專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)一種序列特異性表位抗體的elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)檢測(cè)方法， 具體為檢測(cè)識(shí)別蛋白質(zhì)N末端、C末端以及中間位置Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys特 異性氨基酸序列抗體的ELISA方法。
背景技術(shù)：
由氨基酸序列 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)組成的序列表位 在很多文獻(xiàn)中被稱(chēng)為FLAG標(biāo)簽表位，它是人工設(shè)計(jì)的一種連續(xù)線(xiàn)性序列表位，被成功得 應(yīng)用于重組蛋白的識(shí)別和分離純化，而識(shí)別這一序列的標(biāo)簽抗體通常被稱(chēng)為FLAG標(biāo)簽抗 體，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種含F(xiàn)LAG標(biāo)簽序列的重組蛋白實(shí)驗(yàn)中。但是，由于重組蛋白中所含 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)序列的氨基酸位置分為三種蛋白質(zhì)的 N-末端、中間位置和C-末端，因此所產(chǎn)生的抗體也因此分為三種識(shí)別N-末端的抗體、識(shí) 別中間位置的抗體、識(shí)別C-末端的抗體。并且，目前市場(chǎng)上也存在著這三種不同的商業(yè)抗 體，這給應(yīng)用帶來(lái)了的麻煩。為了能夠有效鑒別三種不同識(shí)別位置的FLAG抗體，我們開(kāi)發(fā) 了檢測(cè)識(shí)別這三種位置的 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)標(biāo)簽抗體 ELISA 試劑盒，該試劑盒能夠有效鑒別以上三種不同識(shí)別位置的抗體，從而方便了后續(xù)的應(yīng)用。ELISA是一種成熟的免疫分析方法，具有特異、靈敏、經(jīng)濟(jì)和快速方便的優(yōu)點(diǎn)，在臨 床醫(yī)學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等諸多方面得到十分廣泛的應(yīng)用，因此，本試劑盒采用ELISA的方法來(lái) 檢測(cè)三種不同識(shí)別位置的抗體，是考慮了多方面的優(yōu)點(diǎn)。目前，國(guó)際上還沒(méi)有專(zhuān)門(mén)用于檢測(cè)Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)標(biāo)簽抗體的試劑盒，因此，該試劑盒的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，是填補(bǔ)了這方面的空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)程序簡(jiǎn)便的檢測(cè)樣本中識(shí)別 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)序列特異性表位的抗體濃度和該抗體所識(shí) 別的表位在蛋白質(zhì)上的位置(N末端、中間位置和C末端)的ELISA試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的首先我們用化學(xué)合成方法合成了用于檢測(cè) 的六種多肽(上海吉爾生化有限公司合成)。其中NA、CA和MA肽段是用來(lái)與酶標(biāo)板上預(yù)先包 被好的HBsAg蛋白特異性結(jié)合的，這三種多肽均含有Thr-Lys-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu 序列，這一序列是用噬菌體表面展示技術(shù)篩選出的能特異性結(jié)合HBsAg蛋白的肽段。NA肽 段在多肽的N末端含有Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位，CA肽段在多 肽的C末端含有Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位，MA肽段在多肽的中 間位置含有Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位。在ELISA檢測(cè)中，我們 使用了雙抗原(表位)夾心法來(lái)檢測(cè)識(shí)別這一不同位置表位的抗體。NA、CA和MA肽段分別是雙抗原夾心法中使用的一種抗原表位，另一對(duì)應(yīng)的抗原表位是NB、CB、MB肽段。也就是 說(shuō)，NA和NB肽段共同構(gòu)成雙抗原(表位)夾心來(lái)檢測(cè)識(shí)別N末端表位的抗體，CA和CB肽段 共同構(gòu)成雙抗原(表位)夾心來(lái)檢測(cè)識(shí)別C末端表位的抗體，MA和MB肽段共同構(gòu)成雙抗原 (表位)夾心來(lái)檢測(cè)識(shí)別中間位置表位的抗體。NB、CB和MB肽段是生物素標(biāo)記的三種肽段， NB肽段在多肽的N末端含有Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位，與NA肽 段相對(duì)應(yīng)，共同構(gòu)成兩個(gè)一致的N末端表位，使用雙抗原(表位)夾心來(lái)檢測(cè)識(shí)別N末端表位 的抗體。CB肽段在多肽的C末端含有Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表 位，與CA肽段相對(duì)應(yīng)，共同構(gòu)成兩個(gè)一致的C末端表位，使用雙抗原(表位)夾心來(lái)檢測(cè)識(shí)別 C末端表位的抗體。