專利名稱：：登革病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，涉及一種酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，尤其是涉及一種登革病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。
背景技術：
：登革熱(DengueFever,DF)是由4個血清型登革病毒(DengueVirus,DV)引起的急性蚊媒傳染病，主要通過埃及伊蚊或白紋伊蚊叮咬傳播。登革病毒屬于黃病毒科(Flaviviridae)，黃病毒屬(Flavivirus)。DF是分布最廣，發(fā)病最多，危害較大的一種蟲媒病毒性疾病，廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶的非洲、美洲、東南亞和西太平洋區(qū)的100多個國家和地區(qū)。據(jù)WHO估計全球約有25億人口的健康受到威脅，每年有5000萬人感疾登革病毒。隨著全球氣候變暖日趨嚴重，登革熱地理分布上有蔓延的趨勢，發(fā)病率和疫情的嚴重程度也有所增加，登革熱已成為全球性的嚴重公共衛(wèi)生問題。登革熱在我國經(jīng)過了30多年靜止期后，1978年廣東佛山突然發(fā)生流行，自此，登革熱一直是廣東省重點防治的傳染病。登革熱疫情來勢急，擴散快，不容易控制，對人民的生命健康產生巨大威脅、對地方經(jīng)濟發(fā)展產生極大影響，因而成為一項重大的公共衛(wèi)生問題。登革熱疑似病例的盡快確診可幫助及早發(fā)現(xiàn)疫情，盡快采取措施，在最小范圍控制疫情，因而把損失減到最少。目前我國對登革熱的實驗室診斷主要依靠進口的酶聯(lián)免疫試劑，其價格昂貴，在基層醫(yī)院及市、縣級疾控中心難于普及，另外，進口試劑采購到貨時間長，實驗室有時未能及時拿到試劑，而延誤診斷。首發(fā)病人往往由于誤診，沒有及時釆耳又有效措施，而導致登革熱疫情蔓延。每宗疫情在其發(fā)現(xiàn)時已陷入十分緊張和被動的局面，進而花費巨大的人力物力去控制。因此，開發(fā)出筒便、快速、經(jīng)濟、適宜于基層單位推廣使用的登革熱診斷試劑成為登革熱疫情控制中急需解決的難題。人感染了登革病毒后，一般經(jīng)過310天(通常4~5天)的潛伏期后，受感染者會出現(xiàn)以發(fā)熱、疼痛為主要癥狀的登革熱，同時，機體的免疫系統(tǒng)會產生一系列的免疫應答反應，初次感染登革病毒，機體產生抗體的速度較慢，滴度也較低，IgM為最初應答的抗體。IgG在發(fā)病的第一周末才出現(xiàn)，滴度很低，上升速度也慢。根據(jù)泛美衛(wèi)生組織標準，到發(fā)病的第五天，80%可查到檢測水平的IgM，發(fā)病的第6-10天，93-99%可查到;險測水平的IgM,IgM可持續(xù)存在90天以上。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種登革病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，通過檢測血清中登革病毒IgM抗體，可對初次感染登革熱的病人進行早期診斷。本發(fā)明所述的一種登革病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，包括酶標記板、陰性對照血清、陽性對照血清、酶標記物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、封板膠，所述酶標記物包含羊抗人IgM-HRP,即羊抗人IgM-,束才艮過氧化物酶；所述酶標記板上的包被抗原為基因工程重組表達的登革病毒包膜蛋白特異性抗原，所述抗原包:fe:氨基酸序列為SEQIDNo.l的重組1型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.3的重組2型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.5的重組3型登革病毒包膜蛋^J特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.7的重組4型登革病毒包膜奎白特異性抗原。所述重組1型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.2的DNA序列所編碼的；所述重組2型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.4的DNA序列所編碼的；所述重組3型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.6的DNA序列所編碼的；所述重組4型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.8的DNA序列所編碼的。