專利名稱：Ctl和nk功能性選擇的細(xì)胞的診斷和治療應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提議了基于使用效應(yīng)細(xì)胞(例如CTL和NK細(xì)胞)的新型治療 和診斷方法，所述效應(yīng)細(xì)胞是由于能夠在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)裂解作用而被選擇 出的。具體地，本發(fā)明教導(dǎo)如何基于它們的裂解特性而選擇免疫系統(tǒng)效應(yīng) 細(xì)胞株系。本發(fā)明還教導(dǎo)了如何能夠通過(guò)考慮所顯示的內(nèi)容來(lái)改進(jìn)用于檢 查治療疫苗活性的診斷程序。最后，還顯示了如何能夠利用該方法來(lái)改進(jìn) 目前使用的細(xì)胞治療法。
應(yīng)該注意，在此和以下，通過(guò)術(shù)語(yǔ)"效應(yīng)細(xì)胞"或，更一般地，通過(guò) 術(shù)語(yǔ)"效應(yīng)器"應(yīng)理解為意指對(duì)"靶"粒子起作用的粒子(細(xì)胞或?qū)傥⑸?物體)，依次定義為這樣的細(xì)胞或?qū)傥⑸矬w，在所述細(xì)胞或?qū)傥⑸矬w 上表達(dá)由效應(yīng)器誘導(dǎo)的修飾。
技術(shù)狀況
免疫系統(tǒng)的一些重要工作特性是由被認(rèn)為"稀少的"細(xì)胞組的作用所 決定的。在這種情形中，"稀少的"應(yīng)該理解為意指在己知亞群中具有千 分之一或更小的頻率的細(xì)胞亞群。例如，已知疾病諸如腫瘤疾病的進(jìn)程能 夠通過(guò)在具有恰當(dāng)特征的靶細(xì)胞中具有誘導(dǎo)裂解作用特性的免疫系統(tǒng)細(xì) 胞亞組來(lái)進(jìn)行對(duì)比。同樣已知所述效應(yīng)細(xì)胞是稀少的，因此該作用如果不 通過(guò)恰當(dāng)?shù)闹委煼椒ㄟM(jìn)行刺激，則不是非常有效的。
在治療領(lǐng)域中，現(xiàn)在通過(guò)與通過(guò)"處于極限的"稀釋進(jìn)行的克隆選擇 相結(jié)合的預(yù)-純化分離CTL和NK細(xì)胞(10)。這些策略，即使它們是有效 的并已經(jīng)達(dá)到了應(yīng)用成功的要求，但是，是復(fù)雜、漫長(zhǎng)和昂貴的。此外， 克隆選擇策略不一定總是能夠起作用的，因?yàn)樵谠S多情形中，待攻擊的耙 細(xì)胞(例如屬于腫瘤)的受體的特征是未知或僅部分已知的。
在這點(diǎn)上，
1.已知在腫瘤-特異性肽是已知的情形中，預(yù)選擇腫瘤-特異性CTL群體是可能的，且己經(jīng)記述在治療方案中(11);
2. 已知在大多數(shù)情形中，贅生性細(xì)胞-特異性CTL以1/1000-10,000的 數(shù)量級(jí)存在于患者中(12);
3. 可能利用免疫學(xué)技術(shù)分離能夠在其中識(shí)別腫瘤-特異性CTL的CTL 群體(13);
4. 能夠在體外擴(kuò)增單CTL，從而產(chǎn)生可用于下列生物化學(xué)分析的同源 群體(14)，并且如果為了腫瘤的免疫治療，以高效方式擴(kuò)增，則它們應(yīng) 該維持對(duì)惡性細(xì)胞的特異性(15);
5. 完全與CTL分離類似的策略可以應(yīng)用于能夠在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)裂解 作用的其它效應(yīng)細(xì)胞；