MB肽段在多肽的中間位置含有Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序 列特異性表位，與MA肽段相對(duì)應(yīng)，共同構(gòu)成兩個(gè)一致的中間位置表位，使用雙抗原(表位)夾 心來(lái)檢測(cè)識(shí)別中間位置表位的抗體。我們用商品化的HBsAg蛋白(上海科華生物有限公司)來(lái)預(yù)先包被酶標(biāo)板，用封 閉液封閉后，洗滌，干燥，制成預(yù)包被板。使用時(shí)，將待測(cè)樣品與NA、NB肽段同時(shí)加入孔中 來(lái)檢測(cè)識(shí)別N末端表位抗體、或?qū)⒋郎y(cè)樣品與CA、CB肽段同時(shí)加入孔中來(lái)檢測(cè)識(shí)別C末 端表位抗體、或?qū)⒋郎y(cè)樣品與MA、MB肽段同時(shí)加入孔中來(lái)檢測(cè)識(shí)別中間位置表位抗體， 經(jīng)過(guò)孵育洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和霉素，避光孵育、徹底洗滌后 再加入底物顯示，最后用硫酸終止反應(yīng)并在450nm處檢測(cè)吸光度值。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度 和相應(yīng)的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，待測(cè)樣品中的抗體濃度就可以通過(guò)它的吸光值并對(duì)應(yīng)標(biāo) 準(zhǔn)曲線(xiàn)得到；根據(jù)第一步加入NA、CA或MA肽段所代表的孔，就能確定該抗體所識(shí)別的 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位在蛋白質(zhì)中所處的位置N末端、C末 端或中間位置。本發(fā)明檢測(cè)識(shí)別Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)序列特異性表 位抗體的ELISA試劑盒，其包括以下組成
(1)包被緩沖液為磷酸鹽緩沖液(PBS)，其成分為140mMNaCl，2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4, pH 值為 7. 4 ；
(2)洗滌液為含0. 05%Tween-20 的 PBS，其成分為 PBS，0. 05%Tween_20 ；
(3)封閉液為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA；
(4)加樣緩沖液的成分為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA；
(5)反應(yīng)終止液成分為2MH2SO4 ；
(6)已經(jīng)包被好HBsAg抗原的酶標(biāo)板；
(7)與HBsAg抗原特異性結(jié)合的三種肽段，濃度為4μ g/ml
a.檢測(cè)識(shí)別N末端Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位抗體的肽 段一NA肽段序列
Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-S er-Thr-LyS-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu ；
b.檢測(cè)識(shí)別C末端Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位抗體的肽 段一CA肽段序列
Thr-Lys-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-A sp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ；c.檢測(cè)中間位置Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位抗體的肽段一 MA 肽段序列Thr-Lys-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ；
(8)生物素標(biāo)記的三種肽段，濃度為4μ g/ml 檢測(cè)N末端表位抗體的NB肽段(序列B iotin-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)、檢測(cè) C 末端表位 抗體的 CB 肽段(序列=Biotin-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp -Asp-Lys)、檢測(cè)中間位置表位抗體的MB肽段
(序列:Biotin-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)；
(9)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和霉素，濃度200μ g/ml ；
(10)底物TMB ；
(11)標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為100μ g/ μ 1。本發(fā)明檢測(cè)識(shí)別Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)序列特異性表 位抗體的ELISA試劑盒的使用步驟如下
(1)在已經(jīng)包被有HBsAg抗原的酶標(biāo)板中，加入4μ g/ml的ΝΑ、CA或MA肽段，以100 μ 1/ 孔加入酶標(biāo)板，4°C孵育12小時(shí)；
(2)棄去包被液體，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗滌三次，加入封閉液PBS_1%BSA 200μ 1/孔，37°C孵育 Ih ；
(3)棄去封閉液，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗滌一次，加入待測(cè)樣品或倍比稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)品50 μ 1/孔，同時(shí)加入4 μ g/ml的NB、CB、MB肽段50 μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(4)用PBS-1%BSA按照1:1000比例稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和霉素儲(chǔ) 存液，終濃度為200yg/L;