所述的陽性對照血清是在含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mM的pH7.4的PBS中，加入確定濃度的陽性血清制成，陽性對照的A值應大于1.5;陰性對照血清是在含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mM的pH7.4的PBS中，按5%的比例加入混合好的陰性血清制成，陰性對照的A值應小于0.1。所述酶標記板的制備方法是將所述的基因工程重組表達的登革病毒包膜蛋白特異性抗原按確定的濃度用0.05M的pH9.6的CB即碳酸鹽緩沖液稀釋后，按0.1ml/孔包被到微孔板內，在2°C~8。C吸附24~26小時后，用10mMPBST即吐溫磷酸緩沖液按0.25ml/孔洗板，再用封閉液按0.15ml/孔在2。C8。C封閉18~20小時，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后用鋁膜袋密封，置28。C呆存。所述的封閉液的組成為含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mM的pH7.4的PBS即磷酸緩沖液。所述的酶標記物是用酶標稀釋液按工作濃度配制的羊抗人IgM-HRP工作液，所述的酶標稀釋液的組成為pH7.4的10mM磷酸緩沖液即PBS,其中含10%山羊血清、0.2%吐溫-20和0.02%疊氮鈉。登革病毒為單股正鏈RNA病毒，長度約為11Kb,編碼3400個氨基酸，分子量為4200KDa。基因組含有一個長的開放讀碼框架，編碼病毒的全部蛋白包括3種結構蛋白和7個非結構(NS)蛋白。其中E結構蛋白是一種包膜糖蛋白，亞群特異和型特異的抗原決定簇及中和、血凝抑制作用的主要抗原表位均位于包膜蛋白E上，因此E結構蛋白對病原診斷具有重要意義。本發(fā)明所述的登革病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒采用重組登革病毒1-4型E蛋白B區(qū)的型特異性抗原(約120個氨基酸)，避免與黃熱病毒、乙型腦炎病毒抗原產生交叉反應。國外商品化登革病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑多采用純化的全病毒抗原，這些試劑缺點是本底高，與黃病毒科病毒存在交叉反應，最常見者為乙型腦炎病毒與黃熱病毒。本發(fā)明研制的試'劑盒克服了國外試劑的缺點。'與國內外同類產品比較在國內尚無檢測登革病毒抗體的酶免試劑。在國外，常用的登革熱酶聯(lián)免疫診斷試劑全部采用細胞培養(yǎng)后純化的全病毒抗原。如目前唯一獲得美國FDA批準文號的澳大利亞PanBio公司生產的DengueIgMELISA診斷試劑盒，其不足在于本底高，因而需要借助酶標比色儀檢測，閾值(cut-off值)為0.4-0.65，與黃病毒科病毒如乙型腦炎病毒存在交叉反應。本發(fā)明制備的登革病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑是間接法IgM-ELISA，方法簡便、易操作，靈敏性高，與黃熱病毒、乙型腦炎病毒抗原幾乎不產生交叉反應。本發(fā)明所述的登革病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的成功研制，填補了我國無登革熱診斷試劑的空白，結束我國登革熱酶免試劑長期依賴進口的局面，它可全面替4<進口試劑，用于我國常規(guī)登革熱監(jiān)測樣本的檢測。本發(fā)明對于今后我國登革熱疑似病例的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早處理，及時應對疫情，防止登革病毒傳播，保障人民群眾的健康將可發(fā)4軍重要作用，相對進口試劑盒，本發(fā)明具有價格低廉的優(yōu)勢，保障我國登革熱監(jiān)測工作順利進行的同時，并為我國疾控系統(tǒng)節(jié)約檢測成本。圖1為表達質粒的構建示意圖。圖2為登革重組抗原純化過程SDS-PAGE蛋白電泳圖譜；1:蛋白標準P7708V;2:超聲后離心的上清；3:親和層析純化的蛋白；4:陽離子交換純化的蛋白；5:分子篩純化的蛋白。圖3.為重組蛋白WesternBlot鑒定結果；M:蛋白質markerP7708V;1-3:WB反應帶；4:陰性對照。具體實施例方式實施例一登革抗原的克隆、表達和純化(一)材料1、標準毒抹登革l型(Hawaii抹)，簡稱D1;登革2型(NGC4朱)，簡稱D2;登革3型(H87林)，簡稱D3;登革4型(H241林)，簡稱D4;購自中國藥品生物制品^全定所，.由廣東省疾病預防控制中心保存。.2、質?？寺≥d體BM13質粒購自TaKaRa公司，表達質粒pET22b(+)是Novagen產品。由廣東省疾病預防控制中心-微生物抬、瞼所保存。3、菌抹受體菌五.co/z'TOP10F'和表達用的大腸桿菌BL21StarTM(DE3)購自Invitrogen公司，由廣東省疾病預防控制中心微生物檢驗所保存。