專(zhuān)利名稱(chēng)：：對(duì)cea陰性胃癌檢測(cè)和預(yù)后判斷的質(zhì)譜試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的CEA陰性胃癌生物樣品中蛋白質(zhì)分析方法的試劑盒。一種通過(guò)能與蛋白質(zhì)結(jié)合的基質(zhì)去捕獲生物標(biāo)志，并用有定量控制的質(zhì)譜分析來(lái)檢測(cè)CEA陰性胃癌生物標(biāo)志。在此提及的此項(xiàng)發(fā)明涉及蛋白質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域，為一種新的非侵入性的體外質(zhì)譜檢測(cè)方法。本發(fā)明可以應(yīng)用到已經(jīng)脫離人體的體液中的CEA陰性胃癌生物標(biāo)志組合的檢測(cè)方法或試劑盒。
背景技術(shù)：
：不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定人體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于體外疾病樣本診斷及篩査，并最終用于藥物開(kāi)發(fā)和疾病治療。而要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的差異化分析，要求能夠達(dá)到分辨細(xì)胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)序列鑒定分析。用質(zhì)譜聯(lián)合可克服這一技術(shù)缺點(diǎn)。胃癌的發(fā)生是一個(gè)多基因突變導(dǎo)致抑癌基因失活、癌基因活化的過(guò)程。基因組學(xué)研究由于自身的限制難以完全闡明基因與蛋白質(zhì)參與過(guò)程及其具體作用，而近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為人們從整體上了解惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了較為理想的技術(shù)平臺(tái)。目前臨床上對(duì)惡性腫瘤預(yù)后評(píng)估主要依賴(lài)于臨床表現(xiàn)、病理學(xué)及傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志(tumormarker),但腫瘤早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時(shí)常常無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，而病理學(xué)證據(jù)很難得到且重復(fù)性差。我國(guó)胃癌發(fā)病率高，其死亡率又占各種惡性腫瘤之首位，因此，胃癌是一個(gè)嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的常見(jiàn)病，應(yīng)引起重視。已有的腫瘤標(biāo)志物CEA(S卩，癌胚抗原)單項(xiàng)指標(biāo)的靈敏度僅為18-40%，目前沒(méi)有血清胃癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤標(biāo)志物，難以用于胃癌早期檢測(cè)及胃癌正確分期。因此從血清中尋求特異生物標(biāo)志物用于CEA陰性胃癌的檢測(cè)及分期是臨床急需解決的難題。傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志CEA在胃癌預(yù)后評(píng)估中有重要價(jià)值，但臨床工作中也發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)比例的胃癌患者中因CEA表達(dá)陰性而無(wú)法檢測(cè)，同時(shí)對(duì)于CEA陰性胃癌患者的預(yù)后評(píng)估則缺乏有效的早期監(jiān)測(cè)手段。我們?cè)谶M(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有一個(gè)臨床CEA陰性胃癌質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立一種在CEA陰性胃癌生物樣品中檢測(cè)的方法。該方法為CEA陰性胃癌的早期檢測(cè)提供了新的途徑，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的CEA陰性胃癌生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明涉及一種通過(guò)生物標(biāo)志結(jié)合的基質(zhì)表面，并用定量性質(zhì)譜分析來(lái)同時(shí)檢測(cè)多種生物標(biāo)志狀態(tài)。本發(fā)明中的生物標(biāo)志是利用一臺(tái)質(zhì)譜儀來(lái)發(fā)現(xiàn)的。該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為+/-0.1%。基質(zhì)是任何能與生物標(biāo)志選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)。舉例說(shuō)明，WCX陰離子，C8/C18疏水作用基質(zhì)吸附劑，分離生物化學(xué)中的這些方法和由這些方法產(chǎn)生的吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽(yáng)離子蛋白質(zhì))。底基洗去未吸附的物質(zhì)。任何適宜的洗液均可使用。生物標(biāo)志首先能夠被具有能與生物標(biāo)志物結(jié)合基質(zhì)吸附表面捕獲，非吸附物能從基質(zhì)上洗脫，吸附到底基的生物標(biāo)志物在質(zhì)譜儀中被檢測(cè)。