6. CTL (和類似的效應(yīng)細(xì)胞)在免疫療法中的應(yīng)用不限于腫瘤的治療， 而是能夠涉及其它病理學(xué)，其中包括病毒病理學(xué)(例如AIDS)和由于細(xì) 菌感染的病理學(xué)。
針對(duì)CTL進(jìn)行的考慮也延伸到NK細(xì)胞，首先目前實(shí)現(xiàn)了 NK細(xì)胞的 應(yīng)用，其條件是NK細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中特別活躍地誘導(dǎo)裂解作用(16)。
根據(jù)這些考慮，容許以合理的時(shí)間和有效方法選擇對(duì)耙細(xì)胞是高度裂 解性的CTL克隆的方法在治療范圍中是非常重要的。
發(fā)明概述
本發(fā)明教導(dǎo)用于通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和量化靶細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)的裂解 而功能性選擇免疫系統(tǒng)細(xì)胞的方法，所述靶細(xì)胞的裂解是由T-細(xì)胞毒性淋 巴細(xì)胞(CTL) (1)和能夠在恰當(dāng)?shù)募?xì)胞靶點(diǎn)中誘導(dǎo)裂解的其它細(xì)胞(典 型地，天然殺傷細(xì)胞NK) (2)介導(dǎo)的。該方法基于創(chuàng)新的CTL活性分析 測(cè)定和其它具有比當(dāng)前可用的那些更高能力的溶胞細(xì)胞。因此，本發(fā)明在 診斷部門具有直接應(yīng)用。此外，認(rèn)為該方法是用于分離具有高活性的效應(yīng) 細(xì)胞(典型地，CTL或NK)克隆的有效策略。因此，本發(fā)明在治療部門 具有重要應(yīng)用。
具體地，本發(fā)明涉及用于選擇預(yù)先從人類收集的、特別有效用于獲得 腫瘤患者疾病狀態(tài)的診斷/預(yù)后檢查的重要信息的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的方法，所 述方法包括下列步驟a)允許預(yù)先收集的免疫系統(tǒng)細(xì)胞與各種耙粒子相互作用，由于所述相互作用引起的所述靶粒子的修飾是免疫系統(tǒng)細(xì)胞所需
特性的指示；b)檢查所述相互作用對(duì)所述靶粒子的作用；和c)在經(jīng)歷了 與所述靶粒子相互作用的免疫系統(tǒng)細(xì)胞中，選擇在靶粒子中誘導(dǎo)了所述修 飾、因此作為效應(yīng)細(xì)胞對(duì)其起作用的那些。
此外，按照本發(fā)明的方法還能夠包括擴(kuò)增在步驟c)結(jié)束時(shí)選擇出的 免疫系統(tǒng)細(xì)胞的步驟，從而創(chuàng)建上述選擇的抗腫瘤效應(yīng)器克隆，所述抗腫 瘤效應(yīng)器是通過(guò)裂解機(jī)制的特殊效力從單核細(xì)胞的異種群體(循環(huán)或"停 留"在引流淋巴區(qū)域中)中選擇的。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，擴(kuò)增步驟是通過(guò)連續(xù)的階段進(jìn)行的，在可 能不穩(wěn)定克隆群體的離體擴(kuò)增過(guò)程中，在一個(gè)階段和下一個(gè)階段之間進(jìn)行 具有最佳特征的效應(yīng)器的再選擇，特別地對(duì)至少一個(gè)所述可能不穩(wěn)定的克 隆群體重復(fù)步驟a)、 b)和c)。
