專利名稱：一種制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及新型鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋 白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法。
技術(shù)背景藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。根據(jù) 其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、 藻紅藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和 變藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亞基， 每個亞基中藻膽色素(phycobilin )通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白 (即o-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相 互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得 CPE主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā) 射約630nm的熒光；CPC吸收約620咖的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素 (phycoerythrobilin，簡稱PEB); PEC的alpha亞基結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素 (phycoviolobilin，簡稱PVB ); PEC的beta亞基結(jié)合的輔基色素為藻藍(lán)膽素 (phycocyanobilin，簡稱PCB); CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為藻藍(lán)膽素PCB。鏈霉親和素可以跟生物素特異結(jié)合，通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)，可以實現(xiàn)信號放 大作用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)檢測和醫(yī) 療檢測等領(lǐng)域。目前主要是通過化學(xué)交聯(lián)實現(xiàn)鏈霉親和素對目標(biāo)的標(biāo)記。CPC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(Tooley A丄Cai Y A, Glazer A N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host[J] Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98(19):10560 10565)。 PCB生物合成基因由力o7和pcjo4組成，可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)PCB (F. T丄andgraf, C. Forreiter, et al. Recombinant holophytochrome in Echerichia coli[J]. FEBSLetters, 2001,508:459-462)。與前人的方法不同，我們發(fā)現(xiàn)」朋Z ae朋sp. PCC7120中W75M9基因編碼betal55裂合酶，在其它藍(lán)藻中也存在同源的betal55裂合 酶。這些betal55裂合酶能催化PCB與CPC的beta亞基及其同源蛋白質(zhì)的155位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價結(jié)合，從而生成具有優(yōu)良熒光性質(zhì)的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。通過基因工程技術(shù)，把鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白基因拼接后 克隆于表達載體，可以在大腸桿菌內(nèi)表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的融 合蛋白，直接實現(xiàn)鏈鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的連接，而不需要通過化學(xué)交 聯(lián)等方法來實現(xiàn)鏈霉親和素標(biāo)記。藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。藻藍(lán)蛋白類 熒光蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，通過直接實現(xiàn)鏈鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白 的連接，可用于生物學(xué)檢測以及醫(yī)療檢測領(lǐng)域。本發(fā)明為藻藍(lán)蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料 應(yīng)用于醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域，特別是檢測領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供分子設(shè)計制備新型鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法。它是應(yīng)用betal55裂合酶催化PCB與鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價結(jié)合，從而制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。將含有betal55裂合酶基因、鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接的基因、PCB生物合成酶基因的表達質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入宿主菌，得到相應(yīng)的工程菌，通過如此設(shè)計的基因工程菌生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的 一種制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法，包括下述步驟(1) 采用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中， 得到beta裂合酶表達質(zhì)粒；(2) 用基因工程方法將藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因和鏈霉親和素基因 拼接后克隆于第二個表達載體中，可以表達鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白的融合蛋白，得到鏈霉 親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達質(zhì)粒；(3) 用基因工程方法將PCB生物合成酶基因力o7和pc/力或其同源基因同時克隆于第 三個表達載體中或分別克隆于第四個表達載體中，得到PCB合成質(zhì)粒；(4) 將beta裂合酶表達質(zhì)粒、鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達質(zhì)粒、PCB生物合 成酶質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌， 應(yīng)用此工程菌發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋 白類熒光蛋白質(zhì)。上述的制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法中所述的宿主菌為大腸 桿菌。所述的betal55裂合酶基因是指與^7a6ae/ a sp. PCC7120中a〃5JJ9基因同源的 基因。所述的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因是指與^7s6ae朋sp. PCC7120或?qū)?a/w'/70犯ssp.PCC7603中c/7c5基因同源的基因。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)，大腸桿菌繁殖快，可以大大縮短周期；2、 與藻類相比，大腸桿菌細(xì)胞壁容易破碎，純化過程中可節(jié)省能源；3、 通過大腸桿菌生產(chǎn)，目標(biāo)蛋白含量高，有His-tag標(biāo)記，且體系中幾乎沒有性質(zhì) 類似的蛋白，提取方便；4、 方便進行藻膽蛋白分子設(shè)計，有利于發(fā)展熒光藻膽蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料。


圖1為本發(fā)明中A115339催化下生成的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的吸 收與熒光光譜；其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
具體實施方式
