專利名稱：檢測血小板特異性抗體的流式微球方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種血小板基礎(chǔ)實驗研究上用來檢測血小板特異性抗體的具有較高敏感性 的新型實驗方法。
背景技術(shù)：
依據(jù)實驗室血小板抗體檢測方法出現(xiàn)的早晚，可分為I期、II期及III期檢查方法'。I期檢査出現(xiàn)于十九世紀50年代至70年代，主要檢測患者血清或血漿在體外對正常血小板功能的影響，所用的實驗方法均是間接法，其敏感性和特異性均很低。II期實驗方法在十九世紀70年代發(fā)展起來，主要 是檢測血小板相關(guān)抗體。血小板相關(guān)抗體雖然有較高的敏感性但特異性較低。 III期實驗方法是在十九世紀80年代中期發(fā)展起來的抗原特異性分析法。最 近發(fā)展起來的糖蛋白俘獲檢查法一即單克隆抗體固定特異血小板抗原法，不 僅可檢測血小板特異性抗體(間接法)而且可檢測血小板相關(guān)的特異性抗體 (直接法)；并且血小板裂解發(fā)生在特異性抗體與血小板膜糖蛋白結(jié)合后，避 免了去垢劑處理對自身抗原表位的破壞；實驗中在分離的試管內(nèi)洗滌致敏的 正常血小板，阻止了血漿/血清與塑料的粘附，減低了背景干擾。這些方法特異 性較高，敏感性太低，限制了其在血小板抗體基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用。目前實驗室需要一種敏 感性高的檢測血小板自身特異性抗體的試驗方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明屬于一種血小板基礎(chǔ)實驗研究上用來檢測血小板特異性抗體的具有較高敏感性的新型實驗方法。本發(fā)明用抗人血小板膜糖蛋白單抗包被微球，將血小板裂解液與包被過的微球孵育，之 后加入藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗體，流式細胞儀分析。若血小板表面存在 特異性抗體，則形成"微球-血小板膜糖蛋白單抗-血小板膜糖蛋白特異性抗體-藻紅蛋白標(biāo) 記的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗體"復(fù)合物結(jié)構(gòu),表現(xiàn)為檢測微球的熒光強度增高。本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下步驟l微球包被采用物理吸附的方法包被聚苯乙烯微球，利用抗體Fc段的疏水作用與微球吸附，F(xiàn)ab段仍保持活性。包被前重懸微球，將微球加入包被緩沖液稀釋好的鼠抗人單抗中， 室溫渦旋震蕩；2患者血樣采集與處理抽取患者靜脈血分離血小板，轉(zhuǎn)移至離心管，離心取沉淀，血小板裂解液裂解后離心，吸取上清液；3抗原的俘獲與上機檢測向裂解后上清液加入單抗包被過的微球，室溫震蕩孵育，加 入藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗體，避光震蕩孵育離心，棄上清，流式細胞儀上進行檢測；4數(shù)據(jù)處理散點圖圈出檢測微球門，獲取微球，記錄直方圖中的檢測微球的平均熒光 強度，對數(shù)據(jù)進行分析。設(shè)正常人作為對照。本發(fā)明操作方便，技術(shù)成熟，檢測血小板特異性抗體敏感性高，有助于血小板特異性抗 體的基礎(chǔ)實驗研究。
具體實施例方式本發(fā)明的檢測步驟如下1微球包被采用物理吸附的方法包被聚苯乙烯微球，利用抗體FC段的疏水作用與微球吸附，F(xiàn)ab段仍保持活性。包被前重懸微球，將微球加入包被緩沖液稀釋好的鼠抗人血小 板膜糖蛋白單抗中(使抗體與微球比例為70ug抗體/ml微球)，室溫渦旋震蕩2小時(或4 。C渦旋震蕩過夜)，0.01M PBS/TWEEN洗滌三次，之后5%小牛血清白蛋白震蕩封閉微球2h， 0. 01M PBS/TWEEN洗滌三次，含0. 2%疊氮鈉的等滲鹽溶液重懸微球，使微球最終濃度為0. 25%。 4'C保存。十第1、 2、 5、 10、 30、 40天應(yīng)用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋A G多 克隆抗體及羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗體(陰性對照)檢測微球，根據(jù)熒光強度的高低及 其變化判斷微球包被效果和穩(wěn)定性；2血樣采集與處理采血前血細胞計數(shù)儀計數(shù)患者血小板，根據(jù)患者血小板計數(shù)，于枸 櫞酸鈉抗凝的硅化管采集外周靜脈血(應(yīng)使采集血液屮至少含有1X1()S個血小板)，200Xg 離心10分鐘，吸取上層富血小板血漿(PRP),轉(zhuǎn)移至離心管，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘(將 上清取出，置于離心管中，-scrc凍存，留作血漿中糖蛋白特異性特異性抗體的測定)，取沉 淀，P服.2、 0. 