本發(fā)明還涉及上述方法用于制備包括處于載體中的免疫系統(tǒng)細(xì)胞和/ 或它們的克隆的藥物的應(yīng)用，所述免疫系統(tǒng)細(xì)胞是經(jīng)過(guò)步驟a)、 b)和c) 選擇的，所述載體適合于以治療為目的的體內(nèi)再輸注，所述體內(nèi)再灌輸可 能發(fā)生在用樹突細(xì)胞刺激后。
最后，本發(fā)明涉及小型化裝置的應(yīng)用，所述裝置容許在不改變效應(yīng)細(xì) 胞和靶細(xì)胞的生物學(xué)活性的條件下，操作效應(yīng)細(xì)胞和耙細(xì)胞，從而進(jìn)行效 應(yīng)細(xì)胞的選擇和用于制備上文指出的類型的藥物，本發(fā)明還涉及選擇的和 擴(kuò)增的裂解性效應(yīng)細(xì)胞制備用于治療病理的藥物的應(yīng)用，所述病理能夠通 過(guò)體內(nèi)再輸注所選擇和擴(kuò)增的裂解性效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行治療，所述應(yīng)用的特征 在于所述藥物僅包括預(yù)先選擇的效應(yīng)細(xì)胞和/或預(yù)先選擇的效應(yīng)細(xì)胞的克 隆，所述預(yù)先選擇的效應(yīng)細(xì)胞和/或所述預(yù)先選擇的效應(yīng)細(xì)胞的克隆全部具 有基本相似的裂解活性。
附圖簡(jiǎn)述


圖1.A:指向擊中靶點(diǎn)腫瘤細(xì)胞(綠色箭頭)的CTL替換(3CTL: 紅色箭頭)。B: CTL和靶細(xì)胞復(fù)合體。
圖2.CTL (黑色箭頭)和一種靶細(xì)胞(綠色箭頭)的相互作用耙細(xì) 胞處于晚期裂解狀態(tài)。圖3.A:靶細(xì)胞的裂解動(dòng)力學(xué)。B:非預(yù)-活化的CTL。
圖4.A:通過(guò)在Cr51釋放測(cè)定中的裂解％測(cè)量的鈣熒光素對(duì)CTL裂解 活性的影響。在黑色柱形圖中，報(bào)告了存在(左側(cè))或不存在(右側(cè))鈣 熒光素的條件下，靶LCL (B35，負(fù)載了EBV肽)的特異性裂解；在白色 柱形圖中，報(bào)告了由沒(méi)有負(fù)載肽的LCL代表的對(duì)照。B.甘露糖醇緩沖液 對(duì)CTL裂解活性的影響(Cr51釋放測(cè)定)。在黑色柱形圖中，報(bào)告了在含 有甘露糖醇的緩沖液(左側(cè))中或在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(RPMI;右側(cè))中靶LCL 的特異性裂解；在白色柱形圖中，顯示了由沒(méi)有負(fù)載肽的LCL代表的對(duì) 照。
圖5.在SmartSlide⑧上，檢測(cè)在DEP替換和負(fù)載鈣熒光素后，在甘露 糖醇緩沖液中負(fù)載了 EBV肽的靶LCL的特異性溶胞。A-D圖檢測(cè)了 10' 和20，后，由HPV-特異性CTL引起的HPV-陽(yáng)性LCL的裂解；圖E-H:相 反，EBV-特異性CTL不裂解沒(méi)有負(fù)載所述肽的LCL。
圖6.報(bào)告的數(shù)據(jù)是三次試驗(yàn)的平均值，其中隨著時(shí)間的推移檢測(cè)到熒 光信號(hào)(鈣熒光素)的減少，其原因在于在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(RPMI)中共-培 養(yǎng)15，(圖B)或30，(圖C)后，由特異性CTL引起的負(fù)載EBV肽的LCL-B35 的裂解。平行對(duì)照檢測(cè)(A中的白色柱形圖；C中的空心符號(hào))顯示裂解 是特異性的；事實(shí)上，如果LCL沒(méi)有負(fù)載EBV肽，則不存在；在這種情 形中，信號(hào)強(qiáng)度隨著時(shí)間的減少是最小的。
