專利名稱：用于胃癌的診斷、預(yù)后和治療的基于微rna的方法和組合物的制作方法
用于胃癌的診斷、預(yù)后和治療的基于微RNA的方法和組合
物發(fā)明者Carlo Μ. Croce, Fabio Petrocca，Andrea Vecchione交叉參考相關(guān)申請本申請要求2008年2月28日提交的美國臨時申請61/067，445的權(quán)益，其全部公 開內(nèi)容明確地通過引用合并入本文。關(guān)于聯(lián)邦政府支助的研究的聲明本發(fā)明是在NCI基金CA76259和CA8134下由政府支助進行的。政府在本發(fā)明中 具有某些權(quán)利。本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域和工業(yè)適用性本發(fā)明總地說來涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明的某些方面包括在胃癌相關(guān)病癥的 診斷、治療和預(yù)后中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
不承認(rèn)本部分中公開的背景技術(shù)在法律上構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)。雖然胃癌的發(fā)病率在西方國家中從20世紀(jì)40年代至20世紀(jì)80年代下降，但其 在整個世界上仍然是主要的公共衛(wèi)生問題，其是世界范圍內(nèi)第二廣泛診斷的惡性腫瘤并且 在每年的所有癌癥相關(guān)死亡中占12% (Uemura等人，2001)。95%以上的胃腫瘤為組織學(xué)上 分類為腸類型或彌漫型的腺癌(Lauren P，1965)。腸腫瘤的發(fā)展已被表征為經(jīng)由許多連續(xù) 步驟的進展。特別地，兩個事件是胃腫瘤發(fā)生的特征E2F1的上調(diào)(Suzuki等人，1999)和 TGFE抗性的發(fā)生(Ju等人，2003 ；Park等人，1994)。E2F1是通過反式激活(transactivating)許多參與染色體DNA復(fù)制的基因(包括 其自己的啟動子)來促進G1/S轉(zhuǎn)換的細(xì)胞周期的主調(diào)控劑(DeGregori，2002)。雖然E2F1 的過表達(dá)本身是使細(xì)胞易于轉(zhuǎn)化的致癌事件(Pierce等人，1999)，但當(dāng)其在高于臨界閾值 上發(fā)生時，其也代表了有效的細(xì)胞凋亡信號(Lazzerini Denchi等人，2005)。在另一個方面，轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGFβ)是在所謂的形態(tài)發(fā)生程序(上皮與間質(zhì) 區(qū)室之間的交流(crosstalk)的復(fù)雜系統(tǒng)，其指導(dǎo)胃腸細(xì)胞朝向增殖、分化或細(xì)胞凋亡)中 起主要作用的細(xì)胞因子(van denBrink和Offerhaus，2007)。盡管對治療此類疾病的療法進行了相當(dāng)多的研究，但仍然難以有效地診斷和治療 它們，并且在患者中觀察到的死亡率表明，需要改進所述疾病的診斷、治療和預(yù)防。發(fā)明概述在第一方面，本文中提供了診斷受試者是否患有胃相關(guān)病癥或處于發(fā)生胃相關(guān)病 癥的風(fēng)險中，確定患有胃癌和/或相關(guān)病癥的受試者的預(yù)后和/或治療患有此類病癥的受 試者的方法，其包括測量來自受試者的測試樣品中至少一個生物標(biāo)志物的水平，其中相對 于對照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平，測試樣品中生物標(biāo)志物的水平的改變表示受試者 患有所述病癥或處于發(fā)生所述病癥的風(fēng)險中。在某些實施方案中，測試樣品中至少一個生物標(biāo)志物的水平低于對照樣品中相應(yīng) 的生物標(biāo)志物的水平。
在某些實施方案中，測試樣品中至少一個生物標(biāo)志物的水平高于對照樣品中相應(yīng) 的生物標(biāo)志物的水平。在某些實施方案中，差異表達(dá)的至少一個生物標(biāo)志物選自

圖13-表1中所列的組。在某些實施方案中，病癥包括慢性胃炎并且至少一個生物標(biāo)志物選自上調(diào)的 miR-I 和 miR-155。在某些實施方案中，病癥包括慢性胃炎并且至少一個生物標(biāo)志物選自下調(diào)的 miR-205、miR-203、miR-202、miR-20 和 miR_26b。在某些實施方案中，差異表達(dá)的至少一個生物標(biāo)志物選自圖14-表2中所列的組。在某些實施方案中，病癥包括胃腺癌并且至少一個生物標(biāo)志物選自上調(diào)的 miR-2UmiR-223> miR-25> miR-17-5-p> miR-125b> miR-181b> miR-106a> miR-107> miR-92> miR-103、miR-221、miR-93、miR-100、miR-181、miR_106b、miR-191、miR-214、miR-130、 miR-342、miR-222、miR-320 和 miR_99b。在某些實施方案中，病癥包括胃腺癌并且至少一個生物標(biāo)志物選自下調(diào)的 miR-136、miR-218、miR-212、miR-96、miR-339 和 miR_130b。在某些實施方案中，差異表達(dá)的至少一個生物標(biāo)志物選自圖16-表3中所列的組 miR-21、miR-223、miR-25、miR-92、miR-107、miR-93、miR_106b、miR-17_5p、miR_181b 和 miR_106ao在某些實施方案中，至少一個生物標(biāo)志物包括miR-160b-25簇miR_106b、miR-93 和 miR-25。在另一個方面，本文中提供了至少一個生物標(biāo)志物(其包括miR-160b_25簇 miR-106b、miR-93和miR-25)在調(diào)控圖18-表6中所列的一個或多個基因PHLPPL、GM632、 ALX4、PLEKHMU JOSDU ZFPM2、GATAD2B、ZNF238、ATXNl、NEUROD1、BCL2L11、KLF12、UBE2W、 0SBPL5、SNFILK, PCAF, PAPOLA 和 CFL2 的表達(dá)中的用途。在另一個方面，本文中提供了在有此需要的受試者中調(diào)控E2F1的表達(dá)的方法，其 包括施用足以調(diào)控E2F1的表達(dá)的有效量的miR-106b和/或miR-93或其功能性變體。在另一個方面，本文中提供了 miR_106b和miR-93用于在有此需要的受試者中調(diào) 控E2F1表達(dá)的用途。在另一個方面，本文中提供了調(diào)控TGFE腫瘤抑制途徑(tumor suppressor pathway)(其干擾CDKNlA (p21Wafl/Cipl)和/或BCL2L11 (Bim)的表達(dá))的方法，該方法包 括上調(diào)miR-106b、miR-93和miR-25中的一個或多個。在另一個方面，本文中提供了 miR-106b-25簇在胃癌中在E2F1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和TGFE 抗性發(fā)生的調(diào)控中的用途。在另一個方面，本文中提供了用于在有此需要的受試者中控制E2F1表達(dá)的方法， 其包括調(diào)控受試者中的miR-106b和miR-93的水平。在另一個方面，本文中提供了 E2F1在有此需要的受試者中調(diào)控miR-106b_25表達(dá) (與Mcm7平行)的用途。在另一個方面，本文中提供了用于在有此需要的受試者中控制E2F1蛋白合成速 率，防止其過量積累的方法，所述方法包括調(diào)控miR-106b-25簇在受試者中的水平。在另一個方面，本文中提供了 miR_106b和miR-93在有此需要的受試者中削弱TGFE-誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯的用途。在另一個方面，本文中提供了 miR_106b和miR_93在有此需要的受試者中通過在 轉(zhuǎn)錄后水平上抑制P21的表達(dá)干擾TGFO-誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯的用途。在另一個方面，本文中提供了 miR-25與miR_106b和miR_93在有此需要的受試者 中協(xié)同阻止TGFO-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生的用途。在另一個方面，本文中提供了用于在有此需要的受試者中調(diào)控miR-106b_25簇的 表達(dá)以阻止使胃癌細(xì)胞免受細(xì)胞凋亡的保護作用的方法。在另一個方面，本文中提供了胃癌的獨特微RNA表達(dá)特征(signature)，其包括調(diào) 控腫瘤微RNA加工的一個或多個生物標(biāo)志物的表達(dá)的改變。在另一個方面，本文中提供了影響胃癌中靶mRNA的轉(zhuǎn)錄物豐度和/或蛋白質(zhì)表達(dá) 的方法，其包括使有此需要的受試者中一個或多個微RNA失調(diào)。在某些實施方案中，所述方法還包括抑制癌癥相關(guān)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。在某些實施方案中，所述方法還包括改變miR-106b、miR-93和miR-25中的一個或 多個的表達(dá)以抑制癌癥相關(guān)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。在另一個方面，本文中提供了微RNA和編碼蛋白質(zhì)的RNA的大規(guī)?；虮磉_(dá)特征 譜分析用于鑒定在人胃癌中發(fā)生的微RNA功能的改變的用途。權(quán)利要求1的方法，其包括確定胃癌受試者的預(yù)后，包括測量來自受試者的測試 樣品中至少一個生物標(biāo)志物的水平，其中i)所述生物標(biāo)志物與此類癌癥中的不利預(yù)后相 關(guān)；和ii)相對于對照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平，測試樣品中至少一個生物標(biāo)志物 的水平的改變表示不利的預(yù)后。在某些實施方案中，所述方法還包括診斷受試者是否患有胃癌或處于發(fā)生胃癌的 風(fēng)險中，其包括1)從獲自受試者的測試樣品反轉(zhuǎn)錄RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸；2) 將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供測試樣品的雜 交特征譜；和3)將測試樣品雜交特征譜與從對照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較，其中至少 一個miRNA的信號的改變表示受試者患有此類癌癥或處于發(fā)生此類癌癥的風(fēng)險中。在某些實施方案中，相對于從對照樣品產(chǎn)生的信號，至少一個miRNA的信號下調(diào)， 和/或其中相對于從對照樣品產(chǎn)生的信號，至少一個miRNA的信號上調(diào)。在某些實施方案中，選自表13、表14和表16中所列的組的至少一個生物標(biāo)志物的 信號的改變表示受試者患有具有不利預(yù)后的此類癌癥或處于發(fā)生所述癌癥的風(fēng)險中。在另一個方面，本文中提供了胃病癥或疾病的生物標(biāo)志物，其包括miR_106b、 miR-93和mir-25中的一個或多個。在另一個方面，本文中提供了用于在胃癌細(xì)胞中調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，其包括 在胃癌細(xì)胞中調(diào)控下列中的一個或多個的表達(dá)miR-106b、miR-93和mir_25。在另一個方面，本文中提供了用于在胃癌細(xì)胞中調(diào)控E2Fl、CDKNlA(p21WaflCipl) 和BCL2Lll(Bim)中的一個或多個的表達(dá)的組合物，所述組合物包括下列中的一個或多個 miR-106b、miR-93 和 mir_25 或其功能變體。在另一個方面，本文中提供了用于在有此需要的受試者中調(diào)控E2F1和p21/WAFl 蛋白水平中的一個或多個的方法，其包括使用下列中的一個或多個miR-106b、miR-93和 mir-25,或其功能性變體中。
在另一個方面，本文中提供了用于在有此需要的受試者中增加胃癌細(xì)胞中p21/ WAFl和/或E2F1蛋白水平的包含反義miR-106b的組合物。在另一個方面，本文中提供了治療患有胃癌的受試者的胃癌的方法，在所述胃癌 中至少一個生物標(biāo)志物在受試者的癌細(xì)胞中相對于對照細(xì)胞下調(diào)或上調(diào)，所述方法包括 1)當(dāng)至少一個生物標(biāo)志物在癌細(xì)胞中下調(diào)時，給受試者施用有效量的至少一個分離的生物 標(biāo)志物，或其分離的變體或生物學(xué)活性片段，以便受試者中癌細(xì)胞的增殖被抑制；或2)當(dāng) 至少一個生物標(biāo)志物在癌細(xì)胞中上調(diào)時，給受試者施用有效量的至少一種抑制至少一個生 物標(biāo)志物的表達(dá)的化合物，以便受試者中癌細(xì)胞的增殖被抑制。在另一個方面，本文中提供了治療受試者的胃癌的方法，其包括1)測定相對于 對照細(xì)胞，胃癌細(xì)胞中至少一個生物標(biāo)志物的量；和2)通過i)如果癌細(xì)胞中表達(dá)的生物 標(biāo)志物的量低于對照細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量，給受試者施用有效量的至少一個分離 的生物標(biāo)志物；或ii)如果癌細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量高于對照細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo) 志物的量，給受試者施用有效量的至少一種用于抑制至少一個生物標(biāo)志物的表達(dá)的化合物 來改變胃癌細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量。在另一個方面，本文中提供了用于治療胃癌的藥物組合物，其包含至少一個分離 的生物標(biāo)志物和可藥用載體。在某些實施方案中，至少一個分離的生物標(biāo)志物相應(yīng)于相對于對照細(xì)胞在胃癌細(xì) 胞中下調(diào)的生物標(biāo)志物。在某些實施方案中，藥物組合物包含至少一個miR表達(dá)抑制劑化合物和可藥用載 體。在另一個方面，本文中提供了鑒定抗胃癌試劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測試試 劑和測量與胃癌細(xì)胞中減少的表達(dá)水平相關(guān)的至少一個生物標(biāo)志物的水平，其中相對于對 照細(xì)胞，細(xì)胞中生物標(biāo)志物的水平的增加表示測試試劑是抗胃癌試劑。在另一個方面，本文中提供了鑒定抗胃癌試劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測試試 劑和測量與胃癌細(xì)胞中增加的表達(dá)水平相關(guān)的至少一個生物標(biāo)志物的水平，其中相對于對 照細(xì)胞，細(xì)胞中生物標(biāo)志物的水平的減少表示測試試劑是抗癌癥試劑。在另一個方面，本文中提供了評估療法預(yù)防、診斷和/或治療胃癌相關(guān)疾病的有 效性的方法，其包括i)使動物經(jīng)歷其有效性有待評估的療法，和ii)通過估計表13、14和 16的一個或多個中所列的至少一個生物標(biāo)志物來測定測試的療法在治療或預(yù)防疾病中的 有效性水平。前述權(quán)利要求的方法，其中候選治療劑包括藥物組合物、營養(yǎng)組合物 (nutraceutical composition)禾口順勢療法組合物中的一種或多種。 在某些實施方案中，待評估的療法用于人受試者。在另一個方面，本文中提供了制品，其包含至少一個結(jié)合胃癌相關(guān)疾病的標(biāo)志物 的捕獲試劑，所述標(biāo)志物包括表13、14和16的一個或多個中所列的至少一個生物標(biāo)志物。在另一個方面，本文中提供了用于篩選治療胃癌相關(guān)疾病的治療劑的候選化合物 的試劑盒，其中試劑盒包括表13、14和16的一個或多個中所列的至少一個生物標(biāo)志物的 一個或多個試劑和表達(dá)至少一個生物標(biāo)志物的細(xì)胞。在某些實施方案中，使用包含特異性結(jié)合至少一個生物標(biāo)志物的抗體或抗體片段的試劑檢測生物標(biāo)志物的存在。在另一個方面，本文中提供了干擾胃癌相關(guān)疾病應(yīng)答信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的試劑用于制 造藥劑的用途，所述藥劑用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個體中疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重度，其中所 述試劑包括表13、14和16的一個或多個中所列的至少一個生物標(biāo)志物。在另一個方面，本文中提供了治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制有此需要的個體中胃癌相關(guān) 疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重度的方法，其包括給個體施用干擾至少胃癌相關(guān)疾病應(yīng)答級聯(lián)的試劑， 其中所述試劑包括表13、14和16的一個或多個中所列的至少一個生物標(biāo)志物。在另一個方面，本文中提供了干擾至少胃癌相關(guān)疾病應(yīng)答級聯(lián)的試劑用于制造藥 劑的用途，所述藥劑用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個體中胃癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重度，其 中所述試劑包括表13、14和16的一個或多個中所列的至少一個生物標(biāo)志物。在另一個方面，本文中提供了包含miR-106b、miR-93和miR-25中的一個或多個的 反義抑制劑的組合物。在另一個方面，本文中提供了治療有此需要的受試者的胃病癥的方法，其包括給 受試者施用治療有效量的組合物。在某些實施方案中，預(yù)防性施用組合物。在某些實施方案中，組合物的施用延遲了胃癌的一個或多個癥狀的發(fā)作。在某些實施方案中，組合物的施用抑制胃癌的發(fā)生。在某些實施方案中，組合物的施用抑制腫瘤生長。在另一個方面，本文中提供了用于檢測生物學(xué)樣品中胃癌的存在的方法，該方法 包括i)將懷疑包含胃癌的生物學(xué)樣品暴露于為此的標(biāo)志物；和ii)如果有的話，檢測樣品 中標(biāo)志物的存在或不存在。在某些實施方案中，標(biāo)志物包括可檢測的標(biāo)記。在某些實施方案中，所述方法還包括將來自受試者的生物學(xué)樣品中標(biāo)志物的量與 來自正常受試者的相應(yīng)生物學(xué)樣品中標(biāo)志物的量相比。在某些實施方案中，所述方法還包括在不同時間點從受試者收集多個生物學(xué)樣品 和比較各生物學(xué)樣品中標(biāo)志物的量以確定標(biāo)志物的量在受試者中隨時間增加還是減少。在另一個方面，本文中提供了用于治療受試者的胃癌的方法，所述方法包括胃癌 受體激動劑。在某些實施方案中，受體激動劑是miR-106b、miR-93和miR-25中的一個或多個 的反義抑制劑。在另一個方面，本文中提供了制造用于治療胃癌的藥物的用途，其包含選自下列 的核酸分子表13、14和16中顯示的miR、來源于其的序列、來自此類miR的互補序列和來 源于這樣的互補序列的序列。在某些實施方案中，所述藥物包含提供選自下列的序列的核酸分子表13、14和 16中所列的miR、來源于此類miR的序列、此類miR的互補序列和來源于這樣的互補序列的 序列。在另一個方面，本文中提供了鑒定誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的分化的有效治療劑或治療劑的 組合的體外方法，該方法包括步驟i)培養(yǎng)來源于胃腫瘤的細(xì)胞，ii)向細(xì)胞系的培養(yǎng)基中 加入至少一種化合物，iii)分析步驟(i)與(ii)之間至少一個miR的表達(dá)水平的變化和iv)鑒定誘導(dǎo)步驟(i)與(ii)之間miR的表達(dá)水平的改變的化合物或化合物的組合。在某些實施方案中，步驟(iii)包括分析至少一個miR的表達(dá)水平。在某些實施方案中，步驟(iv)包括鑒定調(diào)控至少一個miR的表達(dá)水平的化合物或 化合物的組合。在某些實施方案中，步驟(iv)包括鑒定減少至少一個miR的表達(dá)水平的化合物或 化合物的組合。在某些實施方案中，化合物是治療癌癥的治療劑。當(dāng)根據(jù)附圖進行閱讀時，根據(jù)下列優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的 和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯然。附圖概述本專利或申請文件可包括一個或多個以彩色制成的圖和/或一個或多個照片。具 有彩色附圖和/或照片的本專利或?qū)＠暾埞_案的拷貝將應(yīng)請求且支付必要的費用后 由專利局(Patent Office)提供。圖1A-1E 慢性胃炎和胃腺癌中miRNA表達(dá)的改變。通過SAM分析(FDR = 0%, q =0)確定，與慢性胃炎(圖1A)或胃腺癌(圖1B)顯著相關(guān)的MiRNA。紅色和綠色分別表 示上調(diào)和下調(diào)。通過蘇木素伊紅(H&E)染色顯示正常胃粘膜、慢性胃炎和胃腺癌的代表性 組織學(xué)特征。圖IC 包含在Mcm7的內(nèi)含子13中的miR-106b_25簇基因組基因座的圖示。 該基因的初級轉(zhuǎn)錄物包含融合至單一分子(我們使用兩組不同的引物(#1和#2)從Snu-16 細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄、擴增和測序該分子)的所有3個miRNA。該分子不僅僅只是Mcm7轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn) 品，因為通過RNAi對Drosha的下調(diào)(圖1D)誘導(dǎo)了該轉(zhuǎn)錄物的顯著積累(圖1E)，這確認(rèn) 活性初級miRNA的存在。誤差棒(bar)表示針對TO標(biāo)準(zhǔn)化的RNA表達(dá)+/-SD。該簇與分別 位于13號染色體和X染色體上的miR-17-92和miR-106a-92簇共有高度的同源性。顏色 標(biāo)識相同家族的miRNA。圖2A-2G :E2F1調(diào)控miR-106b-25的表達(dá)。圖2A 通過諾考達(dá)唑處理12小時在 有絲分裂中同步化，然后釋放于新鮮培養(yǎng)基中的AGS細(xì)胞的FACS分析。在不同時間點收 獲細(xì)胞，并且通過Western印跡法就E2F1蛋白的含量(圖2B)以及通過qRT-PCR就Mcm7、 miR-106b、miR-93和miR-25前體RNA的水平(圖2C)對其進行分析。以一式三份進行每 一個分析。誤差棒表示針對U6標(biāo)準(zhǔn)化的RNA表達(dá)+/-SD。將AGS細(xì)胞以90%匯合涂板，并 且于0. 5% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基中饑餓36小時。然后以25的Μ. 0. I.用adeno_GFP或 adeno-E2Fl病毒感染細(xì)胞，將細(xì)胞再溫育另外21小時此時，細(xì)胞未展示細(xì)胞凋亡的跡象， 如通過形態(tài)學(xué)、臺盼藍(lán)染色和亞二倍體DNA含量的分析所測定的(數(shù)據(jù)未顯示)。如上通過 qRT-PCR 測量 MiR-106b、miR-93 和 miR-25 前體。用抗 E2F1 的 siRNA (IOOnM)轉(zhuǎn)染 Snu_16 細(xì)胞，然后在72小時后，如上通過qRT-PCR測定miR-106b-25前體(圖2E)和成熟(圖2F) 類別的表達(dá)。誤差棒表示針對TO標(biāo)準(zhǔn)化的RNA表達(dá)+/-SD。圖2G:示于圖9中的相同胃原 發(fā)性腫瘤中的E2F1蛋白的表達(dá)。紅圓圈表示Mcm7和miR-106b_25前體RNA在相應(yīng)的腫瘤 中過表達(dá)，如通過qRT-PCR測定的。圖 3A-3F :E2F1 是 miR_106b 和 miR-93 的靶。圖 3A 通過莖-環(huán) qRT-PCR 測定的 成熟miR-106b、miR-93和miR-25在人胃癌細(xì)胞系和正常粘膜中的內(nèi)源性表達(dá)；誤差棒表 示針對TO標(biāo)準(zhǔn)化的RNA表達(dá)+/-SD。Snu-I細(xì)胞據(jù)認(rèn)為來源于胃神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NET)，
