專利名稱：：定量測(cè)定人體丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于體外臨床診斷試劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種適用于測(cè)定人體全血、血清或血漿等中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等生化指標(biāo)的干化學(xué)試紙。
背景技術(shù)：
：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶又稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶，它催化L一丙氨酸和L一谷氨酸之間氨基的轉(zhuǎn)移。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶主要存在于肝細(xì)胞的胞漿中，在心肌、骨骼肌及其它組織中的含量較低。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是肝臟的特異性酶，血清值升高表明肝細(xì)胞質(zhì)膜存在滲漏并退化，其升高的程度與受累細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)。臨床上測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的試劑可分為液體試劑和干化學(xué)試紙兩類。干化學(xué)試紙主要用于快速檢測(cè)。同液體試劑相比，干化學(xué)試紙具有方便、靈活、污染小、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。目前，檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的的干化學(xué)試紙多為國(guó)外產(chǎn)品，主要有縱向和橫向兩類。第一類是以強(qiáng)生公司和富士公司為代表的多層膜干片法，利用感光膠片的涂層技術(shù)將試劑層、輔助試劑層、光漫射層和分布層等試劑涂布在透明支持層上，從支持層的反面測(cè)定光密度的變化。如專利U.S.PAT.N0.5,508，173。第二類是羅氏公司的干化學(xué)產(chǎn)品，U.S.PAT.NO.4,604,264將試劑涂布在多絲的纖維或織物上，全血通過(guò)玻璃纖維橫向過(guò)濾后與上試劑層接觸反應(yīng)，通過(guò)上部覆蓋的一透明薄膜測(cè)定光密度的變化。上述這些產(chǎn)品，有的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，需要專門(mén)的技術(shù)；有的可能存在某些缺陷，如加樣和測(cè)定在同一側(cè)可能會(huì)造成干擾。而且目前應(yīng)用的干式生化分析儀為大中型設(shè)備，它將若干個(gè)生化項(xiàng)目集中在一臺(tái)儀器上測(cè)定。在測(cè)定單一的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶項(xiàng)目時(shí)，如流動(dòng)采血車等場(chǎng)合，其功能和速度會(huì)受到限制。本發(fā)明旨在提供獨(dú)立的小型機(jī)和試紙，更適合丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的大規(guī)模快速篩査。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種使用方便、快速的定量測(cè)定人體全血、血清或血漿中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙。本發(fā)明提供的定量測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，為長(zhǎng)條形，一端為手持區(qū)，另一端為測(cè)試區(qū)，其結(jié)構(gòu)如圖1和圖2所示。它由上支持層1、下支持層2、底物層5和顯色層6組成。其中，上支持層1和下支持層2通過(guò)自帶的膠層粘合在一起。在上支持層1的測(cè)試區(qū)開(kāi)有加樣孔3，下支持層2的對(duì)應(yīng)位置開(kāi)有測(cè)試孔4。底物層5和顯色層6迭合，位于加樣孔和測(cè)試孔處的上支持層1和下支持層2之間。本發(fā)明中，上支持層1和下支持層2可采用高分子聚合材料，如聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚酯纖維等。其中優(yōu)選聚酯纖維。單片支持層的厚度為100-250ym，大小為6X50咖-12X80鵬。