下面以實例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)地說明。 實施例1(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋te， sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必7aw'/70S"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，脫sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^朋力ae朋sp.PCC7120中的 a^5J^9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-aWMJ9，在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。(2) 將^7a6ae朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5和鏈霉親和素基 因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-^-c/ c& 鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。 鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o/-pc/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即鏈霉親和素基因幼在pET30中在vr/wl和《^n兩個酶切位點之間，脫輔基蛋白基因c; ^9是在fcoRV和兩個酶切位點之間；裂合酶基因a775JJ9在pCDFDuet中，處 于第二個多克隆位點，酶切位點是AWn和WoI ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pcj^)， 它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個多克隆位點，在Afco I禾口尸sH之間， pc州在第二個多克隆位點，在yWe I和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-a^5^3義pET30-sa^cpc5和pACYCDuet-/ o卜pcj^轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng) 基中，37"C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l鵬ol/L， 20。C至37'C振蕩表達約12小 時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體 細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應(yīng) 的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。其吸收與熒光光譜見 附圖1所示，其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下
從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜；取100pL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)至 0D6。。=0. 3 0. 4時，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min;離心lmin (10000g， 4""C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmL預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體，離心 30s(10000g， 4。C)去上清，菌體沉淀用100pL預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰上， 加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30min， 42。C熱休克90s，冰浴5min后加入 300pL LB培養(yǎng)基，37。C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平 板上，倒置于37'C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。
提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和；
分別從中取100^iL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中；37。C振蕩培養(yǎng)至OD6。。二0. 5-0.7
時，冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達；避光、2CTC、 150轉(zhuǎn)/分，表達約12小時。離心
收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株進行大量表達。 實施例2
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種勘a6ae/ a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 7柳i/7os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定?？盿Age朋sp. PCC7120在GeneBank中編號
為BA000019，y(/. ^/w'/ owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^/7a6se朋sp.PCC7120中的 a^5^^^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a7J5^3義在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將^7a6ae朋sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5 (C84S)和鏈霉 親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-^-^ci9(C84S)，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿 菌中能表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的 脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(Z W和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o/-pc;^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即鏈霉親和素基因sa在pET30中在fpy71和5^1I兩個酶切位點之間，脫輔基蛋白基 因cpc戲C84S)是在feoRV和J7w I兩個酶切位點之間；裂合酶基因a7J5JJ9在pCDFDuet 中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是^^n和iZwI ; PCB合成酶基因是2個(力o7和 pc州)，它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個多克隆位點，在辰ol和尸" I之間，pc^在第二個多克隆位點，在MyeI和屈oI之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，
利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-W^^3久pET30-sa~c/ c5 (C84S)和pACYCDuet-力o7-pc_M轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0
的LB培養(yǎng)基中，37t:振蕩培養(yǎng)至0"。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-p-D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為lmraol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可提 純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例3
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力/3a6a謹(jǐn)sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必h/z i"os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。j/7a力ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，尨^yzu'"osiASsp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254, 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^7sZ^e/7S sp.PCC7120中的 a^5^J^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a775J3義在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將脫Ja肌'/7o幼s sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5和鏈霉親和 素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-sa-c/^S，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能 表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基 蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力W和/7C州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-pc州，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即鏈霉親和素基因5a在pET30中在《p/71和^^n兩個酶切位點之間，脫輔基蛋白基
因cpcS是在5boRV和兩個酶切位點之間；裂合酶基因a^M滯在pCDFDuet中，處
于第二個多克隆位點，酶切位點是^^II和i7 o1 ; PCB合成酶基因是2個(力W和pc州)，
它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o/處于第一個多克隆位點，在Afcol和尸"I之間，
pc州在第二個多克隆位點，在7fcfe I和i7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-aW5^J;9、 pET30-^"cpcS和pACYCDuet_/ o7-pcy力轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng) 基中，37-C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腦1/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體 細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應(yīng) 的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例4