生物標(biāo)志通過(guò)離子發(fā)生源，如激光，被離子化，產(chǎn)生的離子被一個(gè)離子感受集合器收集，然后質(zhì)量分析器分析那些通過(guò)的離子。之后，檢測(cè)器將檢測(cè)的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50%質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的最大值。生物標(biāo)志的檢測(cè)明顯地將與信號(hào)強(qiáng)度的檢測(cè)有關(guān)。這樣，生物標(biāo)志的數(shù)量與質(zhì)量都可以被檢測(cè)出來(lái)。飛行質(zhì)譜對(duì)待分析物的分析生成飛行時(shí)間譜。該飛行時(shí)間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個(gè)樣本產(chǎn)生的單獨(dú)的脈沖信號(hào)，而是一系列脈沖的信號(hào)之和。這樣降低了干擾，并增加了動(dòng)態(tài)范圍。該飛行時(shí)間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉(zhuǎn)換飛行時(shí)間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過(guò)濾高頻噪音而減輕高頻噪音。通過(guò)對(duì)生物標(biāo)志的吸附和檢測(cè)而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可利用計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)分析程序進(jìn)行分析。該計(jì)算機(jī)程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測(cè)出的生物標(biāo)志的數(shù)量，并顯示信號(hào)的強(qiáng)度和確定被檢測(cè)的每個(gè)生物標(biāo)志的分子量。數(shù)據(jù)分析還能包括一系列的確定生物標(biāo)志的信號(hào)強(qiáng)度和矯正數(shù)據(jù)對(duì)預(yù)定統(tǒng)計(jì)分布狀態(tài)的偏離。例如，通過(guò)計(jì)算與某些參數(shù)相關(guān)的每個(gè)峰值的高度，可規(guī)范觀測(cè)到的峰。該參數(shù)可能是由儀器和類(lèi)似能量吸收分子等化學(xué)成分產(chǎn)生的不重要的干擾，這可以設(shè)置調(diào)零。計(jì)算機(jī)可以將計(jì)算結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種形式來(lái)表現(xiàn)。其標(biāo)準(zhǔn)譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質(zhì)量信息可以在譜帶中保留，產(chǎn)生一個(gè)較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標(biāo)志物更易顯現(xiàn)。在另一種形式中，兩個(gè)或更多的譜比較，便于突顯獨(dú)特的生物標(biāo)志物和那些高于或低于校準(zhǔn)樣本的生物標(biāo)志物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號(hào)的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過(guò)視圖進(jìn)行選擇，軟件是可用的，它可自動(dòng)檢測(cè)峰。一般情況下，該軟件通過(guò)鑒定信號(hào)具有信噪比高于一個(gè)選擇閾值并標(biāo)記出在峰信號(hào)的質(zhì)心處的峰的質(zhì)量這樣的方式操作。在一個(gè)有效的程序中，比較許多譜線以認(rèn)定出現(xiàn)在質(zhì)譜中某一選定范圍內(nèi)同樣的一些峰。該軟件的一個(gè)版本聚集所有出現(xiàn)在確定的質(zhì)量范圍內(nèi)的各條光譜的峰，對(duì)所有在質(zhì)量(質(zhì)荷比)中值附近的峰指定一個(gè)質(zhì)量(質(zhì)荷比)簇。發(fā)明中使用的生物標(biāo)志是基質(zhì)所捕獲。這些生物標(biāo)記是進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜(massspectrometry)測(cè)定其不同分子量來(lái)知道它們特定的身份。CEA陰性胃癌檢測(cè)多肽蛋白篩選。通過(guò)Marm-Whitney〃檢驗(yàn)分析幾百種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜可以用于區(qū)分正常與CEA陰性胃癌的血清。峰值CV〉30W或者p〈0.01為有顯著性差異正常與CEA陰性胃癌蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜的顯著性差異(+15Da)4077.5374161.5094408.3775460.7625918.2876122.7847949.69210284.308161.1438354.54613611.776459.8068627.9573299.3665587.7635047.1475348.8287511,5464627.5028712.4444431.4443541.5274858.2581465.6213854.6983283.0086639.9485814.5056004.3084310.1124223.49311683.23用Mann-Whitney〃檢驗(yàn)比較配對(duì)樣本的蛋白峰，初步分析篩選出CEA陰性胃癌患者與健康人群有5個(gè)差異多肽蛋白，不同峰的分子量、均值及F值見(jiàn)表一-表一164例CEA陰性胃癌與164例年齡匹配的健康人生物樣品中的差異峰情況<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