上下支持層上的加樣孔和測(cè)試孔為圓形，直徑相同，為4-8mm。加樣孔3用于滴加樣品，測(cè)試孔4用于觀察和測(cè)定反應(yīng)區(qū)顏色的變化。本發(fā)明中，底物層5用來(lái)接受樣品，樣品在底物層擴(kuò)散，將浸漬在底物層上的試劑溶解，樣品中的可檢測(cè)部分被轉(zhuǎn)運(yùn)到顯色層的樣品面。底物層5優(yōu)選反應(yīng)區(qū)面積能容納大約10-30yl血液，并能將大約6-10iil樣品轉(zhuǎn)運(yùn)至顯色層的材料。適合做底物層的材料包括玻璃纖維、各種濾紙或無(wú)紡布等，特別優(yōu)選玻璃纖維，其結(jié)構(gòu)疏松，血液樣品中的可檢測(cè)部分和試劑能快速滲透至顯色層，縮短了反應(yīng)時(shí)間。本發(fā)明中，顯色層6為浸漬有檢測(cè)試劑和色原的各種濾紙、無(wú)紡布或合成膜等，優(yōu)選聚砜、聚醚砜或尼龍等材料的合成膜，特別優(yōu)選具有孔徑大小呈梯度變化的孔的合成膜，合成膜上的小孔孔徑范圍為0.2-10um。合成膜有一個(gè)用于點(diǎn)樣的樣品面，和一個(gè)可觀察到顏色變化的檢測(cè)面。當(dāng)血液滲透到膜的大孔面上后，樣品逐漸穿過(guò)膜，流過(guò)的孔徑越來(lái)越小。最后，紅細(xì)胞等物質(zhì)到達(dá)膜的某個(gè)位置就不再往下滲透。含有丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的剩余樣品滲透到小孔面，通過(guò)一系列反應(yīng)，使色原顏色發(fā)生變化，從而指示樣品中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的濃度。本發(fā)明中，反應(yīng)試劑分布于底物層和顯色層上。定量全血或血清/血漿滴加于加樣孔內(nèi)，樣品均勻分布并滲入試劑層中。樣品中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)催化底物L(fēng)一丙氨酸和a—酮戊二酸鈉，產(chǎn)生L一谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸被丙酮酸氧化酶在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及硫胺素焦磷酸(TPP)存在下氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫。在過(guò)氧化物酶作用下，過(guò)氧化氫氧化無(wú)色色原生成有色產(chǎn)物，顏色變化與樣品中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性成正比，用反射光度計(jì)可測(cè)定之。本發(fā)明中，反應(yīng)試劑包括緩沖體系、底物、丙酮酸氧化酶、過(guò)氧化物酶、色原、激活劑、穩(wěn)定劑等。緩沖體系可以是磷酸鹽緩沖液、Tris-HCL或Good's緩沖液等，濃度為0.05M一1.0M，反應(yīng)最佳pH值在6.5-8.0。底物采用L—丙氨酸和a—酮戊二酸鈉，底物在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的催化下產(chǎn)生L一谷氨酸和丙酮酸。L一丙氨酸的濃度為0.5M-1.5M，a—酮戊二酸鈉的濃度為5mM-50mM。生成的丙酮酸被丙酮酸氧化酶在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及硫胺素焦磷酸(TPP)存在下氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫。丙酮酸氧化酶的適宜濃度為30-100U/ml，F(xiàn)AD濃度為0.1mg/ml-0.2mg/ml，TPP濃度為0.4mg/ml-0.8mg/ml;丙酮酸氧化酶的激活劑采用Mg2Mg^的濃度為1.0g/L-3.0g/L;酶的穩(wěn)定劑采用二糖、多糖類或蛋白類穩(wěn)定劑等，如蔗糖、海藻糖和牛血清白蛋白等，在體系中的重量濃度為0.1-2.0%。在過(guò)氧化物酶作用下，過(guò)氧化氫氧化無(wú)色色原生成有色產(chǎn)物。過(guò)氧化物酶濃度為30-100U/ml。色原作為指示劑，可以是單一組分或兩種組分的色原物質(zhì)，優(yōu)選色原強(qiáng)吸收處的波長(zhǎng)不同于樣品的強(qiáng)吸收處的波長(zhǎng)，特別優(yōu)選強(qiáng)吸收處的波長(zhǎng)為610-650nm的色原，濃度為0.03%-0.5%。為定量測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性，發(fā)明人還研制了反射式分光光度計(jì)(另案申請(qǐng)專利)，與本發(fā)明試紙條配套使用。