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^aZwe/ a sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M 7a/w'/70犯s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^7a/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，差/柳i/ owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^朋tee朋sp.PCC7120中的 a^53朋基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a^5M9，在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將M 7a/w'加仰s sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5 (C84S)和 鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒 叫pET30-sa-cpc5 (C84S)，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大 腸桿菌中能表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo) 記的脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ o7-pcy/！，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。即鏈霉親和素基因幼在pET30中在A>/71和^^1I兩個酶切位點之間，脫輔基蛋白基 因cpc萬(C84S)是在fcoRV和兩個酶切位點之間；裂合酶基因W^5^J9在pCDFDuet 中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是^WlI和^wI ; PCB合成酶基因是2個(Zw7和 pcj^)，它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力W處于第一個多克隆位點，在yVco I和尸" I之間，pc^在第二個多克隆位點，在Wel和i^I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-a"5^滯、pET30-stcpcS (C84S)禾tl pACYCDuet-/ o卜pc州轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2CTC至37。C振蕩 表達約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N:r親和層析，可提 純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例5
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種勘a力朋朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必Z3肌'/ os"s sp. PCC7603部分序列己經(jīng)測定。^73&e/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，M ^/w'/7os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^朋6ae朋sp. PCC7120中的 a7753，效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a775J3A在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相
應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將^7a6朋朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5和鏈霉親和素基
因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pC0LADuet中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-幼-c/x^，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌 中能表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫 輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力W和克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-Z o7-; 《W，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即鏈霉親和素基因^和脫輔基蛋白基因cp^拼接后連接到pCOLADuet的￡boR I和 尸"I之間；裂合酶基因3W5^J9在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是 份/II和J/wI ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pcy力)，它們在同一個載體pACYCDuet-l 中，力o7處于第一個多克隆位點，在AfcoI和尸"I之間，pc^在第二個多克隆位點，在 腸I禾口勘I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-a^5JJ久pCOLADuet-s『cpc5和pACYCDuet-Z o7-; cy/1轉(zhuǎn)入大腸桿 菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的LB 培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 2(TC至37。C振蕩表達約12小 時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體 細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng) 的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例6
(1)從GeneBank中可以查到，藻種sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必Z97W'/ os〃s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。A a6朋朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必7a/w'/Jos"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^a6se/7a sp. PCC7120中的 a^5^J^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a775JJ9，在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將力朋6ae朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^ (C84S)和鏈霉 親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pCOLADuet中，所得質(zhì)粒 叫pCOLADuet-^-cp^ (C84S)，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后， 在大腸桿菌中能表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和 素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o卜pc/A在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即鏈霉親和素基因^和脫輔基蛋白基因cpc沃C84S)拼接后連接到pCOLADuet的^boR I和/^tl之間；裂合酶基因a^5J^^在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位 點是^ 711和Z力o I ;PCB合成酶基因是2個(/w7和pcj^)，它們在同一個載體pACYCDuet-l 中，力o7處于第一個多克隆位點，在AfcoI和尸Wl之間，pcj^在第二個多克隆位點，在 腸I禾口 Z/ 。I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-aWSJJA pCOLADuet-sa~cpc5 (C84S)和pACYCDuet-力o7-pcj^轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B;離
心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Nr親和層析，可提
純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。實施例7
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋tee朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必7a歷i"os〃s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。如a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，M ^肌'/7omssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^7atee朋印.PCC7120中的 a^5"JJ9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a7^5^J9，在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將Z9/w'/7ows sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^和鏈霉親和 素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pC0LADuet中，所得質(zhì)粒叫 pC0LADuet-^-c/^5，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌 中能表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫 輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ o/，cy/),在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因cpc5拼接后連接到pC0LADuet的fcoR I和 尸stl之間；裂合酶基因在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是 5g711禾卩J/ o I ; PCB合成酶基因是2個(力W和/ cW)，它們在同一個載體pACYCDuet-l 中，力W處于第一個多克隆位點，在AtoI和尸Wl之間，； cW在第二個多克隆位點，在 腸I禾口勘I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-a^5^J久pC0LADuet-s『cpc5和pACYCDuet-力o7-pc/力轉(zhuǎn)入大腸桿 菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小 時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體 細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng) 的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例8