4、酶類限制性內切酶、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶和dNTP分別購自New-England、Invitrogen、BOEHRINGERMANNHEIM以及大連寶生物工程有限^>司等。5、其它試劑YeastExtract(酵母粉)、TRYPTONE(蛋白胨)和IPTG誘導劑是BBI產品，購自上海生物工程有限公司。(二)方法1.病毒RNA的提取及cDNA合成采用QIAGEN公司QIAampViralRNAminiKit。按試劑盒要求，提取病毒RNA,以隨機引物逆轉錄合成cDNA。2.PCR擴增基因參照上述登革病毒l-4型毒林的包膜蛋白基因序列(來自Genbank),設計引物，在引物的5'端加上EcoRI酶切位點，在引物的3'端加上Xhol酶切位點，以利于克隆入表達載體。針對登革1型包膜蛋白基因的引物為D1E-F:5，-GGAGGAATTCAAAATGGACAAACTGACTCT-3'D1E-R:5'-CCCACCTCGAGACGACGTGCACCACGGGCAGTCGC-3'針對登革2型包膜蛋白基因的引物為D2E-F:5'-GGAGGAATTCCGTATGGACAAACTACAGCT-3'D2E-R:5'-CCCACCTCGAGACGCTTCGCACCACGCATTGTTGT-3，針對登革3型包膜蛋白基因的引物為D3E-F:5'-GGAGGAATTCAAGATGGACAAATTGAAACT-3'D3E-R:5'-CCCACCTCGAGACGACGTGCACCACGGGCAGTGGC-3'針對登革4型包膜蛋白基因的引物為D4E-F:5，-GGAGGAATTCCGTATGGAGAAATTGCGTATTAAGG-3,D4E-F:5'-CCCACCTCGAGACGCTTTGCGCCACGGTATGTGGA-3'循環(huán)程序為用Invitrogen高保真酶，95°C15分鐘熱起動，94。C變性15s，55。C退火30s,68。C延伸lmin,共22個循環(huán)，68。C再作用5min，冷卻至'4。C。3.PCR片段的純化與回收采用QIAGENGelExtractionKit純化PCR片段。4.基因的克隆基本操作參照《MolecularCloning》(Sambrooketal.,1989)進行。包括酶切和連接；質粒DNA的轉化、重組質粒的篩選及重組質粒的鑒定?？寺〉幕蚱谓?jīng)序列測定確認。將純化的PCR片段先克隆在BM13質粒上測片段核苷酸序列，重組表達登革1-4型包膜蛋白抗原(E)分別表示為D1E、D2E、D3E、D4E，其中，D1E-D3E序列為372個核苷酸，編碼124個氨基酸，D4E序列369個核苦酸，編碼123個氨基酸，具體序列如下D1E的核苦酸及M酸序列(372個核香酸，編碼124個氨基酸)核苦酸序列(SEQIDNo.2)AGGAAGCAGCATAGGGAAAATGTTTGAGGCGACTGCCCGTGGTGCACGTCGT氨基酸序列(SEQIDNo.l)EAEPPFGESYIVIGAGEKALKLSWFKKGSSIGKMFEATARGARRD2E的核苷酸及M酸序列(372個核苷酸，編碼124個氨基酸)核苷酸序列(SEQIDNo.4)AGGAAGTTCTATCGGCCMATGATTGAGACMCAATGCGTGGTGCGAAGCGT氨基酸序列(SEQIDNo.3)EAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMIETTMRGAKRD3E的核苷酸及^J^酸序列(372個核苦酸，編碼124個氨基酸)核香酸序列(SEQIDNo.6)GGGAAGCTCGATTGGGAAGATGTTCGAGGCCACTGCCCGTGGTGCACGTCGT氨基酸序列(SEQIDNo.5)EAEPPFGESNIVIGIGDKALK麗YRKGSSIGKMFEATARGARRD4E的核香^及tt酸序列(369個核苦酸，編碼123個氨基酸)核苷酸序列(SEQIDNo.8)GAGTTCCATTGGCMGATGTTTGAGTCCACATACCGTGGCGCAAAGCGT氨基酸序列(SEQIDNo.7)ELERPLDSYIVIGVGDSALTLHWFRKGSSIGKMFESTYRGAKR5.表達質粒的構建選擇D1E、D2E、D3E和D4E測序結果正確的質粒和載體pET22b(+)質粒進行酶切，回收酶切產物，將經(jīng)純化的酶切片段和載體于16。C連接2小時。表達質粒的構建示意圖見圖1。6.轉化感受態(tài)細胞迅速將20(al連接產物加至感受態(tài)細胞中，冰浴30min;'然后42°C2min,力。1mlLB培養(yǎng)基;37。C水浴rhr并不時搖動；然后將600pl培養(yǎng)基用玻璃棒分別涂布在含120^ig/ml氨節(jié)青霉素LB平板上；平板干燥后37。C倒置過夜。7.DNA提取從平板上挑取重組子至2ml含120pg/ml氨卡青霉素LB培養(yǎng)基搖床過夜培養(yǎng)；用QIAprepSpinminiprepKit提取質粒DNA，用PCR和酶切鑒定片段的大小是否正確。