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      一類不對(duì)稱菁類熒光染料的制作方法

      文檔序號(hào):6129971閱讀:360來源:國(guó)知局
      專利名稱:一類不對(duì)稱菁類熒光染料的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及適合用于核酸染色的染料,更具體地說涉及不對(duì)稱 菁類熒光染料。
      背景技術(shù)
      熒光檢測(cè)技術(shù)在DNA雜交測(cè)試、基因重組測(cè)試、免疫檢測(cè)、血 細(xì)胞分析和紳瘤細(xì)胞早期診斷等方面的廣泛應(yīng)用極大地促進(jìn)了熒光 染料的發(fā)展。最早應(yīng)用于生物分析的熒光染料為吖啶、菲啶類染料, 如吖啶橙、溴乙錠等,它們通過嵌入或靜電吸引與DNA小分子結(jié)合, 結(jié)合后熒光大大增強(qiáng)。但未結(jié)合染料的自身熒光會(huì)造成高的熒光背 景,從而干擾檢測(cè)。同時(shí)溴乙4定等有很大的毒性和致癌性,因此它 們已逐漸被其它熒光染料代替。
      目前,使用比較多的有羅丹明、熒光素類、BODIPY類和菁類 熒光染料。菁類熒光染料首先由Williams發(fā)現(xiàn),至今已有150年的 歷史,如今作為生物熒光檢測(cè)探針、CD和VCD記錄材料、感光材 料光敏劑、光電轉(zhuǎn)換材料等已被廣泛的應(yīng)用,其中作為生物分子的 熒光探針用于檢測(cè)核酸、蛋白質(zhì)等尤其成為關(guān)注的焦點(diǎn)。
      菁染料曱川鏈兩端的含氮芳香母核有很多種類,包括噻唑、噻 吩、2-喹啉、4-喹啉和3H-吲哚啉等。按其相同與否可分為對(duì)稱和不 對(duì)稱兩類。其中,不對(duì)稱菁染^f主要應(yīng)用于物理結(jié)合熒光標(biāo)示,與 核酸的結(jié)合方式包括靜電吸引、堿基對(duì)嵌入及溝槽結(jié)合。具體的結(jié) 合方式取決于染料的結(jié)構(gòu)及染料與核酸濃度的比例。不對(duì)稱菁染料 中最典型的一類為TOTO及其類似物和衍生物類。TOTO (p塞唑橙二 聚體)、YOYO (惡唑黃二聚體)是由Glazer研究組開發(fā)的一類對(duì)核酸具有高度親和力的多正電荷不對(duì)稱菁類熒光染料,通過改變多亞曱 基鏈兩端的染料分子可以得到不同的異二聚體類似物和衍生物。這 類染料在溶液中無(wú)熒光,與核酸結(jié)合后焚光增強(qiáng),因此降低了檢測(cè)
      過程中的熒光背景干擾。Jason等用溶液粘度測(cè)定法和原子力顯微鏡 解釋了 TOTO和YOYO與DNA的雙嵌入作用[丄A. Bordelon, K.J. Feierabend, S.A. Siddiqui, L丄.Wright. J. Phys. Chem. B, 2002, 106, 4838-3843]。 Ftirstenberg等利用超快速熒光轉(zhuǎn)換和時(shí)間相關(guān)單光子計(jì) 數(shù)法進(jìn) 一 步闡述了熒光增強(qiáng)的動(dòng)力學(xué)機(jī)理[A. Ftirstenberg, M.D. Julliard, T.G. Deligeorgiec, N.I, Gadjev. J. AM. CHEM. SOC., 2006, 128, 7661-7669]。但是此類染料的光i普在可見光區(qū)(490-530 nm),而生物
      樣品在這個(gè)區(qū)域有很強(qiáng)的吸收和熒光發(fā)射,這會(huì)造成熒光檢測(cè)效率 大大降低。盡管通過增加共軛鏈數(shù)可以使染料的吸收和發(fā)射波長(zhǎng)產(chǎn) 生紅移達(dá)到近紅外區(qū)(WO-IOOO nm),如TOTAB、 TOTIN、 TO-PRO-3、 PO-PRO-2和BO-PRO-2等[K.M. Sovenyhazy,丄A. Bordelon, J.T. Petty. Nucleic Acids Res, 2003, 31, 2561],但這類染料一般分子較大,結(jié)構(gòu) 復(fù)雜,合成步驟多,因而使其商品化受到了限制。
      此外,隨著曱川鏈的增長(zhǎng),菁染料的光穩(wěn)定性逐漸下降,因此 需要進(jìn)一步提高長(zhǎng)波長(zhǎng)菁染料的光穩(wěn)定性。
      美國(guó)專利6004816描述了一種用于分類和計(jì)數(shù)白細(xì)胞的試劑, 其中包含的熒光染料特異性結(jié)合RNA而增加其熒光強(qiáng)度。但是這種 焚光染料的光穩(wěn)定性仍然不足,容易造成實(shí)驗(yàn)誤差。
      美國(guó)專利公開2003/0145394公開了 一種氦-氖激光器可激發(fā)的熒 光染料,其用于檢測(cè)和計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞。這種熒光染料需要昂貴的 氦-氖激光器,實(shí)際應(yīng)用的設(shè)備成本較高。