12而RFl和RF48細(xì)胞來自胃的B細(xì)胞淋巴瘤。所有其他細(xì)胞系來自胃腺癌。圖3B 在抑制 miR-106b和miR-93 (通過ASO轉(zhuǎn)染)或(圖3C)相同miRNA的過表達(dá)(通過寡核苷酸轉(zhuǎn) 染或(圖3D)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo))后48小時，Snu-16細(xì)胞的Western印跡。亂序的(scramble) RNA或LNA寡核苷酸用作陰性對照。對蛋白質(zhì)表達(dá)進行定量并且針對GAPDH進行標(biāo)準(zhǔn)化。 在AGS和MKN-74細(xì)胞中獲得相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。(圖3E)螢光素酶測定顯示用 PGL3-E2F1-3 ‘ UTR和miR_106b或miR-93寡核苷酸共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中螢光素酶活性減少。 與miRNA種子區(qū)域互補的3個假定的miR-106b/miR-93結(jié)合位點中前3個堿基的缺失消除 了該效應(yīng)(MUT)。誤差棒表示針對海腎螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的螢火蟲螢光素酶活性+/-SD。 將各報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至少2次(在不同天)并且以一式三份測定各樣品。圖3F:qRT_PCR 分析顯示E2F1 mRNA在圖3C中顯示的相同細(xì)胞中下調(diào)。誤差棒表示針對U6標(biāo)準(zhǔn)化的RNA 表達(dá)+/-SD。圖4A-4E :miR_106b和miR-93抑制p21蛋白的表達(dá)。圖4A 在使用miR_106b和 miR-93AS0(圖4A)或模擬物(圖4BA)進行轉(zhuǎn)染后或在慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)相同miRNA (圖4C)后 在0.5% FBS RPMI 1640中培養(yǎng)的Snu_16細(xì)胞中的p21表達(dá)。圖4D :qRT_PCR結(jié)果顯示用 miR-106b或miR-93寡核苷酸轉(zhuǎn)染的Snu-16細(xì)胞中p21 mRNA的水平無顯著差異。誤差棒 表示針對U6標(biāo)準(zhǔn)化的RNA表達(dá)+/-SD。圖4E 報告基因測定顯示用pGL3-p21_3 ‘ UTR和 miR-106b或miR-93寡核苷酸共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中螢光素酶活性減少。與miRNA種子區(qū)域互補 的miR-106b/miR-93的預(yù)測的結(jié)合位點的前3個堿基的缺失消除了該效應(yīng)(MUT)。誤差棒 表示針對海腎螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的螢火蟲螢光素酶活性+/-SD。將各報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 至少2次(在不同天)并且以一式三份測定各樣品。圖5A-5D :miR_106b和miR-93的過表達(dá)干擾依賴于TGFE的G1/S細(xì)胞周期停滯。 圖5A =Snu-16細(xì)胞對lng/ml TGFE的生理應(yīng)答在刺激的早期(16小時)細(xì)胞經(jīng)歷G1/S 細(xì)胞周期停滯，同時細(xì)胞凋亡仍然有限，如通過亞二倍體DNA含量所測定的。經(jīng)歷細(xì)胞凋 亡的細(xì)胞的數(shù)目在隨后的數(shù)小時內(nèi)逐漸增加。圖5B 在TGFE刺激后16小時，E2F1蛋白和 (圖5C)Mcm7、miR-106b、miR-93和miR25前體下調(diào)。誤差棒表示針對U6標(biāo)準(zhǔn)化的RNA表 達(dá)+/-SD。圖5D:用指定的寡核苷酸轉(zhuǎn)染Snu-16細(xì)胞，并且在12小時后用lng/ml TGFE進 行處理。上組p21蛋白的表達(dá)。下組FACS分析，使用未配對t檢驗進行模擬物與mi RNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之間的G1/S分?jǐn)?shù)(fraction)的比較。圖6A-6F 內(nèi)源miR_106b和miR-93的表達(dá)的抑制增強依賴于TGFE的G1/S細(xì)胞 周期停滯。圖6A 在通過ASO轉(zhuǎn)染抑制內(nèi)源miRNA后用TGFE處理的Snu-16細(xì)胞的細(xì)胞周 期的分析。計算P值(比較ASO轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的Gl分?jǐn)?shù)與模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的Gl分 數(shù)(未配對t檢驗))(圖6B)。用范圍從0. 1至5. Ong/ml的梯度劑量(graded dose)的 TGFP處理的Snu-16的劑量應(yīng)答曲線。對內(nèi)源miR_106b或miR-93的抑制(通過ASO轉(zhuǎn)染) 恢復(fù)了 Snu-16細(xì)胞對TGFP劑量的敏感性(否則它們對所述劑量具有抗性)(0. 1-0. 3ng/ ml)，如通過FACS分析所確定的。*表示ρ < 0. 0001 (圖6C)。分別通過Western印跡和 qRT-PCR進行p21蛋白和(圖6D)p21 mRNA表達(dá)的分析。誤差棒表示針對U6標(biāo)準(zhǔn)化的RNA 表達(dá)+/-SD。TGFP的存在大大增強了通過抑制內(nèi)源miR-106b和miR-93誘導(dǎo)的p21蛋白上 調(diào)的程度，這可能由增加的p21mRNA的轉(zhuǎn)錄支持。(圖6E)用單獨的抗p21的siRNA或與 miR-106b或miR-93模擬物組合的所述siRNA轉(zhuǎn)染Snu-16細(xì)胞，然后用Ing/mlTGFP處理16
13小時。雖然miR-106b喪失了所有其對細(xì)胞周期的作用，但miR-93在p21沉默后仍然保持 殘留的作用。miR-106b與miR-93之間的該差異應(yīng)答在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的(ρ = 0. 0272)。 (圖6F)在TGFP刺激后通過Western印跡分析參與G1/S檢查點的各種蛋白的表達(dá)。圖7A-7G :miR_25與miR_106b和miR-93協(xié)同阻止TGFP-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā) 生。用miRNA模擬物轉(zhuǎn)染的Snu-16細(xì)胞的CCK-8活力測定。*表示在miR_106b、miR-93、 miR-25和/或miR-106b-25的轉(zhuǎn)染并且隨后用lng/ml TGFP處理48小時后活細(xì)胞數(shù)目的 顯著差異(P < 0. 001)。(圖7B)相反地，miR-106b、miR-93和miR-25的抑制協(xié)同地增強 對TGFP的應(yīng)答在轉(zhuǎn)染三種ASO的混合物后達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性(ρ < 0. 001)。(圖7C)通 過亞二倍體DNA含量的分析確認(rèn)了活力的顯著喪失。(圖7D)在用miRNA模擬物或ASO轉(zhuǎn) 染后或在慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)相同的miRNA后48小時時，Snu-16細(xì)胞中Bim蛋白的表達(dá)。在AGS和 MKN-74細(xì)胞中獲得了相同的對Bim表達(dá)的作用(數(shù)據(jù)未顯示)。(圖7E)螢光素酶測定顯 示用pGL3-Bim-3' UTR和miR-25共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中螢光素酶活性減少。與miRNA種子區(qū)域 互補的miR-25的預(yù)測的結(jié)合位點的前3個堿基的缺失消除了該效應(yīng)(MUT)。誤差棒表示 針對海腎螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的螢火蟲螢光素酶活性+/-SD。將各報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至少 2次(在不同天)并且以一式三份測定各樣品。(圖7F)qRT_PCR分析顯示，在用miR-25寡 核苷酸轉(zhuǎn)染的Snu-16細(xì)胞中Bim mRNA沒有差異(Taqman探針識別兩個主要的同種型Bim EL和Bim L)。誤差棒表示針對U6標(biāo)準(zhǔn)化的RNA表達(dá)+/-SD。(圖7G)用miR-25寡核苷酸、 si-Bim、兩者或亂序的寡核苷酸轉(zhuǎn)染，然后用lng/ml TGFEO處理24小時的Snu-16細(xì)胞中 亞二倍體DNA含量的FACS分析。統(tǒng)計分析如上。圖 8 :E2Fl/miR-106b-25/p21 途徑。概述本文中描述的 miR-106、miR_93 和 miR-25 的作用機制的模型。圖9A-9D 胃癌中miR-106b_25簇的表達(dá)。圖9A 用IOOnM指定的miRNA寡核苷 酸(Ambion)轉(zhuǎn)染293T/17細(xì)胞，并且通過莖-環(huán)qRT-PCR測定miRNA的表達(dá)。MiR_106b、 miR-93,miR-25的引物顯示高度的特異性，miR-17_5p和miR-92的引物分別與miR_106a和 miR-25交叉雜交。將結(jié)果針對TO標(biāo)準(zhǔn)化并且轉(zhuǎn)換成相同的標(biāo)度(scale)。一組10個胃原 發(fā)性腫瘤和10個非腫瘤對照中成熟(圖9B)和前體(圖9C) miRNA的表達(dá)，如通過qRT-PCR 測定的。誤差棒表示來自相同患者的腫瘤與非腫瘤組織之間的相對倍數(shù)改變+/-SD。以一式 三份分析各樣品，并且將其針對RNU49 (成熟miRNA)或CAPN2 (前體miRNA和Mcm7)進行標(biāo) 準(zhǔn)化這些基因顯示在這些樣品中測試的12個不同標(biāo)準(zhǔn)化者之間最小的變異性(< 0. 4Ct 值)。(圖9)用攜帶miR-106b、miR-93、miR-25或miR-106b-25簇的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Snu-16 細(xì)胞，然后利用qRT-PCR在72小時后測量成熟miRNA的水平。誤差棒表示針對U6標(biāo)準(zhǔn)化并 且轉(zhuǎn)換成相同標(biāo)度的RNA表達(dá)+/-SD。通過熒光顯微鏡檢查確認(rèn)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率> 90%。在AGS 細(xì)胞中獲得相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。圖10A-10G 具有高/低miR-106b_25 (基礎(chǔ)條件)的細(xì)胞的增殖研究。分別用 miRNA ASO或模擬物轉(zhuǎn)染的Snu-16細(xì)胞(圖10A，圖10C)和AGS細(xì)胞(圖10B，圖10D)的 FACS分析和增殖曲線。(圖10E)用攜帶在CMV啟動子控制之下的miR-106b，miR-93、miR-25 或miR-106b-25前體的熒光慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的AGS細(xì)胞的增殖曲線。通過熒光顯微 鏡檢查確定感染效率> 95%。(圖10F)集落形成測定用編碼miR-106b、miR-93、miR-25 或miR-106b-25前體或亂序的序列的pRetroSuper-Puro構(gòu)建體轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞并且將其在2ug/ml嘌呤霉素中培養(yǎng)14天。利用Northern印跡和莖-環(huán)qRT-PCR測定此類構(gòu)建體的 有效miRNA表達(dá)和加工(數(shù)據(jù)未顯示)。(圖10G)通過RNAi選擇性沉默p21或E2F1的 Snu-16細(xì)胞的增殖曲線和(H)FACS分析。p21表達(dá)的抑制對細(xì)胞周期產(chǎn)生了難以與miR-93 區(qū)分的作用。圖11 在TGFE存在的情況下的MKN-74細(xì)胞的活力測定。用指定的LNA寡核苷酸 轉(zhuǎn)染MKN-74細(xì)胞以沉默內(nèi)源miRNA的表達(dá)，然后用TGFE處理96小時。通過CCK-8測定確 定細(xì)胞活力。圖12 過表達(dá)miR-25的細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)測定。通過膜聯(lián)蛋白V染 色確認(rèn)示于圖7G中的結(jié)果。圖13 表1 在慢性胃炎與正常胃粘膜中差異表達(dá)的miRNA。圖14 表2 在胃腺癌與非腫瘤胃粘膜中差異表達(dá)的miRNA。圖15 表3 人胃癌細(xì)胞系中的微RNA表達(dá)。圖16 表4 通過qRT-PCR驗證配對的人原發(fā)性腫瘤與非腫瘤對照的微陣列數(shù)據(jù)。圖17 表5 10個配對的胃原發(fā)性腫瘤和非腫瘤對照中Mcm7mRNA和miR-106b_25 的表達(dá)。圖18 表6 在相同的3' UTR上具有假定的miR_106b、miR-93和miR-25結(jié)合位 點的人基因。優(yōu)選實施方案的詳述在整個本公開內(nèi)容中，通過標(biāo)識引用來引用各種公開物、專利和公開的專利說明 書。這些公開物、專利和公開的專利說明書的公開內(nèi)容通過引用合并入本公開內(nèi)容以更全 面地描述本發(fā)明涉及的現(xiàn)有技術(shù)。E2F1活性的下調(diào)和對TGFE的抗性是胃癌的標(biāo)志。微RNA(miRNA)是在人惡性腫瘤 中被頻繁誤調(diào)的(misregulated)小非編碼RNA。此處我們顯示，在人胃腫瘤的亞組中上調(diào)的miR-106b-25簇與其宿主基因Mcm7平 行地被E2F1激活。反過來，miR-106b和miR-93調(diào)控E2F1的表達(dá)，從而建立了 miRNA-指導(dǎo)的 負(fù)反饋回路。此外,此類miRNA的上調(diào)削弱了干擾CDKNlA (p21Wafl/Cipl)和BCL2L11 (Bim) 的表達(dá)的TGFE腫瘤抑制途徑。結(jié)合起來，這些結(jié)果顯示，miR-106b-25簇參與E2F1轉(zhuǎn)錄后 調(diào)控并且可在胃癌中在TGFE抗性的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。微RNA (miRNA)是可調(diào)控大約30%的所有人基因的表達(dá)(通過抑制靶mRNA翻譯或 誘導(dǎo)其降解)的小非編碼RNA。此類基因在人惡性腫瘤中異常表達(dá)，這使得它們的生物學(xué)重 要性變得日益明顯。胃癌引起每年12%的所有癌癥相關(guān)死亡，這要求基于對該疾病發(fā)作背 后的分子機制的更深刻理解的更好的治療。此處，我們顯示miR-106b_25簇的過表達(dá)導(dǎo)致重要的癌癥相關(guān)基因例如TGFE效應(yīng) 物p21Wafl/Cipl和Bim的失調(diào)，從而中斷了 G1/S檢查點并且賦予對依賴于TGFE的細(xì)胞凋 亡的抗性。我們還顯示微RNA(miRNA)可參與胃腫瘤發(fā)生。MiRNA是據(jù)認(rèn)為調(diào)控達(dá)到30%的 人基因的表達(dá)(通過抑制mRNA翻譯或誘導(dǎo)其降解)的非蛋白質(zhì)編碼性基因(Lewis等人，
2005)。除了在細(xì)胞分化和器官發(fā)育中的至關(guān)重要的作用外(Kloosterman和Plasterk，
2006)，miRNA在人癌癥中被頻繁誤調(diào)(Lu等人，2005；Volinia等人，2006)并且它們可充當(dāng)
15有效的癌基因或腫瘤抑制基因(Esquela-Kersher等人2006)。此處我們顯示E2F1調(diào)控miR-106b、miR-93和miR-25 (包含在Mcm7基因中的一簇 內(nèi)含子miRNA)，包括它們在胃原發(fā)性腫瘤中的積累。反過來，miR-106b和miR-93控制E2F1 的表達(dá)，從而建立了在阻止E 2F1自激活和可能地細(xì)胞凋亡中可能是非常重要的負(fù)反饋回 路。在另一方面，我們發(fā)現(xiàn)miR-106b、miR-93和miR-25的過表達(dá)通過干擾p21和 Bim(分別為依賴于TGFE的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡的兩個最下游的效應(yīng)物)的合成引起 減少的胃癌細(xì)胞對TGFE的應(yīng)答。此類miRNA促成了癌細(xì)胞中TGFE抗性的產(chǎn)生，在本文中本發(fā)明者現(xiàn)相信其代表了 用于治療胃癌的新型治療靶。在下列實施例中進一步解釋本發(fā)明，其中，除非另有說明，所有部分和百分比以重 量計并且溫度是攝氏度。應(yīng)理解，表示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的這些實施例僅通過舉例說 明的方式給出。根據(jù)上述討論和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的本質(zhì)特征， 并且無需背離其精神和范圍，可以對本發(fā)明進行多種變化和改進以使其適應(yīng)不同的用法和 條件。本說明書中涉及的所有公開物，包括專利和非專利文獻(xiàn)明確地通過引用并入本文。實施例I人胃癌中miRNA表達(dá)的失調(diào)大多數(shù)胃腺癌在通常與幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori, HP)感染相關(guān)的慢性 炎性背景的環(huán)境中發(fā)生(Uemura等人，2001)。然而，導(dǎo)致HP致癌性的分子機制仍然不清 楚，盡管Thl免疫應(yīng)答似乎在癌前病變例如胃萎縮和腸化生的發(fā)生中至關(guān)重要(Houghton 等人，2002 ；Fox 等人，2000)。在搜索可能參與胃腫瘤發(fā)生的miRNA中，我們使用定制的miRNA微陣列分析了 20 個腸類型的胃原發(fā)性腫瘤(每一個腫瘤與來自相同患者的相鄰非腫瘤胃組織配對)和6個 胃癌細(xì)胞系的總體miRNA表達(dá)。為了鑒定與炎癥和/或癌前病變相關(guān)的特異改變，我們首先 將具有慢性胃炎的組織學(xué)體征的非腫瘤組織(η = 13)與另外的正常粘膜(η = 7)相比較。 通過未配對微陣列顯著性分析(SAM)顯示，7個miRNA與慢性炎癥相關(guān)，包括已知對癌癥易 感(Costinean等人，2006)并且在免疫應(yīng)答的調(diào)控中起主要作用(Rodriguez等人，2007 ； Thai 等人，2007)的 miR-155 (圖 1A，圖 I3-表 1)。然后我們檢查了胃原發(fā)性腫瘤和癌細(xì)胞系的miRNA表達(dá)特征譜通過配對SAM顯 示，與非腫瘤對照相比較，總共14個miRNA在原發(fā)性腫瘤中展示了 2倍或更大的中值過表 達(dá)(圖1B，圖14-表2)。在這些miRNA中，除了不表達(dá)的miR-223以外，14個中有13個在 表達(dá)方面排列高于第80百分位數(shù)(圖15-表3)。只有5個miRNA在癌癥中下調(diào)(圖1B，圖 14-表2)。通過莖-環(huán)qRT-PCR驗證了 10個測試miRNA中的9個的微陣列數(shù)據(jù)(圖16-表 4)。在被誤調(diào)的miRNA當(dāng)中，miR-21、miR-223、miR-25和miR-17_5p在腫瘤中顯示了最高 的過表達(dá)，其分別具有4. 5,4. 2,3. 7和3. 7的中值倍數(shù)改變。這些結(jié)果表明miRNA表達(dá)模式的特定改變是人胃癌的特征，因為腫瘤發(fā)生的最早 步驟牽涉具有已知的致癌特性的miRNA例如miR-21 (Meng等人，2006)和miR-17_5p (He等 人，2005)。miR-106b_25簇在胃癌中過表達(dá)