05mol/L的枸櫞酸鈉洗滌5次，重懸計數(shù)，取1 X 108個血小板置于Ep藻紅蛋 白ndor士'管中，離心棄上清，加入含l%Trit。n X-100的裂解液110ul (內(nèi)含0. lmg/ml的leu 藻紅蛋白ptm)， 4'C30分鐘。5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，吸取上清液，轉(zhuǎn)移至另一Ep藻紅 蛋白ndorf管；3抗原的俘獲與上機檢測向裂解后上清液加入15000個單抗包被過的微球，室溫震蕩 孵育加，離心，棄上清，PBS-TWEEN洗滌三次，之后用98ul 0.01M PBS重懸，加入2ul藻 紅蛋白標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗體，避光震蕩孵育lh，離心，棄上清，PBS-TWEEN 洗滌二次，0.01M PBS調(diào)整最終體積至200ul，在BD-FACS Calibur流式細胞儀上利用 CellQuest Pro軟件進行檢測；4數(shù)據(jù)處理FSC/SSC散點圖圈出檢測微球門，獲取2500-3000個微球，紀錄FL-2直方 圖中的檢測微球的平均熒光強度，存盤后用軟件對數(shù)據(jù)進行分析。檢測標(biāo)本的同時，將三個 正常人的血樣作為正常對照。計算正常對照平均熒光強度的均值，將標(biāo)本平均熒光強度與之 比較并計算比率。
權(quán)利要求
1、檢測血小板特異性抗體的流式微球方法，其特征在于它采用如下步驟(1)微球包被采用物理吸附的方法包被聚苯乙烯微球，利用抗體Fc段的疏水作用與微球吸附，F(xiàn)ab段仍保持活性，包被前重懸微球，將微球加入包被緩沖液稀釋好的鼠抗人單抗中，室溫渦旋震蕩；(2)患者血樣采集與處理抽取患者靜脈血分離血小板，轉(zhuǎn)移至離心管，離心取沉淀，血小板裂解液裂解后離心，吸取上清液；(3)抗原的俘獲與上機檢測向裂解后上清液加入單抗包被過的微球，室溫震蕩孵育，加入藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗體，避光震蕩孵育離心，棄上清，流式細胞儀上進行檢測；(4)數(shù)據(jù)處理散點圖圈出檢測微球門，獲取微球，記錄直方圖中的檢測微球的平均熒光強度，對數(shù)據(jù)進行分析，設(shè)正常對照。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測血小板特異性抗體的流式微球方法，其特征在于用抗人血 小板膜糖蛋白單抗包被微球，將血小板裂解液與包被過的微球孵育，之后加入藻紅蛋白標(biāo)記 的羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗體,流式細胞儀分析，患者血小板表面存在自身抗體，形成"微 球-血小板膜糖蛋白單抗-血小板膜糖蛋白自身抗體-藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗體"復(fù)合物結(jié)構(gòu),表現(xiàn)為檢測微球的熒光強度增高。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種血小板基礎(chǔ)實驗研究上具有較高敏感性的用來檢測血小板特異性抗體的流式微球方法。它用抗人血小板膜糖蛋白單抗包被微球，將血小板裂解液與包被過的微球孵育，之后加入藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗體，流式細胞儀分析。若血小板表面存在自身抗體，則形成“微球-血小板膜糖蛋白單抗-血小板膜糖蛋白自身抗體-藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗體”復(fù)合物結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為檢測微球的熒光強度增高。本發(fā)明操作方便，技術(shù)成熟，檢測血小板自身抗體敏感性高，有助于血小板抗體的基礎(chǔ)實驗研究。
文檔編號G01N33/546GK101246173SQ20071011319
公開日2008年8月20日 申請日期2007年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月22日
發(fā)明者明 侯, 冀學(xué)斌, 劉新光, 張愛軍, 軍 彭, 艷 石, 平 秦 申請人:侯 明;冀學(xué)斌;彭 軍