從中篩選出幾個(gè)特征蛋白峰，5047，5461，8628i15Da3個(gè)差異峰組成的檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)CEA陰性胃癌患者和健康人群盲篩檢驗(yàn)，用此分類(lèi)法分析71份CEA陰性胃癌樣本的質(zhì)譜結(jié)果，其中64份區(qū)分正確，7份區(qū)分錯(cuò)誤，敏感性為90%:71份對(duì)照樣品中69份區(qū)分正確，2份區(qū)分錯(cuò)誤，特異性為97%(見(jiàn)表二)表二生物樣品中檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷呐袆e情況<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠或芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠或芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。將1465.6Da生物標(biāo)志用多級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進(jìn)行排序。通過(guò)將分子碎成碎片，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對(duì)此梯度進(jìn)行分析。鑒別出1465土1Da蛋白為變異的纖維蛋白肽A(Fibrinop印tideA，F(xiàn)PA)(圖3)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為(從N端至C端排列為15個(gè)氨基酸)N端Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端。查已知基因組或cDNA庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)中的正常纖維蛋白肽A分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)(從N端至C端排列16個(gè)氨基酸，分子量為1536Da):N端Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端。用CEA檢測(cè)280例胃癌病人的血清有16.1%陽(yáng)性；抗FPA檢測(cè)280例胃癌病人的血清有95%陽(yáng)性；抗SAA檢測(cè)280例胃癌病人的血清有25.7%陽(yáng)性。表三、區(qū)分正常人、胃癌生物標(biāo)志群篩選試驗(yàn)CEA檢測(cè)抗FPA-質(zhì)譜法抗SAA-質(zhì)譜法SI16.1%ii^25.7%(45/280)(266/280)(72/280)正常人5%17.9%0%(14/280)(50/280)(0/280)用抗FPA(抗纖維蛋白肽A)、抗SAA(抗血清淀粉樣蛋白A)及質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn)分子量為1465土15Da、11683i15Da生物標(biāo)志的變化區(qū)分正常人、胃癌生物標(biāo)志群變異表達(dá)具有重要意義(圖4、5)。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均質(zhì)量是已知的，如果知道了抗原或生物標(biāo)志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測(cè)出來(lái)。血清淀粉樣蛋白A(SAA，11683Da)序列N端RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC端。此結(jié)果表明，抗FPA檢測(cè)胃癌病人的靈敏度為95M;抗SAA檢測(cè)胃癌病人的靈敏度為25.7%。消化系統(tǒng)腫瘤胃癌CEA靈敏度為16.1%。本發(fā)明利用WCX陰離子基質(zhì)及利用C8/C18疏水基質(zhì)磁珠為例對(duì)正常人與CEA陰性胃癌血清(漿)進(jìn)行蛋白質(zhì)對(duì)比分析。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至5cm質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的最大值。一種CEA陰性胃癌檢測(cè)和預(yù)后判斷的質(zhì)譜試劑盒和方法的具體操作步驟以下是用本發(fā)明提供的一個(gè)操作方案及CEA陰性胃癌檢測(cè)試劑盒實(shí)例。1.樣品處理及標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中，視需要離心澄清樣品。質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備定義符合如下標(biāo)準(zhǔn)供血者10人，5男5女，血型為0型；年齡為18-30歲；民族漢。生化指標(biāo)正常，包括總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢査、腎功檢査；無(wú)遺傳病家族史；無(wú)重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸煙者。2.基質(zhì)與CEA陰性胃癌、標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備、樣品上樣抽取0型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液(a)4'C下待血液凝固后馬上離心，4'C離心5min分離血清。(b)4'C下馬上離心，4。C離心5min分離血漿。