在過表達(dá)的miRNA當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)miR_25是特別有用的吸引人的候選物，因為其在胃 腫瘤發(fā)生中起作用。事實上，這是在原發(fā)性胃腫瘤中第3強上調(diào)的miRNA(中值倍數(shù)改變 3. 7 ；范圍1. 0-26. 8)并且在所有人胃癌細(xì)胞系中排列在最高表達(dá)的miRNA之中(高于第 97百分位數(shù))。miR-106b (中值倍數(shù)改變2· 0 ；范圍1. 0-6. 5)和miR-93 (中值倍數(shù)改變 2. 3 ；范圍1. 0-7. 7)也在原發(fā)性腫瘤中上調(diào)并且在所有胃癌細(xì)胞系中高度表達(dá)(分別高于 第82百分位數(shù)和第89百分位數(shù))。這3個miRNA(在下文中miR-106b_25)簇集在染色體7q22上的Mcm7的內(nèi)含子 13中并且在Mcm7初級RNA轉(zhuǎn)錄物的背景中活躍地共轉(zhuǎn)錄(Kim等人，2007和圖1C-E)。幾 個研究報導(dǎo)了該區(qū)域在胃腫瘤中的擴增(Weiss等人，2004 ；Peng等人，2003 ；Takada等人， 2005)。然而，我們在我們的樣品中未能檢測到miR-106b-25基因座的任何擴增(數(shù)據(jù)未顯 示)，這暗示著一定有其他機制促成miR-106b-25在胃癌中的過表達(dá)。Mcm7在G1/S期轉(zhuǎn)變中起著中樞作用，其協(xié)調(diào)染色體DNA上的復(fù)制叉的正確組裝 以及確保所有基因組在每一個細(xì)胞周期中復(fù)制一次并且只復(fù)制一次(Blow和Hodgson， 2002)。由于Mcm7的過表達(dá)已與前列腺和子宮內(nèi)膜癌中的不良預(yù)后相關(guān)聯(lián)(Ren等人，2006 ； Li等人，2005)，因此我們假定Mcm7的致癌性可能至少部分地與包含的miRNA的過表達(dá)關(guān) 聯(lián)。此外，miR-106b-25簇與顯示具有致癌作用的miR-17-92簇(He等人，2005 ；0' Donnell 等人，2005 ；Dews等人，2006)共有高度的同源性(圖1C)。然后我們研究miR-106b_25簇。我們首先確定莖-環(huán)qRT_PCR的特異性。用于 miR-106b、miR-93和miR-25的引物是高度特異的，然而miR-17_5p和miR-92的探針分別與 miR-106a和miR-25交叉雜交(圖9A)。然后，我們使用莖-環(huán)qRT-PCR在獨立的一組10 個胃原發(fā)性腫瘤(與來自相同患者的非腫瘤胃粘膜配對)中測定成熟miRNA類別的表達(dá)。成熟miR-106b、miR-93和miR-25分別在6/10、6/10和5/10的這些腫瘤中過表 達(dá)，雖然在它們的表達(dá)水平中不存在相互關(guān)聯(lián)(圖9B)。我們通過常規(guī)qRT-PCR檢查了相同腫瘤中miRNA前體的水平(圖9C)，我們發(fā)現(xiàn) miR-106b、miR-93 和 miR-25 前體類別在腫瘤中協(xié)同表達(dá)[r(106b/93) = 0. 93 ；r(106b/25) =0. 78 ；r (93/25) = 0. 88，圖 17-表 5]。在5個過表達(dá)miR-106b_25前體的腫瘤中，3個腫瘤也表達(dá)高水平的成熟 miR-106b、miR-93和miR-25，然而剩余的腫瘤展示可變的各成熟miRNA的表達(dá)，這顯示控制 個體miRNA的另外的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平。Mcm7 mRNA也在5/10的腫瘤中過表達(dá)，這顯示與miR_106b、miR-93和miR-25前 體的水平幾乎完全相關(guān)(分別地r = 0. 98,0. 92,0. 72，圖9C和圖17-表5)。這些數(shù)據(jù)顯示，miR-106b-25前體與Mcm7 mRNA平行地在胃原發(fā)性腫瘤亞組中特 異性過表達(dá)。雖然我們不能排除miR-106b-25具有獨立啟動子的可能性，但我們的結(jié)果顯 示胃腫瘤中miR-106b-25的轉(zhuǎn)錄由其宿主基因Mcm7驅(qū)動。此外，轉(zhuǎn)錄后機制也在決定成熟 miR-106b-25的水平中起主要作用，如最近對于其他miRNA所提出的(Thomson等人，2006)。負(fù)反饋回路控制E2F1和miR-106b_25的表達(dá)。E2F1是反式激活參與染色體DNA復(fù)制的眾多基因(Johnson和DeGregori，2006) (包括Mcm7 (Suzuki等人，1998 ;Arata等人，2000))的轉(zhuǎn)錄因子。在本文中本發(fā)明者現(xiàn)相 信，miR-106b-25的轉(zhuǎn)錄可類似地受E2F1調(diào)控。為了進行檢測，我們首先確定E2F1蛋白水平的內(nèi)源性波動是否相應(yīng)于Mcm7和miR-106b-25表達(dá)的相似變化。有趣地，通過諾考達(dá)唑 處理12小時而在有絲分裂中停滯的AGS胃癌細(xì)胞不表達(dá)E2F1蛋白并且顯示Mcm7轉(zhuǎn)錄物(2 倍)以及miR-106b、miR-93和miR-25前體(分別地4. 0,5. 2和12. 0倍)的減少(與指數(shù) 生長的細(xì)胞相比)。當(dāng)細(xì)胞被釋放并且重新進入Gl期時，E2F1表達(dá)平行于Mcm7、miR-106b、 miR-93和miR-25前體RNA的再積累。(圖2A-C)。該過程與E2F1表達(dá)直接相關(guān)，因為其特異性過表達(dá)(通過腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo))(圖2D) 或沉默(通過RNA干擾)(圖2E)也誘導(dǎo)了 miR-106b-25前體水平的一致改變。E2F1功能 的喪失也在72小時后影響成熟miRNA的表達(dá)(圖2F)。為了進一步在體內(nèi)驗證數(shù)據(jù)，我們通過Western印跡分析了 E2F1蛋白在10個原 發(fā)性胃腫瘤中的表達(dá)并且發(fā)現(xiàn)E2F1蛋白與Mcm7/miR-106b-25前體表達(dá)之間的正相關(guān)(圖 2G)。事實上，5個過表達(dá)E2F1的腫瘤中有4個展示更高水平的Mcm7和miR-106b_25前體 (圖9C)。在這些腫瘤中，3個腫瘤也過表達(dá)成熟miR-106b、miR-93和miR-25(圖9B)。然 而，一個腫瘤顯示Mcm7和miR-106b-25前體上調(diào)，而無可檢測的E2F1水平，這顯示其他轉(zhuǎn) 錄因子也參與了 miR-106b-25的調(diào)控。這些結(jié)果表明E2F1同時調(diào)控miR-106b-25和Mcm7的表達(dá)，從而顯示，胃癌中此類 miRNA的過表達(dá)至少部分因E2F1的上調(diào)而引起。最近，已提出miR-17-5p為E2F1的新轉(zhuǎn)錄后調(diào)控劑(0' Donnell等人，2005)。鑒 于miR-17-5p、miR-106b和miR-93序列之間的相似性，我們探究了 miR_106b和miR-93可 能也參與E2F1表達(dá)的調(diào)控的可能性。因為這些miRNA廣泛地在一組12個胃癌細(xì)胞系中表 達(dá)(通過qRT-PCR進行分析)(圖3A)，所以我們采用功能喪失法來拮抗miR-106b_25?？?miR-106b和miR-93的LNA反義寡核苷酸(ASO)的轉(zhuǎn)染在Snu_16細(xì)胞中誘導(dǎo)E2F1蛋白的 積累，這表明此類miRNA的內(nèi)源水平控制其表達(dá)(圖3B)。此外，通過寡核苷酸轉(zhuǎn)染或慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的此類miRNA的過表達(dá)(圖9D)明確 地減少Snu-16和AGS胃癌細(xì)胞系中E2F1蛋白的水平(圖3C和圖3D)并且抑制含有E2F1 3' UTR的報告基因載體的表達(dá)。報告基因載體中預(yù)測的miRNA結(jié)合位點的突變消除該效 應(yīng)，從而表明miR-106b和miR-93直接與E2F1 3' UTR相互作用(圖3E)。然而，在miR_106b 和miR-93轉(zhuǎn)染后，E2F1 mRNA減少2倍，這可能是由于部分mRNA降解或E2F1轉(zhuǎn)錄激活子 的下調(diào)(圖3F)。已爭辯，miR-17-5p可能通過抑制實際上激活E2F1轉(zhuǎn)錄并且也是miR-17_5p的靶 的AIB-I蛋白來間接地抑制E2F1表達(dá)(Hossain等人，2006)。雖然miRNA作用于相同途 徑內(nèi)的不同靶是非常合理的，但我們分析了 AGS和Snu-16細(xì)胞中AIB-I蛋白的水平，并且 我們發(fā)現(xiàn)，在分別用miR-106b或miR-93轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中水平微小減少或根本無差異，這顯示 AIB-I是miR-106b的真正低親和力的靶，其可能只部分地促成E2F1的下調(diào)(圖3C)?？偟膩碚f，這些結(jié)果顯示E2F1調(diào)控miR-106b-25的表達(dá)但也是miR_106b和 miR-93的靶，從而建立了胃癌細(xì)胞中的負(fù)反饋回路。因為已知E2F1通過正反饋回路自激活 其自己的啟動子，因此此類miRNA可控制E2F1蛋白合成的速率，從而阻止其過度積累，如最 近對于同源物miR-17-5p和miR_20a所提出的(Sylvestre等人，2007 ；Woods等人，2007)。miR-106b和miR-93削弱TGFE-誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯。這些結(jié)果顯示當(dāng)細(xì)胞退出有絲分裂并且重新進入Gl期時，E2F1迅速誘導(dǎo)miR-106b-25的轉(zhuǎn)錄。在此基礎(chǔ)上，我們假設(shè)miR-106b_25與E2F1理想地協(xié)同抑制G0/G1 相關(guān)活性的可能作用。因此，我們探詢TargetScan數(shù)據(jù)庫以尋找已知受E2F1負(fù)調(diào)控的基 因，并且我們將CDKNlA(p21)鑒定為miR-106b和miR-93的假定的靶。該基因，通常在人 癌癥中功能失調(diào)，是細(xì)胞周期的關(guān)鍵抑制劑(Mattioli等人，2007)。有趣地，我們確認(rèn)在 Snu-16細(xì)胞中內(nèi)源表達(dá)的miR-106b和miR-93轉(zhuǎn)錄后調(diào)控p21。事實上，它們的抑制(通 過AS0)增強了 p21蛋白的表達(dá)(圖4A)。相反地，通過寡核苷酸轉(zhuǎn)染(圖4B)或慢病毒轉(zhuǎn) 導(dǎo)(圖4C)獲得的miR-106b和miR-93的上調(diào)抑制p21蛋白的表達(dá)而不顯著改變p21 mRNA 的水平(圖4D)。此外，miR-106b和miR-93模擬物抑制含有p21 3' UTR的報告基因載體 的表達(dá)，而預(yù)測的miRNA結(jié)合位點的突變消除該效應(yīng)(圖4E)。鑒于p21在細(xì)胞周期調(diào)控中的重要性，我們決定闡明miR106b_25在控制胃癌細(xì)胞 增殖中的作用。出人意料地，通過ASO轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的miR-106b、miR-93和/或miR-25的功能 喪失不產(chǎn)生Snu-16細(xì)胞的細(xì)胞周期和增殖的任何顯著變化(圖IOA和圖10C)。類似地，通 過寡核苷酸轉(zhuǎn)染或慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的所述3個miRNA的過表達(dá)不顯著改變AGS細(xì)胞的增殖 速率和集落形成效率，雖然我們注意到在miR-93過表達(dá)時有限的但可重現(xiàn)的細(xì)胞周期干 擾(+8%的S期細(xì)胞，圖10BU0D禾口 10E)。我們使用GTL-16和MKN-74胃癌細(xì)胞系獲得相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，這表明 miR-106b-25的功能不是胃癌細(xì)胞體外存活和增殖所必需的。然而，通過RNAi對p21或 E2F1的特異性沉默同樣沒有產(chǎn)生增殖的顯著改變(圖IOG和10H)，從而確認(rèn)這些癌癥細(xì)胞 系不對p21基礎(chǔ)水平作出響應(yīng)并且可很好地補償E2F1表達(dá)的缺失。然后我們闡明miR-106b_25在TGFO存在的情況下的作用該細(xì)胞因子，通過誘導(dǎo) P21和其他抗增殖分子的表達(dá)，在胃腸道中適時確保成熟細(xì)胞的協(xié)同的細(xì)胞周期停滯和細(xì) 胞凋亡，從而控制上皮細(xì)胞的生理更新(van den Brink和Offerhaus，2007)。該至關(guān)重要 的腫瘤抑制途徑的削弱是胃癌的標(biāo)志(Ju等人，2003 ；Park等人，1994)。然而，Snu-16細(xì)胞 是在體外仍然對相對高劑量的TGFO作出響應(yīng)，經(jīng)歷G1/S停滯和隨后大量細(xì)胞凋亡的少數(shù) 胃癌細(xì)胞系之一(Ohgushi等人，2005和圖5A)。然而，細(xì)胞活力在24小時后降低，這打開 了研究與TGFO相關(guān)的早期分子變化的窗口。有趣地，使用TGFO的刺激在16小時后(此時細(xì)胞生理性經(jīng)歷G1/S停滯)誘導(dǎo) E2F1蛋白、Mcm7 mRNA和miR-106b_25前體的顯著下調(diào)，這表明此類miRNA的下調(diào)是對TGFO 的生理響應(yīng)的一部分(圖5B和5C)。為了確定該過程的重要性，我們在TGFO存在的情況下 通過在Snu-16細(xì)胞中引入miR-106b、miR-93和/或miR-25模擬物來中和miR-106b_25的 下調(diào)。值得注意地，miR-93的過表達(dá)完全消除TGFO誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯，而miR-106b部 分地減少該效應(yīng)(P < 0. 0002)，與由此類miRNA誘導(dǎo)的p21下調(diào)的程度一致(圖5D)。相反地，通過ASO拮抗內(nèi)源miR-106b和miR-93的表達(dá)顯著增加經(jīng)歷依賴于TGFO 的細(xì)胞周期停滯的Snu-16細(xì)胞的數(shù)目(ρ < 0. 0013)并且恢復(fù)了細(xì)胞對亞適量的TGFO的 敏感性(P < 0. 0001)(否則這些細(xì)胞對所述劑量具有抗性)(圖6A和6B)。因此，在TGFO存在的情況下通過抑制內(nèi)源miR106b和miR-93獲得的p21上調(diào)的 程度(圖6C)是基礎(chǔ)條件下的2倍(圖4A)，這可能由p21 mRNA的活躍轉(zhuǎn)錄支持(圖6D)。為了確定p21在誘導(dǎo)與miR-106b和miR-93的功能獲得/喪失相關(guān)的表型中的 作用，我們通過RNAi (si-p21)在用TGFP處理的Snu-16細(xì)胞中特異性沉默p21。這幾乎全
19面概括了 miR-106b和miR-93的過表達(dá)對細(xì)胞周期分布的作用(圖5D)，然而si_p21與 miR-106b和miR-93的共轉(zhuǎn)染顯著減少了此類miRNA對TGFO-誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯的作用， 這表明P21是該生物學(xué)背景中的主要靶(圖6E)。然而，在p21不存在的情況下仍然可觀 察到miR-93對依賴于TGFO的細(xì)胞周期停滯的小的但統(tǒng)計學(xué)上顯著的作用(ρ = 0. 0272)， 這暗示著其他直接或間接的靶與Ρ21協(xié)同作用。參與G1/S檢查點的基因的表達(dá)的分析將 P27指定為miR-93的可能的間接靶(圖6F)。這些數(shù)據(jù)顯示miR-106b和miR-93主要通過在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制p21的表達(dá)來干 擾TGFO誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯。然而，不依賴于p21的途徑也可參與傳遞miR-93對細(xì)胞周 期控制的完全作用。miR-25與miR_106b和miR-93協(xié)同阻止TGFO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這些結(jié)果顯示miR-106b和miR-93在TGFP刺激的早期調(diào)控細(xì)胞周期停滯的作 用。我們分析在延長的對TGFP的暴露(其最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡)后的miR-106b-25的功能 (Ohgushi 等人，2005，和圖 5B)。我們通過四唑還原測定檢查用TGFP刺激24至48小時的Snu-16細(xì)胞的活力。 miR-106b、miR-93和/或miR-25模擬物在此類細(xì)胞中的引入誘導(dǎo)顯著的對TGFP的抗性(圖 7A)。相反地，當(dāng)所有3種miRNA同時被抑制時，ASO轉(zhuǎn)染在活細(xì)胞數(shù)目方面誘導(dǎo)了達(dá)到統(tǒng) 計學(xué)顯著性(P = 0. 003)的負(fù)趨勢(圖7B)。該結(jié)果通過FACS分析得到證實，其顯示在沉 默3種miRNA后亞二倍體細(xì)胞的數(shù)目顯著增加(p<0. 001)。此外，該測定的更高的靈敏度 允許檢測在miR-106b、miR-93或miR-25的個別抑制后亞二倍體細(xì)胞的百分比的更小但顯 著的變化(P < 0. 001)(圖7C)。最后，miR-106b-25的沉默部分恢復(fù)對TGFE的敏感性(否 則MKN-74細(xì)胞對其具有抗性)(圖11)。結(jié)合起來，這些結(jié)果與其中內(nèi)源miR-106b、miR-93 和miR-25協(xié)同調(diào)控一個或多個介導(dǎo)依賴于TGFE的細(xì)胞凋亡的靶的表達(dá)的模型相符。我們搜索TargetScan數(shù)據(jù)庫以尋找細(xì)胞凋亡的效應(yīng)物，并且我們在18個同時具 有假定的miR-106b、miR-93和miR-25結(jié)合位點的人基因中將BCL2L11 (Bim)鑒定為唯一強 的候選物(圖18-表6)。Bim是通過激活促凋亡分子如Box和Bad以及拮抗抗凋亡分子如 Bcl2和Bill來在多種組織中關(guān)鍵性地調(diào)控細(xì)胞凋亡的僅BH3的蛋白(BH3-only protein) (Gross等人，1999)。為了正確地調(diào)控細(xì)胞凋亡，Bim與其伴侶蛋白的細(xì)胞內(nèi)濃度的精細(xì)平 衡是至關(guān)重要的。Bim是單倍不足的并且單個等位基因的失活甚至在不喪失另一個等位基 因的情況下也可加速小鼠中Myc誘導(dǎo)的腫瘤的發(fā)生(Egle等人，2004)。值得注意的是，Bim 是TGFE途徑的最下游細(xì)胞凋亡效應(yīng)物并且其下調(diào)在Snu-16細(xì)胞中消除了依賴于TGFE的 細(xì)胞凋亡(Ohgushi等人，2005)。我們確定了 Bim是否是miR-106b-25的直接靶。Snu-16細(xì)胞表達(dá)Bim的所有3個 主要的同種型，即Bim EL,Bim L和Bim S。有趣地，通過ASO轉(zhuǎn)染拮抗內(nèi)源miR-25在Snu-16 細(xì)胞中誘導(dǎo)了所有3個同種型的積累，而通過寡核苷酸轉(zhuǎn)染或慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的miR-25的 過表達(dá)減少了它們的表達(dá)。相反地，miR-106b和miR-93在所有3個測試的胃癌細(xì)胞系中 不影響B(tài)im的表達(dá)(圖7D)。雖然miR-106b和miR-93與miR-25在其他組織中協(xié)同調(diào)控Bim的表達(dá)仍然是可 能的，但這支持其中細(xì)胞凋亡的多個效應(yīng)物在胃癌中被3個miRNA中的每一個協(xié)同抑制的 模型。
我們關(guān)注于作為此類細(xì)胞凋亡效應(yīng)物之一的Bim并且通過螢光素酶測定確定，在 其3' UTR上的miR-25的預(yù)測的結(jié)合位點介導(dǎo)靶識別和隨后的翻譯抑制(圖7E)。此外， Bim EL和Bim L mRNA的水平在miR-25過表達(dá)后在Snu_16細(xì)胞中未發(fā)生改變，這標(biāo)示著轉(zhuǎn) 錄后調(diào)控機制(圖7F)。為了確定與miR-25的特異性抗細(xì)胞凋亡功能相關(guān)的Bim下調(diào)的重要性，我們使用 抗其3個主要同種型的siRNA(si-Bim，圖7D)在Snu-16細(xì)胞中抑制Bim蛋白，然后我們用 TGFE處理這些細(xì)胞24小時。值得注意地，由si-Bim和miR-25賦予的免受細(xì)胞凋亡的保護 作用非常相似，如通過亞二倍體DNA含量和膜聯(lián)蛋白V染色所測定的。此外，Bim和miR-25 的共轉(zhuǎn)染不具有顯著的累加效應(yīng)(P = 0. 6328)，這表明Bim下調(diào)在過表達(dá)miR-25的細(xì)胞中 是對TGFE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抗性的主要機制(圖7G和圖12)。我們顯示，被E2F1激活并且在人胃腺癌中上調(diào)的miR-106b_25簇改變了胃癌細(xì)胞 對造成細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡的TGFE的生理應(yīng)答(圖8)。這些發(fā)現(xiàn)在胃癌模型中具有特別的意義，因為TGFE腫瘤抑制途徑的削弱是胃腫 瘤發(fā)生中的至關(guān)重要的步驟。碰我們在胃癌發(fā)生的不同步驟中進行miRNA表達(dá)的基因組范圍的分析。因為絕大多 數(shù)胃腫瘤源于慢性炎性背景(Uemura等人，2001)，因此我們考慮區(qū)分癌前改變與腫瘤特異 性改變的特定關(guān)聯(lián)。我們第一次鑒定了迄今為止一直被忽略的miRNA簇在人腫瘤中的特異性過表達(dá)。 雖然我們關(guān)注于胃癌，但miR-106b、miR-93和miR-25在其他類型的癌癥中的過表達(dá)也可能 是共同的(但仍然被低估的)事件。事實上，miR-106b-25的表達(dá)與參與細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)機制的E2F1和Mcm7的表達(dá)密 切相關(guān)。例如，Mcm7通常在前列腺癌中過表達(dá)(Ren等人，2006)并且，事實上，我們之前在對 該類型的癌癥的大規(guī)模miRNA研究中描述了 miR-25的上調(diào)(Volinia等人，2006)。此外，我 們顯示，通常用于測定miR-92(其在大多數(shù)人腫瘤中過表達(dá)(Volinia等人，2006))的表達(dá) 的莖_環(huán)qRT-PCR探針，與miR-25交叉雜交。然而，鑒于幾乎相同的序列，miR-106b_25和 miR-17-92極可能協(xié)同發(fā)揮相似的(如果不相同的話)功能事實上，我們發(fā)現(xiàn)miR-17_5p、 miR-18a和miR_20a也抑制p21的表達(dá)，而miR-92抑制Bim的表達(dá)(F. P.和Α. V.，未公布 的數(shù)據(jù))。此外，miR-106b-25和miR-17-92都受E2F1調(diào)控。然而此類簇也展示一些差異。 例如，miR-106b與miR-17-5p相似，但其短3個核苷酸據(jù)報導(dǎo)3'末端中的特定序列可確 定miRNA的細(xì)胞內(nèi)定位(Hwang等人，2007)。此外，miR-19家族不由miR-106b_25簇代表 (圖 2A)。在另一方面，miR-93屬于miR-372和miR-373的相同家族這3個miRNA在睪丸 生殖細(xì)胞腫瘤中過表達(dá)，在所述細(xì)胞中它們減少LATS2的表達(dá)，從而使細(xì)胞對高p21水平不 敏感(Voorhoeve 等人，2006)。如本文中所顯示的，miR-93在相同的途徑中起作用，直接靶向p21的表達(dá)。因此， 現(xiàn)相信該miRNA家族參與調(diào)控細(xì)胞周期的至關(guān)重要的中樞的控制并且可在癌癥中具有特 殊關(guān)聯(lián)性。此外，miR-93與miR-291_3p、miR—294和miR-295共有高度序列同源性此類