      因此,需要開發(fā)新的熒光染料,該熒光染料優(yōu)選具有以下性質(zhì) 在不存在核酸時(shí)不發(fā)熒光,而在存在核酸時(shí)具有良好的熒光量子產(chǎn) 率;具有一定水平的水溶性,同時(shí)具有一定的穿過細(xì)胞膜的能力; 光譜范圍與生物樣品的光譜范圍有較大差異。

      發(fā)明內(nèi)容
      在一個(gè)方面,本發(fā)明結(jié)合現(xiàn)有的各類菁染料的優(yōu)點(diǎn),在其基礎(chǔ)
      上改進(jìn),提供了一類不對(duì)稱菁類熒光染料,其具有下列結(jié)構(gòu)通式I:
      其中
      n為1 、 2或3;
      X為C(CH3)2、 O、 S或Se;
      R,和R2各自獨(dú)立選自H、 C^烷基、-(:1.6烷基-0115或卣素; Rs為H、 Cw烷基、OR5、 -&.6烷基-0115、 COOR5、 N02、 CN 或卣素;
      &為Cw烷基、-CVJ^l-OR"芐基或鹵素,所述芐基由選自 以下的取代基任選取代卣素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、 芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧 基;
      Rs為H或C,.,8烷基; Y為負(fù)離子。
      優(yōu)選n為l或2,更優(yōu)選n為l。
      優(yōu)選X為C (CH3)2、 O或S;更優(yōu)選X為C (CH。2或S;最優(yōu) 選X為S。
      優(yōu)選1^和R2各自獨(dú)立選自H、 C,.)8烷基或卣素;更優(yōu)選R,和 R2各自獨(dú)立選自H或Cws烷基;再更優(yōu)選R,和R2各自獨(dú)立選自H 或Cl12烷基;再更優(yōu)選&和R2各自獨(dú)立選自H或CV6烷基;最優(yōu) 選R,和R2均為H。優(yōu)選R3為H、 Cw8烷基、OR5、 COORs或面素;更優(yōu)選R3為H、 <^.12烷基、OR5、 COORs或鹵素;最優(yōu)選R3為H、 C^烷基、OR5、 COORs或囟素。
      優(yōu)選R4為Cl18烷基、千基或卣素,所迷千基由選自以下的取代 基任選取代鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧 基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基;更優(yōu)選114 為C^8烷基或者芐基,所述芐基由鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基 或氨基任選取代;更優(yōu)選R4為Cw2烷基或者千基,所述千基由面素、 羥基、巰基、氰基、硝基或氨基任選取代;更優(yōu)選R4為Cl12烷基或 者千基,所述千基由卣素、羥基、巰基、氰基、硝基或氨基任選取 代;最優(yōu)選R4為Cw烷基或千基,所述千基由面素、羥基、巰基、 氰基、硝基或氨基任選取代。
      優(yōu)選115為H或Cw烷基,更優(yōu)選Rs為H或C^烷基。 優(yōu)選Y-為鹵素離子、C104-、 PF6—、 CF3S03-、 BF4-、乙酸根或?qū)?甲苯磺酸負(fù)離子。
      在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明還提供上述式I化合物的綴合物。 在另一個(gè)方面,本發(fā)明還4是供合成上述式I化合物或其綴合物 的方法。
      在另一個(gè)方面,本發(fā)明還4是供包含上述式I化合物或其綴合物 的組合物,所述組合物用于生物樣品的染色。
      在另一個(gè)方面,本發(fā)明還4是供使用上述式I化合物或其綴合物 或包含式I化合物的組合物以染色生物樣品的方法。
      本發(fā)明的這些特征和優(yōu)點(diǎn)以及其他特征和優(yōu)點(diǎn)在參考以下附圖 和本發(fā)明的具體實(shí)施方式
      之后將變得顯而易見。


      圖1是化合物A、 B和已知化合物M在乙醇中的光穩(wěn)定性對(duì)比。 橫坐標(biāo)為時(shí)間(小時(shí)),縱坐標(biāo)為吸光度值保留百分?jǐn)?shù)。所用光源為500W碘鴒燈;所用儀器為紫外可見分光光度計(jì),型號(hào)Lambda35。 圖2是化合物A、 B和已知化合物M在DMSO中的光穩(wěn)定性對(duì) 比。橫坐標(biāo)為時(shí)間(小時(shí)),縱坐標(biāo)為吸光度值保留百分?jǐn)?shù)。所用光 源為500W碘鴒燈;所用儀器為紫外可見分光光度計(jì),型號(hào)Lambda 35。