6-30W血樣滴加于試紙條上，反應(yīng)溫度控制在37±0.3。C，用該光度計(jì)測(cè)定試紙反應(yīng)后在630士20nm波長(zhǎng)下反射光密度的變化，測(cè)試在3.5-5分鐘內(nèi)完成。自動(dòng)報(bào)告和存儲(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并打印。本發(fā)明使用丙酮酸氧化酶法測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性，采用底物層和顯色層迭合的結(jié)構(gòu)，試劑穩(wěn)定性好，顯色強(qiáng)度高，均勻度好，減少了加樣端測(cè)定產(chǎn)生的氣泡、過(guò)量液體、紅細(xì)胞等造成的干擾，可使用全血和血清/血漿作為標(biāo)本。本發(fā)明制造工藝簡(jiǎn)單，與專門(mén)設(shè)計(jì)的小型反射式光度計(jì)配套，使用更為方便快速。圖1為本發(fā)明的干化學(xué)試紙圖示。圖2為本發(fā)明的干化學(xué)試紙剖面圖示。圖中標(biāo)號(hào)1為上支持層，2為下支持層，3為加樣孔，4為測(cè)試孔，5為底物層，6為顯色層。圖3為實(shí)施例1的測(cè)定結(jié)果的回歸直線方程。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:上、下支持層采用PVC片，用打孔機(jī)打出加樣孔3和測(cè)試孔4，孔直徑為4mm，孔距為8mm。底物層5采用玻璃纖維，粘貼于上支持層。顯色層6采用尼龍膜，粘貼于下支持層。將配制好的底物溶液和顯色液用BIO-DOT噴點(diǎn)儀分別點(diǎn)樣于底物層5和顯色層6，每孔6ri。將噴點(diǎn)后的試紙放入30-5(TC的真空干燥箱中，干燥后取出。將上、下支持層對(duì)合粘帖在一起，加樣孔3與測(cè)試孔4對(duì)齊。用滾刀機(jī)將試紙切成8mm寬的試紙條即成。試劑組成如下磷酸鹽緩沖液50mML一丙氨酸500mMa—酮戊二酸鈉lOmMMgCl2*6H20:2.4g/L過(guò)氧化物酶30U/ml丙酮酸氧化酶30U/ml黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD):0.lmg/ml硫胺素焦磷酸(TPP):0.4mg/ml4-氨基安替比林1.2g/LDAOS(色原)0.85g/L(N-乙基一N—(2—羥基一3—磺酸基丙基)一3，5—二甲氨基苯胺)牛血清白蛋白0.2%將6iU7%牛血清白蛋白配制的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶校準(zhǔn)品滴加于加樣孔，用反射式光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，讀取2.5—4分鐘時(shí)的反射強(qiáng)度的變化。結(jié)果見(jiàn)表l:ALT濃度(U/L)反射強(qiáng)度變化15.662.51252000.0320.0500.0800.111以此建立直線回歸方程為Y(反射強(qiáng)度變化)二O.0004X(ALT濃度)+0.0245，r2=0.9987。如圖3所示。實(shí)施例2:上、下支持層采用PET片，用打孔機(jī)打出加樣孔3和測(cè)試孔4，孔直徑為4mm,孔距為8mm。底物層5采用玻璃纖維，顯色層6采用PES膜，寬度為8mm。將底物層5和顯色層6分別浸泡于底物溶液和顯色液中，完全浸濕后取出，刮平。將浸濕的試紙放入30-5(TC的真空干燥箱中，干燥后取出。將底物層5粘貼于上支持層，顯色層6粘貼于下支持層。將上、下支持層對(duì)合粘帖在一起，加樣孔3與測(cè)試孔4對(duì)齊。用滾刀機(jī)將試紙切成8mm寬的試紙條即成。試劑組成如下Good's緩沖液200mML一丙氨酸lOOOmMa—酮戊二酸鈉20mMMgCl2*6H20:2.0g/L過(guò)氧化物酶lOOU/ml丙酮酸氧化酶100U/ml黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD):0.2mg/ml硫胺素焦磷酸(TPP):0.8mg/mlKH2P04:20mM3',3',5'，5'-四甲聯(lián)苯胺(色原)0.1%海藻糖0.5%用高濃度的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶血清稀釋紅細(xì)胞，得到紅細(xì)胞壓積為20%、30%、40%、50%和60%的全血標(biāo)本，加樣量為20nl，分別滴加于加樣孔，用反射式光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，讀取3—4分鐘時(shí)的反射強(qiáng)度的變化。