)氨基酸，具體序列如下DIE的核苷酸及M酸序列(372個(gè)核苷酸，編碼124個(gè)氨基酸)核香酸序列(SEQIDNo.2)AGGMGCAGCATAGGGAMATGTTTGAGGCGACTGCCCGTGGTGCACGTCGT氨基酸序列(SEQIDNo.l)EAEPPFGESYIVIGAGEKALKLSWFKKGSSIGKMFEATARGARRD2E的核苦酸及#^酸序列(372個(gè)核苷酸，編碼124個(gè)氨基酸)核香酸序列(SEQIDNo.4)AGGMGTTCTATCGGCCAAATGATTGAGACMCMTGCGTGGTGCGMGCGT氨基酸序列(SEQIDNo.3)EAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMIETTMRGAKRD3E的核苷酸及M酸序列(372個(gè)核苦酸，編碼124個(gè)氨基酸)核苦酸序列(SEQIDNo.6)GGGAAGCTCGATTGGGAAGATGTTCGAGGCCACTGCCCGTGGTGCACGTCGT氨基酸序列(SEQIDNo.5)EAEPPFGESNIVIGIGDKALK麗YRKGSSIGKMFEATARGARRD4E的核芬酸及氨基酸序列(369個(gè)核苷酸，編碼123個(gè)氨基酸)核苦酸序列(SEQIDNo.8)說明書第7/22頁(yè)GAGTTCCATTGGCMGATGTTTGAGTCCACATACCGTGGCGCAAAGCGT氨基酸序列(SEQIDNo.7)ELERPLDSYIVIGVGDSALTLHWFRKGSSIGKMFESTYRGAKR5.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建選擇D1E、D2E、D3E和D4E測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒和載體pET22b(+)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收酶切產(chǎn)物，將經(jīng)純化的酶切片段和載體于16。C連接2小時(shí)。表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖見圖1。6.轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞'.迅速將20^il連接產(chǎn)物加至感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min;然后42°C2min，力"mlLB培養(yǎng)基；37°C水浴1hr并不時(shí)搖動(dòng)；然后將600pl培養(yǎng)基用玻璃棒分別涂布在含120pg/ml氨千青霉素LB平板上；平板干燥后37。C倒置過夜。7.DNA提取從平板上挑取重組子至2ml含120嗎/ml氨卡青霉素LB培養(yǎng)基搖床過夜培養(yǎng)；用QIAprepSpinminiprepKit提取質(zhì)粒DNA，用PCR和酶切鑒定片段的大小是否正確。8.接種及培養(yǎng)用登革病毒l-4型重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21Star(DE3),各挑取單一菌落接種到20ml含120jag/ml氨卡青霉素的LB培養(yǎng)液中，37。C振搖至第二天上午8:30。各取8ml種子液，加200ml含120ug/ml氨千青霉素LB培養(yǎng)液，37°C180轉(zhuǎn)快搖至OD600為0.6左右，力口IPTG至100jug/ml(IPTG濃度可以優(yōu)化)，同時(shí)再補(bǔ)充一次新的氨爺青霉素至120pg/ml(兩次共為240|ag/ml),繼續(xù)震搖培養(yǎng)3-5小時(shí)，收集菌體。大量發(fā)酵時(shí)，用上述方法等量發(fā)酵1-4型菌液，將菌液混合，超聲后離心收集上清，混合蛋白經(jīng)親和i析，透析，陽(yáng)離子交換和凝膠過濾等多步驟純化。9、聚丙歸酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將1-4型表達(dá)產(chǎn)物超聲后離心的上清，親和層析、陽(yáng)離子交換和分子篩純化收集的蛋白，走SDS-PAGE蛋白電泳。電泳圖譜見圖2。圖2中，1:蛋白標(biāo)準(zhǔn)P7708V;2:超聲后離心的上清；3:親和層析純化的蛋白；4:陽(yáng)離子交換純化的蛋白；5:分子篩純化的蛋白。經(jīng)過多步純化，最后已看不出有雜帶。最終得到目的蛋白大小約為16KDa。10、抗原活性的初步鑒定WesternBlot(WB)實(shí)驗(yàn)將重組蛋白稀釋進(jìn)行SDS-PAGE電泳，凝膠轉(zhuǎn)NC膜，膜切成四條，取三條與登革病毒陽(yáng)性血清反應(yīng)，結(jié)果重組蛋白與陽(yáng)性血清呈特異性反應(yīng)，在約16x103處可見WB反應(yīng)帶，與SDS-PAGE重組蛋白帶大小一致，健康人血清沒有反應(yīng)，WB實(shí)驗(yàn)圖語(yǔ)見圖3。