      圖3是化合物A和已知化合物M在乙醇溶液中的吸收光譜和發(fā) 射光語(yǔ)。橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(nm),縱坐標(biāo)為吸光度和熒光強(qiáng)度的歸一化 數(shù)值。所用儀器為紫外可見分光光度計(jì),型號(hào)Lambda 35;熒光分 光光度計(jì),型號(hào)LS55。
      —圖4是化合物B和已知化合物M在乙醇溶液中的吸收光譜和發(fā) 射光語(yǔ)。橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(nm),縱坐標(biāo)為吸光度和熒光強(qiáng)度的歸一化 數(shù)值。所用儀器為紫外可見分光光度計(jì),型號(hào)Lambda 35;熒光分 光光度計(jì),型號(hào)LS55。
      圖5是化合物A在含不同濃度pET-32a (+)質(zhì)粒DNA的水溶液 中的焚光發(fā)射光i普。橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(nm),縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度?;?物A的濃度為3.3 nM。箭頭表示DNA的濃度(ng/mL)變化從小到大 依次為0、 6.67、 13.33、 20、 26.67。所用儀器為熒光分光光度計(jì), 型號(hào)LS55。
      具體實(shí)施例方式
      除另有說明外,本文中使用的術(shù)語(yǔ)具有以下含義。 本文中使用的術(shù)語(yǔ)"烷基"包括直鏈烷基和支鏈烷基。如提及 單個(gè)烷基如"丙基",則只特指直鏈烷基,如提及單個(gè)支鏈烷基如
      "異丙基",則只特指支鏈烷基。例如,"&.6烷基"包括C"烷基、
      Cw烷基、曱基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。類似的規(guī)則也適
      用于本說明書中使用的其它基團(tuán)。
      本文中使用的術(shù)語(yǔ)"卣素"包括氟、氯、渙和碘。
      本文中使用的術(shù)語(yǔ)"千基,,是指-CIVPh基團(tuán)。當(dāng)用"任選取代"修飾卡基時(shí),指該千基可以未取代的形式存在,或者可被合適的取 代基在任何合適的位置取代。合適的取代基包括但不限于卣素、輕 基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、 氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基等,只要最終形成的化合物具有本 發(fā)明期望的性質(zhì)。優(yōu)選千基由卣素、羥基、巰基、氰基、硝基或氨 基任選取代。
      本文中使用Y表示負(fù)離子,其可為任何合適的負(fù)離子,包括但 不限于無(wú)機(jī)負(fù)離子或有機(jī)負(fù)離子,例如卣素離子、CIO" PF6-、 CF3S03-、 BF4-、乙酸根或?qū)醣交撬岣?fù)離子。
      本發(fā)明的化合物及其綴合物
      在一個(gè)方面,本發(fā)明提供了具有下列結(jié)構(gòu)通式I的不對(duì)稱菁類 熒光染料
      其中
      n為1、 2或3;
      X為C (CH3)2、 O、 S或Se;
      R,和R2各自獨(dú)立選自H、 C!-,8烷基、-。1.6烷基-0115或卣素; 113為H、 &.18烷基、OR5、 -(^.6烷基-0115、 COOR5、 N02、 CN 或卣素;
      R4為CV,8烷基、-&_6烷基-0115、芐基或鹵素,所述芐基由選自 以下的取代基任選取代卣素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、 芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基;
      Rs為H或Cw8烷基; Y-為負(fù)離子。
      優(yōu)選n為1或2,更優(yōu)選n為1 。
      優(yōu)選X為C (CH3)2、 O或S;更優(yōu)選X為C (CH3)2或S;最優(yōu) 選X為S。
      優(yōu)選R!和R2各自獨(dú)立選自H、 (^.18烷基或卣素;更優(yōu)選R,和 R2各自獨(dú)立選自H或烷基;更優(yōu)選R,和R2各自獨(dú)立選自H或
      烷基;更優(yōu)選R,和R2各自獨(dú)立選自H或Cw烷基;最優(yōu)選& 和Rs均為H。
      優(yōu)選R3為H、 &.18烷基、OR5、 COORs或卣素;更優(yōu)選R3為H、 C^2烷基、OR5、 COORs或卣素;最優(yōu)選R3為H、 (^.6烷基、OR5、 COORs或卣素。