詳述
為了分析CTL活性，目前最普遍使用的方法基于來(lái)自裂解的細(xì)胞中的 Cr51釋放(3)。近期調(diào)整了基于非-放射活性銪(Eu3+)的釋放(4)、熒 光標(biāo)記(例如鈣熒光素)的釋放(5)、酯酶活性分析、膜聯(lián)蛋白V或卩-半乳糖苷酶的應(yīng)用的其他方法?；谧杩闺娮臃治龅钠渌椒ㄒ灿葾cea 生物科學(xué)(AceaBiosciences)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，這容許了實(shí)時(shí)檢查對(duì)由免疫 系統(tǒng)細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞聚集物的裂解作用(6， 7)。
這些方法學(xué)遭受一些重要的缺點(diǎn)。在一些情形中，它們基于放射性分 子的使用(3)，并且總是測(cè)定"平均"結(jié)果而非處于單細(xì)胞水平(4， 5)。 當(dāng)能夠使用FACS (熒光激活細(xì)胞分選儀)分析(8)時(shí)，需要相當(dāng)大數(shù)量的細(xì)胞和復(fù)雜且昂貴的儀器。在所有這些分析中，實(shí)時(shí)評(píng)估不可能是有效 的。
鑒于這些考慮， 一種通過(guò)將所述在單細(xì)胞或高度裂解性克隆水平的分
析擴(kuò)展到靶細(xì)胞而容許以實(shí)時(shí)并以有效方法監(jiān)測(cè)由效應(yīng)細(xì)胞(例如CTL)
介導(dǎo)的細(xì)胞裂解的方法確實(shí)在診斷和治療范圍中是非常重要的。
在這點(diǎn)上，
1. 已知能夠利用不同的超活染料對(duì)CTL耙細(xì)胞進(jìn)行染色，如果所述 靶細(xì)胞被裂解和/或受損，則所述超活染料中的一些能夠被釋放到細(xì)胞外
(鈣熒光素(5)屬于這些超活染料)；
2. 已知能夠利用不同的超活染料對(duì)CTL耙細(xì)胞進(jìn)行染色，所述超活 染料識(shí)別復(fù)合體結(jié)構(gòu)(線粒體、細(xì)胞核等)，并且即使所述細(xì)胞受損，所 述超活染料也不能被釋放到細(xì)胞外(9);
3. 適宜的數(shù)據(jù)處理程序和成像方案能夠用于以自動(dòng)化方式量化出現(xiàn) 確定特征的細(xì)胞百分比的目的。
關(guān)于實(shí)時(shí)細(xì)胞操作，該工藝學(xué)近期提供了一些工藝。例如，鑷子激光 容許創(chuàng)建光學(xué)籠(叩ticalcage)，所述光學(xué)籠能夠容納細(xì)胞，并且通過(guò)移動(dòng) 該籠使細(xì)胞彼此接觸(17)。還己知基于介電電泳(DEP)的芯片上實(shí)驗(yàn) 室(Lab-on-a-chip)裝置能夠非常有效地用于以程序性方式替換生物學(xué)項(xiàng) 目(18-21)。特別地，由點(diǎn)陣-電極組成的裝置能夠操作單細(xì)胞或單細(xì)胞分 組。
基于點(diǎn)陣-電極的芯片上實(shí)驗(yàn)室的實(shí)例顯示在(21)中?；诒景l(fā)明， 存在操作CTL、 NK和靶贅生性細(xì)胞的實(shí)時(shí)方法學(xué)的應(yīng)用，并且其還能夠 替換單細(xì)胞，這是為了開發(fā)首先為了識(shí)別以及然后分離高度細(xì)胞毒性的 CTL并且由此能夠用于通過(guò)免疫治療策略治療贅生性病理學(xué)的有效方法 的目的。
試驗(yàn)過(guò)程