圖3中，M:蛋白質(zhì)markerP7708V;1-3:WB反應(yīng)帶；4:陰性對(duì)照。實(shí)施例二重組抗原對(duì)登革病毒IgG抗體反應(yīng)活性的測(cè)定用間接ELISA方法對(duì)純化提取蛋白進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，以確定其對(duì)登革病毒抗體陽(yáng)性血清的反應(yīng)性。'將實(shí)施例一所得的抗原按1:500、1:1000、1:2000稀釋后包被ELISA板，與登革陽(yáng)性血清反應(yīng)，確定包被抗原濃度。登革抗原的免疫活性達(dá)l:1000。重組抗原按選定濃度包被，用間接法ELISA檢測(cè)登革熱病人血清IgG抗體，測(cè)定重組抗原對(duì)登革病毒IgG抗體的反應(yīng)活性。l.重組抗原對(duì)2004年中山登革熱疫情血清樣本的反應(yīng)活性1-4型E蛋白重組抗原按選定濃度包被，用間接法ELISA檢測(cè)2004年中山急性期、恢復(fù)期登革病人血清IgG抗體，30份急性期血清(發(fā)病時(shí)間3-13天)有7份陽(yáng)性(OD值>0.2判為陽(yáng)性，有2例病人發(fā)病8天即可檢測(cè)到IgG抗體)，17份陰性；這30份血清登革病毒IgM抗體檢測(cè)結(jié)果也是陽(yáng)性。28份恢復(fù)期血清IgG抗體全部陽(yáng)性，13份病后37-60天采的恢復(fù)期血清的IgG抗體水平最高，15份病后59-86天采的恢復(fù)期血清IgG抗體水平略有下降，但仍維持在較高的水平。28份恢復(fù)期血清OD值明顯高于急性期血清，有21份OD值呈4倍以上增長(zhǎng)，說明重組抗原能檢測(cè)出病人體內(nèi)IgG抗體水平和變化情況，對(duì)中山登革病人恢復(fù)期血清IgG抗體檢出率達(dá)100%,無一漏檢?；謴?fù)期血清用澳大利亞PanBio登革試劑(DengueIgGCaptureELISA)復(fù)查，結(jié)果也是陽(yáng)性。說明l-4型E蛋白重組抗原對(duì)登革IgG抗體有良好的反應(yīng)性，21例病人急性期、恢復(fù)期血清登革IgG抗體檢測(cè)結(jié)果見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.廣東省及各地級(jí)市CDC登革IgG抗體檢測(cè)結(jié)果將實(shí)施例一所得的重組抗原制備成登革病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒(以下稱自研試劑盒)，分發(fā)給全省各市級(jí)CDC(疾病預(yù)防控制中心)試用，共檢測(cè)了4288份血清，檢出299份陽(yáng)性，在曾流行過登革熱的疫區(qū)，可檢出登革病毒IgG抗體陽(yáng)性血清；廣東省CDC檢測(cè)了1675份血清(血清來源于蟲媒病毒血清庫(kù)，包括登革病人和登革監(jiān)測(cè)血清)登革病毒IgG抗體，檢出154份陽(yáng)性，陽(yáng)性率9.19%,從154份登革病毒IgG陽(yáng)性血清中選出100份，用澳大利亞Panbio登革IgG試劑檢測(cè)，只有2份結(jié)果呈現(xiàn)陰性，98份陽(yáng)性，符合率98%;廣州市和中山市CDC檢測(cè)了360份血清(多數(shù)是登革熱病人急性期血清)，各檢出40份陽(yáng)性，陽(yáng)性率22.22%,其它市多數(shù)采用的是正常人群監(jiān)測(cè)血清，陽(yáng)性率都很低，清遠(yuǎn)和梅州未出現(xiàn)過登革疫情，此2地區(qū)血清檢測(cè)結(jié)果全部陰性。深圳CDC檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本用進(jìn)口試劑澳大利亞PanBio登革試劑(DengueIgGCaptureELISA)比對(duì)結(jié)果也是陽(yáng)性。說明重組抗原具有較好的特異性，結(jié)果見表2。表2廣東省和各地級(jí)市CDC登革IgG抗體檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3.對(duì)其它蟲媒病毒陽(yáng)性血清的檢測(cè)用自研試劑盒檢測(cè)41份(包括深圳市CDC17份)乙腦IgG抗體陽(yáng)性血清，結(jié)果全部陰性。證明重組抗原與乙腦IgG抗體無交叉反應(yīng)，具良好的特異性。上述結(jié)果表明，表達(dá)的抗原對(duì)登革IgG血清的反應(yīng)良好?？捎糜谘兄频歉锊《綢gG抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)。4.對(duì)試劑的穩(wěn)定性能檢測(cè)將自研試劑盒的抗原板放入37。C溫箱，考核6天，檢測(cè)其對(duì)熱環(huán)境下的活性。