8.接種及培養(yǎng)用登革病毒1-4型重組質粒轉化大腸桿菌BL21Star(DE3),各挑取單一菌落接種到20ml含120jjg/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中，37。C振搖至第二天上午8:30。各取8ml種子液，加200ml含120)ag/ml氨卡青霉素LB培養(yǎng)液，37°C180轉快搖至OD600為0.6左右，加IPTG至lOOyg/ml(IPTG濃度可以優(yōu)化)，同時再補充一次新的氨千青霉素至120ng/ml(兩次共為240|ug/ml),繼續(xù)震搖培養(yǎng)3-5小時，收集菌體。大量發(fā)酵時，用上述方法等量發(fā)酵1-4型菌液，將菌液混合，超聲后離心收集上清，混合蛋白經(jīng)親和層析，透析，陽離子交換和凝膠過濾等多步驟純化。9.聚丙烯酰胺凝月交電泳(SDS-PAGE)將1-4型表達產物超聲后離心的上清，親和層析、陽離子交換和分子篩純化收集的蛋白，走SDS-PAGE蛋白電泳。電泳圖語見圖2。圖2中，1:蛋白標準P7708V;2:超聲后離心的上清；3:親和層析純化的蛋白；4:陽離子交換純化的蛋白；5:分子篩純化的蛋白。經(jīng)過多步純化，最后已看不出有雜帶。最終得到目的蛋白大小約為16KDa。10、抗原活性的初步鑒定WesternBlot(WB)實驗將重組蛋白稀釋進行SDS-PAGE電泳，凝膠轉NC膜，膜切成四條，取三條與登革病毒陽性血清反應，結果重組蛋白與陽性血清呈特異性反應，在約16x103處可見WB反應帶，與SDS-PAGE重組蛋白帶大'J、一致，健康人血清沒有反應，WB實驗圖語見圖3，圖3中，M:蛋白質markerP7708V;1-3:WB反應帶；4:陰性對照。實施例二重組抗原對登革病毒IgM抗體反應活性的測定用間接ELISA方法對純化提取蛋白進行血清學檢測，以確定其對登革病毒抗體陽性血清的反應性。將實施例一所得的抗原按1:500、1:1000、1:》000稀釋后包被ELISA板，與登革陽性血清反應，確定包被抗原濃度。登革抗原的抗原活性達l:1000。重組抗原按選定濃度包被，用間接法ELISA檢測登革病毒分離陽性和登革熱疫情血清IgM抗體，測定重組抗原對登革病毒IgM抗體的反應活性。1.重組抗原對病毒分離陽性血清的反應活性用重組抗原與16份登革病毒分離陽性(I型13份、II型3份)血清反應，結果OD值大于或等于0.29,有些高達3.0以上，個別病例發(fā)病當天或1天后就可檢測到登革病毒IgM抗體，敏感性很高。說明重組抗原對登革病毒分離陽性血清IgM抗體有良好的抗原反應性，結果見表l。表1重組抗原對病毒分離陽性血清的反應活性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.重組抗原對2004年中山市登革熱疫情血清的反應活性用重組抗原檢測2004年中山市65份登革熱疫情血清(36例病人不同發(fā)病時間采集的樣本)，36份急性期血清(發(fā)病時間3-13天采集的)登革病毒IgM抗體全部陽性，有些發(fā)病時間短的樣本OD值偏低，13份恢復期血清(發(fā)病時間37-60天采集的)OD值都很高，15份恢復期血清(發(fā)病時間71-86天采集的)OD值下降，但結果仍是陽性，OD值隨發(fā)病時間由低到高，再由高到低，符合登革病毒感染后IgM的產生及變化規(guī)律。用該重組抗原制備的試劑能準確反映出病人體內登革病毒IgM抗體水平和變化情況，對疫情樣本的檢出率達100%，無一份漏檢。說明重組抗原敏感性高，結果見表2。表2重組抗原對2004年中山登革熱疫情血清的反應活性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>實施例三重組抗原檢測登革病毒IgM抗體的敏感性和特異性將實施例一所得的重組抗原制備成登革病毒IgM抗體檢測試劑(以下稱自研試劑)，用該試劑檢測了大量樣本，對重組抗原的敏感性和特異性進行評估。1.與進口試劑(澳大利亞PanBio)的對比結果分析表1中病毒分離陽性的樣本D010044、D010046、D010047、DO聽O、D010052、D010073、DO10074和2004年登革熱疫情樣本A040124、A040134、A040135、A040137用自研試劑檢測結果均為陽性，用澳大利亞PanBio登革試劑(DengueIgMCaptureELISA)的檢測結果均為陰性，對于登革熱發(fā)病早期的病人血清進行檢測，自研的試劑比澳大利亞PanBio的登革試劑更為敏感。用自研的和澳大利亞PanBio的登革IgM抗體檢測試劑，檢測116份登革熱疫情和臨床登革熱疑似病人血清中的登革病毒IgM抗體，結果自研登革試劑檢出65份陽性，陽性率為56%;澳大利亞PanBio登革試劑只檢出52份陽性，陽性率為44.8%。自研試劑對登革熱疫情和臨床登革熱疑似病人血清中的登革病毒IgM抗體的檢出率明顯高于澳大利亞PanBio登革試劑，結果見表3。'