21miRNA在多能性ES細(xì)胞中特異性表達(dá)并且它們在分化后沉默或下調(diào)(Houbaviy等人， 2003)。然而不希望受理論束縛，本發(fā)明者在本文中現(xiàn)相信，此類miRNA可類似地參與p21 的調(diào)控。本發(fā)明者顯示，miRNA通過不同機制在細(xì)胞周期的控制中起作用。在E2F1的情況 下，miRNA顯示主要在調(diào)控性、冗余反饋回路的背景中起作用。事實上，位于分開的miRNA簇 上的miR-106b、miR-93、miR-17-5p和miR_20a受E2F1調(diào)控并且可能協(xié)同抑制其翻譯。同時，我們發(fā)現(xiàn)此類miRNA參與p21表達(dá)的控制和對TGFE的早期應(yīng)答。本發(fā)明者 還相信，它們也控制匯聚于P21上的其他腫瘤抑制途徑。由于突變、缺失、超甲基化、泛素化 或錯誤定位(mislocalization)而產(chǎn)生的p21功能喪失是人胃癌中的常見事件和不利預(yù) 后因素(Mattioli等人，2007)。然而，之前從未探究過miRNA在p21調(diào)控中的作用。因為 80 %的研究的胃原發(fā)性腫瘤不表達(dá)可檢測水平的p21蛋白，因此我們不能確定miRNA與p21 蛋白表達(dá)之間的負(fù)相關(guān)。然而，原發(fā)性腫瘤中的p21 mRNA水平通常與正常組織相當(dāng)，這表 明轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是胃癌中P21下調(diào)的常見原因(F. P和Α. V.，未公布的數(shù)據(jù))。有趣地，p21表達(dá)的誘導(dǎo)似乎是在TGFE刺激的早期引發(fā)miR-106b/miR-93相關(guān) 應(yīng)答的前提條件。相反地，通過RNAi沉默p21顯著地減少了此類miRNA對細(xì)胞周期的作 用。雖然通過計算機方法預(yù)測了每一個miRNA的數(shù)百個不同的靶，但存在日益增加的證據(jù) 表明，“主要的miRNA靶”對于特定生物學(xué)功能可能是至關(guān)重要的。例如，miR-lOb增強乳腺 癌細(xì)胞的細(xì)胞運動性和侵襲力，但該表型在其靶H0XD10的組成型表達(dá)后被完全回復(fù)，盡管 對于該miRNA預(yù)測了 100多個靶(Ma和Weinberg，2007)。當(dāng)然，要指出的是，這些觀察不 排除其中多個靶受單個miRNA的平行調(diào)控是發(fā)揮特定功能所必需的其他背景。此外，多個 miRNA可協(xié)同發(fā)揮相同的功能。這在miR-106b_25簇的情況下是保護胃癌細(xì)胞免受細(xì)胞凋亡。這樣的作用在協(xié) 同抑制不同促凋亡分子的表達(dá)的3個miRNA之間分配。我們將Bim(TGFE途徑的最下游的 細(xì)胞凋亡效應(yīng)物(Ohgushi等人，2005))鑒定為miR-25的關(guān)鍵靶。這在胃癌模型中具有特 別的意義。事實上，TGFE是胃動態(tài)平衡(homeostasis)的主要調(diào)控劑之一并且在通過細(xì) 胞凋亡調(diào)控上皮細(xì)胞的生理更新中是必需的(van den Brink和Offerhaus，2007)。雖然 miR-106b和miR-93的促凋亡靶的身份(identify)仍然不清楚，但我們可清楚地檢測到分 別與miR-106b、miR-93和/或miR-25的過表達(dá)和抑制相關(guān)的抗凋亡和促凋亡應(yīng)答；這些特 性出現(xiàn)在TGFE刺激的后期，此時細(xì)胞周期停滯消除并且細(xì)胞凋亡成為占優(yōu)勢的過程(其表 征了胃細(xì)胞對TGFE的應(yīng)答)。當(dāng)3種ASO被一起遞送時，可通過分析亞二倍體DNA含量容 易地檢測到的、在抑制單個miRNA后觀察到的小的但顯著的改變獲得生物學(xué)一致性，這確 認(rèn)了這些成簇的miRNA之間的協(xié)同關(guān)系。雖然通過四唑還原測定和亞二倍體DNA含量的分析在用單個ASO轉(zhuǎn)染的TGFE刺 激的細(xì)胞中觀察到負(fù)趨勢，但這在四唑還原測定中未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性。這歸咎于與該測 定相關(guān)的5-10%的標(biāo)準(zhǔn)誤差，該標(biāo)準(zhǔn)誤差在統(tǒng)計上排除更小的差異。相反地，亞二倍體DNA 含量的分析中的標(biāo)準(zhǔn)誤差在我們的手中低于2%。當(dāng)我們在原發(fā)性腫瘤中觀察Bim表達(dá)時，我們注意到與正常組織相比普遍的過表 達(dá)(F. P.和A.V.未公布的數(shù)據(jù))。這與之前顯示致癌脅迫(oncogenic stress)誘導(dǎo)Bim 作為防止異常增殖的保衛(wèi)機制的研究相符。特別地，Bim在Myc轉(zhuǎn)基因小鼠中過表達(dá)，這決定了正常細(xì)胞的大量細(xì)胞凋亡。然而，腫瘤在這些小鼠中的發(fā)生與一個Bim等位基因的缺 失(Bim變得不足)一致。盡管如此，與未經(jīng)歷致癌脅迫的健康組織相比較，Bim仍然明確 地在腫瘤中過表達(dá)(Egle等人，2004)。因此，難以確定低于其發(fā)生Bim的不足的閾值，從而 需要可選擇的策略來確定miR-25上調(diào)在體內(nèi)的重要性。已描述了導(dǎo)致癌癥中Bim下調(diào)的幾個機制(從轉(zhuǎn)錄調(diào)控至蛋白降解)(Yano等人， 2006 ；Tan等人，2005)。雖然所有這些機制明確地促成了 Bim沉默，但我們提出miR-25干 擾作為胃癌中Bim的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的新機制。miRNA是否是恰當(dāng)?shù)募?xì)調(diào)分子或它們是否用作關(guān)鍵基因開關(guān)一直存在廣泛爭議。 最近的研究表明，取決于特定的生物學(xué)背景，兩個假說都可能是正確的。從這個角度看， miRNA在癌癥中的治療潛能可以與依賴于特定miRNA的功能變化的發(fā)生嚴(yán)格相關(guān)。了解腫 瘤相關(guān)miRNA的作用機制在建立依賴于miRNA的腫瘤的分子診斷，允許合理地選擇最終對 基于miRNA的療法應(yīng)答的患者中是有用的。實驗方法細(xì)胞培養(yǎng)和處理所有細(xì)胞系獲自ATCC并且培養(yǎng)在補充有10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中。用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，使用 IOOnM 微 RNA 前體(Ambion)、 IOOnM si-p21 (Santa Cruz) UOOnM si_Bim(Cell Signalling)或 IOOnM LNA 微 RNA 反義 寡核苷酸(Exiqon)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在指定的時間收集蛋白質(zhì)裂解物和總RNA。通過Northern 印跡和莖-環(huán)qRT-PCR驗證MiRNA的加工和表達(dá)。我們使用BLOCK-IT Fluorescent Oligo(Invitrogen)驗證所有細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率(> 95% )。為了進行同步化實驗，將AGS細(xì)胞在含有0. 03Pg/ml諾考達(dá)唑的10% FBS RPMI 1640中培養(yǎng)12小時，然后釋放在新鮮培養(yǎng)基中。通過FACS分析跟蹤通過細(xì)胞周期的進展 直至8小時，之后細(xì)胞迅速喪失同步化。為了進行TGFE 實驗，在 6 孔板中使用 5ul Lipofectamine 2000 和 IOOnM miRNA 前體(Ambion)或 LNA 反義寡核苷酸(Exiqon)在 1 1 的 Optimem(GIBCO)和 RPMI 1640 10% FBS(Sigma)的混合物中轉(zhuǎn)染2xl06個Snu_16細(xì)胞。12小時后，用含有l(wèi)ng/ml人重組 TGFEl (Sigma)的RPMI 1640 10% FBS替換培養(yǎng)基。按照制造商的說明書，使用WST四唑鹽 (CCK-8,Dojindo)測定活細(xì)胞的數(shù)目。以一式三份進行所有實驗。結(jié)果表示為平均值士SD。qRT-PCR 按照制造商的說明書(Applied Biosystems, Foster City，CA)，分別使用單管 TaqMan MicroRNA Assays 禾口 Gene Expression Assay 來測定成熟 miRNA 禾口其他 mRNA。在 GeneAmp PCR 9700 Thermocycler (Applied Biosystems)上進行所有 RT 反應(yīng)，包括無模板 對照和RT陰性對照。使用NanoDrop (NanoDrop Technologies，Inc.)測定RNA濃度。將樣 品針對RNU49或CAPN2 (Applied Biosystems)進行標(biāo)準(zhǔn)化，如所指定的。使用ABI Prism 7900HT Sequence檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)定量基因表達(dá)水平。以一式三份進行比 較實時PCR，包括無模板對照。使用比較Ct法計算相對表達(dá)。螢光素酶測定使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，用 lug pGL3 螢火蟲螢光素酶報告基因 載體(參見補充的實驗方法)、0. lug phRLSV40對照載體(Promega)和IOOnM微RNA前體
23(Ambion)在6孔板中共轉(zhuǎn)染MKN-74胃癌細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時使用Dual Luciferase Assay(Promega)連續(xù)地測量螢火蟲和海腎螢光素酶的活性。將各報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至少2 次(在不同天)并且以一式三份測定各樣品。流式細(xì)胞術(shù)為了進行細(xì)胞周期分析，將2xl06個細(xì)胞固定在冷的乙醇中，用RNA酶處理，然后 用碘化丙啶(Sigma)染色。通過使用雙重辨別門控(doublet discrimination gating)利 用EPICS-XL掃描(Beckman Coulter)就DNA含量分析細(xì)胞。以一式三份進行所有分析，計 數(shù)20，000個門控事件/樣品。為了進行細(xì)胞凋亡分析，在冷的PBS中清洗細(xì)胞，將其與膜 聯(lián)蛋白V-FITC (BD Biopharmingen)和PI (Sigma)在黑暗中一起溫育15分鐘，然后在1小 時內(nèi)進行分析。統(tǒng)計分析實驗的結(jié)果表示為平均值+/-SD。使用學(xué)生氏未配對t檢驗來比較測試樣品與對 照樣品的值。P <0.05表示顯著差異。實施例II組織樣品原發(fā)性胃月中瘤樣品獲自 Department of Histopathology (Sant，Andrea Hospital, University of Rome “La Sapienza”，Italy)。所有樣品具有患者的知情同意 書并且進行了組織學(xué)確認(rèn)。用于獲得組織的方案由Sant，Andrea Hospital Bioethical Committee批準(zhǔn)。將各腫瘤與來自相同患者的非腫瘤胃粘膜對照配對。微陣列如所描述的(Liu等人，2004)進行微陣列分析。簡而言之，將5ug總RNA用于在 第2代miRNA微陣列芯片(V2)上進行雜交。這些芯片包含通過接觸技術(shù)點印并且共價連 接至聚合物基質(zhì)的250個人miRNA的基因特異性40聚體寡核苷酸探針。將微陣列在25°C 下于 6X SSPE(0. 9M NaCl_60mM NaH2P04_H20_8mM EDTA，pH 7. 4)、30% 甲酰胺中雜交 18 小 時，在37°C下于0. 75X TNT (Tris/HCl/NaCl/Tween 20)中清洗40分鐘，然后通過用鏈霉抗 生物素蛋白-Alexa Fluor 647綴合物直接檢測含有生物素的轉(zhuǎn)錄物的方法進行處理。通 過使用微陣列掃描儀(將激光設(shè)置至635nm，使用固定的PMT設(shè)置和IOmm的掃描分辨率) 掃描經(jīng)處理的載玻片。使用Global Median, Lowess或Quantile法標(biāo)準(zhǔn)化陣列數(shù)據(jù)，獲得 相似的結(jié)果。在本研究中公布的數(shù)據(jù)來源于Quantile標(biāo)準(zhǔn)化法。通過使用微陣列顯著性 分析(SAM)中的t檢驗法來鑒定差異表達(dá)的miRNA。Western Ep 用于免疫印跡的抗體如下E2F1 (Santa Cruz，小鼠單克隆抗體，1 500)、 AIB-KCell Signalling，小鼠單克隆抗體，1 1000)、p21 (Cell Signalling，小鼠單克隆 抗體，1 1000)、p27 (Santa Cruz，小鼠單克隆抗體 1 500)、CDK2 (Cell Signalling，小 鼠單克隆抗體，1 1000)、CDK4(Cell Signalling，小鼠單克隆抗體，1 1000)、細(xì)胞周 期蛋白Dl (Cell Signalling，小鼠單克隆抗體，1 1000)、細(xì)胞周期蛋白E(Santa Cruz, 兔多克隆抗體，1 500)、pl5 (Cell Signalling，兔多克隆抗體，1 1000)、Bim(Cell Signalling，兔多克隆抗體1 1000)、紐蛋白(Santa Cruz，小鼠單克隆抗體，1 500)、 GAPDH(Calbiochem，小鼠單克隆抗體，1 3000)。使用GelDoc軟件(Biorad)定量條帶。
腺病毒和慢病毒感染Adeno-E2Fl由G. Leone友好提供，并且如所描述的(Leone等人，1998)進行感染。 從 293T/17 細(xì)胞基因組 DNA PCR-擴增 MiR-106b、miR-93、miR_25 和 miR-106b_25 前體 cDNA 并且將其在CMV啟動子之下克隆入變異的第三代慢病毒載體pRRL-CMV-PGK-GFP-WPRE (稱 為Tween)以同時轉(zhuǎn)導(dǎo)報告基因GFP和miRNA。如所描述的(Bonci等人，2003)進行慢病毒 上清液的制備和感染。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生710倍的miRNA表達(dá)的變化，如通過qRT-PCR所測 定的。通過熒光顯微鏡檢查確認(rèn)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率>90%。qRT-PCR (miRNA 前體)為了進行微RNA前體qRT-PCR，在DNA酶處理(Ambion)后使用ThermoScript試劑 盒(Invitrogen)通過逆轉(zhuǎn)錄將使用TRIzoI試劑(Invitrogen)分離的總RNA直接加工成 cDNA。使用 Power Syb-Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)通過 qPCR 擴增靶序 列。將樣品針對TO標(biāo)準(zhǔn)化。在請求后可獲得引物序列。傳感器質(zhì)粒通過PCR從基因組DNA(293T/17細(xì)胞)擴增含有預(yù)測的miRNA結(jié)合位點的E2F1、 p21和Bim 3' UTR，然后通過利用緊在螢火蟲螢光素酶的終止密碼子下游的Xba-I位點將 其插入pGL3對照載體(Promega)。按照制造商的方案，使用QuikChange定點誘變試劑盒 (Stratagene)將miRNA種子區(qū)域互補位點中的前3個核苷酸的缺失插入突變型構(gòu)建體。在 請求后可獲得引物序列。其用途和定義的實例除非另外指出，否則本發(fā)明的實施將使用在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)的藥 物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)方法。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中得到詳 盡的解釋。參見，例如，Handbook of Experimental Immunology，第 I-IV 卷(D. Μ· Weir 禾口 C. C.Blackwelleds. , Blackwell Scientific Publications) ；A.L.Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc. , current addition) ；Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第 2 版，1989) ；Methods In Enzymology (S. Colowick 禾口 N.Kaplan eds. , Academic Press,Inc.)。因此，本文中提供了用于進一步解釋的定義，所述定義不應(yīng)解釋為限定性的。冠詞“a”和“an”在本文中是指一個或多于一個(即，至少一個)冠詞的語法對象。 例如，“an element"是指一個元素或多于一個的元素?！皹?biāo)志物”和“生物標(biāo)志物”是與其在正?；蚪】到M織或細(xì)胞中的表達(dá)水平相比，其 在組織或細(xì)胞中改變的表達(dá)水平與病癥和/或疾病狀態(tài)相關(guān)的基因和/或蛋白質(zhì)和/或其 功能性變體。標(biāo)志物的“正?！钡谋磉_(dá)水平是標(biāo)志物在未患病癥和/或疾病狀態(tài)的人受試者或 患者的細(xì)胞中的表達(dá)水平。標(biāo)志物的“過表達(dá)”或“顯著更高的表達(dá)水平”是指測試樣品中的表達(dá)水平，所述 表達(dá)水平高于用于估量表達(dá)的測定的標(biāo)準(zhǔn)誤，在某些實施方案中，至少2倍，在其他實施方 案中，3、4、5或10倍于對照樣品(例如，來自未患有標(biāo)志物相關(guān)病癥和/或疾病狀態(tài)的健康 受試者的樣品)中的標(biāo)志物的表達(dá)水平和在某些實施方案中幾個對照樣品中的標(biāo)志物的 平均表達(dá)水平。
標(biāo)志物的“顯著更低的表達(dá)水平”是指測試樣品中的表達(dá)水平，所述表達(dá)水平比 對照樣品(例如，來自未患有標(biāo)志物相關(guān)病癥和/或疾病狀態(tài)的健康受試者的樣品)中的 標(biāo)志物的表達(dá)水平和在某些實施方案中幾個對照樣品中的標(biāo)志物的平均表達(dá)水平低至少2 倍，在某些實施方案中低3、4、5或10倍。試劑盒是包含至少一種試劑，例如用于特異性檢測標(biāo)志物的表達(dá)的探針的任何產(chǎn) 品(例如，包裝或容器)?？梢砸杂糜谶M行本發(fā)明的方法的單位的形式推銷(promote)、分 配或銷售試劑盒?！暗鞍踪|(zhì)”包括標(biāo)志物蛋白和它們的片段；變異標(biāo)志物蛋白和它們的片段；包含標(biāo) 志物或變異標(biāo)志物蛋白的至少15個氨基酸的區(qū)段的肽和多肽；以及包含標(biāo)志物或變異標(biāo) 志物蛋白，或標(biāo)志物或變異標(biāo)志物蛋白的至少15個氨基酸的區(qū)段的融合蛋白。本文中所述的組合物、試劑盒和方法特別地具有下列非限定性用途1)評估受試者是否患有病癥和/或疾病狀態(tài)；2)評估受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的分期；3)評估受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的分級；4)評估受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的性質(zhì)；5)評估受試者發(fā)生病癥和/或疾病狀態(tài)的可能性；6)評估與受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞的組織學(xué)類型；7)制備可用于治療受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的抗體、抗體片段或抗體衍生 物；8)評估病癥和/或疾病狀態(tài)在受試者的細(xì)胞中的存在；9)評估一種或多種測試化合物抑制受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的功效；110)評估療法抑制受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的功效；11)監(jiān)控受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的進展；12)選擇抑制受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的組合物或療法；13)治療患有病癥和/或疾病狀態(tài)的受試者；14)抑制受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)；15)評估測試化合物的有害潛能；和16)預(yù)防處于發(fā)生病癥和/或疾病狀態(tài)的風(fēng)險中的受試者的病癥和/或疾病狀態(tài) 的發(fā)作。篩選方法可產(chǎn)生動物模型以使能夠篩選可用于治療或預(yù)防受試者的病癥和/或疾病狀態(tài) 的治療劑。因此，該方法可用于鑒定用于治療或預(yù)防受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的治療 劑。該方法包括對由本文所述的方法產(chǎn)生的動物模型施用候選試劑，評估與未施用候選試 劑的對照動物模型相比動物模型中的至少一種應(yīng)答。如果至少一種應(yīng)答在癥狀上減輕或在 發(fā)作上延遲，則候選試劑是用于治療或預(yù)防疾病的試劑。候選試劑可以是本領(lǐng)域已知的藥理學(xué)試劑(pharmacologic agent)或可以是之前 未知具有任何藥理活性的試劑。試劑可以是天然產(chǎn)生的或?qū)嶒炇抑性O(shè)計的。它們可從微生 物、動物或植物分離，或可重組產(chǎn)生或通過任何適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法合成。它們可以是小分子、 核酸、蛋白質(zhì)、肽或模擬肽(ρ印tidomimetics)。在某些實施方案中，候選試劑是具有大于