      優(yōu)選R4為烷基、千基或囟素,所述卡基由選自以下的取代 基任選取代卣素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧 基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基;更優(yōu)選114 為Cw8烷基或者芐基,所述芐基由面素、羥基、巰基、氰基、硝基 或氨基任選取代;更優(yōu)選IV為Cw2烷基或者千基,所述卡基由囟素、 羥基、巰基、氰基、硝基或氨基任選取代;更優(yōu)選R4為CV12烷基或 者千基,所述千基由卣素、羥基、巰基、氰基、硝基或氨基任選取 代;最優(yōu)選114為C^烷基或千基,所述千基由卣素、羥基、巰基、 氰基、硝基或氨基任選取代。
      優(yōu)選R5為H或Cl12烷基,更優(yōu)選R5為H或C,.6烷基。
      優(yōu)選Y-為囟素離子、C1CV、 PF6'、 CF3S(V、 BF4-、乙酸根或?qū)?曱苯磺酸根負(fù)離子。
      本發(fā)明化合物可作為本文中所述的鹽形式直接用于生物樣品的 染色。或者,在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明化合物可作為式I化合物的 衍生物的形式使用,所述衍生物包括但不限于綴合物。
      典型地,綴合物在熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)中使用。本文中 使用的"綴合物"是指本發(fā)明熒光染料通過共價(jià)鍵與其它分子連接 而形成的化合物??膳c本發(fā)明熒光染料綴合的分子可為與細(xì)胞或細(xì) 胞成分特異性結(jié)合的分子,包括但不限于抗體、抗原、受體、配體、 酶、底物、輔酶等。通常,測(cè)試樣品與熒光綴合物溫育一段時(shí)間, 使得該熒光綴合物與測(cè)試樣品中的某些細(xì)胞或細(xì)胞成分特異性結(jié)
      色步驟可依次進(jìn)行多次,或用多種綴合物同時(shí)進(jìn)行多種染色。染色 完成后,樣品在熒光激活細(xì)胞分選儀中進(jìn)行分析,其中激發(fā)光源激 發(fā)綴合物中的本發(fā)明熒光染料,而測(cè)定裝置測(cè)定由激發(fā)的熒光染料 產(chǎn)生的發(fā)射光。
      或者,在另一個(gè)實(shí)施方案中,該熒光綴合物還可用于固相免疫 測(cè)試,例如夾心型免疫測(cè)試。固相免疫測(cè)試的技術(shù)是本領(lǐng)域7>知的, 可由標(biāo)準(zhǔn)教科書獲得。本發(fā)明的熒光綴合物可用作固相免疫測(cè)試中 的各種合適成分。
      化合物的合成
      在另一個(gè)方面,本發(fā)明還4是供合成上述式I化合物的方法。 該不對(duì)稱菁類熒光染料的合成一般通過以下流程進(jìn)行首先由 未取代或取代的2-曱基苯并噻唑、2-曱基苯并嚼唑或2,3,3-三曱基-3H-吲哚啉等原料開始,使其與取代或未取代的千基面化物反應(yīng),兩者 的摩爾比為1: 1-2,在曱苯中回流12-36小時(shí),可制得季銨鹽中間體 II:II
      其中X、 Rn 113和Y-如式I化合物中所述定義; 然后,將制得的季銨鹽中間體II與連接分子縮合,可得到式III 化合物
      其中X、 n、 Rp 113和Y-如式I化合物中所述定義,連接分子可 為N,N,-二苯基曱脒或其高級(jí)同系物;
      通過與制備式II化合物類似的方法得到取代或未取代的4-曱基 喹啉季銨鹽中間體,最后將其與式III化合物在吡啶或醋酐的作用下 回流,即可得到本發(fā)明的不對(duì)稱菁類熒光染料。所得熒光染料可通 過本領(lǐng)域公知的分離和純化技術(shù)回收,以達(dá)到需要的純度d
      本發(fā)明中使用的各種原料均可市售獲得,或者可通過本領(lǐng)域技 術(shù)人員公知的方法或現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法由本領(lǐng)域公知的原料簡(jiǎn) 單地制備得到。
      應(yīng)認(rèn)識(shí)到,本發(fā)明化合物中的各種環(huán)取代基有 一 些可在上述步 驟進(jìn)行之前或剛完成后,通過標(biāo)準(zhǔn)的芳族取代反應(yīng)來引入或通過常 規(guī)的官能團(tuán)修飾來產(chǎn)生,這包括在本發(fā)明的方法步驟方面。這種反 應(yīng)和修飾包括例如取代基通過芳族取代反應(yīng)的引入、取代基的還原、 取代基的烷基化和取代基的氧化。用于這些過程的試劑和反應(yīng)條件 是化學(xué)領(lǐng)域公知的。芳族取代反應(yīng)的具體實(shí)例包括用濃硝酸引入硝 基,用例如酰囟和路易斯酸(如三氯化鋁)在Friedel Crafts條件下引 入酰基,用烷基卣和路易斯酸(如三氯化鋁)在Friedel Crafts條件下 引入烷基,和引入鹵素基團(tuán)。修飾的具體實(shí)例包括通過例如用鎳催化劑進(jìn)行催化氫化或者用鐵在鹽酸存在下進(jìn)行加熱處理,將硝基還