(5)棄去樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗滌三次，加入稀釋好的辣根 過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和霉素50 μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(6)棄去辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和霉素，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗 滌三次，加入底物TMB 50 μ 1/孔，37°C避光孵育Ih ；
(7)加入2MH2SO4終止液50 μ 1/孔;
(8)讀板酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值；
(9)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖軟件根據(jù)測(cè)定的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
(10)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和未知濃度樣品的OD值計(jì)算待測(cè)樣品中的抗體濃 度；根據(jù)第一步加入NA、CA或MA肽段所代表的孔，來(lái)確定該抗體所識(shí)別的 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位在蛋白質(zhì)中所處的位置N末端、C末 端或中間位置。本試劑盒采用的是ELISA方法中檢測(cè)抗體比較常用的雙抗原夾心法，并對(duì)它進(jìn) 行了改進(jìn)。傳統(tǒng)的雙抗原夾心法僅僅檢測(cè)針對(duì)某個(gè)蛋白質(zhì)抗原的抗體，而不針對(duì)該蛋白 質(zhì)抗原上的某個(gè)特定的氨基酸序列表位的識(shí)別抗體，而本發(fā)明將雙抗原夾心法進(jìn)一步 深化到雙表位夾心法，以此來(lái)檢測(cè)識(shí)別特定的氨基酸序列表位的抗體。在本發(fā)明中對(duì) Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)序列特異性表位抗體進(jìn)行檢測(cè)。特別重要 的是，本發(fā)明還能檢測(cè)針對(duì)特定位置表位的抗體，如N末端表位抗體、C末端表位抗體或中
6盒的一個(gè)最顯著特色和創(chuàng)新。本發(fā)明還具有良好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性，操作時(shí)間短，成本低。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中的一些術(shù)語(yǔ)與縮寫(xiě)B(tài)SA 牛血清白蛋白；Tween-20 吐溫20 ;TMB 四甲 基聯(lián)苯胺；HBsAg 人乙型肝炎表面抗原；OD 吸光度。試劑配方
1.緩沖液
包被緩沖液為磷酸鹽緩沖液(PBS)，其成分為140mM NaCl,2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 1. 8mM KH2PO4, pH 值為 7· 4 ；
洗滌液為含 0. 05%Tween-20 的 PBS，其成分為 PBS，0. 05%Tween_20 ； 封閉液為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA ； 加樣緩沖液為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA ； 反應(yīng)終止液為2M H2SO4
2.蛋白抗原
商品化的HBsAg (上?？迫A生物有限公司)
3.多肽表位抗原
本發(fā)明中的多肽均由上海吉爾生化有限公司合成。A.與HBsAg抗原特異性結(jié)合的三種肽段，濃度為4 μ g/ml
a.檢測(cè)識(shí)別N末端Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位抗體的肽 段一NA肽段序列
三字母縮寫(xiě)序列
Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-S er-Thr-LyS-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu ； 單字母縮寫(xiě)序列 DYKDDDDKSGGGGSGGGGSTKTFTVTE ；
b.檢測(cè)識(shí)別C末端Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位抗體的肽 段一CA肽段序列
三字母縮寫(xiě)序列
Thr-Lys-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-A sp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ； 單字母縮寫(xiě)序列 TKTFTVTEGGGGSGGGGSDYKDDDDK ；
c.檢測(cè)中間位置Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位抗體的肽段一 MA肽段序列
三字母縮寫(xiě)序列
Thr-Lys-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-A sp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ；
7單字母縮寫(xiě)序列
TKTFTVTEGGGGSDYKDDDDKSGGGGS ；
B.生物素標(biāo)記的三種肽段，濃度為4 μ g/ml
a.生物素標(biāo)記的檢測(cè)N末端表位抗體的肽段一NB肽段序列 三字母縮寫(xiě)序列
Biotin-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ； 單字母縮寫(xiě)序列 Biotin-DYKDDDDKSGGGGS ；
b.生物素標(biāo)記的檢測(cè)C末端表位抗體的肽段一CB肽段序列
三字母縮寫(xiě)序列
Biotin-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ； 單字母縮寫(xiě)序列 Biotin-ASGGGGSDYKDDDDK ；
c.生物素標(biāo)記的檢測(cè)中間位置表位抗體的肽段一MB肽段序列
三字母縮寫(xiě)序列
Biotin-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gl y-Gly-Gly-Gly-Ser ； 單字母縮寫(xiě)序列 Biotin-ASGGGGSDYKDDDDKSGGGGS ； 4.酶標(biāo)板 Nunc八聯(lián)孔酶標(biāo)條
本發(fā)明檢測(cè)識(shí)別Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)序列特異性表位抗 體的ELISA試劑盒的使用步驟如下
(1)在已經(jīng)包被有HBsAg抗原的酶標(biāo)板中，分別加入4μ g/ml的ΝΑ、CA或MA肽段，以 100 μ 1/孔加入酶標(biāo)板，4°C孵育12小時(shí)；
(2)棄去包被液體，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗滌三次，加入封閉液PBS_1%BSA 200μ 1/孔，37°C孵育 Ih ；
(3)棄去封閉液，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗滌一次，加入待測(cè)樣品或倍比稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)品50 μ 1/孔，同時(shí)對(duì)應(yīng)加入4 μ g/ml的NB、CB、MB肽段50 μ 1/孔(已加入NA肽段的 孔中加入NB肽段、已加入CA肽段的孔中加入CB肽段、或已加入MA肽段的孔中加入MB肽 段)，37 °C孵育lh；
(4)用PBS-1%BSA按照1:1000比例稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和霉素儲(chǔ) 存液，終濃度為200yg/L;
(5)棄去樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗滌三次，加入稀釋好的辣根 過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和霉素50 μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(6)棄去辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和霉素，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗 滌三次，加入底物TMB 50 μ 1/孔，37°C避光孵育Ih ；
(7)加入2MH2SO4終止液50 μ 1/孔;
(8)讀板酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值；(9)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖軟件根據(jù)測(cè)定的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
(10)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和未知濃度樣品的OD值計(jì)算待測(cè)樣品中的抗體濃 度；根據(jù)第一步加入NA、CA或MA肽段所代表的孔，來(lái)確定該抗體所識(shí)別的 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位在蛋白質(zhì)中所處的位置N末端、C末 端或中間位置。
權(quán)利要求
檢測(cè)一種序列特異性表位抗體的ELISA試劑盒，其特征包括以下組成(1)包被緩沖液為磷酸鹽緩沖液(PBS)，其成分為140mM NaCl，2.7mM KCl， 10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH值為7.4；(2)洗滌液為含0.05%Tween 20的PBS，其成分為PBS，0.05%Tween 20；(3)封閉液為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA；(4)加樣緩沖液的成分為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA；(5)反應(yīng)終止液成分為2M H2SO4；(6)已經(jīng)包被好HBsAg抗原的酶標(biāo)板；(7)與HBsAg抗原特異性結(jié)合的三種肽段，濃度為4μg/mla. 檢測(cè)識(shí)別N末端Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys序列特異性表位抗體的肽段—NA肽段序列Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu；b. 檢測(cè)識(shí)別C末端Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys序列特異性表位抗體的肽段—CA肽段序列Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys；c. 