一種特異性檢測金黃色葡萄球菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域，具體涉及一種食品中金黃色葡萄球菌的檢測方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 金黃色葡萄球菌是一種引起人類和動(dòng)物化膿感染的革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自 然界，如空氣、土壤、水及人和動(dòng)物的排泄物中。該菌對(duì)生長環(huán)境不嚴(yán)格，為條件致病菌，而 大多食品基質(zhì)如乳、肉、蛋、魚等制品為金葡菌生長提供了良好條件，在適合的溫度下，易產(chǎn) 生耐高溫的腸毒素而引起食品中毒，伴有嘔吐劇烈，失水及虛脫等癥狀。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界各 國中由金葡菌引發(fā)的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中排在前三位，占約25%，并造成巨大的 經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響人類食品安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。因而，建立快速有效吸附和檢測金黃色葡萄 球菌的方法變得尤為重要。
[0003] 目前已建立的金黃色葡萄球菌檢測方法主要包括Baird-Parker方法、酶聯(lián)免疫 吸附法（ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)等?，F(xiàn)場快速篩檢方法中則以ELISA方法應(yīng)用最 多，該方法是基于抗原-抗體親和反應(yīng)，以抗體作為識(shí)別分子。但是抗體易受到外界條件尤 其是溫度的影響，對(duì)保藏條件要求苛刻，在很大程度上限制了方法的靈活應(yīng)用。此外，抗體 制備需要經(jīng)過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，繁瑣費(fèi)事，制備的抗體成本高，發(fā)展的方法檢測成本也 相應(yīng)偏高。所以又必要發(fā)展一種快速方便，穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、使用成本低的新 型檢測方法。
[0004] 最近，ATP生物發(fā)光檢測細(xì)菌的方法已日漸成熟，其原理是基于每個(gè)生物體內(nèi)含有 恒量的ATP，ATP在螢火蟲熒光素和熒光素酶的催化下釋放光子產(chǎn)生熒光，發(fā)光強(qiáng)度與生物 體量呈正比，從而間接檢測出生物體的含量。盡管ATP生物發(fā)光法具有快速檢測的特點(diǎn)，但 是不能分辨菌株種類。因此，有必要建立一種基于ATP生物發(fā)光法快速檢測食品中金黃色 葡萄球菌單一致病菌的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種核酸適配體修飾磁性納米粒子捕捉、富集金黃色葡萄球 菌，并采用生物發(fā)光檢測的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：將對(duì)金黃色葡萄球菌具有特異 性識(shí)別功能的核酸適配體修飾在磁性納米粒子表面，該材料可以快速識(shí)別并結(jié)合溶液樣品 中的金黃色葡萄球菌；利用磁場將磁性納米顆粒結(jié)合的金黃色葡萄球菌分離；再將捕捉到 的金黃色葡萄球菌懸浮到一定體積的裂解液中，釋放并用提取出金黃色葡萄球的ATP ;由 于ATP量與菌液濃度呈正比，通過ATP生物發(fā)光法得到細(xì)菌濃度與發(fā)光強(qiáng)度的線性曲線，即 可檢測金黃色葡萄球菌。具體步驟為：
[0006] (I)Fe3O4磁性納米粒子制備
[0007] 以FeCl3 · 6H20作為單一鐵源，乙二醇為還原劑，醋酸鈉提供堿性的反應(yīng)環(huán)境，在 密閉的高溫高壓環(huán)境下，F(xiàn)e3+可被乙二醇部分還原為Fe 2+，鐵離子再被氧化成Fe(OH)3* Fe (OH) 3，再脫水形成Fe3O4，離心分離，超純水清洗即得到Fe3O 4磁性納米粒子。為使所制備 的Fe3O4磁性納米粒子更加穩(wěn)定，在其表面包覆一層二氧化娃：用Stober法在Fe 304納米粒 子表面包裹二氧化硅，即在乙醇和水的介質(zhì)中，通過正硅酸四乙酯在堿性條件下水解生成 Si (OH) 4，最后以SiO2形式包裹在磁納米表面；然后在反應(yīng)體系中加入APTES反應(yīng)24h，形成 氨基化Fe 3O4納米粒子。
[0008] (2)核酸適配體修飾的Fe3O4磁性納米粒子的制備