      原成氨基;將烷硫基氧化成烷基亞磺?;蛲榛酋;?。
      包含式I化合物的本發(fā)明熒光綴合物可通過任何本領(lǐng)域已知的常 規(guī)方法合成。
      組合物
      在再另一個(gè)方面,本發(fā)明還提供包含上述式I化合物或其綴合 物的組合物,所述組合物用于生物樣品的染色。
      本發(fā)明的組合物除包含式I化合物或其綴合物外,還可包含生
      物樣品染色所需要的其它組分,例如溶劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)
      劑、表面活性劑等。本發(fā)明的組合物可作為水溶液形式存在,或者 可作為臨用前用水配制為溶液的其它合適形式存在。
      使用
      在再另一個(gè)方面,本發(fā)明還提供使用上述式I化合物或包含式I 化合物的組合物以染色生物樣品的方法,該方法包括使上述式I化合 物或其綴合物或包含式I化合物的組合物與生物樣品接觸的步驟。本 文中使用的術(shù)語(yǔ)"接觸"可包括在溶液或固相中接觸。
      特點(diǎn)
      由以上描述以及本領(lǐng)域技術(shù)人員^^知的常識(shí),可了解本發(fā)明焚
      光染料的各種優(yōu)點(diǎn),包括但不限于以下
      (1) 本發(fā)明的熒光染料化合物分子中引入了空間位阻大的千 基,提高了染料的光穩(wěn)定性,減小了因甲川鏈增長(zhǎng)而導(dǎo)致的染料光 穩(wěn)定性下降的問題;
      (2) 本發(fā)明的熒光染料化合物在一端引入了喹啉環(huán),與曱川鏈 相同的對(duì)稱苯并噻唑和吲哚啉類菁染料相比,最大吸收波長(zhǎng)可增加 約80nm,發(fā)射波長(zhǎng)范圍寬,可達(dá)650 nm-900 nm的近紅外區(qū),可避 免生物自身的熒光背景干擾,同時(shí)其染料摩爾消光系數(shù)大,靈敏度高,可應(yīng)用于核酸標(biāo)記、免疫4企測(cè)、血細(xì)胞分析等各生物分析領(lǐng)域;
      (3) 本發(fā)明的熒光染料化合物沒有過長(zhǎng)的甲川鏈,因此結(jié)構(gòu)簡(jiǎn) 單,原料易得,毒副性小,成本低廉,易產(chǎn)業(yè)化;
      (4) 本發(fā)明的熒光染料化合物可應(yīng)用廉價(jià)、體積小、性能穩(wěn)定 的紅色半導(dǎo)體激光器作為光源,大大降低配套的儀器成本。
      為了說明本發(fā)明的化合物對(duì)染料性能的優(yōu)化改進(jìn),在實(shí)施例6, 7中以已知化合物M作為參照。M結(jié)構(gòu)如下
      M可通過以下合成路徑來合成,也可參見Journal of the American Chemical Socitey (1945) 67, 18889-93。<formula>complex formula see original document page 17</formula>
      實(shí)施例1
      中間體l-芐基-2-曱基苯并噻唑季銨鹽的合成
      將20 mmol 2-曱基苯并瘞唑和22 mmol溴化卡加入到50 ml含20 ml曱苯的圓底燒瓶中,氬氣保護(hù)。反應(yīng)加熱回流持續(xù)反應(yīng)24小時(shí)后 停止?;旌衔锢鋮s后過濾沉淀并用乙醚洗滌濾餅。干燥后得到淡粉 色的固體粉末,粗收率58%。
      實(shí)施例2
      化合物A的制備
      在60 ml醋酸中,將lOmmol l-卡基-2-曱基苯并噻唑季銨鹽與30 mmol N,N,-二苯基曱脒于90。C油浴上加熱攪拌1.5小時(shí)。將反應(yīng)得 到的紅色油狀物用石油醚懸濁洗滌3次,除去醋酸。然后加入一定 量的乙醚析出橙色固體粉末,過濾,干燥。將此粗產(chǎn)品通過硅膠柱 分離,用洗脫液二氯曱烷:曱醇=100:3,收集黃色組分,收率42%。
      向其中加入l-卡基-4-曱基喹啉季銨鹽4mmo1及吡咬10ml, 90。C油 浴上加熱攪拌1.5小時(shí)。將反應(yīng)液倒入乙醚中,析出暗紫色小顆粒, 過濾,干燥。染料通過硅膠柱分離,用洗脫液二氯甲烷:甲醇- 100:5, 收集藍(lán)色組分,得到標(biāo)題化合物,收率70%。
      tH-NMR 5 (400 MHz, CD3OD, TMS) 5.49 (s, 2H), 5.71 (s, 2H), 6.44 (d, 1H), 6.98 (d, 1H), 7.18-7.80 (m, 18H), 8.23 (t, 1H), 8.31 (d, 1H), 8.36 (d, 1H)。 MS (EI) C33H27BrN2S m/z: 483.2 [M-Br〗+。
      實(shí)施例3