2650且小于大約2，500道爾頓的分子量的小有機化合物。候選試劑包含與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性相互 作用所必需的官能團。還在生物分子中發(fā)現(xiàn)候選試劑，包括但不限于肽、糖、脂肪酸、類固 醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合?？蓮亩喾N來源(包括合成的或天然化合物的文庫)獲得候選試劑。存在例如許多 可獲得用于隨機和定向合成多種有機化合物和生物分子的方法，包括隨機化寡核苷酸和寡 肽的表達(dá)。備選地，以細(xì)菌、真菌、植物和動物提取物的形式存在的天然化合物的文庫是可 獲得的或可容易地產(chǎn)生。此外，天然或合成產(chǎn)生的文庫和化合物可容易地通過常規(guī)化學(xué)、物 理和生物學(xué)方法進行修飾，并且可用于產(chǎn)生組合文庫。在某些實施方案中，候選試劑可使用 組合文庫方法領(lǐng)域中的許多方法中的任一方法來獲得，所述方法包括非限定性實例生物 文庫法；空間可定位平行固相或溶液相文庫法(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries)；需要角軍卷禾只(deconvolution)白勺合成文庫法；"一 珠一化合物(one-bead one-compound) ”文庫法；和使用親和層析選擇的合成文庫法。在某些其他實施方案中，可將某些藥理學(xué)藥劑經(jīng)歷定向或隨機化學(xué)修飾，例如酰 化、烷化、酯化、酰胺化(amidification)等以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。用于鑒定治療受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的治療劑的相同方法還可用于驗證 體外研究產(chǎn)生的前導(dǎo)化合物(lead compound)/試劑。候選試劑可以是上調(diào)或下調(diào)受試者中一個或多個病癥和/或疾病狀態(tài)應(yīng)答途徑 的試劑。在某些實施方案中，候選試劑可以是影響這樣的途徑的拮抗劑。用于治療病癥和/或疾病狀態(tài)的方法本文提供了用于治療、抑制、減輕或逆轉(zhuǎn)病癥和/或疾病狀態(tài)應(yīng)答的方法。在本文 所述的方法中，對有此需要的個體施用干擾信號級聯(lián)的試劑，所述個體例如但不限于其中 這樣的并發(fā)癥還不明顯的受試者和已具有至少一種這樣的應(yīng)答的受試者。在前一種情況下，這樣的治療用于預(yù)防此類應(yīng)答的發(fā)生和/或減輕它們發(fā)生的程 度。在后一種情況下，這樣的治療用于減輕此類應(yīng)答發(fā)生的程度，阻止它們進一步發(fā)展或逆 轉(zhuǎn)所述應(yīng)答。在某些實施方案中，干擾應(yīng)答級聯(lián)的試劑可以是對此類應(yīng)答特異的抗體。生物標(biāo)志物的表達(dá)可以以許多方式抑制標(biāo)志物的表達(dá)，所述方式包括非限定性實例可對疾病細(xì)胞 提供反義寡核苷酸以抑制標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄、翻譯或兩者。備選地，可對細(xì)胞提供編碼特異性結(jié) 合標(biāo)志物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段并且與適當(dāng)?shù)膯幼?調(diào)節(jié)子區(qū)域有效連接 的多核苷酸，以產(chǎn)生抑制所述蛋白的功能或活性的細(xì)胞內(nèi)抗體。標(biāo)志物的表達(dá)和/或功能 還可通過用特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段處理疾病細(xì)胞來抑制。 通過使用本文中描述的方法，可篩選多種分子，特別地包括足夠小以使它們能夠穿過細(xì)胞 膜的分子，以鑒定抑制標(biāo)志物的表達(dá)或抑制標(biāo)志物蛋白的功能的分子?？蓪κ茉囌咛峁┤?此鑒定的化合物以抑制受試者的疾病細(xì)胞。任何標(biāo)志物或標(biāo)志物的組合，以及與所述標(biāo)志物組合的任何特定標(biāo)志物可用于本 文中描述的組合物、試劑盒和方法中。一般地，期望使用這樣的標(biāo)志物，對于所述標(biāo)志物，疾 病細(xì)胞中該標(biāo)志物的表達(dá)水平與正常結(jié)腸系統(tǒng)細(xì)胞中相同標(biāo)志物的表達(dá)水平之間的差異 盡可能大。雖然該差異可以小至用于評估標(biāo)志物的表達(dá)的方法的檢測極限，但期望差異至少大于評估方法的標(biāo)準(zhǔn)誤，在一些實施方案中，與正常組織中相同標(biāo)志物的表達(dá)水平相比， 至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000 倍或更大的差異。已公認(rèn)，某些標(biāo)志物蛋白被分泌至圍繞細(xì)胞的細(xì)胞外空間。由于此類標(biāo)志物蛋白 可在體液樣品中檢測，因此將這些標(biāo)志物用于組合物、試劑盒和方法的某些實施方案，所述 體液樣品可以比組織活檢樣品更容易地從人受試者收集。此外，用于檢測標(biāo)志物蛋白的體 內(nèi)技術(shù)包括將抗所述蛋白的標(biāo)記抗體引入受試者。例如，抗體可用其在受試者中的存在和 定位可利用標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)來檢測的放射性標(biāo)記物進行標(biāo)記。為了確定任何特定的標(biāo)志物蛋白是否是分泌蛋白，在例如哺乳動物細(xì)胞例如人 細(xì)胞系中表達(dá)標(biāo)志物蛋白，收集細(xì)胞外液體，評估蛋白質(zhì)在細(xì)胞外液體中的存在或不存在 (例如，使用特異性結(jié)合所述蛋白的標(biāo)記抗體)。應(yīng)理解，含有此類細(xì)胞的受試者樣品可用于本文中所述的方法。在這些實施方案 中，標(biāo)志物的表達(dá)水平可通過評估樣品中標(biāo)志物的量(例如，絕對量或濃度)來評估。當(dāng)然， 可在評估樣品中標(biāo)志物的量之前將細(xì)胞樣品經(jīng)歷多種收集后制備和貯藏技術(shù)(例如，核酸 和/或蛋白質(zhì)提取、固定、貯藏、冷凍、超濾、濃縮、蒸發(fā)、離心等)。還應(yīng)理解，可使標(biāo)志物流出細(xì)胞進入例如呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血流和/或間質(zhì)間 隙?？梢岳缤ㄟ^檢查痰、BAL、血清、血漿、尿、糞便等來檢測流出的標(biāo)志物。組合物、試劑盒和方法可用于檢測標(biāo)志物蛋白的表達(dá)，所述標(biāo)志物蛋白具有至少 一個展示于表達(dá)其的細(xì)胞的表面上的部分。例如，可將免疫學(xué)方法用于檢測完整細(xì)胞上的 此類蛋白，或可將基于計算機的序列分析法用于預(yù)測至少一個細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(即，包括分 泌蛋白和具有至少一個細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì))的存在?？蓹z測標(biāo)志物蛋白的表達(dá)而無 需裂解細(xì)胞(例如，使用特異性結(jié)合蛋白的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域的標(biāo)記抗體)，所述標(biāo)志物蛋白 具有至少一個展示于表達(dá)其的細(xì)胞的表面上的部分。標(biāo)志物的表達(dá)可通過多種用于檢測轉(zhuǎn)錄的核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法中的任一 種來評估。此類方法的非限定性實例包括用于檢測分泌蛋白、細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白或 核蛋白的免疫學(xué)方法、蛋白質(zhì)純化法、蛋白質(zhì)功能或活性測定法、核酸雜交法、核酸逆轉(zhuǎn)錄 法以及核酸擴增法。在特定的實施方案中，標(biāo)志物的表達(dá)可使用特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白或其片段(包 括已經(jīng)歷所有或部分其正常翻譯后修飾的標(biāo)志物蛋白)的抗體(例如，放射性標(biāo)記的、發(fā)色 團標(biāo)記的、熒光團標(biāo)記的或酶標(biāo)記的抗體)、抗體衍生物(例如，綴合有底物或蛋白質(zhì)或蛋 白質(zhì)-配體對的配體的抗體)或抗體片段(例如，單鏈抗體、分離的抗體高變結(jié)構(gòu)域等)來 評估。在另一個特定的實施方案中，標(biāo)志物的表達(dá)通過下述來評估從受試者樣品的細(xì) 胞制備mRNA/cDNA ( S卩，轉(zhuǎn)錄的多核苷酸)，然后將mRNA/cDNA與為標(biāo)志物核酸的互補序列的 參照多核苷酸或其片段雜交。任選地，可在與參照多核苷酸雜交前使用多種聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)方法中的任一種來擴增cDNA ；優(yōu)選，其不進行擴增。同樣可使用定量PCR檢測一個或多 個標(biāo)志物的表達(dá)以評估標(biāo)志物的表達(dá)水平。備選地，可使用檢測標(biāo)志物的突變或變體(例 如，單核苷酸多態(tài)性、缺失等)的許多方法中的任一種來檢測受試者中標(biāo)志物的存在。在相關(guān)實施方案中，將獲自樣品的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸的混合物與在其上固定有多核 苷酸(其與標(biāo)志物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更
28多個核苷酸殘基)互補或同源)的基質(zhì)接觸。如果可在基質(zhì)上差異地檢測到互補或同源的 多核苷酸(例如，可使用不同的發(fā)色團或熒光團檢測或固定至不同的選擇的位置)，那么可 使用單個基質(zhì)(例如，固定在所選擇的位置上的多核苷酸的“基因芯片”微陣列)同時評估 多個標(biāo)志物的表達(dá)水平。當(dāng)使用包括將一個核酸與另一個核酸雜交的評估標(biāo)志物表達(dá)的方 法時，期望在嚴(yán)格雜交條件下進行雜交。在某些實施方案中，可使用質(zhì)譜法或表面等離子共振術(shù)進行生物標(biāo)志物測定 (biomarker assay) 0在不同的實施方案中，鑒定活性抗受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的試 劑的方法可包括一個或多個下列步驟a)提供含有一個或多個標(biāo)志物或其衍生物的細(xì)胞的樣品；b)從此類細(xì)胞制備提取物；c)將所述提取物與含有標(biāo)志物結(jié)合位點的標(biāo)記核酸探針混合；和，d)在測試試劑存在或不存在的情況下測定標(biāo)志物與核酸探針之間的復(fù)合 物的形成。測定步驟可包括將所述提取物/核酸探針混合物經(jīng)歷電泳遷移率試驗 (electrophoretic mobility shift assay)。在某些實施方案中，測定步驟包括選自酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、基于熒光的測 定和超高通量測定，例如，表面等離子共振術(shù)(SPR)或熒光相關(guān)光譜(FCS)測定的測定。在 此類實施方案中，SPR傳感器用于指導(dǎo)生物分子相互作用的實時觀察，因為SPR對金屬-電 介質(zhì)表面上的微小折射率改變非常敏感。Sra是對大約200nm的SI5R傳感器/樣品介面內(nèi) 的 ο5至ιο_6折射率(Ri)單位的改變敏感的表面技術(shù)。因此，sra光譜法用于監(jiān)控沉積在 傳感層上的薄有機薄膜的生長。因為組合物、試劑盒和方法依賴于一種或多種標(biāo)志物的表達(dá)水平的差異的檢測， 因此期望標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著大于用于評估至少一種正常細(xì)胞和受結(jié)腸癌影響的細(xì)胞 中的表達(dá)的方法的最小檢測極限。應(yīng)理解，通過使用一種或多種標(biāo)志物對另外的受試者樣品進行常規(guī)篩選，將了解 某些標(biāo)志物在不同類型的細(xì)胞，包括受試者的特定病癥和/或疾病狀態(tài)細(xì)胞中過表達(dá)。此外，通過就標(biāo)志物的表達(dá)評估更大數(shù)量的受試者樣品，并且使從其獲得樣品的 個體受試者的結(jié)果相互關(guān)聯(lián)，還將確認(rèn)某些標(biāo)志物的改變的表達(dá)與受試者的病癥和/或疾 病狀態(tài)強相關(guān)以及其他標(biāo)志物的改變的表達(dá)與其他疾病強相關(guān)。從而組合物、試劑盒和方 法可用于表征受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的分期、分級、組織學(xué)類型和性質(zhì)中的一種或 多種。當(dāng)組合物、試劑盒和方法用于表征受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的分期、分級、組 織學(xué)類型和性質(zhì)中的一種或多種時，期望選擇標(biāo)志物或標(biāo)志物組以使在至少大約20%，在 某些實施方案中，至少大約40%、60%或80%和基本上所有受試者(其患有相應(yīng)分期、分 級、組織學(xué)類型或性質(zhì)的病癥和/或疾病狀態(tài))中獲得陽性結(jié)果?？蛇x擇本發(fā)明的標(biāo)志物 或標(biāo)志物組以使對于一般群體可獲得大于大約10%的陽性預(yù)測值(在非限定性的實例中， 外加大于80%的測定特異性)。當(dāng)多個標(biāo)志物用于組合物、試劑盒和方法時，可在單個反應(yīng)混合物(即，使用針對 各個標(biāo)志物的試劑，例如不同的熒光探針)或在相應(yīng)于一個或多個標(biāo)志物的單獨的反應(yīng)混 合物中，將受試者樣品中各標(biāo)志物的表達(dá)水平與相同類型的非病癥和/或非疾病樣品中多個標(biāo)志物中的每一個的正常表達(dá)水平相比較。在一個實施方案中，相對于相應(yīng)的正常水平， 樣品中一個以上的標(biāo)志物的顯著增加的表達(dá)水平表示受試者患有病癥和/或疾病狀態(tài)。當(dāng) 使用多個標(biāo)志物時，可使用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50或更多個單獨的標(biāo)志物；在某 些實施方案中，可能期望使用更少的標(biāo)志物。為了使組合物、試劑盒和方法的靈敏性最大化(即在干擾可歸因于受試者樣品中 系統(tǒng)來源的細(xì)胞的情況下)，期望本文中所使用的標(biāo)志物是具有受限制的組織分布(例如 通常不在非系統(tǒng)組織中表達(dá))的標(biāo)志物。應(yīng)認(rèn)識到，組合物、試劑盒和方法對于具有增加的發(fā)生受試者的病癥和/或疾病 狀態(tài)的風(fēng)險的受試者和他們的醫(yī)學(xué)顧問將是特別有用的。被認(rèn)為具有增加的發(fā)生病癥和/ 或疾病的風(fēng)險的受試者包括例如具有此類病癥或疾病的家族史的受試者?？梢砸远喾N方法評估正常人系統(tǒng)組織中標(biāo)志物的表達(dá)水平。在一個實施方案中， 該正常表達(dá)水平通過下述來評估評估一部分表現(xiàn)正常的系統(tǒng)細(xì)胞中標(biāo)志物的表達(dá)水平且 將該正常表達(dá)水平與一部分懷疑為異常的系統(tǒng)細(xì)胞中的表達(dá)水平相比較。備選地，特別是 當(dāng)由于常規(guī)進行本文中所述的方法而可獲得進一步的信息時，可使用標(biāo)志物的正常表達(dá)的 群體平均值。在其他實施方案中，標(biāo)志物的"正常"表達(dá)水平可通過評估標(biāo)志物在從未受 影響的受試者獲得的受試者樣品、在懷疑病癥和/或疾病狀態(tài)在受試者中發(fā)作之前從受試 者獲得的受試者樣品、編檔保存的受試者樣品等中的表達(dá)來進行測定。本文中還提供了用于評估病癥和/或疾病狀態(tài)細(xì)胞在樣品(例如編檔保存的組織 樣品或從受試者獲得的樣品)中的存在的組合物、試劑盒和方法。這些組合物、試劑盒和方 法基本上與上述的相同，除了必要時，使組合物、試劑盒和方法適用于除了受試者樣品外的 樣品。例如，當(dāng)待使用的樣品是石蠟包埋的(parafinized)編檔保存的人組織樣品時，可能 必需在用于評估樣品中標(biāo)志物表達(dá)水平的組合物、試劑盒或方法中調(diào)整化合物的比例。試劑盒和試劑試劑盒可用于評估疾病細(xì)胞的存在(例如在樣品例如受試者樣品中)。試劑盒包 括多種試劑，其各自能夠特異性結(jié)合標(biāo)志物核酸或蛋白質(zhì)。用于與標(biāo)志物蛋白結(jié)合的合適 的試劑包括抗體、抗體衍生物、抗體片段等。用于與標(biāo)志物核酸(例如基因組DNA、MRNA、剪 接的MRNA、cDNA等)結(jié)合的合適的試劑包括互補核酸。例如，核酸試劑可包括固定至基質(zhì) 的寡核苷酸(標(biāo)記的或未標(biāo)記的)、不與基質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記的寡核苷酸、PCR引物對、分子信標(biāo) 探針等。試劑盒可任選地包含用于進行本文中所述的方法的另外的成分。例如，試劑盒可 包含適合于使互補核酸退火或適合于使抗體與其特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合的液體(例如 SSC緩沖液)、一個或多個樣品隔室、描述方法的進行的說明書、正常結(jié)腸系統(tǒng)細(xì)胞樣品、結(jié) 腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞樣品等。產(chǎn)生抗體的方法本文中還提供了制備產(chǎn)生用于評估受試者是否患有病癥和/或疾病狀態(tài)的抗體 的分離的雜交瘤的方法。在該方法中，合成或分離(例如通過從表達(dá)其的細(xì)胞純化或通過 體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸)含有完整標(biāo)志物蛋白或其區(qū)段的蛋白質(zhì) 或肽。使用蛋白質(zhì)或肽免疫脊椎動物例如哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔或綿羊。任選地(和 優(yōu)選地)可用蛋白質(zhì)或肽免疫脊椎動物至少另外一次，從而使脊椎動物呈現(xiàn)強烈的針對蛋白質(zhì)或肽的免疫應(yīng)答。從免疫的脊椎動物分離脾細(xì)胞，使用多種方法中的任一種將其與永 生化的細(xì)胞系融合從而形成雜交瘤。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法篩選以該方式形成的雜交瘤，從而 鑒定一個或多個產(chǎn)生特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白或其片段的抗體的雜交瘤。本文還提供了通過 該方法制備的雜交瘤和使用這樣的雜交瘤制備的抗體。評估功效的方法本文還提供了評估測試化合物抑制疾病細(xì)胞的功效的方法。如上所述，標(biāo)志物的 表達(dá)水平的差異與受試者的細(xì)胞的異常狀態(tài)相關(guān)。雖然公認(rèn)，某些標(biāo)志物的表達(dá)水平的變 化可能由此類細(xì)胞的異常狀態(tài)引起，但同樣公認(rèn)，其他標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化誘導(dǎo)、維持 和促進此類細(xì)胞的異常狀態(tài)。因此，抑制受試者的病癥和/或疾病狀態(tài)的化合物將使一個 或多個標(biāo)志物的表達(dá)水平改變至更接近該標(biāo)志物的正常表達(dá)水平(即，所述標(biāo)志物在正常 細(xì)胞中的表達(dá)水平)的水平。因此本方法包括將在測試化合物存在的情況下維持的第一細(xì)胞樣品中的標(biāo)志物 的表達(dá)與在測試化合物不存在的情況下維持的第二結(jié)腸細(xì)胞樣品中的標(biāo)志物的表達(dá)相比 較。在測試化合物存在的情況下，標(biāo)志物的顯著減少的表達(dá)表示該測試化合物抑制相關(guān)疾 病。細(xì)胞樣品可以例如是獲自受試者的正常細(xì)胞的單個樣品的等分、獲自受試者的正常細(xì) 胞的混合樣品、正常細(xì)胞系的細(xì)胞、獲自受試者的相關(guān)疾病細(xì)胞的單個樣品的等分、獲自受 試者的相關(guān)疾病細(xì)胞的混合樣品、相關(guān)疾病細(xì)胞系的細(xì)胞等。在一個實施方案中，樣品是獲自受試者的癌癥相關(guān)疾病細(xì)胞，并且檢測多種據(jù)認(rèn) 為對于抑制各種癌癥相關(guān)疾病是有效的化合物，以鑒定可能最佳地抑制受試者的癌癥相關(guān) 疾病的化合物。同樣可將該方法用于評估療法抑制受試者的相關(guān)疾病的有效性。在該方法中，評 估一個或多個標(biāo)志物在樣品對(一個樣品經(jīng)歷療法，另一個不經(jīng)歷療法)中的表達(dá)水平。與 評估測試化合物的有效性的方法一樣，如果療法誘導(dǎo)顯著更低的標(biāo)志物表達(dá)水平，則療法 對于抑制癌癥相關(guān)疾病是有效的。如上，如果來自選擇的受試者的樣品用于本方法，那么可 在體外評估備選療法以選擇對于抑制受試者的癌癥相關(guān)疾病最可能有效的療法。如本文中所描述的，人細(xì)胞的異常狀態(tài)與標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化相關(guān)。還提供 了用于評估測試化合物的有害潛能的方法。該方法包括在測試化合物存在和不存的情況下 維持分開的人細(xì)胞等分。比較各等分中標(biāo)志物的表達(dá)。在測試化合物存在的情況下維持的 等分中標(biāo)志物的顯著更高的表達(dá)水平(相對于在測試化合物不存在的情況下維持的等分) 表示測試化合物具有有害的潛能。各種測試化合物的相對有害潛能可通過比較相關(guān)標(biāo)志物 的表達(dá)水平的增強或抑制的程度，通過比較其表達(dá)水平被增強或抑制的標(biāo)志物的數(shù)目，或 通過比較兩者來評估。在下列部分更詳細(xì)地描述了各個方面。分離的蛋白質(zhì)和抗體一個方面涉及分離的標(biāo)志物蛋白和其生物活性部分，以及適合用作免疫原以產(chǎn)生 抗標(biāo)志物蛋白或其片段的抗體的多肽片段。在一個實施方案中，天然標(biāo)志物蛋白可使用標(biāo) 準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)通過適當(dāng)?shù)募兓桨笍募?xì)胞或組織來源分離。在另一個實施方案中，含 有完整的標(biāo)志物蛋白或其區(qū)段的蛋白質(zhì)或肽通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。除重組表達(dá)外，可使 用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成此類蛋白質(zhì)或肽。“分離的”或“純化的”蛋白質(zhì)或其生物活性部分基本上不含細(xì)胞材料或來自細(xì)胞或組織來源(所述蛋白質(zhì)源自于其)的其他污染性蛋白，或當(dāng)化學(xué)合成時基本上不含化學(xué) 前體或其他化學(xué)藥品。