標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控或CEA陰性胃癌血清(漿)樣品分裝10(Hil—小管，于—8(TC儲(chǔ)存；或取混合血清(漿)1:2稀釋于U9緩沖液(9MUrea，2%CHAPS,50rnMTris-HCL，pH9.0)一小管，25。C儲(chǔ)存。即成為CEA陰性胃癌、標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)試劑盒。將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清及樣品點(diǎn)樣在有支持物的基質(zhì)中的一個(gè)位點(diǎn)上。支持物用磁性珠或芯片。基質(zhì)是用于標(biāo)記、結(jié)合血清(漿)的。標(biāo)記至液相色譜柱子上的基質(zhì)可用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)的標(biāo)準(zhǔn)方法去分析。將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控0血清(漿)用于質(zhì)譜儀試劑盒的定量方法。3.洗滌用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。以下步驟用0.05%1%三氟乙酸徹底洗滌整個(gè)磁性珠陣列點(diǎn)，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專(zhuān)用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)。吸能分子可用Si卿inicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等。3.質(zhì)譜的定量控制及測(cè)試用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離己洗脫的生物標(biāo)志后用液相色譜質(zhì)譜^^用儀(LC-MS)標(biāo)準(zhǔn)方法去分析滯留于各位點(diǎn)的生物標(biāo)志或蛋白質(zhì)。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da等強(qiáng)度調(diào)至5(m信號(hào)強(qiáng)度的最大值。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50%質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的最大值。用2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da標(biāo)準(zhǔn)峰為質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)定性(分子量)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明將蛋白質(zhì)分成了幾大類(lèi)，即WCX陰離子、C8/C18疏水作用等蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析及定量。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠或芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠或芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本發(fā)明可用于體外細(xì)胞和非侵入性的體外CEA陰性胃癌質(zhì)譜檢測(cè)方法的定量控制，如離體體液的胃癌試劑盒用于臨床質(zhì)譜的CEA陰性胃癌檢測(cè)方法?？梢詸z測(cè)多個(gè)胃癌蛋白質(zhì)生物標(biāo)志群及質(zhì)譜多肽圖譜。本發(fā)明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測(cè)方法比較，具有以下的特點(diǎn)(1)準(zhǔn)確質(zhì)譜直接分析有很強(qiáng)的精確性，一般誤差率只有0.1Da。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均質(zhì)量是已知的，如果知道了抗原或生物標(biāo)志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測(cè)出來(lái)。(2)方便本方法將蛋白質(zhì)分成了幾大類(lèi)，即陰離子、疏水作用蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析。支持基質(zhì)的方法所用吸附劑的支持物是磁珠或芯片。用磁性分離器分離磁珠及樣品，無(wú)需離心樣品。磁珠表面的結(jié)合面積大于芯片，從而其靈敏性比芯片更高。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析。(3)快捷用本發(fā)明提供的蛋白指紋法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，無(wú)需對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行瀾序。本發(fā)明采用了計(jì)算機(jī)"條碼格式"，信號(hào)強(qiáng)度沿著線性軸以暗度強(qiáng)度值顯示。此強(qiáng)度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動(dòng)分析對(duì)比強(qiáng)弱，從而有助于臨床復(fù)雜的檢測(cè)，如可用此"蛋白指紋"或條碼格式進(jìn)行醫(yī)學(xué)分析。