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種勘a/^e朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， #. 7朋7i/7oms sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定?？盬ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必J柳j'/7^iASsp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^7s6ae朋sp.PCC7120中的 a^5^J^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-aJ75JJft在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將必7aw'/7o幼s sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5 (C84S)和 鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pCOLADuet中，所得 質(zhì)粒叫pCOLADuet-幼-cp^ (C84S)，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接 后，在大腸桿菌中能表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉 親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pc/力)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-Zw7-p《W，在大腸桿菌中能同時表達H01和PcyA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因cpc沃C84S)拼接后連接到pCOLADuet的fcoR I和尸"I之間；裂合酶基因a"5339在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位 點是^g^II和i7 o I ; PCB合成酶基因是2個(力W和pcj^)，它們在同一個載體pACYCDuet-l 中，力o7處于第一個多克隆位點，在AfcoI和Atl之間，pc^在第二個多克隆位點，在 順I(yè)禾口勘I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-s^5"JJ久pC0LADuet-sa~cpc5 (C84S)和pACYCDuet-力o7-轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lramol/L, 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提 純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例9
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種Z朋6ae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 7a/w'/70幼s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。勘sfee朋sp. PCC7120在GeneBank中編號
為BA000019，M 7柳i/ os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將J朋力朋朋印.PCC7120中的 a775^J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-W753J仏在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將」朋6朋朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因c; cS和鏈霉親和素基 因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-幼-cpcA 鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達得到鏈霉親和 素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達H01。
將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pc/A在大腸桿菌中能表達PcyA。即脫輔基蛋白基因wcS在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因m在yfp/ I和^"7II兩個酶切位點之間；裂合酶基因a775^J9在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是5^711和J/wI ;PCB合成酶基因是2個(力o7和pcy力)， 力o/在pACYCDuet-1中，處于第一個多克隆位點，在Afco I和尸W I之間，pc/力在pETDuet-1 中第二個多克隆位點，在y\we I和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-377M滯、pET30-5^c; c5和pACYCDuet-力o厶pETDuet-/ c/力轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Nr親和層析，可提 純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例10
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， # 〗細(xì)i/ os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定?？盿tee朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，;K sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^73&朋a印.PCC7120中的 a^5^J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a725^JA在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將^7a力朋"a sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因c/ c^ (C84S)和鏈霉 親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-wc/^5(C84S)，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿 菌中能表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的 脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達HOl。
將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pc州，在大腸桿菌中能表達PcyA。
即脫輔基蛋白基因c/x^(C84S)在pET30中是在fcoRV和i7 o I兩個酶切位點之間， 鏈霉親和素基因sa在和^^1I兩個酶切位點之間；裂合酶基因a775^J9在pCDFDuet 中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是5^II和化ol ; PCB合成酶基因是2個(力oJ和 pc州)，Z o7在pACYCDuet-1中，處于第一個多克隆位點，在Afco I禾P尸st I之間，/ c州在 pETDuet-1中第二個多克隆位點，在y^/e I和i7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-a^5^J義pET30_sa~c/ c5(C84S)和pACYCDuet-/ o7、 pETDuet-pcyZ 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖 苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振 蕩表達約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B; 離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可 提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例11
(1)從GeneBank中可以査到，藻種sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 尨7柳i/ osiAS sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^朋6a朋a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必7a啦'"o幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254，可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^朋6朋朋sp.PCC7120中的 a^5^J^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-W7533義在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將M 7a/w'/7os"s sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因c;xW和鏈霉親和 素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-^-c/x^，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能 表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基 蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力W克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達HOl。