結(jié)果見(jiàn)表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果說(shuō)明紅細(xì)胞壓積在30%—50%的全血標(biāo)本在測(cè)定時(shí)幾乎不受紅細(xì)胞的干擾。權(quán)利要求1、一種定量測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，其特征在于形狀為長(zhǎng)條形，一端為手持區(qū)，另一端為測(cè)試區(qū)，由上支持層(1)、下支持層(2)、底物層(5)和顯色層(6)組成；其中，上支持層(1)和下支持層(2)通過(guò)自帶的膠粘層粘合在一起；在上支持層(1)的測(cè)試區(qū)開(kāi)有加樣孔(3)，下支持層(2)的對(duì)應(yīng)位置開(kāi)有測(cè)試孔(4)；底物層(5)和顯色層(6)迭合，位于加樣孔(3)和測(cè)試孔(4)處的上支持層(1)和下支持層(2)之間；底物層(5)和顯色層(6)上浸漬有反應(yīng)試劑；該反應(yīng)試劑包括緩沖體系、底物、丙酮酸氧化酶、過(guò)氧化物酶、色原、激活劑和穩(wěn)定劑，其中，緩沖體系是磷酸鹽緩沖液、Tris-HCL或Good’s緩沖液，濃度為0.05M-1.0M，反應(yīng)pH值在6.5-8.0；底物為L(zhǎng)-丙氨酸和α-酮戊二酸鈉，L-丙氨酸的濃度為0.5M-1.5M；α-酮戊二酸鈉的濃度為5mM-50mM；丙酮酸氧化酶的濃度為30-100U/ml；過(guò)氧化物酶濃度為30-100U/ml；色原是單一組分或兩種組分的色原物質(zhì)，濃度為0.03％-0.5％；丙酮酸氧化酶的輔酶采用黃素腺嘌呤二核苷酸和硫胺素焦磷酸，黃素腺嘌呤二核苷酸濃度為0.1mg/ml-0.2mg/ml，硫胺素焦磷酸濃度為0.4mg/ml-0.8mg/ml；丙酮酸氧化酶的激活劑采用Mg2+，濃度為1.0g/L-3.0g/L；酶的穩(wěn)定劑為二糖、多糖類或蛋白類穩(wěn)定劑，在體系中的重量濃度為0.1-2.0％。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，其特征在于所述的上支持層和下支持層的材料為高分子聚合材料，單片支持層的厚度為100-250wm,大小為6X50mm-12X80mm，上支持層和下支持層的規(guī)格相同，其上的加樣孔(3)和測(cè)試孔(4)為圓形，直徑為4-8mm。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，其特征在于所述的底物層(5)的材料采用玻璃纖維、各種濾紙或無(wú)紡布。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，其特征在于所述的顯色層(6)的材料為各種濾紙、無(wú)紡布或合成膜。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的定量測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，其特征在于所述合成膜為聚砜、聚醚砜或尼龍。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的定量測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的干化學(xué)試紙，其特征在于所述合成膜具有孔徑大小呈梯度變化的孔，其中小孔的孔徑范圍為0.2-104m。全文摘要本發(fā)明屬于體外臨床診斷試劑領(lǐng)域，具體為一種定量測(cè)定人體丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的干化學(xué)試紙。試紙由長(zhǎng)條形的上、下支持層組成，在測(cè)試區(qū)從上到下依次為加樣孔、底物層、顯色層和測(cè)試孔。底物層可選用玻璃纖維、濾紙和無(wú)紡布等材料，浸漬有底物等試劑；顯色層為各種濾紙、無(wú)紡布或合成膜，浸漬有色原等試劑。樣品從加樣孔進(jìn)入底物層，轉(zhuǎn)運(yùn)至顯色層的樣品面，含有被檢測(cè)成分的液體滲透至顯色層的檢測(cè)面，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)引起色原顏色的改變，通過(guò)下支持層上的測(cè)試孔在顯色層的檢測(cè)面即可測(cè)定光密度的變化。該試紙用于快速測(cè)定人體全血、血清或血漿中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性，是肝功能檢測(cè)的重要指標(biāo)之一。文檔編號(hào)G01N21/78GK101105491SQ200710044719公開(kāi)日2008年1月16日申請(qǐng)日期2007年8月9日優(yōu)先權(quán)日2007年8月9日發(fā)明者朱世成,縵王,漪田申請(qǐng)人:上?？迫A生物工程股份有限公司