說(shuō)明書(shū)附1CEA陰性表達(dá)胃癌血清質(zhì)譜多肽蛋白圖譜圖2CEA陰性表達(dá)胃癌及健康人群盲篩的敏感性、特異性及ROC曲線圖31465.63Da蛋白的排序鑒定圖4變異的纖維蛋白肽A的一個(gè)特征峰圖5變異的血清淀粉樣蛋白A的一個(gè)特征峰具體實(shí)施方式本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1正常與CEA陰性胃癌患者的區(qū)分及質(zhì)譜的試劑盒制備(1)實(shí)驗(yàn)方法CEA陰性胃癌患者的術(shù)前血清280例，平均年齡47歲。健康體檢者280例，平均年齡45歲，來(lái)源于肝功能、腎功能等檢査均正常的體檢人群。受檢者空腹采集靜脈血1mL，采集后立即于4。C冰箱靜置2小時(shí)，4'C4000r/min離心10分鐘分離血清，將血清于4°C12000r/min再次離心5分鐘，去除所有殘留細(xì)胞碎片和不溶物，在冰上將血清分裝為10CmL/管，共5管，保存于-8(TC冰箱。避免反復(fù)凍融。蛋白質(zhì)芯片及磁珠操作步驟血清樣品處理從-8(TC冰箱中取出血清，于4'C，10OOOrpm離心5min。取1(￥L血清樣品，加20叱U9處理液(9mol/L尿素，2%CHAPS,1%DTT，50ramol/LTris-CL，pH9.0)，充分混勻，冰浴振蕩30min后取出，加入360叱結(jié)合緩沖液(100廳1/LNaAc,pH4.0),立即混勻。芯片上樣及洗脫將WCX2芯片(弱陰型離子表面，羧基基團(tuán)，捕獲正電荷基團(tuán)蛋白)裝入bi叩rocessor中，每孔加入200ML結(jié)合緩沖液，室溫振蕩洗淶2次，每次5min，甩干。每孔分別加入100叱處理好的樣品，振蕩孵育lh,甩去樣品，用200yl芯片洗脫緩沖液(100ramol/LNaAc,pH4.0)室溫振蕩洗滌2次，每次5min,甩干；再用HPLCH20洗滌一次，立即甩千。取出芯片，每點(diǎn)加2次0.5叱SPA飽和溶液，晾干后上機(jī)測(cè)量。磁珠上樣及洗脫將處理好的樣品IOO叱加至已裝好WCX磁珠(弱陰離子表面，羧酸基團(tuán)，捕獲正電荷基團(tuán)蛋白)的PCR管中，置磁性處理器上孵育30min,除去液體。加IOO叱磁珠結(jié)合緩沖液(50mmol/LNaAc,pH4.04.3)至已裝好WCX磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作2次。加10叱ElutionBuffer2min，洗脫標(biāo)本至上清液。取5叱上清液移至另一個(gè)PCR管中，加入5叱SPA飽和溶液充分混勻，取lA混合溶液加樣到Au片上，晾干后上機(jī)測(cè)量。數(shù)據(jù)收集將處理好的Au片置入MALDI-T0F-MS進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。在讀取數(shù)據(jù)前，用加有all-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的芯片校正質(zhì)譜儀，使分子量誤差〈0.1%。本研究中閱讀儀的主要參數(shù)設(shè)定為，最高檢測(cè)分子量為50kDa，優(yōu)化分子量范圍100015000Da，最佳聚集中心8000Da,數(shù)據(jù)采集參數(shù)范圍2080，收集總數(shù)為130次。軟件中設(shè)定讀片程序，以讀取數(shù)據(jù)。用血清中的內(nèi)標(biāo)峰4091.1Da或6634.0Da校正原始數(shù)據(jù)中的蛋白指紋圖譜，使分子量誤差〈0.01%，從而獲得的精確的蛋白指紋圖譜。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用軟件分析處理所有峰譜，形成蛋白指紋圖譜。所有的圖譜都進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)一到它們自己全部的離子總數(shù)(峰面積的總和)。將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1或6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至4050%信號(hào)強(qiáng)度的最大值，并且用最顯著的峰進(jìn)行了校正，而后又進(jìn)行了"減少基線"，定義蛋白峰(s/n〉5，最小的峰強(qiáng)度>1.6)。分析所有l(wèi)50kDa之間的蛋白峰，并且仔細(xì)檢查了每個(gè)相應(yīng)的峰，計(jì)算出峰的平均數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)和變異系數(shù)(CV%)。用Mann-WhitneyV檢驗(yàn)比較配對(duì)樣本的蛋白峰，計(jì)算p值.CEA陰性胃癌檢測(cè)取空腹靜脈血4mL，離心后提取血清，按照檢測(cè)系統(tǒng)步驟進(jìn)行操作，正常參考值CEA<5ug/L(<5ng/ml)。CEA陰性胃癌檢測(cè)多肽蛋白篩選用Mann-Whitney〃檢驗(yàn)比較配對(duì)樣本的蛋白峰，初步分析篩選出CEA陰性胃癌患者與健康人群有5個(gè)差異多肽蛋白，不同峰的分子量、均值及戶(hù)值見(jiàn)表一表一164例CEA陰性胃癌與164例年齡匹配的健康人生物樣品中的差異峰情況<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例2試劑盒的雙盲測(cè)試用從實(shí)施例1中篩選出幾個(gè)特征蛋白峰，5047，5461，8628土15Da3個(gè)差異峰組成的檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?