      化合物B的制備<formula>complex formula see original document page 18</formula>在60ml醋酸中,將10mmo1 l-(4-氟)-卡基-2-曱基苯并噻唑季銨 鹽與30 mmol N,N,-二苯基曱脒于90°C油浴上加熱攪拌1.5小時(shí)。將 反應(yīng)得到的紅色油狀物用石油醚懸濁洗滌3次,除去醋酸。然后加 入一定量的乙醚析出橙色固體粉末,過濾,干燥。將此粗產(chǎn)品通過 硅膠柱分離,用洗脫液二氯曱烷:曱醇=100:3,收集黃色組分,收率 47%。向其中加入l-(4-氟)-千基-4-曱基喹啉季銨鹽5mmo1及吡啶 10ml, 90°C油浴上加熱攪拌l.5小時(shí)。將反應(yīng)液倒入乙醚中,析出 暗紫色小顆粒,過濾,干燥。染料通過硅膠柱分離,用洗脫液二氯 曱烷:曱醇=100:5,收集藍(lán)色組分,得到標(biāo)題化合物,收率65%。 'H國(guó)NMR 5 (400 MHz, CD3OD,TMS) 5.46 (s, 2H), 5.68 (s, 2H), 6.45 (d,
      1H), 6.97 (d, 1H), 7.05-7.76 (m, 16H), 8.18 (t, 1H), 8.30 (d, 1H), 8.37 (d, 1H)。 MS (EI) C33H25BrF2N2S m/z: 519.2 [M-Br] +。實(shí)施例4
      化合物c的制備
      將10mmo1 l-(4-曱氧基)-千基-2-曱基苯并噻唑季銨鹽與14 mmol N, N,-二苯基甲脒在40 ml醋酸中,于90°C油浴上加熱攪拌2小時(shí)。 將反應(yīng)得到的紅色油狀物用石油醚懸濁洗滌3次,除去醋酸。然后 加入一定量的乙醚析出橙色固體粉末,過濾,干燥。將此粗產(chǎn)品通 過硅膠柱分離,用洗脫液二氯甲烷:甲醇=100:3.5,收集黃色組分, 收率35%。向其中加入l-乙基-4-曱基喹啉季銨鹽3 mmol及吡咬8 ml, 90°C油浴上加熱攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)液倒入乙醚中,析出暗紫色小 顆粒,過濾,干燥。染料通過硅膠柱分離,用洗脫液二氯曱烷:甲醇= 100:6,收集藍(lán)色組分,收率75%。
      ^-NMR 5 (40Q MHz, CD3OD, TMS) 1.23 (t, 3H), 3.76 (tetra, 2H), 3.69 (s, 3H), 5.69 (s, 2H), 6.44 (d, 1H), 6.98 (d, 1H), 7.18-7.90 (m, 12H), 8.23 (t, 1H), 8.31 (d, 1H), 8.36 (d, 1H)。 MS (EI) C29H27IN2OS m/z: 451.2 [M-
      I]+。
      實(shí)施例5
      化合物D的制備<formula>complex formula see original document page 20</formula>
      將lOmmol l-(4-羧基)-千基-2,3,3-三甲基苯-3H-吲哚啉季銨鹽與 15 mmol N,N,-二苯基曱脒在40ml醋酸中,于90°C油浴上加熱攪拌 1.5小時(shí)。將反應(yīng)得到的紅色油狀物用石油醚懸濁洗滌3次,除去醋 酸。然后加入一定量的乙醚析出橙色固體粉末,過濾,干燥。將此 粗產(chǎn)品通過硅膠柱分離,用洗脫液二氯曱烷:曱醇=100:4,收集黃色 組分,收率37%。向其中加入1,4-二曱基喹啉季銨鹽4 mmol及醋酐 8 ml, 90°C油浴上加熱攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)液倒入乙醚中,析出暗 紫色小顆粒,過濾,干燥。染泮+通過硅膠柱分離,用洗脫液二氯甲 烷:曱醇=100:20,收集紫色組分,收率68%。
      iH-NMR 5 (400 MHz, CD3OD, TMS) 1.73 (s, 6H), 3.80 (s, 3H), 5.49 (s, 2H) 6.44 (d, 1H), 6.96 (d, 1H) 7.21-7.80 (m, 12H), 8.22 (t, 1H), 8.32 (d,
      1H), 8.36 (d, 1H)。 MS (EI) C31H29IN202 m/z: 461.2 [M-I]+。
      實(shí)施例6 化合物E的制備
      <formula>complex formula see original document page 20</formula>
      將8 mmol l-千基-2-曱基苯并噻唑季銨鹽與10 mmol丙二醛縮苯
      胺鹽酸在20 ml溶劑(醋酸:醋酸酐=1:1)中加熱到120°C,反應(yīng)1小 時(shí)后,冷卻,加入乙酸乙酯析出固體。過濾,乙酸乙酯沖洗3次, 除去未反應(yīng)的過量的縮合劑。干燥,得棕黃色粉末,粗收率79%。 向其中加入l-(4-硝基)-千基-4-甲基喹淋季銨鹽6 mmol及醋酐10 ml, 120°C油浴上加熱攪拌1.5小時(shí)。將反應(yīng)液倒入乙醚中,析出暗紫色 小顆粒,過濾,干燥。染料通過硅膠柱分離,用洗脫液二氯曱烷:曱 醇=100:10,收集藍(lán)色組分,收率43%。