術(shù)語“基本上不含細(xì)胞材料”包括其中將蛋白質(zhì)與從其分離或重組 產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞組分分離的蛋白質(zhì)制劑。因此，基本上不合細(xì)胞材料的蛋白 質(zhì)包括具有低于大約30%、20%、10%或5% (按干重計算)的異種蛋白質(zhì)(在本文中也稱 為“污染性蛋白”)的蛋白質(zhì)制劑。當(dāng)重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)或其生物活性部分時，其也優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，S卩，培養(yǎng)基 占據(jù)低于大約20%、10%或5%的蛋白質(zhì)制劑的體積。當(dāng)通過化學(xué)合成產(chǎn)生蛋白質(zhì)時，其優(yōu) 選基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)藥品，即，其與參與蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或其他化學(xué) 藥品分離。因此，此類蛋白質(zhì)制劑具有低于大約30%、20%、10%、5% (按干重計算)的化 學(xué)前體或除了目的多肽外的化合物。標(biāo)志物蛋白的生物活性部分包括含有與標(biāo)志物蛋白的氨基酸序列充分同一或源 自于其的氨基酸序列的多肽，其包含比全長蛋白質(zhì)更少的氨基酸，并且展示相應(yīng)的全長蛋 白質(zhì)的至少一種活性。通常，生物活性部分包含具有相應(yīng)的全長蛋白質(zhì)的至少一種活性的 結(jié)構(gòu)域或基序。標(biāo)志物蛋白的生物活性部分可以是其長度為例如10、25、50、100或更多個 氨基酸的多肽。此外，其中標(biāo)志物蛋白的其他區(qū)域被缺失的其他生物活性部分可通過重組 技術(shù)來制備，并且可就標(biāo)志物蛋白的天然形式的一種或多種功能活性對其進行評估。在某 些實施方案中，有用的蛋白質(zhì)與此類序列之一基本上同一(例如，至少大約40%，在某些實 施方案中，50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同一)并且保持相應(yīng)的天然發(fā)生的標(biāo) 志物蛋白的功能活性但因天然等位基因變異或誘變而在氨基酸序列上不同。此外，標(biāo)志物蛋白的區(qū)段文庫可用于產(chǎn)生用于篩選和隨后選擇變異標(biāo)志物蛋白或 其區(qū)段的多肽的多樣化(variegated)群體。預(yù)測醫(yī)學(xué)本文中還提供了動物模型和標(biāo)志物在預(yù)測醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的用途，其中診斷測定、預(yù) 后測定、藥物基因組學(xué)和監(jiān)控臨床試驗用于預(yù)后(預(yù)測)目的，從而預(yù)防性治療個體。因 此，本文中還提供了用于測定一個或多個標(biāo)志物蛋白或核酸的表達(dá)水平以確定個體是否處 于發(fā)生特定病癥和/或疾病的風(fēng)險中的診斷測定。此類測定可用于預(yù)后或預(yù)測目的，從而 在病癥和/或疾病發(fā)作之前預(yù)防性治療個體。在另一個方面，方法可用于相同個體的至少周期性篩查以觀察該個體是否已暴露 于改變他/她的表達(dá)模式的化學(xué)藥品或毒素。另一方面涉及監(jiān)控被施用以抑制病癥和/或疾病或治療或預(yù)防任何其他病癥的 試劑(例如，藥物或其他化合物)在臨床試驗中對標(biāo)志物的表達(dá)或活性的影響(例如，以了 解這樣的治療可能具有的任何系統(tǒng)性作用)。藥物組合物化合物可進行配制以用于在合適的藥物載體中局部(topically)、局域(locally) 或全身性施用。Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 15 版，Ε· W. Martin (Mark Publishing Company，1975)，公開了常用載體和制備方法?；衔镞€可以封裝在用于靶向 細(xì)胞的合適的生物相容性微膠囊、微粒或微球體(由生物可降解或非生物可降解聚合物或 蛋白質(zhì)或脂質(zhì)體形成)。此類系統(tǒng)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的并且可進行最優(yōu)化以 與合適的核酸一起使用。
在例如 Sambrook 等人，1989, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York ；禾口 Ausubel 等人，1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，New York中描述了用于核酸遞送的各種方法。此 類核酸遞送系統(tǒng)包括期望的核酸，例如但不限于，其以“裸露的”形式作為“裸露的”核酸， 或配制于適合于遞送的媒介物中例如與陽離子分子或形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的復(fù)合物中，或作 為載體的成分或藥物組合物的成分?？蓪⒑怂徇f送系統(tǒng)直接(例如通過將其與細(xì)胞接觸) 或間接(例如通過任何生物過程的作用)提供給細(xì)胞。用于局部施用的制劑可包括軟膏、洗劑、乳膏劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和 粉劑。需要時可使用常規(guī)藥物載體(水性的、粉狀的或基于油的)或增稠劑。適合用于胃腸外施用例如通過關(guān)節(jié)內(nèi)(關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和 皮下途徑施用的制劑包括水性和非水性的等滲無菌注射液，其可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑 菌劑和使制劑與期望的受者的血液等滲的溶質(zhì)，以及水性和非水性無菌懸浮液、溶液或乳 劑，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、分散劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。用于注射的制劑可以以單 位劑型、與加入的防腐劑一起存在，例如存在于安瓿中或存在于多劑量容器中。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可容易地確定制備和配制組合物的各種參數(shù)而無需過度的實驗?？蓡为毜鼗蚺c其他合 適的成分組合來使用化合物。一般地，施用化合物(包括核酸)的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。特別地，已用于核 酸治療劑的施用途徑，和目前使用的制劑一起，為選擇的核酸提供了優(yōu)選的施用和配制途 徑，當(dāng)然這將取決于因素例如特定的制劑、待治療的受試者的狀態(tài)的嚴(yán)重度和治療功效所 需的劑量。如本文中通常使用的，“有效量”是指在對其施用了制劑的受試者(與未接受所 述化合物的匹配的受試者相比較)中能夠治療病癥的一個或多個癥狀，逆轉(zhuǎn)病癥的一個或 多個癥狀的進展，終止病癥的一個或多個癥狀的進展或預(yù)防病癥的一個或多個癥狀的發(fā)生 的量?；衔锏膶嶋H有效量可根據(jù)待使用的特定化合物或其組合、配制的特定組合物、施用 模式，和個體的年齡、體重、狀況，和待治療的癥狀或病況的嚴(yán)重度而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何可接受的方法可用于給受試者施用制劑。取決于待治 療的病況，施用可以是局部的(即，至特定區(qū)域、生理系統(tǒng)、組織、器官或細(xì)胞類型)或全身 性的。藥物基因組學(xué)標(biāo)志物還可用作藥物基因組學(xué)標(biāo)志物。如本文中所用的，“藥物基因組學(xué)標(biāo)志物” 是其表達(dá)水平與受試者中特定臨床藥物應(yīng)答或易感性相關(guān)的目的生物化學(xué)標(biāo)志物。藥物基 因組學(xué)標(biāo)志物表達(dá)的存在或量與預(yù)測的受試者應(yīng)答和更特別地受試者的腫瘤對用特定藥 物或藥物種類的療法的應(yīng)答相關(guān)。通過評估受試者中一個或多個藥物基因組學(xué)標(biāo)志物的表 達(dá)的存在或量，可選擇最適合于受試者的或預(yù)測具有更大的成功程度的藥物療法。監(jiān)控臨床試驗監(jiān)控試劑(例如，藥物化合物)對標(biāo)志物的表達(dá)水平的影響不僅可用于基礎(chǔ)藥物 篩選，而且還可用于臨床試驗。例如，可在接受結(jié)腸癌相關(guān)疾病治療的受試者的臨床試驗中 監(jiān)控試劑影響標(biāo)志物表達(dá)的有效性。在一個非限定性實施方案中，本發(fā)明提供了用于監(jiān)控利用試劑(例如，激動劑、拮 抗劑、模擬肽、蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子或其他藥物候選物)治療受試者的有效性的方法，
33該方法包括步驟i)在施用試劑之前從受試者獲得施用前的樣品；ii)檢測一個或多個選擇的標(biāo)志物在施用前的樣品中的表達(dá)水平；iii)從受試者獲得一個或多個施用后的樣品；iv)檢測標(biāo)志物在施用后的樣品中的表達(dá)水平；ν)將施用前的樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平與施用后的樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平相 比較；和vi)相應(yīng)地改變試劑至受試者的施用。例如，在治療過程中增加的標(biāo)志物基因的表達(dá)可表明無效劑量，從而需要增加劑 量。相反地，減少的標(biāo)志基因的表達(dá)可表明有效治療，從而不需要改變劑量。電子設(shè)備可讀介質(zhì)、系統(tǒng)、陣列和使用其的方法如本文中所使用的，“電子設(shè)備可讀介質(zhì)”是指用于存儲、保存或包含可用電子設(shè) 備直接閱讀和存取的數(shù)據(jù)或信息的任何適當(dāng)介質(zhì)。此類介質(zhì)可包括但不限于磁性存儲 介質(zhì)，例如軟盤、硬盤存儲介質(zhì)以及磁帶；光學(xué)存儲介質(zhì)例如光盤；電子存儲介質(zhì)例如RAM、 R0M、EPR0M、EEPR0M等；以及普通硬盤和這些類別的混合體例如磁性/光學(xué)存儲介質(zhì)?？蓪?介質(zhì)進行改造或設(shè)定以用于在其上記錄本文中所述的標(biāo)志物。如本文中所用的，術(shù)語“電子設(shè)備”旨在包括任何適當(dāng)?shù)挠嬎慊蛱幚碓O(shè)備或其他經(jīng) 改造或設(shè)定用于存儲數(shù)據(jù)或信息的裝置。適合用于本發(fā)明的電子設(shè)備的實例包括獨立的計 算設(shè)備；網(wǎng)絡(luò)，包括局域網(wǎng)(LAN)、廣域網(wǎng)絡(luò)(WAN)因特網(wǎng)、內(nèi)聯(lián)網(wǎng)和外聯(lián)網(wǎng)；電子器具例如 個人數(shù)字助理(PDA)、手機、尋呼機(pager)等；以及局域和分布式處理系統(tǒng)。如本文中所使用的，“記錄”是指在電子設(shè)備可讀介質(zhì)上存儲或編碼信息的過程。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地采用任何用于在介質(zhì)上記錄信息的方法來產(chǎn)生包含本文中所述 的標(biāo)志物的材料。許多軟件程序和格式可用于在電子設(shè)備可讀介質(zhì)上存儲本發(fā)明的標(biāo)志物信息。 為了獲得或產(chǎn)生在其上記錄了標(biāo)志物的介質(zhì)，可使用許多數(shù)據(jù)處理程序構(gòu)建格式(data processor structuring format)(例如，文本文件或數(shù)據(jù)庫)。通過以可讀形式提供標(biāo)志 物，可常規(guī)存取用于多種目的的標(biāo)志物序列信息。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用可讀形式的 核苷酸或氨基酸序列來將靶序列或靶結(jié)構(gòu)基序與存儲在數(shù)據(jù)存儲工具中的序列相比較。搜 索工具用于鑒定匹配特定靶序列或靶基序的序列的片段或區(qū)域。因此，本文中還提供了用于保存進行確定受試者是否具有癌癥相關(guān)疾病或?qū)?癌癥相關(guān)疾病的易感性的方法的說明書的介質(zhì)，其中所述方法包括步驟確定標(biāo)志物 的存在或不存在，并且基于標(biāo)志物的存在或不存在來確定受試者是否具有癌癥相關(guān)疾 病或?qū)Π┌Y相關(guān)疾病的易感性，和/或推薦用于癌癥相關(guān)疾病或癌癥相關(guān)疾病前狀況 (pre-cancer-related disease condition)白勺特定治療。本文中還提供了電子系統(tǒng)和/或在網(wǎng)絡(luò)中提供了用于確定受試者是否患有癌癥 相關(guān)疾病或具有對與標(biāo)志物相關(guān)的癌癥相關(guān)疾病的易感性的方法，其中所述方法包括步 驟確定標(biāo)志物的存在或不存在，并且基于標(biāo)志物的存在或不存在來確定受試者是否患有 特定病癥和/或疾病或具有對此類病癥和/或疾病的易感性，和/或推薦用于此類疾病或 疾病和/或這樣的癌癥相關(guān)疾病前狀況的特定治療。該方法還可包括接收與受試者相關(guān)的表型信息和/或從網(wǎng)絡(luò)獲取與受試者相關(guān)的表型信息的步驟。本文中還提供了網(wǎng)絡(luò)，用于確定受試者是否患有病癥和/或疾病或具有對與標(biāo)志 物相關(guān)的病癥和/或疾病的易感性的方法，所述方法包括步驟接收與標(biāo)志物相關(guān)的信息， 接收與受試者相關(guān)的表型信息，從網(wǎng)絡(luò)獲取相應(yīng)于標(biāo)志物和/或病癥和/或疾病的信息，并 且基于表型信息、標(biāo)志物和獲取的信息中的一個或多個，確定受試者是否患有病癥和/或 疾病或具有對其的易感性。所述方法還包括推薦用于病癥和/或疾病或?qū)ζ涞囊赘行缘奶?定治療的步驟。本文中還提供了用于確定受試者是否患有病癥和/或疾病或具有對其的易感性 的商業(yè)方法，所述方法包括步驟接收與標(biāo)志物相關(guān)的信息，接收與受試者相關(guān)的表型信 息，從網(wǎng)絡(luò)獲取相應(yīng)于標(biāo)志物和/或病癥和/或疾病的信息，并且基于表型信息、標(biāo)志物和 獲得的信息中的一個或多個，確定受試者是否患有病癥和/或疾病或具有對其的易感性。 所述方法還可包括推薦用于其的特定治療的步驟。本文中還提供了可用于測定陣列中一個或多個基因的表達(dá)的陣列。在一個實施方 案中，陣列可用于測定組織中基因的表達(dá)，從而確定陣列中基因的組織特異性。這樣，可就 表達(dá)同時測定直至大約7000或更多個基因。這使得能夠產(chǎn)生顯示在一個或多個組織中特 異性表達(dá)的一組基因的特征譜。除了此類定性測定外，本文中還提供了基因表達(dá)的定量。因此，不僅組織特異性而 且一組基因在組織中的表達(dá)水平也是可確定的。因此，可基于基因本身的組織表達(dá)和在該 組織中的表達(dá)水平來對基因進行分類。這可用于例如確定組織間基因表達(dá)的關(guān)系。因此， 可干擾一個組織，然后可測定對第二組織中的基因表達(dá)的影響。在本說明書中，可測定一種 細(xì)胞類型對另一種細(xì)胞類型(響應(yīng)生物刺激)的影響。此類測定可用于例如在基因表達(dá)的水平上了解細(xì)胞間相互作用的效果。如果試 劑被治療性施用以治療一種細(xì)胞類型但其對另一種細(xì)胞類型具有不期望的作用，則所述方 法提供了確定不期望的作用的分子基礎(chǔ)的測定，從而提供共施用中和劑(counteracting agent)或另外治療不期望的作用的機會。類似地，即使在單個細(xì)胞類型中，可在分子水平上 測定不期望的生物學(xué)效應(yīng)。因此，可確定和中和試劑對非靶基因的表達(dá)的作用。在另一個實施方案中，陣列可用于監(jiān)控陣列中一個或多個基因的表達(dá)的時程。如 本文中所公開的，這可發(fā)生在各種生物學(xué)背景(例如病癥和/或疾病的發(fā)生，其進展)和過 程(例如與其相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化)中。陣列還可用于確定基因的表達(dá)或其他基因的表達(dá)在相同細(xì)胞或不同細(xì)胞中的作 用。如果不能調(diào)控最終或下游靶，那么這提供了例如用于治療性干預(yù)的備選分子靶的選擇。陣列還可用于確定一個或多個基因在正常和異常細(xì)胞中的差異表達(dá)模式。這提供 了可用作診斷或治療性干預(yù)的分子靶的一組基因。替代 + 示志物(Surrogate Marker)標(biāo)志物可用作一種或多種病癥或疾病狀態(tài)或?qū)е缕涞臓顩r的替代標(biāo)志物。如本文 中所使用的，“替代標(biāo)志物”是與疾病或病癥的不存在或存在，或與疾病或病癥的進展相關(guān) 的目的生物化學(xué)標(biāo)志物。此類標(biāo)志物的存在或量不依賴于疾病。因此，此類標(biāo)志物可用于 指示特定的療程在減輕疾病狀態(tài)或病癥中是否有效。當(dāng)疾病狀態(tài)或病癥的存在或程度難以 通過標(biāo)準(zhǔn)方法來評估，或當(dāng)在達(dá)到潛在危險的臨床終點之前期望評估疾病進展時，替代標(biāo)志物是特別有用的。標(biāo)志物還可用作藥效標(biāo)志物(pharmacodynamic marker)。如本文中所使用的，“藥 效標(biāo)志物”是與藥物作用特異性相關(guān)的目的生物化學(xué)標(biāo)志物。藥效標(biāo)志物的存在或量與將 對其施用藥物的疾病狀態(tài)或病癥無關(guān)；因此，標(biāo)志物的存在或量表示藥物在受試者中的存 在或活性。例如，藥效標(biāo)志物可表示藥物在生物組織中的濃度，因為標(biāo)志物在該組織中表達(dá) 或轉(zhuǎn)錄，或者不表達(dá)或轉(zhuǎn)錄與藥物的水平相關(guān)。這樣，藥物的分布或吸收可通過藥效標(biāo)志物 來監(jiān)控。類似地，藥效標(biāo)志物的存在或量可與藥物的代謝產(chǎn)物的存在或量相關(guān)，這樣標(biāo)志物 的存在或量表示藥物在體內(nèi)的相對分解速率。藥效標(biāo)志物在增加藥物作用的檢測的靈敏性中特別有用，特別是當(dāng)以低劑量施用 藥物時。由于即使少量的藥物也可足以激活多輪的標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，因此擴增的標(biāo)志物 可以以比藥物本身更容易檢測的量存在。同樣，標(biāo)志物由于其本身的性質(zhì)而可以更容易地 進行檢測；例如，通過使用本文中描述的方法，可將抗體用于針對蛋白標(biāo)志物的基于免疫的 檢測系統(tǒng)，或可使用標(biāo)志物特異性放射性標(biāo)記探針來檢測mRNA標(biāo)志物。此外，藥效標(biāo)志物 的使用可提供由于藥物治療超出可直接觀察的范圍而產(chǎn)生的風(fēng)險的基于機制的預(yù)測。用于檢測的方案檢測病癥和/或疾病的方法可包括例如在一段時間內(nèi)測量各標(biāo)志物基因在來自 受試者的生物學(xué)樣品中的表達(dá)水平和將該水平與對照生物學(xué)樣品中標(biāo)志物基因的水平相 比較。當(dāng)標(biāo)志物基因是本文中描述的基因之一并且表達(dá)水平差異表達(dá)(例如，比對照中 的表達(dá)水平更高或更低)時，受試者被判斷為患有病癥和/或疾病。當(dāng)標(biāo)志物基因的表達(dá) 水平落在容許的范圍內(nèi)時，受試者不可能患有所述病癥和/或疾病?？赏ㄟ^測量對照中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平來預(yù)先測定對照的標(biāo)準(zhǔn)值，以比較表達(dá) 水平。例如，可基于上述標(biāo)志物基因在對照中的表達(dá)水平來測定標(biāo)準(zhǔn)值。例如，在某些實施 方案中，容許的范圍基于標(biāo)準(zhǔn)值采用士2S.D.。在測定標(biāo)準(zhǔn)值后，可通過只測量來自受試者 的生物學(xué)樣品中的表達(dá)水平并將該值與測定的對照的標(biāo)準(zhǔn)值相比較來進行檢測方法。標(biāo)志物基因的表達(dá)水平包括標(biāo)志物基因至mRNA的轉(zhuǎn)錄和至蛋白質(zhì)的翻譯。因此， 基于相應(yīng)于標(biāo)志物基因的mRNA的表達(dá)強度或由標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的比 較，進行檢測病癥和/或疾病的一個方法?？筛鶕?jù)各種基因分析方法在病癥和/或疾病的檢測中測量標(biāo)志物基因的表達(dá)水 平。具體地，可使用例如利用與此類基因雜交的核酸作為探針的雜交技術(shù)，或利用與標(biāo)志物 基因雜交的DNA作為引物的基因擴增技術(shù)。可基于標(biāo)志物基因的核苷酸序列設(shè)計用于檢測的探針或引物。本文中描述了各標(biāo) 志物基因的核苷酸序列的標(biāo)識號。此外，應(yīng)理解，高等動物的基因通常伴有高頻率的多態(tài)性。也存在許多在剪接過程 中產(chǎn)生含有相互不同的氨基酸序列的同種型的分子。與結(jié)腸癌相關(guān)疾病相關(guān)的、具有與標(biāo) 志物基因的活性相似的活性的任何基因包括在標(biāo)志物基因中，即使其由于多態(tài)性或為同種 型而具有核苷酸序列差異。也應(yīng)理解，標(biāo)志物基因可包括除了人外的其他物種的同源物。因此，除非明確指 出，否則表述“標(biāo)志物基因”是指對于物種獨特的標(biāo)志物基因的同源物或已被導(dǎo)入個體的外