圖1中上面四例為胃癌患者，下面四例為健康人群)對(duì)CEA陰性胃癌患者和健康人群盲篩檢驗(yàn)及R0C曲線，用此分類(lèi)法分析71份CEA陰性胃癌樣本的質(zhì)譜結(jié)果，其中64份區(qū)分正確，7份區(qū)分錯(cuò)誤，敏感性為90%;71份對(duì)照樣品中69份區(qū)分正確，2份區(qū)分錯(cuò)誤，特異性為97%(見(jiàn)表二、圖2):表二生物樣品中檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷呐袆e情況<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注敏感性90%(64/71);特異性97%(69/71)利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠或芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠或芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。實(shí)施例31465.6Da蛋白的排序鑒定將1465.6Da生物標(biāo)志用多級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進(jìn)行排序。通過(guò)將分子碎成碎片，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對(duì)此梯度進(jìn)行分析。鑒別出1465土1Da蛋白為變異的纖維蛋白肽A(Fibrinop印tideAwithalaninetruncationatN-terminal)(圖3)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為(從N端至C端排列為15個(gè)氨基酸)N端Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端。查已知基因組或cDNA庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)中的正常纖維蛋白肽A分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)(從N端至C端排列16個(gè)氨基酸，分子量為1536Da):N端Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端。實(shí)施例4變異的或修飾的生物標(biāo)記抗體的制備變異的或修飾的生物標(biāo)記的合成合成纖維蛋白肽A及血清淀粉樣蛋白A。血清淀粉樣蛋白A序列-N端RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC端。將合成的變異的生物標(biāo)記免疫小鼠，待免疫反應(yīng)出現(xiàn)后，從外周血中分離B細(xì)胞。用溶血噬菌斑分析法選擇并分離出能分泌所需抗體的單個(gè)淋巴細(xì)胞。將單個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增至1X107個(gè)以上，用QuickmRNAPurificationKit提取mRNA。以提取的mRNA為模板，合成cDNA鏈。以此cDNA為模板，加入鼠抗體重鏈可變區(qū)(VH)通用引物，輕鏈可變區(qū)(V,)通用引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，獲得擴(kuò)增的Vh基因片段和Vl基因片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物在15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定和分離。用glassmilk回收擴(kuò)增的Vh基因片段和Vl基因片段。與等摩爾嘗試的LimkerPrimerMix混合，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，逢接Vh和V,.。擴(kuò)增產(chǎn)物分離純化后，獲得特異性單鏈抗體(ScFV)。此ScFV可用于制備檢測(cè)所需DNA片。將此擴(kuò)增產(chǎn)物兩端加限制性酶切位點(diǎn)，純化定量后，連接到pu"9載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感染大腸桿菌TOPIO。經(jīng)藍(lán)白斑篩選及酶切鑒定，篩選出重組質(zhì)粒。在96孔板形成單克隆抗體。用ELISA法篩選出效價(jià)最高的單克隆抗體株，大量制備，并從培養(yǎng)上清中提取所需抗體。此抗體可用于制備檢測(cè)所需試劑盒。實(shí)施例5抗體與免疫組質(zhì)譜檢測(cè)的應(yīng)用(2)實(shí)驗(yàn)方法一、材料1.標(biāo)本來(lái)源A.280例正常人對(duì)照組的血清；B.280例胃癌病人的血清。2.質(zhì)量控制A.人標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清B.質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測(cè)試前，用上述標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清。3.基質(zhì)含已標(biāo)記的等量抗體抗FPA(抗纖維蛋白肽A)、抗SAA(抗血清淀粉樣蛋白A)。二、方法1.樣品的收集全血采集后吸取血清，置于一80'C保存；-8(TC冰箱中取出血清樣品，置冰盒上融解；以10,000轉(zhuǎn)/分，4。C離心2分鐘；取上清液。2.樣品的準(zhǔn)備每個(gè)吸附劑支持物點(diǎn)需要血清lW，將血清用緩沖液稀釋?zhuān)瑢悠烦浞只靹颉?.樣品檢測(cè)上樣，在吸附劑支持物(基質(zhì)含已標(biāo)記的等量抗體抗纖維蛋白肽A、抗血清淀粉樣蛋白A)中加入處理好的樣品，置振蕩器，400-600轉(zhuǎn)/分，震蕩3060分鐘。加入20(mi的結(jié)合緩沖液X2。加入200WHPLC水X1。取出吸附劑支持物后，待干后，樣品加入0.5Pl的SINAPINIC酸(5mg/mL50%乙腈；0.5%三氟乙酸)，任其自然干燥。4.將上述樣品加入質(zhì)譜中，就會(huì)生成飛行時(shí)間質(zhì)譜。