在用埃巴病毒(EBV)毒株B95.8感染人B淋巴細(xì)胞后，獲得了類淋 巴母細(xì)胞細(xì)胞系(LCL X26 )。使用EBV-特異性肽HPVGEADYFEY (HPV)， 其對(duì)應(yīng)于EBNA1蛋白的aa407-417進(jìn)行刺激。以3.5x106細(xì)胞/ L的濃度，將來(lái)自HLA-B35供體的外周血(PBL)的淋巴細(xì)胞涂布到在培養(yǎng)基RPMI 1640, 10% FCS (Hyclone)中的21孔平板中，并用HPV肽(IO iaM)進(jìn)行刺 激。7和14天后再次刺激培養(yǎng)物，并且對(duì)培養(yǎng)基增補(bǔ)10 U/ml rlL-2 (Chiron)。在第14和21天，利用合適的細(xì)胞毒性測(cè)定(51Cr-釋放)，通過(guò) CTL活性分析T-細(xì)胞培養(yǎng)物(3)。
對(duì)獲得的結(jié)果的評(píng)論
該研究的結(jié)果顯示在圖1-6中報(bào)告的實(shí)施例中。提供實(shí)施例是為了例 證的目的，而非意欲以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在圖1中，報(bào)告了三 種CTL (紅色箭頭)的替換，所述三種CTL通過(guò)產(chǎn)生在該圖右側(cè)顯示的 復(fù)合體，而指向擊中單一的靶點(diǎn)腫瘤細(xì)胞，其中CTL以紅色顯示，且靶 細(xì)胞以綠色顯示。
我們驚訝地發(fā)現(xiàn)在含有點(diǎn)陣電極的芯片上實(shí)驗(yàn)室上替換的CTL能夠 與贅生性靶細(xì)胞接觸，并且能夠以非?？焖俚臅r(shí)間(8-20分鐘不同)裂解 它們。如果用鈣熒光素標(biāo)記細(xì)胞，那么它們?nèi)绻峭暾膭t是熒光的，如 果被CTL損傷則失去熒光性(圖2和圖3)。通過(guò)利用針對(duì)線粒體或DNA 的染料進(jìn)行雙染色，被CTL損傷的細(xì)胞失去它們的鈣熒光素的熒光性， 而維持針對(duì)線粒體或DNA的特異性染料中的一種。因此，通過(guò)熒光顯微 鏡分析(可能利用成像程序)，有可能區(qū)別活性的CTL和非活性的CTL。 非-選擇的CTL沒(méi)有顯示出對(duì)非預(yù)-負(fù)載肽的LCL的裂解活性。
從另一方面，如近期所述(22-25)，由DEP操作的細(xì)胞維持它們的表 型和它們的分化的特征。按照本發(fā)明，注意到這種類型的操作也不改變細(xì) 胞裂解活性和光學(xué)信號(hào)(熒光性)的檢測(cè)。因此，這種方法適合于直接識(shí) 別以及隨后分離和擴(kuò)增活性CTL克隆、以及對(duì)確定的細(xì)胞靶標(biāo)顯示出細(xì) 胞裂解活性的其他細(xì)胞群體。
除了在該示范中使用的光學(xué)成像技術(shù)，已知阻抗測(cè)量技術(shù)(6)容許以 高水平的精確性檢查單細(xì)胞的狀態(tài)。因此，該實(shí)施方案中描述的光學(xué)技術(shù) 意欲僅作為更普通方法的范例。
圖2顯示與CTL相互作用后，處于晚期裂解狀態(tài)中的細(xì)胞的詳細(xì)信息。 具體地，在圖的右部中，能夠觀察到由三種CTL (黑色箭頭)引起的裂解的靶細(xì)胞(綠色箭頭)。圖3 (圖A)顯示CTL/靶細(xì)胞聚集體的裂解動(dòng)力 學(xué)。在B中，指出了非-預(yù)選擇的CTL不是裂解性的。如能夠看到地，該 策略容許分析與CTL接觸后的裂解動(dòng)力學(xué)并識(shí)別具有高細(xì)胞裂解活性的 CTL模式。
