基于生物素和鏈霉親和素系統(tǒng)的微流控免疫芯片分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于生物素和鏈霉親和素信號(hào)放大系統(tǒng)的微流控免疫芯片分析方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]構(gòu)建高靈敏分析方法一直是分析化學(xué)領(lǐng)域追求的目標(biāo)之一。高靈敏分析方法推動(dòng)了分析化學(xué)的發(fā)展及其在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全、生物成像等領(lǐng)域的應(yīng)用。在重大傳染病、細(xì)菌或病毒感染、癌癥等疾病的早期診斷以及食品和環(huán)境中痕量有毒物質(zhì)的篩查中，高靈敏分析方法尤為重要。以抗體-抗原特異性識(shí)別為基礎(chǔ)的免疫生物標(biāo)記分析方法是一種將生物標(biāo)記技術(shù)的高靈敏性和免疫反應(yīng)的高度特異性結(jié)合在一起的分析方法，具有靈敏度高、特異性好、分析快速等優(yōu)點(diǎn)。酶聯(lián)免疫是其中的代表，該方法具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡單、成本低、易于商品化和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。但傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法一般都是基于免疫標(biāo)記酶和底物之間的一次酶促信號(hào)放大，其靈敏度只能達(dá)到ng/mL。同時(shí)，酶聯(lián)免疫分析方法反應(yīng)時(shí)間長，勞動(dòng)強(qiáng)度大。在需要高靈敏度、臨床快速診斷的分析領(lǐng)域，傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法很難滿足需要，因此，如何實(shí)現(xiàn)簡單便捷快速的高靈敏免疫分析仍是分析化學(xué)領(lǐng)域的重要挑戰(zhàn)之一。
[0003]近年來，毒品的泛濫給世界各國人民的生命財(cái)產(chǎn)構(gòu)成重大的威脅，因此世界各國對(duì)禁毒工作十分重視，而毒品的檢測(cè)對(duì)于打擊毒品犯罪、抑制毒品流行具有重要的意義，并且可以為執(zhí)法工作人員提供直接的證據(jù)。然而，由于毒品的種類及數(shù)量逐漸增加，這對(duì)于毒品檢測(cè)鑒定提出了更高的要求。國內(nèi)對(duì)于毒品及代謝物的快速分析，一類主要利用進(jìn)口的免疫檢測(cè)試劑盒，該方法不需要復(fù)雜的樣品前處理，簡單、快速，可很方便的進(jìn)行篩選和現(xiàn)場分析，但是此方法的缺點(diǎn)是干擾因素多，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性，并且只能定性篩檢使用，并不能確定尿液中毒品的含量，所以在作出陽性結(jié)論之前應(yīng)用更精確更特異的方法確證。另一類國內(nèi)比較傳統(tǒng)的定量分析毒品的方法是借助于色譜類檢測(cè)方法，例如氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC/MS)、液相色譜法(HPLC)、液-質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等，此類方法的靈敏度較高，能給出較為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)信息，對(duì)毒品可以進(jìn)行定量分析，但是尿液樣本需要經(jīng)過前處理、萃取、衍生化等復(fù)雜過程，并且需要大型儀器以及專業(yè)人員進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)周期較長，不適合現(xiàn)場、快速的檢測(cè)。
[0004]作為細(xì)菌感染早期發(fā)病專屬性的生物標(biāo)志物，降|丐素原(procalcitonin，PCT)近年來已經(jīng)在臨床診斷中得到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。降鈣素原在正常人血清中的含量很低(< 0.05ng/mL)，當(dāng)細(xì)菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時(shí)，PCT在血清中的含量會(huì)升高，其含量可以反映出機(jī)體被細(xì)菌等感染的程度，并且大量研究結(jié)果表明PCT含量變化對(duì)細(xì)菌感染的敏感度和響應(yīng)速度優(yōu)于傳統(tǒng)的炎癥生物標(biāo)記物(如超敏C-反應(yīng)蛋白)，因此，快速、高靈敏地分析血清中的PCT含量對(duì)細(xì)菌感染早期診斷和合理使用抗生素具有十分重要的意義。目前檢測(cè)血清中降鈣素原的方法主要有酶聯(lián)免疫分析方法、膠體金免疫層析試紙條、化學(xué)發(fā)光免疫分析方法、放射性免疫分析方法等。膠體金免疫層析試紙條具有快速，簡單，成本低等優(yōu)點(diǎn)，但該方法最大的缺點(diǎn)是靈敏度低。傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法具有操作相對(duì)簡單，檢測(cè)成本比較低等優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度相對(duì)偏低，反應(yīng)時(shí)間較長，難以檢測(cè)到血清中痕量的PCT，因此很難實(shí)現(xiàn)早期診斷?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析方法的靈敏度比傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法提高了 1-2個(gè)數(shù)量級(jí)，其靈敏度達(dá)到0.0lng/mL-0.1ng/mL水平，目前此方法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，但對(duì)于早期感染或者患者自身血清中的超痕量PCT，該方法的靈敏度還有待提高。