用于生產(chǎn)β-丙氨酸的工程菌及生產(chǎn)β-丙氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物催化領(lǐng)域，尤其設(shè)及用于生產(chǎn)0-丙氨酸的基因工程菌的構(gòu)建及 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 0-丙氨酸是自然界天然存在的唯一一個(gè)0型丙氨酸，在醫(yī)療，食品，化工領(lǐng)域有 廣泛的應(yīng)用。如作為化工原料合成泛酸巧、肌膚W及用于合成治療腫瘤高血巧的帕米磯酸 鋼和治療潰瘍性腸炎的費(fèi)特異性抗炎藥物己柳氮。另外，0-丙氨酸還可W作為藥劑制備 中的沉淀劑、水的凈化絮凝劑、電鍛緩蝕劑、鉛中毒解毒劑W及用于合成甜味劑等。
[0003] 0 -丙氨酸化學(xué)法生產(chǎn)包括丙締膳法、丙締酸法、班巧酷亞胺降解法及0 -氨基丙 膳法。其中，丙締膳法是國內(nèi)生產(chǎn)0-丙氨酸的主要方法。該方法將丙締膳和氨水氨化反 應(yīng)生成0-氨基丙膳，再在酸性或堿性條件下水解即得。該方法原料易得，成本較低，但有 副反應(yīng)，且水解過程中生成大量無機(jī)鹽，產(chǎn)物較難純化。
[0004] 近年來，通過生物轉(zhuǎn)化法來生產(chǎn)0-丙氨酸因其反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、環(huán)境 友好等特點(diǎn)受到越來越多的關(guān)注。生物轉(zhuǎn)化法主要利用心天冬氨酸a駿化酶特異性地 脫去k天冬氨酸的a駿基，生成P -丙氨酸。1999年，Nicole等報(bào)道了在大腸桿菌中 過表達(dá)其自身來源的心天冬氨酸a駿化酶，酶活僅為〇.22U/mg，而在大腸桿菌中表達(dá)來 源于谷氨酸椿狀桿菌的心天冬氨酸a駿化酶，酶活為3. 42U/mg(Nicole, 1999, Applied and Elnvironmental Microbiology)。2002 年，Qiopra 等發(fā)現(xiàn)來源于結(jié)核桿菌 (M. tuberculosis)的心天冬氨酸 a 駿化酶的酶活為 35 ]imol/g*h(Qiopra, 2002, Protein Expression and 化rification)〇2006年，中國專利申請公開No. CN 101210230A，其中公開 了使用過表達(dá)其自身來源的心天冬氨酸a駿化酶的大腸桿菌化21 〇)E3)進(jìn)行生物催化， 最終產(chǎn)0-丙氨酸2. 94g/L。由此可見，該些早期研究中由于所選擇的心天冬氨酸a駿化 酶活性較低，從而導(dǎo)致生物轉(zhuǎn)化得到的0 -丙氨酸產(chǎn)量極低，無法達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的需要。 因此，仍需要進(jìn)一步開發(fā)可用于工業(yè)化微生物催化制備0-丙氨酸的工程菌及可行的制備 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述問題，本發(fā)明通過在大腸桿菌基因組上選擇合適的整合位點(diǎn)，將本發(fā)明 人之前篩選到的高酶活的、來源于枯草芽抱桿菌炬acillus subtilis)的心天冬氨酸a 駿化酶編碼基因整合到大腸桿菌基因組上，獲得不包含質(zhì)粒的基因工程菌，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，不 僅能夠表達(dá)產(chǎn)生高活性的心天冬氨酸a駿化酶，而且避免了菌體培養(yǎng)過程中抗生素的使 用及質(zhì)粒丟失情況，適于工業(yè)化微生物酶催化制備0 -丙氨酸。
[0006] 為此，根據(jù)本發(fā)明，提供一種工程菌，其中所述工程菌是在大腸桿菌基因組上的一 個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)（例如2~4個(gè)）整合有DNA序列的重組菌，所述DNA序列包含選自編碼枯 草芽抱桿菌心天冬氨酸a駿化酶的基因和編碼與所述酶具有至少60%、優(yōu)選80%、更優(yōu) 選90%、進(jìn)一步優(yōu)選95%和最優(yōu)選98%、甚至99%同源性且具有所述酶活性的多膚的基因 中的一個(gè)。
[0007] 所述枯草芽抱桿菌k天冬氨酸a駿化酶優(yōu)選為序列6所示的氨基酸序列。
[000引本發(fā)明的工程菌能夠過表達(dá)序列6所示的枯草芽抱桿菌的k天冬氨酸a駿化 酶或者過表達(dá)與所述酶具有至少60 %、優(yōu)選80 %、更優(yōu)選90 %、進(jìn)一步優(yōu)選95 %和最優(yōu)選 98%同源性且具有所述酶活性的多膚。
[0009] 根據(jù)一種實(shí)施方式，所述編碼枯草芽抱桿菌心天冬氨酸a駿化酶的基因?yàn)樾蛄?5所示的核巧酸序列。
[0010] 所述DNA序列進(jìn)一步包含啟動(dòng)子序列。
[0011] 對所述啟動(dòng)子序列沒有特別的限制，只要能夠啟動(dòng)插入的心天冬氨酸a駿化酶 編碼基因的任何啟動(dòng)子都是可行的。例如但不限于；枯草芽抱桿菌心天冬氨酸a駿化酶 基因自身的啟動(dòng)子，構(gòu)建本發(fā)明工程菌所用質(zhì)粒中攜帶的啟動(dòng)子，例如可W是PUC19中啟 動(dòng)子、祀T-30a(+)中的啟動(dòng)子，還可W是常用的強(qiáng)啟動(dòng)子，如Lac、T7等。優(yōu)選T7啟動(dòng)子 (序列8)。