將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pc州，在大腸桿菌中能表達PcyA。
即脫輔基蛋白基因cp"在pET30中是在fcoRV和屈o I兩個酶切位點之間，鏈霉親 和素基因幼在《p/71和^711兩個酶切位點之間；裂合酶基因a^5"9在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點，酶切位點是和J/w I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pc州)， 力W在pACYCDuet-1中，處于第一個多克隆位點，在Afcol和尸st I之間，pc;^在pETDuet-l 中第二個多克隆位點，在AWe I和i7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-a"5^3R pET30-sa^c/x^和pACYCDuet-力o厶pETDuet-pcj^轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提 純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例12
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種j朋&e朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必^肌'/7o^as sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必^3肌'/ os〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^7s/^e/7s sp.PCC7120中的 W75"JJ^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a7J5"JJA在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將M Ja邁i，s〃s sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^ (C84S)和 鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒 叫pET30-w(C84S)，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大 腸桿菌中能表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo) 記的脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達H01。
將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pc州，在大腸桿菌中能表達PcyA。
即脫輔基蛋白基因cpc5(C84S)在pET30中是在fcoRV和J/ o I兩個酶切位點之間， 鏈霉親和素基因m在A^"I和《g7II兩個酶切位點之間；裂合酶基因aW5339在pCDFDuet 中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是^ 7II和; PCB合成酶基因是2個(力W和 / c^)， Z o7在pACYCDuet-1中，處于第一個多克隆位點，在vVco I和尸W I之間，pc州在 pETDuet-l中第二個多克隆位點，在AWe I和J/ o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-a"55M、 pET30-stc/ Ci9(C84S)和pACYCDuet-力o入pETDuet-pc^ 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振 蕩表達約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B; 離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N廣親和層析，可 提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例13
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種勘a力ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， i/. 2柳i/ os〃s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。J/7a6aey7a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，J/. h加'加s"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^朋6a朋s sp.PCC7120中的 a^5^^^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a^5^JA在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將^7a力a朋asp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因c/x^和鏈霉親和素基 因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pC0LADuet中，所得質(zhì)粒叫 pC0LADuet-sa-cpc必鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌 中能表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫 輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達H01。
將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pc/A在大腸桿菌中能表達PcyA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因c/ c^拼接后連接到pCOLADuet的fcoR I和 尸"I之間；裂合酶基因s775^39在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是 A^II和i7wl ; PCB合成酶基因是2個(力o/和； ci^)，力o7在pACYCDuet-1中，處于第 一個多克隆位點，在Afco I和尸"I之間，在pETDuet-l中第二個多克隆位點，在AWe I和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1
混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，
利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-a"5^J義pC0LADuet-^3~cpci9和pACYCDuet-力o厶pETDuet-/ c/j 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 2(TC至37。C振 蕩表達約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B; 離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可 提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例14
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種肋a6ae/7a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M h/M'/K^iAS sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。/l朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必^肌'/70SiAs sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將力/7a/^e;73 sp.PCC7120中的 a775^39基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-aL 5^3A在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將力朋6朋朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5 (C84S)和鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pCOLADuet中，所得質(zhì)粒 叫pCOLADuet-幼-cpc^ (C84S)，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后， 在大腸桿菌中能表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和 素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力W克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達H01 。
將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pc^，在大腸桿菌中能表達PcyA。
即鏈霉親和素基因ss和脫輔基蛋白基因cpcS(C84S)拼接后連接到pCOLADuet的￡boR I和尸WI之間；裂合酶基因aW5^J^在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位 點是)fe^n禾t] J力o I ; PCB合成酶基因是2個(力W和； c州)，力o7在pACYCDuet-1中，處 于第一個多克隆位點，在yVcoI和尸stl之間，pcy/!在pETDuet-1中第二個多克隆位點， 在WeI和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet—aWM朋、pC0LADuet-sa~ c; c5 ( C84S )禾Q pACYCDuet-力oA pETDuet-;x;/力轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此 工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫 代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20'C至37'C振蕩表達約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素 -藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni" 親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋 白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例15