圖4A顯示用鈣熒光素標(biāo)記不改變CTL的裂解機(jī)制或?qū)ω?fù)載了 EBV 肽的(LCL)HLA-B35淋巴細(xì)胞的特異性識(shí)別。在圖4B中，還顯示出介電 電泳或含有甘露糖醇的緩沖液對(duì)該機(jī)制均不具有任何作用，即是與其他人 對(duì)基因表達(dá)模式(37)和K562生長(zhǎng)能力(35， 36)的檢査結(jié)果相校準(zhǔn)的 結(jié)果，所述對(duì)基因表達(dá)模式和K562生長(zhǎng)能力的檢査結(jié)果不被介電電泳引 起改變。
在圖5和6中顯示的試驗(yàn)中進(jìn)一步檢查了在所用的試驗(yàn)條件(甘露糖 醇緩沖液和通過(guò)介電電泳替換)下對(duì)識(shí)別反應(yīng)和裂解的特異性的維持。在 圖6中，還顯示了在CTL對(duì)LCL的特異性裂解后的熒光性強(qiáng)度變化動(dòng)力 學(xué)，在從DEP處理開始的最初8-10分鐘中已經(jīng)能夠?qū)⑵渲赋?，并且從?限數(shù)量的細(xì)胞(數(shù)量=25，30，20,27)開始?？傊?，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了免疫 反應(yīng)的特異性在該試驗(yàn)情形中得到保持。事實(shí)上，免疫反應(yīng)也在極端減少 的細(xì)胞數(shù)量的存在下引起選擇性行為絕對(duì)不是顯然的。具體地，發(fā)生這種 類型操作的環(huán)境防止細(xì)胞中的聚集現(xiàn)象，相反地，這發(fā)生在所有其他方法 學(xué)中。盡管如此，免疫反應(yīng)的選擇性和特異性的發(fā)現(xiàn)開啟了通向本專利重 要的教導(dǎo)系列的大門。
能夠?qū)崟r(shí)地先體外再體內(nèi)地計(jì)數(shù)細(xì)胞毒性效應(yīng)器(在報(bào)告的實(shí)施例中 的CTL，還有NK細(xì)胞和其他)，并且該分析不是基于"替代終點(diǎn)(surrogate endopoints)"(例如，效應(yīng)器的表面特異性標(biāo)記的表達(dá)，淋巴因子的釋放， 分化抗原的表達(dá)，等)而是基于以單細(xì)胞水平在線和實(shí)時(shí)定量讀取裂解效 力，上述事實(shí)是創(chuàng)新的并具有巨大的重要性。事實(shí)上，已知并不是所有識(shí) 別給定抗原的T-淋巴細(xì)胞同等地裂解(2， 28)，并且成熟表型-淋巴細(xì)胞的百 分比在接種疫苗的過(guò)程中增加(29)。預(yù)測(cè)與使用替代終點(diǎn)相比，使用直 接的細(xì)胞毒性作為終點(diǎn)與臨床預(yù)后非常相關(guān)，并且容許更精確地監(jiān)測(cè)疫苗 制劑在誘導(dǎo)特異性免疫中的效力。此外，在近期沒(méi)有接種疫苗的患者中還 經(jīng)常觀察到抗腫瘤T-淋巴細(xì)胞的存在，伴隨著疾病的復(fù)發(fā)和重現(xiàn)(30)。作為在操作己知技術(shù)后的細(xì)胞回收技術(shù)(33)，該過(guò)程具有治療所涉及 的情況。分離和回收具有高裂解活性的效應(yīng)細(xì)胞容許"體外"培育高度選 擇的細(xì)胞，目的是進(jìn)行生物化學(xué)研究和擴(kuò)增所選擇的群體。這兩種策略均 具有對(duì)腫瘤免疫療法的深刻暗示。
事實(shí)上，從單核細(xì)胞異源群體(循環(huán)或"停留"在引流淋巴區(qū)域中) 中分離高選擇性的細(xì)胞毒性效應(yīng)器容許(a)為了特別的裂解機(jī)制效力， 克隆擴(kuò)增上述選擇的抗腫瘤效應(yīng)器；(b)在可能不穩(wěn)定的克隆群體的離體