表3自研和澳大利亞PanBio登革試劑比對結果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.對廣東省蟲媒實驗室血清庫的測定結果廣東省自80年代以來，幾乎每年都出現(xiàn)登革疫情。我們用自研試劑檢測了617份各地市級疾病預防控制中心(以下簡稱CDC)上送的登革熱疫情和臨床登革熱疑似病人血清中的登革病毒IgM抗體，結果陽性436份(其中登革1型血清410份、2型血清15份、3型血清5份、4型血清6份，可見本品對登革1-4型血清均具有反應活性，沒有出現(xiàn)某一型別漏檢的情況)，陰性181份，陽性率為70%;對臨床確認登革熱病人樣本的檢出率為90%(2002年傳染病院提供的樣本)，結果見表4。表4廣東省蟲媒實驗室血清庫登革病毒IgM抗體測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>3.發(fā)熱病人和健康人群血清登革IgM抗體檢測結果用自研試劑盒檢測了中山市和湛江市CDC送檢的245份發(fā)熱病人和120份健康人群血清，共檢出陽性24份，其中中山市的14份陽性標本中有12份是2004年登革熱疫情病人血清，本試劑能檢測出發(fā)熱病人中的登革熱患者，健康人群血清中共檢出3份陽性，假陽性率為2.5%。自研試劑具有良好的敏感性和特異性。結果見表5:表52004年發(fā)熱病人和健康人群血清登革IgM抗體檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4.對其它蟲媒病毒陽性血清的檢測用自研試劑盒檢測25份乙腦和16份流行性出血熱(EHF)IgM抗體陽性血清，結果乙腦只有1份OD值為0.327,其余24份均為陰性，16份EHF血清檢測結果全部為陰性。說明重組抗原與乙腦抗體交叉反應性很低，和EHF血清不存在交叉反應。本試劑具良好的特異性。5.干擾檢測用自研試劑盒檢測高血酯、高膽紅素、高血紅蛋白、-黃疽和抗凝劑處理(EDTA、枸櫞酸鈉)的血漿樣本，檢測結果全部為陰性。說明這些血清對DengueIgM的檢測無明顯干擾。對同屬黃病毒科的HCV陽性血清無明顯交叉反應，特異性好。6..對試劑的穩(wěn)定性能檢測將抗原板放入37。C溫箱，考核6天，檢測其對熱環(huán)境下的活性。4企測項包括陰、陽性血清，廠內臨界質控血清，其結果與4'C條件下保存的抗原板所檢測的結果比較，抗原活性下降未超過擬訂規(guī)程的要求。上述結果表明，表達的抗原對登革IgM血清的反應良好。實施例四本發(fā)明所述的登革病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的生產工藝(一)材料1.登革抗原制備見實施例一。所述抗原1:1000包被時，對廠內參比品陽性符合率達到98%,特異性達到97%。2.羊抗人IgM-HRP:SIGMA產品。3.TMB:德國柏林格產品。4.陽性對照血清在含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mM的pH7.4的PBS中，加入確定濃度的陽性血清，陽性^"照的A值應大于1.5。5.陰性對照血清在含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mM的pH7.4的PBS中，按5%的比例加入混合好的陰性血清。陰性對照的A值應小于0.1。6.酶標板12孔板條，CV(%)《10%?？刹捎蒙钲诮鸾腥A有限公司的產品。7.廠內參比品自廣東省疾病預防控制中心微檢所蟲媒病研究室的血清庫中篩選和制備。8.山羊血清購自浙江三利生物制品廠，蛋白含量為3.3±0.5%,無菌試驗陰性，對試劑盒反應系統(tǒng)無抑制。9.其它試劑均為國產分析純試劑。(二)制備過程1.抗原制備及檢定(見實施例一至三)2.包^f皮工藝的確定(1)固相載體的篩選CV值測定包被后取1份Dengue-IgM弱陽性血清(CV血清)用間接法測定10孔CV值；吸附性測定取自制Dengue基因工程抗原自'1:250開始對倍稀釋包被，取1份Dengue-IgM陽性血清用間接法測定，觀察OD〉0.5的孔序。(2)封閉條件的選擇選擇現(xiàn)有的多種封閉液配方進行試驗，最后選定用含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mMPBS(PH7.4),150ul/孔封閉，4。C過夜后扣干。(3)包被板制備將所述的基因工程重組表達的登革病毒包膜蛋白特異性抗原按確定的濃度用0.05M的pH9.6的CB即碳酸鹽緩沖液稀釋后，按O.lml/孔包被到微孔板內，在2°C~8。C吸附24~26小時后，用10mMPBST即吐溫磷酸緩沖液按0.25ml/孔洗板，再用封閉液按0.15ml/孔在2'C8。C封閉18-20小時，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后用鋁膜袋密封，置2~8TM呆存。