檢測(cè)項(xiàng)包括陰、陽(yáng)性血清，廠內(nèi)臨界質(zhì)控血清，其結(jié)果與4'C條件下保存的抗原板所檢測(cè)的結(jié)果比較，抗原活性下降未超過25%。5.干護(hù)。險(xiǎn)測(cè)-用自研試劑盒檢測(cè)高血酯、高膽紅素、高血紅蛋白、黃疸和抗凝舯處理(EDTA、枸櫞酸鈉)的血漿樣本，檢測(cè)結(jié)果全部為陰性。說明這些血清對(duì)DengueIgG的檢測(cè)無明顯干擾。對(duì)同屬黃病毒科的HCV陽(yáng)性血清無明顯交叉反應(yīng)，特異性好。實(shí)施例三本發(fā)明所迷的登革病毒IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的生產(chǎn)工藝(一)材料1.登革抗原制備見實(shí)施例一。所述抗原l:1000包被時(shí)，對(duì)廠內(nèi)參比品陽(yáng)性符合率達(dá)到98%，特異性達(dá)到97%。2.羊抗人IgG-HRP:深圳瑞桑公司產(chǎn)品。3.TMB:德國(guó)柏林格產(chǎn)品。4.陽(yáng)性對(duì)照血清所述的陽(yáng)性對(duì)照血清是在含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mM的pH7.4的PBS中，加入確定濃度的陽(yáng)性血清制成，陽(yáng)性對(duì)照的A值應(yīng)大于1.5。5.陰性對(duì)照血清陰性對(duì)照血清是在含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mM的pH7.4的PBS中，按5%的比例加入混合好的陰性血清制成。陰性對(duì)照的A值應(yīng)小于0.1。6.酶標(biāo)板12孔板條，CV(%)《10%?？刹捎蒙钲诮饢u華有限公司的產(chǎn)品。7.廠內(nèi)參比品自廣東省疾病預(yù)防控制中心微檢所蟲媒病研究室的血清庫(kù)中篩選和制備。8.山羊血清購(gòu)自浙江三利生物制品廠，委白含量為3.3±0.5%,無菌試驗(yàn)陰性，對(duì)試劑盒反應(yīng)系統(tǒng)無抑制。9.其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?二)制備過程1.抗原制備及檢定(見實(shí)施例一至二)2.包被工藝的確定(1)固相載體的篩選CV值測(cè)定包被后取1份Dengue-IgG弱陽(yáng)性血清(CV血清)用間接法測(cè)定10孔CV值；吸附性測(cè)定取自制Dengue基因工程抗原自1:250開始對(duì)倍稀釋包被，取1份Dengue-IgG陽(yáng)性血清用間接法測(cè)定，觀察OD>0.5的孔序。(2)封閉條件的選擇選擇現(xiàn)有的多種封閉液配方進(jìn)行試驗(yàn)，最后選定用含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mMPBS(pH7.4),150ul/孔封閉，4。C過夜后扣干。(3)包被板制備將所述的基因工程重組表達(dá)的登革病毒包膜蛋白特異性抗原按確定的濃度用0.05M的pH9.6的CB即碳酸鹽緩沖液稀釋后，按0.1ml/孔包被到微孔板內(nèi)，在2°C~8。C吸附24~26小時(shí)后，用10mMPBST即吐溫磷酸緩沖液按0.25ml/孔洗板，再用封閉液按0.15ml/孔在2°C8。C封閉18-20小時(shí)，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后用鋁膜袋密封，置28t:保存。3、酶標(biāo)抗體稀釋液的選擇及效價(jià)滴定采用經(jīng)篩選的酶標(biāo)稀釋液(pH7.4的10mMPBS,含10%山羊血清和0.2%吐溫-20、0.2%Bronidox),按工作濃度配制羊抗人IgG-HRP工作液，其穩(wěn)定性符合質(zhì)檢要求。經(jīng)滴定，羊抗人IgG-HRP的效價(jià)為1:10000。4、cut-off值的確定從中山市博愛醫(yī)院、中醫(yī)院、人民醫(yī)院取回的正常體檢的血清標(biāo)本、門診病人血清(非登革熱患者)400份進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出均值為0.0351，SD=0.0372,X+3SD=0.147,確定cut-off值為0.15+陰性對(duì)照均值(該值不足0.050的以0.050計(jì))。5、制檢規(guī)程的確定根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)及過程，參照《中國(guó)生物制品規(guī)程n部》的格式，制訂本試劑盒的制造及檢定規(guī)程。