檢測(cè)中間位置Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys序列特異性表位抗體的肽段—MA肽段序列Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Gly Gly Gly Gly Ser Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser；(8)生物素標(biāo)記的三種肽段，濃度為4μg/ml檢測(cè)N末端表位抗體的NB肽段(序列Biotin Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser)、檢測(cè)C末端表位抗體的CB肽段(序列Biotin Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys)、檢測(cè)中間位置表位抗體的MB肽段；(序列Biotin Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser)；(9)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和霉素，濃度200μg/ml；(10)底物TMB；(11)標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為100μg/μl。
2.檢測(cè)一種序列特異性表位抗體的ELISA試劑盒，其使用方法包括以下步驟(1)在已經(jīng)包被有HBsAg抗原的酶標(biāo)板中，加入4μ g/ml的ΝΑ、CA或MA肽段，以100 μ 1/ 孔加入酶標(biāo)板，4°C孵育12小時(shí)；(2)棄去包被液體，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗滌三次，加入封閉液PBS_1%BSA 200μ 1/孔，37°C孵育 Ih ；(3)棄去封閉液，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗滌一次，加入待測(cè)樣品或倍比稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)品50 μ 1/孔，同時(shí)加入4 μ g/ml的NB、CB、MB肽段50 μ 1/孔(已加入NA肽段的孔中 加入NB肽段、已加入CA肽段的孔中加入CB肽段、或已加入MA肽段的孔中加入MB肽段)， 37 °C 孵育 Ih ；(4)用PBS-1%BSA按照1:1000比例稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和霉素儲(chǔ) 存液，終濃度為200yg/L;(5)棄去樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗滌三次，加入稀釋好的辣根 過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和霉素50 μ 1/孔，37°C孵育Ih ；(6)棄去辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和霉素，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗 滌三次，加入底物TMB 50 μ 1/孔，37°C避光孵育Ih ；(7)加入2MH2SO4終止液50 μ 1/孔;(8)讀板酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值；(9)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖軟件根據(jù)測(cè)定的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；(10)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和未知濃度樣品的OD值計(jì)算待測(cè)樣品中的抗體濃 度；根據(jù)第一步加入NA、CA或MA肽段所代表的孔，來(lái)確定該抗體所識(shí)別的 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特異性表位在蛋白質(zhì)中所處的位置N末端、C末 端或中間位置。
全文摘要
該試劑盒包括已包被有HBsAg抗原的酶標(biāo)板；與HBsAg抗原特異性結(jié)合的三種肽段(該肽段分別包含有處于N末端的DYKDDDDK序列、C末端的DYKDDDDK序列和中間位置的DYKDDDDK序列)；生物素標(biāo)記的三種肽段；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈親和霉素；底物TMB。其使用包括該試劑盒采用雙抗原夾心法原理來(lái)檢測(cè)三種不同的抗DYKDDDDK序列特異性表位抗體。在已經(jīng)包被有HBsAg抗原的酶標(biāo)板中加入與HBsAg抗原特異性結(jié)合的一種肽段，封閉后加入待檢樣品、生物素標(biāo)記的同種相應(yīng)肽段共孵育；經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加入底物TMB溶液反應(yīng)顯色，最后用硫酸終止反應(yīng)并在450nm處檢測(cè)吸光度值。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度和相應(yīng)的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，待檢樣品中的抗DYKDDDDK序列特異性表位抗體濃度就可以通過(guò)它的吸光值并對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到，并可得出該抗體所識(shí)別的序列位置。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101900736SQ201010172689
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月15日
發(fā)明者倪潤(rùn)洲, 李小彥, 李左宜 申請(qǐng)人:李小彥;倪潤(rùn)洲;李左宜