3、酶標抗體稀釋液的選擇及效價滴定采用經(jīng)篩選的酶標稀釋液(pH7.4的10mMPBS,含10%山羊血清和0.2%吐溫-20、0.2%Bronidox),按工作濃度配制羊抗人IgM-HRP工作液，其穩(wěn)定性符合質檢要求。經(jīng)滴定，羊抗人IgM-HRP的效價為1:12000。4、cut-off^i的確定.從中山市博愛醫(yī)院、中醫(yī)院、人民醫(yī)院取回的正常體檢的血清標本、門診病人血清(非登革熱患者)463份進行;險測，并進行統(tǒng)計分析，得出均值為0.043,SD=0.0519,X+3SD=0.199,確定cut-off值為0.2+陰性對照均值(該值不足0.050的以0.050計)。5、制檢規(guī)程的確定根據(jù)以上實驗及過程，參照《中國生物制品規(guī)程II部》的格式，制訂本試劑盒的制造及檢定規(guī)程。SEQUENCELISTING(序列表)<110〉廣東省疾病預防控制中心〈120〉登革病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒〈130〉<141>2007-05-15<160>16<170〉Patentlnversion3.4〈210>1〈211〉124<212>PRT<213>登革病毒l型E蛋白B區(qū)<400>1LysMetAspLysLeuThrLeuLysGlyMetSerTyrValMetCysThr151015GlySerPheLysLeuGluLysGluValAlaGluThrGinHisGlyThr202530ValLeuValGinlieLysTyrGluGlyThrAspAlaProCysLyslie354045ProPheSerThrGinAspGluArgGlyValThrGinAsnGlyArgLeu505560lieThrAlaAsnProlieValThrAspLysGluLysProValAsnlie65707580GluAlaGluProProPheGlyGluSerTyrlieVallieGlyAlaGly859095GluLysAlaLeuLysLeuSerTrpPheLysLysGlySerSerlieGly100105110LysMetPhe&luAlaThrAlaArgGlyAlaArgArg115120〈210〉2〈211>372〈212〉DNA〈213〉登革病毒l型E蛋白B區(qū)<400〉2aaaatggacaaactgactctaaaagggatgtcatatgttatgtgcacaggctcattcaagGOctagagaaagaagtggctgagacccaacatggaaccgttctagtgcagattaaatacgaa120ggaacagatgcaccatgcaagatccctttttcgacccaagatgaaagaggagtaacccag180aacgggagattaataacagccaaccctatagttactgacaaagaaaaaccagtcaacatt240<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>GluAlaGluProProPheGlyA印SerTyrlielielieGlyValGlu859095ProGlyGinLeuLysLeuAsnTrpPheLysLysGlySerSerlieGly100105110GinMetlieGluThrThrMetArgGlyAlaLysArg115120<210〉4〈211〉372<212〉DNA〈213〉登革病毒2型E蛋白B區(qū)<400>4cgtatggacaaactacagctcaaaggaatgtcatactctatgtgcacaggaaagtttaaa60gttgtgaaggaaatagcagaaacacaacatggaacaatagttatcagsgtacaatatgaa120ggggacggttctccatgtaagatcccttttgagataatggatttggaaaaaagacatgtt180ttaggtcgcctgattacagtcaacccaatcgtaacagaaaaagatagcccagtcaacata240gaagcagaacctccattcggagacagctacatcatcataggagtagagccgggacaattg300a.agctcaactggtttaagaaaggaagttctatcggccaaatgattgagacaacaatgcgt360ggtgcgaagcgt372〈210〉5〈211>124<212>PRT〈213〉登革病毒3型E蛋白B區(qū)〈400〉5LysMetAspLysLeuLysLeuLysGlyMetSerTyrAlaMetCysLeu151015AsnThrPheValLeuLysLysGluValSerGluThrGinHisGlyThr202530lieLeulieLysValGluTyrLysGlyGluAspAlaProCysLyslie354045ProPheSerThrGluAspGlyGinGlyLysAlaHisAsnGlyArgLeu505560lieThrAlaAsnProValValThrLysLysGluGluProValAsnlie65707580GluAlaGluProProPheGlyGluSerAsnlieVallieGlylieGly859095AspLysAlaLeuLyslieAsnTrpTyrArgLysGlySerSerlieGly100105110LysMetPheGluAlaThrAlaArgGlyAlaArgArg115120〈210〉6〈211〉372〈212〉DNA〈213〉登革病毒3型E蛋白B區(qū)<:400>6aagatggacaaattgaaactcaaggggatgagctatgcaatgtgcttgaatacctttgtg601:tgaagaaagaagtctccgaaacgcagcatgggacaatactcattaaggttgagtacaaa120ggggaagatgcaccctgcaagattcctttctccacggaggatggacaagggaaagctcac180aatggcagactgatcacagccaatccagtggtgaccaagaaggaggagcctgtcaacatt240gaggctgaacctccttttggggaaagtaatatagtaattggaattggagacaaagccctg300aaaatcaactggtacaggaagggaagctcgattgggaagatgttcgaggccactgcccgt360ggtgcacgtcgt372〈210〉7〈211〉123〈212〉PRT<213〉登革病毒4型E蛋白B區(qū)<400〉7ArgMetGluLysLeuArglieLysGlyMetSerTyrThrMetCysSer151015GlyLysPheSerlieAspLysGluMetAlaGluThrGinHisGlyThr202530ThrValValLysValLysTyrGluGlyAlaGlyAlaProCysLysVal354045ProlieGlulieArgAspValAsnLysGluLysValValGlyArglie505560lieSerProThrProPheAlaGluAsnThrAsnSerValThrAsnlie65707580GluLeuGluArgProLeuAspSerTyrlieVallieGlyValGlyAsp859095SerAlaLeuThrLeuHisTrpPheArgLysGlySerSerlieGlyLys100105110MetPheGluSerThrTyrArgGlyAlaLysArg115120〈210〉8〈211〉369〈212〉DNA<213〉登革^毒4型E蛋白B區(qū)〈400>8cgtatggagaaattgcgtattaagggaatgtcatacacgatgtgctcaggaaagttctca60attgacaaagagatggcagaaacacagcatgggacaacagtggtaaaagtcaagtatgag120ggtgctggagctccatgtaaagttcccatagagataagagatgtgaacaaggaaaaagtg180gtagggcgtatcatctcacctaccccttttgctgagaataccaacagtgtaaccaacata240gaattagaacgccctttggacagctacatagtaataggtgttggagacagcgcattaaca300ctccattggttcaggaaagggagttccattggcaagatgtttgagtccacataccgtggc360gcaaagcgt369<210>9〈211〉30<212>腿〈213>人工合成引物<400>9ggaggaattcaaaatggacaaactgactct30〈210〉10〈211>35<212〉DNA<213>人工合成引物〈400〉10cccacctcgagacgacgtgcaccacgggcagtcgc〈210>11<211>30〈212>DNA〈213〉人工合成引物〈400〉11ggaggaattccgtatggacaaactacagct〈210〉12〈211>35〈212〉腿〈213>人工合成引物〈400>12cccacctcgagacgcttcgcaccacgcattgttgt〈210>13〈211>30〈212〉DNA<213>人工合成引物<400〉13ggagg33ttc33g3tggac3aMtga朋ct<210>14〈211〉35〈212〉DNA35303530〈213〉人工合成引物〈400〉14cccacctcgagacgacgtgcaccacgggcagtggc35〈210〉15<211>35〈212>DNA<213>人工合成引物<400〉15ggaggaattccgtatggagaaattgcgtattaagg35〈210〉16〈211〉35<212>DNA〈213〉人工合成引物〈400〉16cccacctcgagacgctttgcgccacggtatgtgga3權利要求1、一種登革病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