SEQUENCELISTING(序列表)〈110〉廣東省疾病預(yù)防控制中心〈120〉登革病毒IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒〈130〉〈141〉2007-05-15〈160〉16〈170〉Patentlnversion3.4〈210〉1〈211〉124〈212>PRT〈213〉登革病毒l型E蛋白B區(qū)〈400〉1LysMetAspLysLeuThrLeuLysGlyMetSerTyrValMetCysThr151015GlySerPheLysLeuGluLysGluValAlaGluThrGinHisGlyThr202530ValLeuValGinlieLysTyrGluGlyThrAspAlaProCysLyslie354045ProPheSerThrGinAspGluArgGlyValThrGinAsnGlyArgLeu505560lieThrAlaAsnProlieValThrAspLysGluLysProValAsnlie65707580GluAlaGluProProPheGlyGluSerTyrlieVallieGlyAlaGly859095GluLysAlaLeuLysLeuSerTrpPheLysLysGlySerSerlieGly100105110LysMetPheGluAla'ThrAlaArgGlyAlaArgArg115120<210>2〈211〉372〈212〉DNA〈213〉登革病毒l型E蛋白B區(qū)〈400〉2aaaatggacaaactgactctaaaagggatgtcatatgttatgtgcacaggctcattcaag60ctagagaaagaagtggctgagacccaacatggaaccgttctagtgcagattaaatacgaa120ggaacagatgcaccatgcaagatccctttttcgacccaagatgaaagaggagtaacccag180aacgggagattaataacagccaaccctatagttactgacaaagaaaaaccagtcaacatt240gaggcagaaccaccttttggtgagagttacatcgtgataggagcaggtgaaaaagctttg300aaactaagttggttcaagaaaggaagcagcatagggaaaatgtttgaggcgactgcccgt360ggtgcacgtcgt372〈210〉3〈211>124〈212〉PRT〈213〉登革病毒2型E蛋白B區(qū)<400>3ArgMetAspLysLeuGinLeuLysGlyMetSerTyrSerMetCysThr151015GlyLysPheLysValValLysGlulieAlaGluThrGinHisGlyThr202530lieVallieArgValGinTyrGluGlyAspGlySerProCysLyslie354045ProPheGlulieMetAspLeuGluLysArgHisValLeuGlyArgLeu505560lieThrValAsnProlieValThrGluLysAspSerProValAsnlie65707580GluAlaGluProProPheGlyAspSerTyrlielielieGlyValGlu859095ProGlyGinLeuLysLeuAsnTrpPheLysLysGlySerSerlieGly100105GinMetlieGluThrThrMetArgGlyAlaLysArg115120〈210〉4<211>372<212>DNA〈213〉登革病毒2型E蛋白B區(qū)110<400>4cgtatggacaaactacagctcaaaggaatgtcatactctatgtgcacaggaaagtttaaa60gttgtgaaggaaatagcagaaacacaacatggaacaatagtta/tcagagtacaatatgaa120ggggacggttctccatgtaagatcccttttgagataatggatttggaaaaaagacatgtt180ttaggtcgcctgattacagtcaacccaatcgtaacagaaaaagatagcccagtcaacata240gaagcagaacctccattcggagacagctacatcatcataggagtagagccgggacaattg300aagctcaactggtttaagaaaggaagttctatcggccaaatgattgagacaacaatgcgt360ggtgcgaagcgt372〈210〉5<211〉124〈212〉PRT〈213〉登革病毒3型E蛋白B區(qū)<400>5LysMetAspLysLeuLysLeuLysGlyMetSerTyrAlaMetCysLeu151015AsnThrPheValLeuLysLysGluValSerGluThrGinHisGlyThr202530lieLeulieLysValGluTyrLysGlyGluAspAlaProCysLyslie354045ProPheSerThrGluAspGlyGinGlyLysAlaHisAsnGlyArgLeu505560lieThrAlaAsnProValValThrLysLysGluGluProValAsnlie65707580GluAlaGluProProPheGlyGluSerAsnlieVallieGlylieGly859095AspLysAlaLeuLyslieAsnTrpTyrArgLysGlySerSerlieGly100105110LysMetPheGluAlaThrAlaArgGlyAlaArgArg115120〈210〉6〈211〉372<212〉DNA〈213〉登革病毒3型E蛋白B區(qū)〈400〉6aagatggacaaattgaaactcaaggggatgagctatgcaatgtgcttgaatacctttgtg60ttgaagaaagaagtctccgaaacgcagcatgggacaatactcattaaggttgagtacaaa120ggggaagatgcaccctgcaagattcctttctccacggaggatggacaagggaaagctcac180aatggcagactgatcacagccaatccagtggtgaccaagaaggaggagcctgtcaacatt240gaggctgaacctccttttggggaaagtaatatagtaattggaattggagacaaagccctg300aaaatcaactggtacaggaagggaagctcgattgggaagatgttcgaggccactgcccgt360ggtgcacgtcgt372<210>7〈211〉123〈212>PRT〈213〉登革病毒4型E蛋白B區(qū)〈400〉7ArgMetGluLysLeuArglieLysGlyMetSerTyrThrMetCysSer151015GlyLysPheSerlieAspLysGluMetAlaGluThrGinHisGlyThr202530ThrValValLysValLysTyrGluGlyAlaGlyAlaProCysLysVal354045ProlieGlulieArgAspValAsnLysGluLysValValGlyArglie505560lieSerProThrProPheAlaGluAsnThrAsnSerValThrAsnlie657075'80GluLeuGluArgProLeuAspSerTyrlieVallieGlyValGlyAsp859095SerAlaLeuThrLeuHisTrpPheArgLysGlySerSerlieGlyLys100105110MetPheGluSerThrTyrArgGlyAlaLysArg115120〈210〉8<211>369〈212〉DNA<213〉登革病毒4型E蛋白B區(qū)〈400〉8cgtatggagaaattgcgtattaagggaatgtcatacacgatgtgctcaggaaagttctca60attgacaaagagatggcagaaacacagcatgggacaacagtggtaaaagtcaagt3tgag120ggtgctggagctccatgtaaagttcccatagagataagagatgtgaacaaggaaaaagtg180gtagggcgtatcatctcacctaccccttttgctgagaataccaacagtgtaaccaacata240gaattagaacgccctttggacagctacatagtaataggtgttggagacagcgcattaaca300ctccattggttcaggaaagggagttccattg'gcaagatgtttgagtccacataccgtggc360gcaaagcgt369〈210>9〈211>30<212>DNA〈213〉人工合成引物〈400〉9ggaggaattcaaaatggacaaactgactct30〈210〉10<211〉35<212〉DNA<213〉人工合成引物〈400〉10cccacctcgagacgacgtgcaccacgggcagtcgc〈210〉11〈211〉30〈212〉薩〈213〉人工合成引物<400>11ggaggaattccgtatggacaaactacagct<210>12〈211〉35<212〉■〈213〉人工合成引物〈400〉12cccacctcgagacgcttcgcaccacgcattgttgt說明書第21/22頁(yè)3530〈210〉13〈211〉30〈212〉DNA<213>人工合成引物〈400〉13ggaggaattcaagatggacaaattgaaact30〈210〉14<211>〈212〉DNA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>權(quán)利要求1、一種登革病毒IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，包括酶標(biāo)記板、陰性對(duì)照血清、陽(yáng)性對(duì)照血清、酶標(biāo)記物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、封板膠，其特征在于所述酶標(biāo)記物包含羊抗人IgG-HRP，即羊抗人IgG-辣根過氧化物酶；所述酶標(biāo)記板上的包被抗原為基因工程重組表達(dá)的登革病毒包膜蛋白特異性抗原，所述抗原包括氨基酸序列為SEQIDNo.1的重組1型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.3的重組2型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.5的重組3型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.7的重組4型登革病毒包膜蛋白特異性抗原。