      !H國(guó)NMR 5 (400 MHz, CD3OD, TMS) 5.49 (s, 2H), 5.72 (s, 2H),6.24 (d, 1H), 6.37 (d, 1H), 6.48 (t, 2H), 8.29 (t, 1H), 7.22-7.85 (m, 17H), 8.38 (d, 1H), 8.45 (d, 1H)。 MS (EI) C35H28BrN302S: m/z: 554.2 [M誦Br] +。
      實(shí)施例7
      化合物A、 B和M在乙醇和DMSO中的光穩(wěn)定性測(cè)定
      將化合物A、 B和M分別配成1 x 1(T5M的甲醇和DMSO溶液 裝入可以密封的比色皿中。使用50g/L的亞灘酸鈉溶液盛于一個(gè)長(zhǎng)方 體玻璃缸中^L截止濾光器,濾去波長(zhǎng)小于400 nm的紫外光。另外, 亞硝酸鈉溶液也能起到冷阱的作用,使樣品的溫度保持常溫。測(cè)定 樣品的初始吸光度值后,選用500W碘鴒燈作為光源,距離樣品20 cm 處,通電光照,計(jì)時(shí)。每隔l小時(shí)后,測(cè)量樣品光照后的吸光度值。 如圖l和2所示,經(jīng)過6小時(shí)光照后,已知化合物M在乙醇和DMSO 中分別褪色38%和54%;化合物A分別褪色16%和45%;化合物B 分別褪色21%和48%。所用儀器為紫外可見分光光度計(jì),型號(hào)Lambda 35。
      數(shù)據(jù)顯示,本發(fā)明化合物相對(duì)已知化合物,顯示出明顯較高的 光穩(wěn)定性。
      實(shí)施例8
      化合物A、 B和M在乙醇中的熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定
      配置一定濃度的化合物A、 B和M的乙醇溶液,滿足經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定最大吸收值<0.1。分別選定激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定熒光強(qiáng)
      度。平行測(cè)定三次,算出熒光量子產(chǎn)率,取平均值。以羅丹明B作 為標(biāo)準(zhǔn)物(Of = 0.97,乙醇)計(jì)算,在乙醇溶液中已知化合物M的熒 光量子產(chǎn)率0F = 0.44 x 10-2; A的熒光量子產(chǎn)率0>F = 0.76 x 10'2; B 的熒光量子產(chǎn)率①F = 0.55 xlO-2。如圖3和4分別為化合物A和M, B和M在乙醇中的吸收和發(fā)射光i普。所用儀器為紫外可見分光光度 計(jì),型號(hào)Lambda 35;熒光分光光度計(jì),型號(hào)LS 55。
      數(shù)據(jù)顯示,本發(fā)明化合物相對(duì)已知化合物,顯示出較高的熒光 量子產(chǎn)率。
      實(shí)施例9
      化合物A在含不同濃度DNA的水溶液中熒光強(qiáng)度的測(cè)定
      配制濃度為1 x 10-4 M的化合物A的DMSO溶液,取lOO^L加 去離子水稀釋至3mL置于比色皿中,測(cè)定其熒光強(qiáng)度。然后,取濃 度為10ng/|iiL的pET-32a (+)質(zhì)粒DNA 2 滴加到上述比色皿中, 穩(wěn)定后測(cè)定其熒光強(qiáng)度。如此繼續(xù)滴加該DNA并測(cè)定熒光強(qiáng)度值, 結(jié)果見圖5,隨著DNA濃度的增大,熒光逐漸增強(qiáng)。同時(shí),染料發(fā) 射光譜與加入DNA之前相比出現(xiàn)lOnm左右的紅移。測(cè)試溫度為0-5°C;所用儀器為熒光分光光度計(jì),型號(hào)LS55。根據(jù)圖5可知,本 發(fā)明熒光染料產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與DNA的濃度呈濃度依賴性,從而可 用于細(xì)胞內(nèi)核酸的染色。
      權(quán)利要求
      1.一類熒光染料,所述染料具有如下結(jié)構(gòu)通式I其中n為1、2或3;X為C(CH3)2、O、S或Se;R1和R2各自獨(dú)立選自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或鹵素;R3為H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或鹵素;R4為C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、芐基或鹵素,其中芐基由選自以下的取代基任選取代鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、鹵代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基;R5為H或C1-18烷基;Y-為負(fù)離子。