，包括酶標記板、陰性對照血清、陽性對照血清、酶標記物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、封板膠，其特征在于所述酶標記物包含羊抗人IgM-HRP，即羊抗人IgM-辣根過氧化物酶；所述酶標記板上的包被抗原為基因工程重組表達的登革病毒包膜蛋白特異性抗原，所述抗原包括氨基酸序列為SEQIDNo.1的重組1型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.3的重組2型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.5的重組3型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.7的重組4型登革病毒包膜蛋白特異性抗原。2、根據(jù)權利要求1所述的登革病i抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其特征在于所述重組1型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.2的DNA序列所編碼的；所述重組2型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.4的DNA序列所編碼的；所述重組3型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.6的DNA序列所編碼的；所述重組4型登革病毒包膜蛋白特異性抗原是由SEQIDNo.8的DNA序列所編碼的。3、根據(jù)權利要求1所述的登革病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其特征在于所述的陽性對照血清是在含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mM的pH7.4的PBS中，加入確定濃度的陽性血清制成，陽性對照的A值應大于1.5;陰性對照血清是在含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的lOmM的pH7.4的PBS中，按5%的比例加入混合好的陰性血清制成，陰性對照的A值應小于0.1。4、根據(jù)權利要求1所述的登革病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其特征在于所述酶標記板的制備方法是將所述的基因工程重組表達的登革病毒包膜蛋白特異性抗原按確定的濃度用0.05M的pH9.6的CB即碳酸鹽緩沖液稀釋后，按O.lml/孔包被到微孔板內，在2°C~8'C吸附24~26小時后，用10mMPBST即吐溫磷酸緩沖液按0.25ml/孔洗板，再用封閉液按0.15ml/孔在2。C8。C封閉18-20小時，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后用鋁膜袋密封，置28。C保存。5、根據(jù)權利要求4所述的登革病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其特征在于所述的封閉液的組成為含20%山羊血清和0.02%疊氮鈉的10mM的pH7.4的PBS即磷酸緩沖液。6、根據(jù)權利要求1所述的登革病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其特征在于所述的所述酶標記物是用酶標稀釋液按工作濃度配制的羊抗人IgM-HRP工作液，所述的酶標稀釋液的組成為pH7.4的10mM磷酸緩沖液即PBS,其中含10%山羊血清、0.2%吐溫-20和0.02%疊氮鈉。全文摘要本發(fā)明涉及一種登革病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒包括酶標記板、陰性對照血清、陽性對照血清、酶標記物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、封板膠，所述酶標記物包含羊抗人IgM-HRP；所述酶標記板上的包被抗原包括氨基酸序列為SEQIDNo.1的重組1型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.3的重組2型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.5的重組3型登革病毒包膜蛋白特異性抗原；氨基酸序列為SEQIDNo.7的重組4型登革病毒包膜蛋白特異性抗原。通過檢測血清中登革病毒IgM抗體，可對初次感染登革熱的病人進行早期診斷。文檔編號G01N33/53GK101308138SQ20071002800公開日2008年11月19日申請日期2007年5月15日優(yōu)先權日2007年5月15日發(fā)明者周惠瓊,柯昌文,江立敏,夔鄭申請人:廣東省疾病預防控制中心