外部使用多肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)校正質(zhì)量精確性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，通過(guò)分析血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述生物標(biāo)志可以用于區(qū)分正常人、消化系統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志群變異表達(dá)(表三)。表三、區(qū)分正常人、胃癌生物標(biāo)志群<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>CEA檢測(cè)280例胃癌病人的血清有16.1%陽(yáng)性；抗FPA檢測(cè)280例胃癌病人的血清有95%陽(yáng)性；抗SAA檢測(cè)280例胃癌病人的血清有25.7%陽(yáng)性。發(fā)現(xiàn)分子量為1465土15Da、11683土15Da生物標(biāo)志的變化區(qū)分正常人、胃癌生物標(biāo)志群變異表達(dá)具有重要意義(圖4、5)。此結(jié)果表明，抗FPA檢測(cè)胃癌病人的靈敏度為95%;抗SAA檢測(cè)胃癌病人的靈敏度為25.7W。消化系統(tǒng)腫瘤胃癌CEA靈敏度為16.1%。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種用磁珠支持基質(zhì)的方法捕獲體外生物樣品中CEA陰性胃癌蛋白質(zhì)組的試劑盒和方法，其特征是采用蛋白指紋法對(duì)CEA陰性胃癌中體外樣品蛋白質(zhì)組或質(zhì)譜多肽圖譜進(jìn)行鑒別檢測(cè)。用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)控制下的定量性質(zhì)譜分析來(lái)檢測(cè)。該方法通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)樣品處理及質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備；(2)基質(zhì)與血清(漿)結(jié)合試劑盒制備、樣品上樣；(3)洗滌；(4)質(zhì)譜的定量控制及質(zhì)譜檢測(cè)；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中。用O型血，男女相等，混合制備質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)；所述步驟(2)將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)及樣品點(diǎn)樣在有支持物的基質(zhì)中的一個(gè)位點(diǎn)上。支持物用磁珠或芯片?；|(zhì)是用WCX陰離子基質(zhì)及C8/C18疏水基質(zhì)或抗體基質(zhì)與血清(漿)選擇性結(jié)合；所述步驟(3)用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。用三氟乙酸徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專(zhuān)用金屬片或位點(diǎn)上。所述步驟(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)用質(zhì)譜儀去分析滯留與各位點(diǎn)的生物標(biāo)志或用電噴霧電離已洗脫的生物標(biāo)志后用質(zhì)譜儀去分析。對(duì)血液進(jìn)行蛋白質(zhì)對(duì)比分析，用計(jì)算機(jī)分析血液中質(zhì)荷比數(shù)據(jù)。本試劑盒依據(jù)幾個(gè)特征蛋白峰5047，5461，8628±15Da，雙盲測(cè)試CEA陰性胃癌體外樣品的敏感性90％，特異性97％。2.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，所用的基質(zhì)包括陰離子、疏水作用及抗體吸附劑。3.權(quán)利要求2中所用吸附劑的支持物是磁珠或芯片。4.一種權(quán)利要求l所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它包括一容器以及裝于容器中的權(quán)利要求1所述的生物樣品。將生物樣品分裝100nl—小管，于一80'C儲(chǔ)存或取生物樣品1:2稀釋于一小管U9緩沖液(9ML)rea，2%CHAPS,50mMTris-HCL，pH9.0)，25°C儲(chǔ)存。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征于，所述的生物樣品為血清或血漿。6.—種權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒對(duì)CEA陰性胃癌的預(yù)后判斷。7.—種權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒用于CEA陰性胃癌的預(yù)后判斷的1465土15Da蛋白質(zhì)是變異的纖維蛋白肽A。8.—種權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒用于CEA陰性胃癌的預(yù)后判斷的11683土15Da蛋白質(zhì)是變異的血清淀粉樣蛋白A。全文摘要本發(fā)明涉及一種用磁珠支持基質(zhì)的方法捕獲體外生物樣品中胃癌蛋白質(zhì)組，用磁性分離器分離磁珠及樣品，無(wú)需離心樣品。然后用質(zhì)譜法進(jìn)行分析的蛋白指紋法。本發(fā)明的方法可用于正常人與CEA陰性胃癌體外樣品檢測(cè)和預(yù)后判斷的蛋白指紋或質(zhì)譜多肽圖譜的試劑盒。本方法準(zhǔn)確、方便且快捷。文檔編號(hào)G01N30/02GK101271088SQ200710087170公開(kāi)日2008年9月24日申請(qǐng)日期2007年3月23日優(yōu)先權(quán)日2007年3月23日發(fā)明者洋許申請(qǐng)人:洋許