放射免疫分析方法靈敏度高，可以滿足超痕量PCT檢測(cè)的需要，但是該方法具有放射性污染，操作過程復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間也比較長(8-16h)，限制了該方法在PCT檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0005]微流控芯片技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種微型反應(yīng)操作技術(shù)，該檢測(cè)方法通過某種材質(zhì)加工成的微型管道芯片，制備成微型的反應(yīng)區(qū)域，最突出的優(yōu)點(diǎn)是使用的樣本量及試劑量非常少，并可實(shí)現(xiàn)高通量，多樣本同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)的時(shí)間比傳統(tǒng)微孔板方法大大縮短，是一種非常適合快速現(xiàn)場檢測(cè)的技術(shù)平臺(tái)。然而，微流控免疫芯片并沒有從本質(zhì)上解決傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫分析靈敏度低的問題。
[0006]綜上所述，本領(lǐng)域很有必要研究開發(fā)檢測(cè)靈敏度更高、檢測(cè)更為方便、適合于快速現(xiàn)場檢測(cè)的免疫檢測(cè)分析新技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對(duì)目前的免疫分析方法在檢測(cè)靈敏度、分析速度和信號(hào)讀出方式等方面不能滿足實(shí)際應(yīng)用需求的情況，而提供一種基于生物素和鏈霉親和素系統(tǒng)的微流控免疫芯片分析方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的免疫分析方法具有靈敏度高、信號(hào)讀出方式簡單、檢測(cè)線性范圍寬、分析速度快、檢測(cè)成本低、可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案。
[0009]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是:一種基于生物素和鏈霉親和素系統(tǒng)的微流控免疫芯片分析方法，其包括如下步驟:
[0010](1)取第一張微流控芯片與基底密封，使通道I的表面與基底緊密貼合，將包被物質(zhì)通入通道I中以包被在基底上，包被完成后去掉第一張微流控芯片；
[0011](2)取第二張微流控芯片與基底密封，使通道II的表面與基底緊密貼合且通道II的排布方向與通道I的方向垂直，向通道II中通入待測(cè)物，孵育后用緩沖液進(jìn)行沖洗；
[0012](3)向通道II中通入以生物素或鏈霉親和素標(biāo)記的二抗，孵育后用緩沖液進(jìn)行沖洗，所述二抗為抗待測(cè)物的抗體；
[0013](4)向通道II中通入鏈霉親和素或生物素標(biāo)記的HRP，孵育后用緩沖液進(jìn)行沖洗；
[0014](5)去掉第二張微流控芯片，向反應(yīng)區(qū)域加入HRP催化發(fā)光的化學(xué)反應(yīng)液，以化學(xué)發(fā)光儀讀取數(shù)據(jù)；
[0015]其中，所述通道I為第一張微流控芯片的通道，所述通道II為第二張微流控芯片的通道；
[0016]當(dāng)待測(cè)物為完全抗原時(shí)，所述包被物質(zhì)為能夠與所述完全抗原對(duì)應(yīng)結(jié)合且與所述二抗具有不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體，當(dāng)待測(cè)物為抗體時(shí)，所述包被物質(zhì)為與所述抗體對(duì)應(yīng)的完全抗原或與所述抗體對(duì)應(yīng)的由半抗原分子與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)形成的人工抗原；
[0017]當(dāng)步驟(3)中加入以生物素標(biāo)記的二抗時(shí)，則步驟(4)中加入以鏈霉親和素標(biāo)記的HRP;當(dāng)步驟(3)中加入以鏈霉親和素標(biāo)記的二抗時(shí)，則步驟(4)中加入以生物素標(biāo)記的HRP。
[0018]本發(fā)明中，步驟(1)為取第一張微流控芯片與基底密封，使通道I的表面與基底緊密貼合，將包被物質(zhì)通入通道I中以包被在基底上，包被完成后去掉第一張微流控芯片。
[0019]所述的微流控芯片為本領(lǐng)域常規(guī)，普通市售的微流控芯片均適用于本發(fā)明，其一般都具有多個(gè)并列的通道，可以用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本或者多個(gè)指標(biāo)。
[0020]所述的基底為本領(lǐng)域常規(guī)所指，一般指固相反應(yīng)基底。所述基底的材質(zhì)為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地選自聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷和聚甲基丙烯酸甲酯，更佳地為聚苯乙烯。
[0021]如本領(lǐng)域常規(guī)，所述的包被物質(zhì)為捕獲物質(zhì)，一般是抗體，如果是半抗原分子，則將半抗原分子與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)后再進(jìn)行包被。所述的包被物質(zhì)能夠特異性結(jié)合步驟(2)中所述的待測(cè)物。
[0022]所述的將包被物質(zhì)通入通道I中以包被在基底上是本領(lǐng)域的常規(guī)操作，即將包被物質(zhì)包被于基底上之后，于合適溫度孵育一段時(shí)間(如室溫下30min)，以使包被物質(zhì)牢固吸附于基底即可。
[0023]本發(fā)明中，步驟(2)為取第二張微流控芯片與基底密封，使通道II的表面與基底緊密貼合且通道II的排布方向與通道I的方向垂直，向通道II中通入待測(cè)物，孵育后用緩沖液進(jìn)行沖洗。
[0024]其中，所述待測(cè)物為待檢測(cè)的