[0012] 根據(jù)一種實(shí)施方式，所述整合位點(diǎn)是大腸桿菌基因組中的化地基因和tlaB基因 中的位點(diǎn)。
[0013] 優(yōu)選地，所述大腸桿菌為化21 0E3)。
[0014] 根據(jù)更為具體的實(shí)施方式，通過同源重組將由四個(gè)DNA片段組成的1 ? 2 ? 3 ? 4片 段整合到大腸桿菌化21 〇)E3)基因組中化地基因中，其中所述1 ? 2 ? 3 ? 4片段中，片段 1為大腸桿菌化21值E3)基因組（GenBank:AM946981. 2)第4287847-4287308位核巧酸的 DNA片段，片段2為質(zhì)粒祀T30-panDe(序列7)第68-998位核巧酸的DNA片段，片段3為 質(zhì)粒P邸4佑enBank:AY048743. 1)第31-1507位核巧酸的DNA片段，和片段4為大腸桿菌 BL21 〇)E3)基因組（GenBank:AM946981. 2)第 4287127-4286588 位核巧酸的 DNA 片段；
[0015] 丟掉kan抗性，獲得在化地基因中插入一拷貝心天冬氨酸a駿化酶基因的重組 菌訊
[0016] 通過同源重組將由四個(gè)DNA片段組成的2-1 ? 2-2 ? 2-3 ? 2-4片段整合到大腸桿 菌化21值盼）基因組中tk巧基因中，其中所述2-1 ? 2-2 ? 2-3 ? 2-4片段中，片段2-1為 大腸桿菌化21值E3)基因組（GenBank:AM946981. 2)第2444239-2444839位核巧酸的DNA 片段，片段2-2為質(zhì)粒祀T30-panDe(序列7)第236-735位核巧酸的DNA片段，片段2-3為 質(zhì)粒P邸4佑enBank:AY048743. 1)第31-1508位核巧酸的DNA片段，和片段4為大腸桿菌 BL21 〇)E3)基因組（GenBank:AM946981. 2)第 2445379-2445978 位核巧酸的 DNA 片段；
[0017] 丟掉kan抗性，獲得在化地基因和tlaB基因中插入兩拷貝k天冬氨酸a駿化 酶基因的重組菌。
[0018] 本發(fā)明的工程菌用于生產(chǎn)0 -丙氨酸。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面提供一種生產(chǎn)0-丙氨酸的方法，包括發(fā)酵培養(yǎng)上述工程 菌的步驟。還包括^心天冬氨酸為底物，用所述工程菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)0-丙氨酸。
[0020] 本發(fā)明將原來在質(zhì)粒上表達(dá)的心天冬氨酸a駿化酶整合到大腸桿菌基因組中， 進(jìn)一步提高了培養(yǎng)液中心天冬氨酸a駿化酶活性。本發(fā)明的工程菌不但避免了菌體在大 規(guī)模培養(yǎng)過程中的質(zhì)粒丟失問題，保證了工業(yè)化應(yīng)用過程中酶活的穩(wěn)定，而且該工程菌能 夠正常生長和表達(dá)心天冬氨酸a駿化酶。另外，本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌在菌體培養(yǎng)過程 中無需添加抗生素，節(jié)約了培養(yǎng)成本和后續(xù)污水處理成本，有利于在工業(yè)上實(shí)現(xiàn)0 -丙氨 酸的生物法生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0021] 通過W下附圖可W更好地理解本發(fā)明。
[0022] 圖1為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的HPLC圖譜。
[0023] 圖2為工程菌甲、工程菌己、工程菌丙和工程菌了發(fā)酵液經(jīng)細(xì)胞破碎后得到的上 清液的酶活柱形圖。
[0024] 圖3為生物轉(zhuǎn)化過程中轉(zhuǎn)化體系中生成的0 -丙氨酸濃度隨時(shí)間變化的曲線圖。 [00巧]圖4中A為根據(jù)本發(fā)明的方法構(gòu)建PAND-1菌株時(shí)片段化地-panDe-kan-化地的 電泳圖；B為驗(yàn)證構(gòu)建的PAND-1-1菌株中是否帶有化地-panDe-kan-化地片段的電泳圖；C 為驗(yàn)證構(gòu)建的PAND1菌株中已丟掉卡那霉素抗性的電泳圖。
[0026] 圖5中A為根據(jù)本發(fā)明的方法構(gòu)建PAND-2菌株時(shí)片段tlaB-panDe-kan-tktB的 電泳圖；B為驗(yàn)證構(gòu)建的PAND-2-1菌株中是否帶有tlaB-panDe-kan-tlaB片段的電泳圖；C 為驗(yàn)證構(gòu)建的PAND2菌株中已丟掉卡那霉素抗性的電泳圖。
[0027] 圖6為重組菌株P(guān)AND-1和PAND-2在不同溫度下培養(yǎng)12小時(shí)后培養(yǎng)液中k天冬 氨酸a駿化酶活性檢測結(jié)果。
[002引圖7為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例將編碼枯草芽抱k天冬氨酸a駿化酶的基因插入大腸 桿菌化21 0E3)的同源重組方法示意圖，其中
[0029] A為野生型炬L2UDE3))大腸桿菌基因組中用引物化地-for和化地-rev通過PCR 獲得1735bp DNA片段；
[0030] B為將片段化地-panDe-kan-Fr地插入到基因組后，用引物化地-For和化