      2. 權(quán)利要求1的化合物,其中&和112獨(dú)立選自H、 C1-18烷基 或卣素;優(yōu)選R1和R2均為H。
      3. 權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的化合物,其中113為H、 C1-18烷基、 OR5、 COOR5或卣素;優(yōu)選R3為H、 C1-C6烷基、OR5、 COOR5或卣素。
      4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的化合物,其中114為<^.18烷基、千基 或囟素,所述千基由選自以下的取代基任選取代面素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基;優(yōu)選R4為C"6烷基或卡基,所述千基由 鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基或氨基任選取代。
      5. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的化合物,其中115為H或Cw2烷基, 優(yōu)選R5為H或C^烷基。
      6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的化合物,其中X為C (CH3)2、 O或 S;優(yōu)選X為C(CH3)2或S。
      7. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的化合物,其中n為1或2。
      8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的化合物,其中Y-為卣素離子、CKV、 PF6-、 CF3S03-、 BF4-、乙酸根或?qū)醣交撬嶝?fù)離子。
      9. 權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的化合物,其中所述化合物為<formula>see original document page 3</formula><formula>see original document page 3</formula>
      10. —種綴合物,其特征在于,所述綴合物中包含權(quán)利要求1-9 中任一項(xiàng)的化合物。
      11. 一種合成權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的化合物的方法,所述方法包括1)使未取代或取代的2-曱基苯并噻唑、2-曱基苯并噁唑或2,3,3-三曱基-3H-吲咮啉與取代或未取代的千基自化物反應(yīng),得到季銨鹽中 間體II:II2)將l)中得到的季銨鹽中間體II與N,N,-二苯基曱脒或其高級(jí)同系物縮合,可得到式m化合物:3) 通過與制備式II化合物類似的方法,得到取代或未取代的4-曱基喹啉季銨鹽中間體;4) 將3)中得到的4-曱基喹啉季銨鹽中間體與式III化合物回流, 得到式I化合物;其中X、 n、 Rt、 R2、 R3、 R4、 R5和Y-如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的定義。
      12. —種用于生物樣品染色的組合物,其特征在于所述組合物包 含權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的化合物或權(quán)利要求10的綴合物。
      13. —種染色生物樣品的方法,所述方法包括將權(quán)利要求1-9中 任一項(xiàng)的化合物、權(quán)利要求10的綴合物或權(quán)利要求11的組合物與 生物樣品接觸。
      全文摘要
      本發(fā)明提供了一種式I的不對(duì)稱菁類熒光染料,其中X、n、R<sub>1</sub>、R<sub>2</sub>、R<sub>3</sub>、R<sub>4</sub>、R<sub>5</sub>和Y<sup>-</sup>如說明書中的定義。本發(fā)明還提供了該熒光染料的綴合物、制備方法、包含這種熒光染料的組合物和使用這種熒光染料或其組合物進(jìn)行生物染色的方法。
      文檔編號(hào)G01N1/30GK101343420SQ200710137258
      公開日2009年1月14日 申請(qǐng)日期2007年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月12日
      發(fā)明者彤 吳, 孫世國(guó), 彭孝軍, 兵 徐, 樊江莉, 王炳帥, 邵建輝 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué);深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司
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