(1)從GeneBank中可以查到，藻種勘a6ae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，M 7柳i"os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。J朋力ae"a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，M h肌'/7o^vs sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^朋Z^朋a印.PCC7120中的 a7^5^J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a^5"J3ft在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將M 7a歷i加stA9 sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^和鏈霉親和 素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pC0LADuet中，所得質(zhì)粒叫 pC0LADuet-幼-cpc5，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌 中能表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫 輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達H01。
將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-z c^，在大腸桿菌中能表達PcyA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因cpcS拼接后連接到pC0LADuet的￡boR I和 尸WI之間；裂合酶基因aW5^J^在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位點是 5^HI禾Q ; PCB合成酶基因是2個(力W和/ c/力)，/ o7在pACYCDuet-l中，處于第
一個多克隆位點，在I和尸"I之間，pc/力在pETDuet-l中第二個多克隆位點，在We I禾口勘I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pCDFDuet-aJ75JJ9、 pCOLADuet-sa~c/x^和pACYCDuet-力o厶pETDuet-pcj^
轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖 苷(is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 2CTC至37。C振 蕩表達約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B; 離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可 提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例16
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種j朋6雄a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 尨Ja/w'/ os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。j/7a/^e/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必^/w'/70s^sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將/I朋tee朋sp.PCC7120中的 aW5^39基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a^5J3A在 大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將;K Ja肌'/JO犯s sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5 (C84S)和 鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達載體pCOLADuet中，所得 質(zhì)粒叫pCOLADuet-sa-c; c5 (C84S)，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接 后，在大腸桿菌中能表達得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉 親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達H01。
將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pcyA在大腸桿菌中能表達PcyA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因cpcMC84S)拼接后連接到pCOLADuet的fcoR I和P"I之間；裂合酶基因aL 5"J^^在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點，酶切位 點是和J力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pc;^)，力o7在pACYCDuet-1中，處 于第一個多克隆位點，在yfeol和尸"I之間，pcy/I在pETDuet-1中第二個多克隆位點， 在yVofel和之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段， 把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pCDFDuet-a^5^J9、 pCOLADuet-( C84S )禾。pACYCDuet-力o7 、 pETDuet-z^j^轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此 工程菌接種于pH 7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至ODe。。為0. 5至0.8，加入異丙基硫 代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37t:振蕩表達約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素 -藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni" 親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋 白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 上述制備方法適用于釆用各種藍(lán)藻中的betal55裂合酶、藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白、藻 藍(lán)膽素生物合成酶基因或其同源基因以及鏈霉親和素基因及其同源基因來制備鏈霉親和 素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，但涉及到微生物菌種公開的問題，本發(fā)明只選用了 GenBank中己公開全序列的藍(lán)藻力朋6朋朋sp. PCC7120和已經(jīng)部分測序的yK 7柳y/ os"s sp. PCC7603為例對本發(fā)明方法加以說明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開的內(nèi)容采用其 它原料實施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法，其特征在于包括下述步驟(1)采用基因工程方法，將beta155裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到beta裂合酶表達質(zhì)粒；(2)用基因工程方法將藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因和鏈霉親和素基因拼接后克隆于第二個表達載體中，可以表達鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達質(zhì)粒；(3)用基因工程方法將PCB生物合成酶基因ho1和pcyA或其同源基因同時克隆于第三個表達載體中或分別克隆于第四個表達載體中，得到PCB合成質(zhì)粒；(4)將beta裂合酶表達質(zhì)粒、鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達質(zhì)粒、PCB生物合成酶質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的宿主菌為大腸桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的betal55裂合酶基因是指與 力朋6ae朋sp. PCC7120中aWMJ9基因同源的基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因是 指與^ aZ^e朋sp. PCC7120或屈Ja/z J'/7oms sp. PCC7603中c;x^基因同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法，通過應(yīng)用藻膽蛋白beta155裂合酶催化藻藍(lán)膽素與鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價結(jié)合，制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法應(yīng)用生物過程生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法。藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)能應(yīng)用于食品、保健與醫(yī)藥功能材料領(lǐng)域，特別是應(yīng)用為生物和醫(yī)學(xué)分子監(jiān)測領(lǐng)域的熒光探針。
文檔編號G01N33/52GK101408541SQ20071003077
公開日2009年4月15日 申請日期2007年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月9日
發(fā)明者佟順剛, 明 周, 坤 夏, 趙開弘 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司;華中科技大學(xué)