[0009] 取上述氨基化Fe3O4磁性納米粒子分散于PBS緩沖溶液中，再加入戊二醛溶液，室 溫下緩慢振蕩2h，用PBS洗3次，再將粒子分散于avidin (125 μ g/mL)溶液，緩慢振蕩12h， PBS洗3次并分散到PBS中，得到Avidin修飾的磁性納米顆粒。生物素標(biāo)記核酸適配體序 列為：Biotin-CCC CCC GCA ATG GTA CGG TAC TTC CTC GGC ACG TTC TCA GTA GCG CTC GCT GGT CAT CCC ACA GCT ACG TCA AAA GTG CAC GCT ACT TTG CTA A。將 Avidin 修飾的磁性 納米顆粒和生物素標(biāo)記核酸適配體緩慢振蕩12h后，利用永磁鐵磁性分離，由于生物素與 親和素之間的特異性相互作用，即得適配體修飾的Fe 3O4磁性納米粒子。
[0010] (3)適配體修飾的磁納米粒子對(duì)金黃色葡萄球菌的捕捉、分離與富集
[0011] 取ImL的液體樣品與2mL適配體修飾磁納米粒子進(jìn)行混合，振蕩孵育反應(yīng)lOmin， 磁性分離，棄去上清液中的樣品基質(zhì)，磁性分離得到的產(chǎn)物用Tris-HCl緩沖液洗三次，將 其再懸浮于100 μ L Tris-HCl緩沖液中，即得到濃縮10倍后的被適配體化磁納米捕獲的金 黃色葡萄球菌懸菌液。
[0012] (4)金黃色葡萄球菌體內(nèi)ATP的釋放及生物發(fā)光法測定
[0013] 采用 TCA，BAB，CTAB，DMSO 或 SDS (優(yōu)選 CTAB)的 3 % TCA 溶液作為 ATP 提取劑， 取20 μ L提取劑與100 μ L樣品進(jìn)行混合，輕微振蕩反應(yīng)2min，充分釋放細(xì)菌體內(nèi)的ATP 后，稀釋20倍。取50 μ L稀釋液與70 μ L濃度為50mg/mL的螢火蟲熒光素與熒光素酶溶液 進(jìn)行反應(yīng)，MPI-E化學(xué)發(fā)光檢測儀記錄ATP生物發(fā)光相對(duì)發(fā)光值（RLU)與細(xì)菌濃度的對(duì)數(shù) log (cfu/mL)建立的金黃色葡萄球菌檢測的線性關(guān)系定量。
[0014] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)是：
[0015] (1)核酸適配體對(duì)金黃色葡萄球菌具有特異性識(shí)別作用，且具有易合成、易修飾、 易固定、可反復(fù)使用和長期保存的優(yōu)點(diǎn)。
[0016] (2)利用磁性納米粒子完成對(duì)目標(biāo)菌的結(jié)合、分離、富集和濃縮，不但可以有效去 除樣品基質(zhì)和其它干擾菌，而且可以提高檢測的靈敏度
[0017] (3)采用優(yōu)化的ATP生物發(fā)光檢測法檢測金黃色葡萄球菌，可以大大縮短檢測時(shí) 間，已達(dá)到快速檢測的目的。
[0018] (4)可快速、簡單、靈敏、特異的檢測食品中的金黃色葡萄球菌，簡化樣品前處理， 縮短了檢測時(shí)間。
【附圖說明】：
[0019] 附圖1為：核酸適配體修飾的磁性納米粒子捕捉生物發(fā)光檢測金黃色葡萄球菌的 實(shí)驗(yàn)原理圖。附圖2為：Fe 3O4磁性納米粒子與氨基化的Fe 304磁性納米粒子的電鏡圖：(a) Fe3O4(WFe3O4-SiO2-NH 2。附圖3 :核酸適配體化的磁性納米材料捕獲濃縮10后的金黃色葡 萄球菌溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地描述：
[0021] (1)通過溶劑熱法合成Fe3O4磁性納米粒子，并對(duì)其表面進(jìn)行修飾。分析天平準(zhǔn)確 稱取0· 81g FeCl3 ·6Η20,2· 16g NaAC加入到30mL乙二醇中，50°C磁力攪拌，形成均一溶液。 與反應(yīng)釜中反應(yīng)200°C，6h。自然冷卻后，用水和乙醇交叉洗各3次，于50°C真空干燥12h， 得到Fe 3O4磁性納米粒子。
[0022] (2)利用改進(jìn)的Stober法對(duì)Fe3O4磁性納米粒子進(jìn)行表面氨基化修飾。取30mg上 述合成的Fe 3O4磁性納米粒子，加入100mL，0.1 M HC1，超聲分散5min。再水洗2次，乙醇洗 1次。分散到126. 6mL無水乙醇和30mL超純水中，機(jī)械攪拌（30轉(zhuǎn)/分鐘），加入I. 05mL 濃氨水，再超聲5min。又繼續(xù)機(jī)械攪拌，加入I. 08mL的TE0S，攪拌12h(時(shí)間越長，娃層越 厚）。乙醇洗5次，再分散到150mL無水乙醇中，再加入ImL的APTES，機(jī)械攪拌24h。乙醇 洗5次，真空干燥，得到Fe 3O4-SiO2-NH2。
[0023] (3)利用戊二醛法將氨基化的磁性納米粒子與親和素偶聯(lián)。