36源標(biāo)志物基因。同樣，應(yīng)理解，“標(biāo)志物基因的同源物”是指來源于除了人以外的物種的基因，其在 嚴(yán)格條件下可作為探針與人標(biāo)志物基因雜交。這樣的嚴(yán)格條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員(其可 通過實驗或憑經(jīng)驗選擇適當(dāng)?shù)臈l件來產(chǎn)生相同嚴(yán)格性)來說是已知的。含有標(biāo)志物基因的核苷酸序列或與標(biāo)志物基因的核苷酸序列的互補鏈互補并且 具有至少15個核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探針。因此，“互補鏈”是指由 A:T (對于RNA為U)和G:C堿基對組成的雙鏈DNA中相對于另一條鏈的一條鏈。此外，“互補”不僅意指與至少15個連續(xù)核苷酸的區(qū)域完全互補的序列，而且還指 具有在某些情況下至少40 %，在某些情況下50 %，在某些情況下60 %，在某些情況下70 %， 至少80%、90%和95%或更高的核苷酸序列同源性的序列。核苷酸序列之間的同源性的程 度可利用算法BLAST等來測定。此類多核苷酸可用作檢測標(biāo)志物基因的探針，或用作擴增標(biāo)志物基因的引物。當(dāng) 用作引物時，多核苷酸通常包含15bp至lOObp，在某些實施方案中15bp至35bp的核苷酸。 當(dāng)用作探針時，DNA包含標(biāo)志物基因的整個核苷酸序列(或其互補鏈)，或具有至少15bp核 苷酸的其部分序列。當(dāng)用作引物時，3'區(qū)域必須與標(biāo)志物基因互補，而5'區(qū)域可連接至限 制性內(nèi)切酶識別序列或標(biāo)簽(tag)。“多核苷酸”可以是DNA或RNA。此類多核苷酸可以是合成的或天然發(fā)生的。同樣， 通常也標(biāo)記用作雜交探針的DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解此類標(biāo)記方法。在本文中，術(shù)語 “寡核苷酸”意指具有相對低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在多核苷酸內(nèi)?？墒褂美鏝orthern雜交、斑點印跡雜交或DNA微陣列技術(shù)進行利用雜交技術(shù)的 病癥和/或疾病的檢測。此外，可使用基因擴增技術(shù)例如RT-PCR法。通過在RT-PCR的基 因擴增步驟中使用PCR擴增監(jiān)控法，可更加定量地分析標(biāo)志物基因的表達(dá)。在PCR基因擴增監(jiān)控法中，將檢測靶(DNA或RNA的反轉(zhuǎn)錄物)與用熒光染料和吸 收熒光的猝滅劑標(biāo)記的探針雜交。當(dāng)PCR進行并且Taq聚合酶以其5' -3'外切核酸酶活 性降解探針時，熒光染料與猝滅劑彼此分離，從而檢測到熒光。實時檢測熒光。通過同時測 量其中靶的拷貝數(shù)是已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品，可利用循環(huán)數(shù)(其中PCR擴增是線性的)測定受試 者樣品中靶的拷貝數(shù)。同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)PCR擴增監(jiān)控法可使用任何適當(dāng)?shù)姆椒?來進行。還可通過檢測標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)來進行檢測結(jié)腸癌相關(guān)疾病的方法。在下 文中，標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)被描述為“標(biāo)志物蛋白”。對于此類檢測方法，可通過使用結(jié) 合各標(biāo)志物蛋白的抗體來應(yīng)用例如，Western印跡法、免疫沉淀法和ELISA法。用于檢測的結(jié)合標(biāo)志物蛋白的抗體可通過任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)來產(chǎn)生。同樣，為了檢 測標(biāo)志物蛋白，可適當(dāng)?shù)貥?biāo)記這樣的抗體。備選地，可不標(biāo)記抗體，而是標(biāo)記特異性結(jié)合抗 體的物質(zhì)例如蛋白A或蛋白G以間接檢測標(biāo)志物蛋白。更特別地，此類檢測方法可包括 ELISA 法。可以例如通過將標(biāo)志物基因或其部分插入表達(dá)載體，將構(gòu)建體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì) 胞來產(chǎn)生轉(zhuǎn)化株，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化株以表達(dá)重組蛋白，然后從培養(yǎng)物或培養(yǎng)上清液純化表達(dá) 的重組蛋白來獲得用作抗原的蛋白質(zhì)或其部分肽。備選地，可化學(xué)合成由基因編碼的氨基 酸序列或含有由全長cDNA編碼的氨基酸序列的一部分的寡肽，以用作免疫原。
此外，可通過將不僅生物學(xué)樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平而且標(biāo)志物蛋白的活性用作指標(biāo)來進行結(jié)腸癌相關(guān)疾病的檢測。標(biāo)志物蛋白的活性意指蛋白本身固有的生物學(xué)活 性。可使用各種方法測量每一種蛋白的活性。即使在常規(guī)檢測中受試者未被診斷為患有病癥和/或疾病(盡管癥狀暗示此類疾 病)，這樣的受試者是否患有病癥和/或疾病也可通過按照本文中所述的方法進行檢測來 容易地確定。更特別地，在某些實施方案中，當(dāng)標(biāo)志物基因是本文描述的基因之一時，其癥狀至 少暗示對病癥和/或疾病的易感性的受試者中，標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的增加或減少表明 癥狀主要由所述病癥和/或疾病引起。此外，檢測可用于確定病癥和/或疾病是否在受試者中得到改善。換句話說，本文 中描述的方法可用于判斷用于所述病癥和/或疾病的治療的治療效果。此外，當(dāng)標(biāo)志物基 因是本文描述的基因之一時，已被診斷為患有所述病癥和/或疾病的受試者中，標(biāo)志物基 因的表達(dá)水平的增加或減少意味著疾病已向前發(fā)展。還可基于表達(dá)水平的差異測定病癥和/或疾病的嚴(yán)重度和/或?qū)ζ涞囊赘行?。?如，當(dāng)標(biāo)志物基因是本文描述的基因之一時，標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的增加程度與病癥和/ 或疾病的存在和/或嚴(yán)重度相關(guān)。動物模型還可產(chǎn)生病癥和/或疾病的動物模型，其中一個或多個標(biāo)志物基因或功能上與標(biāo) 志物基因等同的基因的表達(dá)水平在所述動物模型中已被提高。如本文中所用的，“功能上等 同的基因”通常是編碼具有與標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)的已知活性相似的活性的蛋白質(zhì)的 基因。功能上等同的基因的代表性實例包括受試動物的標(biāo)志物基因?qū)?yīng)物，其是動物本身 固有的。動物模型可用于檢測由于病癥和/或疾病而引起的生理學(xué)變化。在某些實施方案 中，動物模型可用于揭示標(biāo)志物基因的另外的功能和評估其靶為標(biāo)志物基因的藥物。動物模型可通過控制對應(yīng)物基因的表達(dá)水平或施用對應(yīng)物基因來產(chǎn)生。方法可包 括通過控制選自本文中所述的基因的基因的表達(dá)水平來產(chǎn)生動物模型。在另一個實施方案 中，方法可包括通過施用由本文中所描述的基因編碼的蛋白質(zhì)或施用抗所述蛋白的抗體來 產(chǎn)生動物模型。還應(yīng)理解，在某些其他實施方案中，可過表達(dá)標(biāo)志物，以便可使用適當(dāng)?shù)姆?法測量標(biāo)志物。在另一個實施方案中，動物模型可通過導(dǎo)入選自此類基因的基因，或通過施 用由這樣的基因編碼的蛋白質(zhì)來產(chǎn)生。在另一個實施方案中，病癥和/或疾病可通過抑制 選自此類基因的基因的表達(dá)或由這樣的基因編碼的蛋白質(zhì)的活性來誘導(dǎo)。反義核酸、核酶 或RNAi可用于抑制表達(dá)。蛋白質(zhì)的活性可通過施用抑制所述活性的物質(zhì)例如抗體來有效 地控制。動物模型可用于闡明病癥和/或疾病背后的機制，還可用于檢測通過篩選獲得的 化合物的安全性。例如，當(dāng)動物模型產(chǎn)生特定病癥和/或疾病的癥狀時，或當(dāng)牽涉某種病癥 和/或疾病的測量值在動物中改變時，可構(gòu)建篩選系統(tǒng)以探測具有減輕疾病的活性的化合 物。如本文中所使用的，表述“表達(dá)水平的增加”是指下列情況的任一種人工表達(dá)作 為外源基因?qū)氲臉?biāo)志物基因；受試動物本身固有的標(biāo)志物基因的轉(zhuǎn)錄和其至蛋白質(zhì)的翻譯得到增強；或作為翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的水解被抑制。如本文中所用的，表述“表達(dá)水平的減少”是指其中受試動物的標(biāo)志物基因的轉(zhuǎn)錄 和其至蛋白質(zhì)的翻譯被抑制的情況，或其中作為翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的水解被增強的情況。 基因的表達(dá)水平可以例如通過DNA芯片上信號強度的差異來測定。此外，翻譯產(chǎn)物(蛋白 質(zhì))的活性可通過與正常情況中的活性相比較來測定。也在預(yù)期的范圍內(nèi)的是動物模型可包括轉(zhuǎn)基因動物，包括例如其中已人工導(dǎo)入 并且表達(dá)標(biāo)志物基因的動物；標(biāo)志物基因敲除動物；和其中已用另一個基因置換標(biāo)志物基 因的基因敲入動物。已向其中導(dǎo)入了標(biāo)志物基因的反義核酸、核酶、具有RNAi作用的多核 苷酸或用作誘餌核酸的DNA等的轉(zhuǎn)基因動物可用作轉(zhuǎn)基因動物。此類轉(zhuǎn)基因動物還包括例 如這樣的動物，在所述動物中標(biāo)志物蛋白的活性已通過將突變導(dǎo)入基因的編碼區(qū)而得到增 強或抑制，或氨基酸序列已被修飾而變得抗水解或?qū)λ饷舾?。氨基酸序列中的突變包?置換、缺失、插入和添加。表達(dá)的實例此外，標(biāo)志物基因本身的表達(dá)可通過向基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)導(dǎo)入突變來控制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員理解此類氨基酸置換。同樣，被突變的氨基酸的數(shù)目不受特別限制，只要活性得 到保持即可。通常，其在50個氨基酸以內(nèi)，在某些非限定性實施方案中，在30個氨基酸以 內(nèi)，在10個氨基酸以內(nèi)，或在3個氨基酸以內(nèi)。突變的位點可以是任何位點，只要活性得到 保持即可。在另一個方面，本文中提供了治療特定病癥和/或疾病的治療劑的候選化合物的 篩選方法。一個或多個標(biāo)志物基因選自本文中描述的基因?？赏ㄟ^選擇能夠增加或減少標(biāo) 志物基因的表達(dá)水平的化合物來獲得結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療劑。應(yīng)理解，表述“增加基因的表達(dá)水平的化合物”是指促進基因轉(zhuǎn)錄、基因翻譯或蛋 白質(zhì)活性的表達(dá)的步驟中的任一步驟的化合物。另一方面，表述“減少基因的表達(dá)水平的化 合物”，如本文中所用的，是指抑制這些步驟中的任一步驟的化合物。在特定的方面，可在體內(nèi)或體外進行篩選用于病癥和/或疾病的治療劑的方法。 該篩選方法可以例如通過下列步驟來進行1)對動物受試者施用候選化合物；2)測量動物受試者的生物學(xué)樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平；或3)選擇與對照(其未與候選化合物接觸)中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平相比較增加或 減少標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的化合物。在另一個方面，本文中提供了這樣的方法，其通過將動物受試者與候選化合物接 觸，然后監(jiān)控化合物對來源于動物受試者的生物學(xué)樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的作用來 評估藥劑的候選化合物對標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的功效。來源于動物受試者的生物學(xué)樣品 中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的變化可使用與上述檢測方法中所用的相同的技術(shù)來監(jiān)控。此 外，基于評估，可通過篩選來選擇藥劑的候選化合物。
本文中所引用的所有專利、專利申請和參考文獻(xiàn)以其全文通過引用合并入本文。 雖然對于制備和使用其的本領(lǐng)域技術(shù)人員來說已十分詳盡地描述和例示了本發(fā)明，但各種 改變、修飾和改進是顯然的，且不背離本發(fā)明的精神和范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解，本 發(fā)明可進行適當(dāng)?shù)馗淖円赃m合于實現(xiàn)目的和獲得提及的目標(biāo)和有利方面以及其中固有的那些。
某些核堿基(Nucleobase)序列本文中描述的成熟miRNA和它們的相應(yīng)的莖-環(huán)序列的核堿基序列是見于 miRBase (見于http //microrna. sanger. ac. uk/的miRNA序列和注釋的在線可搜索數(shù)據(jù) 庫)中的序列。miRBase序列數(shù)據(jù)庫中的條目(entry)代表預(yù)測的miRNA轉(zhuǎn)錄物的發(fā)夾部 分(莖-環(huán))和關(guān)于成熟miRNA序列的定位和序列的信息。數(shù)據(jù)庫中miRNA的莖-環(huán)序列 嚴(yán)格說來不是前體miRNA (pre-miRNA)，并且在一些情況下可包括pre_miRNA和來自假定的 初級轉(zhuǎn)錄物的一些側(cè)翼序列。本文中描述的miRNA核堿基序列包括miRNA的任何形式，包 括miRBase序列數(shù)據(jù)庫的Release 10. O中描述的序列和miRBase序列數(shù)據(jù)庫的任何更早 的Release中描述的序列。序列數(shù)據(jù)庫釋放可導(dǎo)致某些miRNA的重新命名。序列數(shù)據(jù)庫釋 放可導(dǎo)致成熟miRNA序列的變化?？砂ù祟愋揎椀墓押塑账岬幕衔锟膳c本文中描述的 miRNA的任何核堿基序列形式互補。應(yīng)理解，本文中所示的任何核堿基序列不依賴于對糖部分、核苷間連接或核堿基 的任何修飾。還應(yīng)理解，包含U的核堿基序列也包括其中在一個或多個具有‘U’的位點上 ‘U’被‘T’置換的相同核堿基序列。反過來，應(yīng)理解，包含T的核堿基序列也包括其中在一 個或多個具有‘T’的位點上‘T’被‘U’置換的相同核堿基序列。在某些實施方案中，修飾的寡核苷酸具有與miRNA或其前體互補的核堿基序列， 這意味著修飾的寡核苷酸的核堿基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或更多個核堿基的區(qū)域 中與 miRNA 或其前體的互補序列至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、 98%或99%同一，或兩個序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交。因此，在某些實施方案中，修飾的寡 核苷酸的核堿基序列相對于其靶miRNA或靶miRNA前體序列可具有一個或多個錯配的堿基 對，并且能夠與其靶序列雜交。在某些實施方案中，修飾的寡核苷酸具有與miRNA或其前體 100%互補的核堿基序列。在某些實施方案中，修飾的寡核苷酸的核堿基序列具有對miRNA 的全長互補性。miRNA (miR)療法在一些實施方案中，本發(fā)明提供了抑制受試者的一個或多個基因的表達(dá)的微RNA。 微RNA表達(dá)特征譜可用作新型癌癥生物標(biāo)志物。本文中包括使用一個或多個MiR抑制基因表達(dá)和/或活性的方法。在一些實施方 案中，miR抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)。在其他實施方案中，miRNA抑制基因活性(例如，細(xì)胞侵襲活 性)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多種技術(shù)從細(xì)胞或組織分離，重組產(chǎn)生或體外合 成miRNA。在一個實施方案中，從細(xì)胞或組織分離miRNA。用于從細(xì)胞或組織分離miRNA 的技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。例如，可使用來自Ambion，Inc. WmirVana miRNA分離試劑盒從總RNA分離miRNA。另一種技術(shù)利用flashlPAGE Fractionator System (Ambion, Inc.)來進行小核酸的PAGE純化。關(guān)于miRNA治療劑的使用，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，體內(nèi)施用的核酸被吸收和分配 至細(xì)胞和組織?？梢砸院线m的方式遞送核酸，所述方式使得能夠組織特異性地吸收試劑和/或核酸遞送系統(tǒng)。本文中描述的試劑可通過任何已知的常規(guī)療法來補充治療狀況，所述療法包括但不限于抗體施用、疫苗施用、細(xì)胞毒性劑、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸類似物和生物 應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的施用。可一起或相繼使用兩個或多個組合的化合物。本發(fā)明的某些實施方案提供了包含(a) —種或多種核酸或小分子化合物以及(b) 一種或多種其他化學(xué)治療劑的藥物組合物。另外的有用的定義“受試者”是指經(jīng)選擇接受治療或療法的人或非人動物。“懷疑患有……的受試者” 是指展示病癥、疾病或病況的一個或多個臨床指標(biāo)的受試者?！邦A(yù)防”或“防止”是指延遲或阻止病況或疾病的發(fā)作、發(fā)展或進展，持續(xù)一段時間， 包括數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。“治療”或“醫(yī)治”是指一種或多種用于治愈或改善病癥和/或疾病 的特定方法的應(yīng)用。在某些實施方案中，特定方法是一種或多種藥劑的施用。“改善”是指減輕病況或疾病的至少一個指標(biāo)的嚴(yán)重度。在某些實施方案中，改善 包括病況或疾病的一個或多個指標(biāo)的進展的延遲或減緩。指標(biāo)的嚴(yán)重度可通過對于本領(lǐng)域 技術(shù)人員來說是已知的主觀或客觀量度來測定?！坝写诵枰氖茉囌摺笔侵复_定為需要治療或療法的受試者?！笆┯谩笔侵附o受試者提供藥劑或組合物，包括但不限于由醫(yī)學(xué)專業(yè)人員施用和自 我施用?！拔改c外施用”是指通過注射或輸注進行的施用。胃腸外施用包括但不限于皮下施 用、靜脈內(nèi)施用、肌內(nèi)施用、動脈內(nèi)施用和顱內(nèi)施用?！捌は率┯谩笔侵妇o在皮膚下方施用。“改善功能”是指使功能向正常參數(shù)改變。在某些實施方案中，通過測量在受試者 的體液中發(fā)現(xiàn)的分子評估功能?！八幬锝M合物”是指適合于給個體施用的物質(zhì)的混合物，其 包括藥劑。例如，藥物組合物可包含修飾的寡核苷酸和無菌水性溶液?！鞍泻怂帷?、“靶RNA”、“靶RNA轉(zhuǎn)錄物”和“核酸靶”都是指能夠被反義化合物靶向的 核酸。“靶向”是指與靶核酸雜交并且誘導(dǎo)期望的作用的核堿基序列的設(shè)計和選擇的過程。 “被靶向”是指具有核堿基序列，所述序列允許與靶核酸雜交以誘導(dǎo)期望的作用。在某些實 施方案中，期望的作用是靶核酸的減少?！罢{(diào)控”是指對功能或活性的干擾。在某些實施方案中，調(diào)控是指基因表達(dá)的增加。 在某些實施方案中，調(diào)控是指基因表達(dá)的減少?！氨磉_(dá)”是指藉以將基因的編碼信息轉(zhuǎn)變成存在于細(xì)胞中和在細(xì)胞中運轉(zhuǎn)的結(jié)構(gòu) 的任何功能和步驟?！皡^(qū)域”是指核酸內(nèi)一部分連接的核苷。在某些實施方案中，修飾的寡核苷酸具 有與靶核酸的區(qū)域互補的核堿基序列。例如，在某些此類實施方案中，修飾的寡核苷酸與 miRNA莖-環(huán)序列的區(qū)域互補。在某些此類實施方案中，修飾的寡核苷酸與miRNA序列的區(qū) 域100%同一?！皡^(qū)段”是指更小的區(qū)域或區(qū)域的亞部分。“核堿基序列”是指以5'至3'方向，不依賴于任何糖、連接和/或核堿基修飾的 連續(xù)核堿基的順序?！斑B續(xù)核堿基”是指核酸中彼此緊密相鄰的核堿基?！昂藟A基互補性”是指兩個核堿基通過氫鍵非共價配對的能力?！盎パa”是指第一核堿基序列在 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個核堿基的區(qū)域內(nèi)與第二核堿基序列的互補序 列至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99% 同一，或 100% 同