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革病毒抗如酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其特征在于所述重組1型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.2的DNA序列所編碼的；所述重組2型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.4的DNA序列所編碼的；所述重組3型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.6的DNA序列所編碼的；所述重組4型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.8的DNA序列所編碼的。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其特征在于所述的陽(yáng)性對(duì)照血清是在含20。/。山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mM的pH7.4的PBS中，加入確定濃度的陽(yáng)性血清制成，陽(yáng)性對(duì)照的A值應(yīng)大于1.5;陰性對(duì)照血清是在含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mM的pH7.4的PBS中，按5%的比例加入混合好的陰性血清制成，陰性對(duì)照的A值應(yīng)小于0.1。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記板的制備方法是將所述的基因工程重組表達(dá)的登革病毒包膜蛋白特異性抗原按確定的濃度用0.05M的pH9.6的CP即碳酸鹽緩沖液稀釋后，按0.1ml/孔包被到微孔板內(nèi)，在2°C8。C吸附24~26小時(shí)后，用10mMPBST即吐溫磷酸緩沖液按0.25ml/孔洗板，再用封閉液按0.15ml/孔在2。C8。C封閉18~20小時(shí)，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后用鋁膜袋密封，置28。C保存。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的登革病毒抗體酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的封閉液的組成為含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的pH7.4的10mM磷酸緩沖液即PBS。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其特征在于所述的所述酶標(biāo)記物是用酶標(biāo)稀釋液按工作濃度配制的羊抗人IgG-HRP工作液，所述的酶標(biāo)稀釋液的組成為pH7.4的10mMPBS即磷酸緩沖液，其中含10%山羊血清、0.2%吐溫-20和0.02%疊氮鈉。全文摘要本發(fā)明涉及一種登革病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒包括酶標(biāo)記板、陰性對(duì)照血清、陽(yáng)性對(duì)照血清、酶標(biāo)記物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、封板膠，所述酶標(biāo)記物包含羊抗人IgG-HRP；所述酶標(biāo)記板上的包被抗原包括氨基酸序列為SEQIDNo.1的重組1型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.3的重組2型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.5的重組3型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.7的重組4型登革病毒包膜蛋白特異性抗原。通過檢測(cè)血清中登革病毒IgG抗體，可對(duì)二次或以上多次感染登革熱的病人進(jìn)行早期診斷和對(duì)健康人群的血清流行病學(xué)調(diào)查。并可對(duì)初次感染登革熱的病人進(jìn)行最后確診。文檔編號(hào)G01N33/531GK101308137SQ20071002800公開日2008年11月19日申請(qǐng)日期2007年5月15日優(yōu)先權(quán)日2007年5月15日發(fā)明者周惠瓊,柯昌文,江立敏,夔鄭申請(qǐng)人:廣東省疾病預(yù)防控制中心