一，或兩個序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交。在某些實施方案中，具有與miRNA或其前體100% 互補的核堿基序列的修飾的寡核苷酸可以在修飾的寡核苷酸的整個長度上不與miRNA或 其前體100%互補?！盎パa性”是指第一核酸與第二核酸之間的核堿基配對能力?！叭L互補性”是指 第一核酸的各核堿基能夠與第二核酸中相應(yīng)的位點上的各核堿基配對。例如，在某些實施 方案中，其中各核堿基與miRNA中的核堿基具有互補性的修飾的寡核苷酸與miRNA具有全 長互補性?！鞍俜直然パa性”是指核酸中互補核堿基的數(shù)目除以核酸的長度。在某些實施方案 中，修飾的寡核苷酸的百分比互補性是指與靶核酸互補的核堿基的數(shù)目除以修飾的寡核苷 酸的核堿基數(shù)目。在某些實施方案中，修飾的寡核苷酸的百分比互補性是指與miRNA互補 的核堿基的數(shù)目除以修飾的寡核苷酸的核堿基的數(shù)目?！鞍俜直冉Y(jié)合的區(qū)域”是指與寡核苷酸區(qū)域互補的區(qū)域的百分比。通過將與寡核苷 酸互補的靶區(qū)域的核堿基的數(shù)目除以靶區(qū)域的長度來計算百分比結(jié)合的區(qū)域。在某些實施 方案中，百分比結(jié)合的區(qū)域是至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少 97%，至少 98%，至少 99%或 100%?！鞍俜直韧恍浴笔侵傅谝缓怂嶂信c第二核酸相應(yīng)的位點上的核堿基相同的核堿 基的數(shù)目除以第一核酸中的核堿基的總數(shù)。本文中使用的“大體上同一的”可以指第一與第二核堿基序列在8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90,95,100 或更多個核堿基的區(qū)域上至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 97%、98%或 99% 同一，或 100% 同一?！半s交”是指通過核堿基的互補性發(fā)生的互補核酸的退火?！板e配”是指不能夠與第二核酸的相應(yīng)的位點上的核堿基配對的第一核酸的核堿基?！胺腔パa核堿基”是指不能夠通過氫鍵配對的兩個核堿基?！巴坏模?，是指具有相同核堿基序列?！癿iRNA”或“miR”是指長度在18至25個核堿基之間的非編碼RNA，其與編碼RNA 雜交并且調(diào)控編碼RNA的表達(dá)。在某些實施方案中，miRNA是Dicer切割pre-miRNA的產(chǎn) 物。miRNA 的實例見于稱為 miRBase 的 miRNA 數(shù)據(jù)庫(http //microrna. sanger. ac. uk/)?！癙re-miRNA”或〃 pre-miR”是指具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，其包含miRNA。在某 些實施方案中，pre-miRNA是稱為Drosha的雙鏈RNA特異性核糖核酸酶切割pri_miR的產(chǎn) 物。“莖-環(huán)序列”是指具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)并且包含成熟miRNA序列的RNA。Pre-miRNA序 列和莖-環(huán)序列可重疊。莖-環(huán)序列的實例可見于稱為miRBase的miRNA數(shù)據(jù)庫(http:// microrna. sanger. ac. uk/) 0"miRNA前體”是指源自基因組DNA并且包含含有一個或多個miRNA序列的非編碼性結(jié)構(gòu)化RNA的轉(zhuǎn)錄物。例如，在某些實施方案中，miRNA前體是pre-miRNA。在某些實施 方案中，miRNA前體是pri-miRNA。“反義化合物”是指具有允許與靶核酸雜交的核堿基序列的化合物。在某些實施方 案中，反義化合物是具有與靶核酸互補的核堿基序列的寡核苷酸?！肮押塑账帷笔侵高B接的核苷的聚合物，各核苷可以彼此獨立地被修飾或不被修 飾?！疤烊话l(fā)生的核苷間連接”是指核苷之間的3'至5'磷酸二酯連接。“天然核堿基”是 指相對于其天然發(fā)生的形式未被修飾的核堿基。“miR拮抗劑”是指經(jīng)設(shè)計用于干擾或抑制 miRNA的活性的試劑。在某些實施方案中，miR拮抗劑包括靶向miRNA的反義化合物。在某 些實施方案中，miR拮抗劑包括具有與miRNA或其前體的核堿基序列互補的核堿基序列的 修飾的寡核苷酸。在某些實施方案中，miR拮抗劑包括干擾或抑制miRNA的活性的小分子等。 本文中所描述的方法和試劑代表優(yōu)選實施方案，是示例性的，并且不意欲限制本 發(fā)明的范圍。其中的改進和其他用途對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯然的。這些改進包括在本 發(fā)明的精神內(nèi)并且由權(quán)利要求的范圍界定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，同樣極顯然的是可 對本文中公開的發(fā)明進行各種替代和改進而不背離本發(fā)明的范圍和精神。應(yīng)理解，雖然本發(fā)明已通過優(yōu)選實施方案和任選特征明確地公開，但本領(lǐng)域技術(shù) 人員可采用本文中公開的概念的改進和變化，并且此類改進和變化被認(rèn)為在由所附權(quán)利要 求界定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。雖然通過參考各種和優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解， 可進行各種變化并且可用等同物替代其元素而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進行許 多改進以使特定的情況或材料適合于本發(fā)明的教導(dǎo)而不背離本發(fā)明的基本范圍。參考文獻(xiàn)本文中用于舉例說明本發(fā)明或提供關(guān)于本發(fā)明的實施的另外的詳細(xì)內(nèi)容的公開 案和其他材料通過引用合并入本文，并且為方便起見提供于下列參考書目中。本文中引用的任何文獻(xiàn)的引用不意欲作為任何前述內(nèi)容是相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)。 關(guān)于日期的所有聲明和關(guān)于這些文獻(xiàn)的內(nèi)容的所有陳述基于申請人可獲得的信息，并且不 構(gòu)成關(guān)于這些文獻(xiàn)的日期或內(nèi)容的正確性的任何承認(rèn)。Arata, Y. ， Fujita, M. ， Ohtani, K. ， Kijima, S. ， and Kato, J. 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權(quán)利要求
1.一種方法，所述方法診斷受試者是否患有胃相關(guān)病癥或處于發(fā)生胃相關(guān)病癥的風(fēng)險 中，確定患有胃癌和/或相關(guān)病癥的受試者的預(yù)后和/或治療患有這樣的病癥的受試者，其 包括測量來自受試者的測試樣品中至少一個生物標(biāo)志物的水平，其中相對于對照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平，測試樣品中生物標(biāo)志物的水平的改 變表示受試者患有所述病癥或處于發(fā)生所述病癥的風(fēng)險中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中測試樣品中所述至少一個生物標(biāo)志物的水平低于對照樣品 中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平。
3.權(quán)利要求1的方法，其中測試樣品中所述至少一個生物標(biāo)志物的水平高于對照樣品 中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平。
4.權(quán)利要求1的方法，其中差異表達(dá)的所述至少一個生物標(biāo)志物選自圖13-表1中所 列的組。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述病癥包括慢性胃炎并且至少一個生物標(biāo)志物選自上 調(diào)的 miR-1 和 miR-155。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述病癥包括慢性胃炎并且至少一個生物標(biāo)志物選自下 調(diào)的 miR-205、miR-203、miR-202、miR-20 和 miR_26b。
7.權(quán)利要求1的方法，其中差異表達(dá)的所述至少一個生物標(biāo)志物選自圖14-表2中所 列的組。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述病癥包括胃腺癌并且至少一個生物標(biāo)志物選自上調(diào) 的 miR-21、miR-223、miR-25、miR-17-5-p、miR-125b、miR-181b、miR-106a、miR-107、miR-92、 miR-103、miR-221、miR-93、miR-100、miR-181、miR_106b、miR-191、miR-214、miR-130、 miR-342、miR-222、miR-320 和 miR_99b。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述病癥包括胃腺癌并且至少一個生物標(biāo)志物選自下調(diào) 的 miR-136、miR-218、miR-212、miR-96、miR-339 和 miR_130b。
10.權(quán)利要求1的方法，其中差異表達(dá)的所述至少一個生物標(biāo)志物選自圖16-表3中 所列的組miR-21、miR-223、miR-25、miR-92、miR-107、miR-93、miR_106b、miR-17_5p、 miR-181b 和 miR_106a。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個生物標(biāo)志物包括miR-160b-25簇 miR-106b、miR-93 和 miR-25。
12.至少一個生物標(biāo)志物在調(diào)控圖18-表6中所列的基因PHLPPL、GM632、ALX4、 PLEKHM1、JOSD1、ZFPM2、GATAD2B、ZNF238、ATXNl、NEUROD1、BCL2L11、KLFl2、UBE2W、0SBPL5、 SNF1LK、PCAF、PAPOLA和CFL2中的一個或多個的表達(dá)中的用途，所述生物標(biāo)志物包括 miR-160b-25 簇miR_106b、miR-93 和 miR-25。
13.用于在有此需要的受試者中調(diào)控E2F1的表達(dá)的方法，其包括施用足以調(diào)控E2F1的 表達(dá)的有效量的miR-106b和/或miR-93或其功能性變體。
14.miR-106b和miR-93用于在有此需要的受試者中調(diào)控E2F1的表達(dá)的用途。
15.調(diào)控TGFE腫瘤抑制途徑的方法，所述途徑干擾⑶KNlA(p21Wan/Cipl)和/或 BCL2L11(Bim)的表達(dá)，所述方法包括上調(diào)miR_106b、miR-93和miR-25中的一個或多個。
16.miR-106b-25簇在E2F1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和胃癌中TGFE抗性的發(fā)生的調(diào)控中的用途。
17.用于在有此需要的受試者中控制E2F1的表達(dá)的方法，其包括調(diào)控受試者中 miR-106b 和 miR-93 的水平。
18.E2F1用于在有此需要的受試者中同時調(diào)控miR-106b-25和Mcm7的表達(dá)的用途。
19.用于在有此需要的受試者中控制E2F1蛋白合成的速率，預(yù)防其過量積累的方法， 該方法包括調(diào)控受試者中miR-106b-25簇的水平。
20.miR-106b和miR-93用于在有此需要的受試者中削弱TGFE誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯的 用途。
21.miR-106b和miR-93在有此需要的受試者中通過在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制p21的表達(dá)來 干擾TGFO誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯的用途。
22.miR-25在有此需要的受試者中與miR-106b和miR-93協(xié)同阻止TGFO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋 亡的發(fā)生的用途。
23.用于在有此需要的受試者中調(diào)控miR-106b-25簇的表達(dá)以阻止使胃癌細(xì)胞免受細(xì) 胞凋亡的保護作用的方法。
24.胃癌中獨特的微RNA表達(dá)特征，其包括一個或多個調(diào)控腫瘤微RNA加工的生物標(biāo)志 物的表達(dá)的改變。
25.影響胃癌中靶mRNA的轉(zhuǎn)錄物豐度和/或蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，其包括使有此需要的 受試者中一個或多個微RNA失調(diào)。
26.前述權(quán)利要求的方法，其包括抑制癌癥相關(guān)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。
27.前述權(quán)利要求的方法，其包括改變miR-106b、miR-93和miR-25中的一個或多個的 表達(dá)以抑制癌癥相關(guān)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。
28.微RNA和編碼蛋白質(zhì)的RNA的大規(guī)?；虮磉_(dá)特征譜分析的用途，其用于鑒定人胃 癌中發(fā)生的微RNA功能的改變。
29.權(quán)利要求1的方法，其包括確定患有胃癌的受試者的預(yù)后，包括測量來自受試者的 測試樣品中至少一個生物標(biāo)志物的水平，其中i)生物標(biāo)志物與此類癌癥中不利的預(yù)后相關(guān)；和ii)相對于對照樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的水平，測試樣品中所述至少一個生物標(biāo)志 物的水平的改變表示不利的預(yù)后。
30.權(quán)利要求1的方法，其包括診斷受試者是否患有胃癌或處于發(fā)生胃癌的風(fēng)險中，所 述方法包括1)從獲自受試者的測試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸；2)將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供測試樣 品的雜交特征譜；和3)將測試樣品雜交特征譜與從對照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較，其中至少一個 miRNA的信號的改變表示受試者患有所述癌癥或處于發(fā)生所述癌癥的風(fēng)險中。
31.前述權(quán)利要求的方法，其中相對于從對照樣品產(chǎn)生的信號，至少一個miRNA的信號 下調(diào)，和/或其中相對于從對照樣品產(chǎn)生的信號，至少一個miRNA的信號上調(diào)。
32.前述權(quán)利要求的方法，其中選自表13、表14和表16中所列的組的至少一個生物標(biāo) 志物的信號的改變表示受試者患有具有不利預(yù)后的此類癌癥或處于發(fā)生具有不利預(yù)后的 此類癌癥的風(fēng)險中。
33.胃病癥或疾病的生物標(biāo)志物，其包括下列中的一個或多個miR-106b、miR-93和 mir_250
34.用于調(diào)控胃癌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，其包括調(diào)控下列中的一個或多個在胃 癌細(xì)胞中的表達(dá)miR-106b、miR-93和mir_25。
35.用于調(diào)控E2Fl、CDKNlA(p21WaflCipl)和BCL2L11(Bim)中的一個或多個在胃癌細(xì) 胞中的表達(dá)的組合物，所述組合物包含下列中的一個或多個miR-106b、miR-93和mir_25， 或其功能性變體。
36.用于在有此需要的受試者中調(diào)控E2F1和p21/WAFl蛋白水平中的一個或多個的方 法，其包括使用下列中的一個或多個miR-106b、miR-93和mir_25，或其功能性變體。
37.一種組合物，其包含用于在有此需要的受試者中在胃癌細(xì)胞中增加P21/WAF1和/ 或E2F1的蛋白水平的反義miR-106b。
38.治療患有胃癌的受試者的胃癌的方法，在所述胃癌中至少一個生物標(biāo)志物在受試 者的癌細(xì)胞中相對于對照細(xì)胞下調(diào)或上調(diào)，所述方法包括1)當(dāng)所述至少一個生物標(biāo)志物在癌細(xì)胞中下調(diào)時，給受試者施用有效量的至少一個分 離的生物標(biāo)志物，或其分離的變體或生物學(xué)活性片段，以便受試者中癌細(xì)胞的增殖被抑制； 或2)當(dāng)所述至少一個生物標(biāo)志物在癌細(xì)胞中上調(diào)時，給受試者施用有效量的至少一種抑 制所述至少一個生物標(biāo)志物表達(dá)的化合物，以便受試者中癌細(xì)胞的增殖被抑制。
39.治療受試者的胃癌的方法，其包括1)測定相對于對照細(xì)胞，胃癌細(xì)胞中至少一個生物標(biāo)志物的量；和2)通過下列來改變胃癌細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量i)如果癌細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量低于對照細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量，給受 試者施用有效量的至少一個分離的生物標(biāo)志物；或 )如果癌細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量高于對照細(xì)胞中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量，給 受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一個生物標(biāo)志物表達(dá)的化合物。
40.用于治療胃癌的藥物組合物，其包含至少一個分離的生物標(biāo)志物和可藥用載體。
41.前述權(quán)利要求的藥物組合物，其中所述至少一個分離的生物標(biāo)志物相應(yīng)于相對于 對照細(xì)胞在胃癌細(xì)胞中下調(diào)的生物標(biāo)志物。
42.前述權(quán)利要求的藥物組合物，其包含至少一個miR表達(dá)抑制劑化合物和可藥用載體。
43.鑒定抗胃癌試劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測試試劑和測量與胃癌細(xì)胞中減少的 表達(dá)水平相關(guān)的至少一個生物標(biāo)志物的水平，其中相對于對照細(xì)胞，細(xì)胞中生物標(biāo)志物的 水平的增加表示測試試劑是抗胃癌試劑。
44.鑒定抗胃癌試劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測試試劑和測量與胃癌細(xì)胞中增加的 表達(dá)水平相關(guān)的至少一個生物標(biāo)志物的水平，其中相對于對照細(xì)胞，細(xì)胞中生物標(biāo)志物的 水平的減少表示測試試劑是抗癌癥試劑。
45.評估療法預(yù)防、診斷和/或治療胃癌相關(guān)疾病的有效性的方法，其包括i)使動物經(jīng)歷其有效性待評估的療法，和ii)通過評估表13、14和16的一個或多個中所列的至少一個生物標(biāo)志物來測定被測試的療法在治療或預(yù)防疾病中的有效性的水平。
46.前述權(quán)利要求的方法，其中候選治療劑包括下列中的一種或多種藥物組合物、營 養(yǎng)組合物和順勢療法組合物。
47.前述權(quán)利要求的方法，其中被評估的療法用于人受試者。
48.一種制品，其包含至少一種結(jié)合胃癌相關(guān)疾病的標(biāo)志物的捕獲試劑，所述標(biāo)志物 包括表13、14和16的一個或多個中所列的至少一個生物標(biāo)志物。
49.用于篩選治療胃癌相關(guān)疾病的治療劑的候選化合物的試劑盒，其中所述試劑盒包 括表13、14和16的一個或多個中所列的至少一個生物標(biāo)志物的一個或多個試劑，和表達(dá) 至少一個生物標(biāo)志物的細(xì)胞。
50.前述權(quán)利要求的試劑盒，其中使用包含特異性結(jié)合至少一個生物標(biāo)志物的抗體或 抗體片段的試劑檢測生物標(biāo)志物的存在。
51.干擾胃癌相關(guān)疾病應(yīng)答信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的試劑用于制造藥劑的用途，所述藥劑用于 治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個體中疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重度，其中所述試劑包含表13、14和16的一 個或多個中所列的至少一個生物標(biāo)志物。
52.治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制有此需要的個體的胃癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重度的方法， 其包括給個體施用干擾至少胃癌相關(guān)疾病應(yīng)答級聯(lián)的試劑，其中所述試劑包含表13、14 和16的一個或多個中所列的至少一個生物標(biāo)志物。
53.干擾至少胃癌相關(guān)疾病應(yīng)答級聯(lián)的試劑用于制造藥劑的用途，所述藥劑用于治療、 預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個體的胃癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重度，其中所述試劑包含表13、14和16 的一個或多個中所列的至少一個生物標(biāo)志物。
54.包含miR-106b，miR-93和miR-25中的一個或多個的反義抑制劑的組合物。
55.治療有此需要的受試者中的胃病癥的方法，其包括給受試者施用治療有效量的前 述權(quán)利要求的組合物。
56.前述權(quán)利要求的方法，其中預(yù)防性施用所述組合物。
57.前述權(quán)利要求的方法，其中所述組合物的施用延遲胃癌的一個或多個癥狀的發(fā)作。
58.前述權(quán)利要求的方法，其中所述組合物的施用抑制胃癌的發(fā)生。
59.前述權(quán)利要求的方法，其中所述組合物的施用抑制腫瘤生長。
60.用于檢測生物學(xué)樣品中胃癌的存在的方法，該方法包括i)將懷疑包含胃癌的生物學(xué)樣品暴露于用于其的標(biāo)志物；和 )如果有的話，檢測樣品中所述標(biāo)志物的存在或不存在。
61.前述權(quán)利要求的方法，其中所述標(biāo)志物包括可檢測的標(biāo)記。
62.前述權(quán)利要求的方法，其還包括將來自受試者的生物學(xué)樣品中標(biāo)志物的量與來自 正常受試者的相應(yīng)的生物學(xué)樣品中標(biāo)志物的量相比較。
63.前述權(quán)利要求的方法，其還包括在不同時間點從受試者收集多個生物學(xué)樣品和比 較各生物學(xué)樣品中標(biāo)志物的量以確定標(biāo)志物的量在受試者中是隨時間增加還是減少。
64.治療受試者的胃癌的方法，該方法包括胃癌受體激動劑。
65.前述權(quán)利要求的方法，其中所述受體激動劑是miR-106b、miR-93和miR-25中的一 個或多個的反義抑制劑。
66.制造用于治療胃癌的藥物的用途，所述藥物包含選自下列的核酸分子表13、14和16中顯示的miR、來源于其的序列、此類miR的互補序列和來源于這樣的互補序列的序列。
67.前述權(quán)利要求的用途，其中所述藥物包含核酸分子，所述核酸分子提供選自下列的 序列表13、14和16中所列的miR、來源于此類miR的序列、此類miR的互補序列和來源于 這樣的互補序列的序列。
68.鑒定誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞分化的有效治療劑或治療劑的組合的體外方法，該方法包括步驟i)培養(yǎng)來源于胃腫瘤的細(xì)胞， )向細(xì)胞系的培養(yǎng)基中加入至少一種化合物，iii)分析步驟(i)與(ii)之間至少一個miR的表達(dá)水平的變化，和iv)鑒定誘導(dǎo)步驟(i)與(ii)之間miR的表達(dá)水平的變化的化合物或化合物的組合。
69.前述權(quán)利要求的方法，其中步驟(iii)包括分析至少一個miR的表達(dá)水平。
70.前述權(quán)利要求的方法，其中步驟(iv)包括鑒定調(diào)控至少一個miR的表達(dá)水平的化 合物或化合物的組合。
71.前述權(quán)利要求的方法，其中步驟(iv)包括鑒定減少至少一個miR的表達(dá)水平的化 合物或化合物的組合。
72.前述權(quán)利要求的方法，其中所述化合物是治療癌癥的治療劑。
全文摘要
公開了用于胃癌相關(guān)疾病的診斷、預(yù)后和/或治療的方法和組合物。
文檔編號C12Q1/68GK102007223SQ200980112966
公開日2011年4月6日 申請日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月28日
發(fā)明者A·維克馳歐尼, C·M·克羅斯, F·派特羅卡 申請人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會