擴(kuò)增過(guò)程中對(duì)效應(yīng)器進(jìn)行再選擇。用于可能在用樹突細(xì)胞剌激后為了治療
目的的體內(nèi)再輸注的技術(shù)是可用的(31)。這些效應(yīng)器局部和/或系統(tǒng)再輸
注的效力，和自體輸注的攝取還能夠隨著時(shí)間受到監(jiān)測(cè)，并且與免疫狀態(tài)
和疾病的過(guò)程相關(guān)(31)。
體外擴(kuò)增高度裂解性細(xì)胞，如果需要改變表型并將它們?cè)佥斪⒌交加?瘤形成的患者中(過(guò)繼性(adoptive)-細(xì)胞-轉(zhuǎn)移治療)的可能性已經(jīng)成為 多個(gè)研究的主題(28-30,32)。在該試驗(yàn)策略中，快速識(shí)別具有高度裂解活 性和產(chǎn)生具有治療重要性的細(xì)胞負(fù)載的能力然而維持基因穩(wěn)定性的效應(yīng) 器仍然是限制因素。
本專利的策略主題與減少時(shí)間和改進(jìn)對(duì)具有高度裂解活性的細(xì)胞的選 擇程序相一致，其一方面促進(jìn)靶點(diǎn)腫瘤抗原的識(shí)別，另一方面促進(jìn)可用于 免疫治療的細(xì)胞的擴(kuò)增。如果，通過(guò)實(shí)施例的方式，考慮將(32)中提示 的方法用于獲得對(duì)在靶細(xì)胞中潛在地具有誘導(dǎo)裂解活性的有用的細(xì)胞株 的功能性選擇，則通過(guò)本方法獲得的選擇質(zhì)量的改進(jìn)將得到更好的理解。 (32)中的技術(shù)源自這樣的觀察，即存在能夠在腫瘤組織中滲透并對(duì)致癌 細(xì)胞發(fā)揮裂解活性的細(xì)胞株，即TIL或腫瘤滲透淋巴細(xì)胞。也是在這種情 形中，在患者中發(fā)現(xiàn)的TIL的數(shù)量低于為了獲得疾病好轉(zhuǎn)所需要的數(shù)量。 然后能夠?qū)⒃摲桨缚偨Y(jié)為下列步驟1)從患者獲得活組織切片，2)處理 該組織，從而容許對(duì)理想的細(xì)胞體外輸注合適的營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子，3)在 生長(zhǎng)步驟結(jié)束后，純化TIL的細(xì)胞株，并去除腫瘤細(xì)胞，4)將由此獲得 的細(xì)胞再輸注到患者中。己知僅有一部分以該方法獲得的TIL顯示出裂解 活性，并且因此，由于不能超越為了限制不希望的副作用向患者中再輸注 的細(xì)胞數(shù)量，所以該治療法具有有限的效力。本專利中提出的方法以顯著的方式降低了本文中所討論的方法的限制，因?yàn)?)效應(yīng)細(xì)胞的選擇能夠 擴(kuò)展到也在外周血中存在的細(xì)胞系，并且不限于TIL; 2)功能性選擇產(chǎn)生
這樣一組株系，即它們的裂解活性是已知的；3)容許改進(jìn)這些細(xì)胞系的
擴(kuò)增程序，這歸因于在不同擴(kuò)增步驟中監(jiān)測(cè)所關(guān)心的細(xì)胞系穩(wěn)定性的可能
性；4)減少了治療所需要的細(xì)胞負(fù)載，并且因此，對(duì)向患者中再輸注的 相同物質(zhì)提供了更有目的的作用。第3)點(diǎn)以顯著的方式改進(jìn)了與CTL型 細(xì)胞系擴(kuò)增相關(guān)的技術(shù)狀態(tài)，已知所述CTL型細(xì)胞系在一定數(shù)量的擴(kuò)增 后改變裂解表型。在這樣的極端情形中，其中具有理想裂解特征的單細(xì)胞 在選擇程序之后可用，并且需要達(dá)到數(shù)百萬(wàn)細(xì)胞數(shù)量的治療效價(jià)的細(xì)胞負(fù) 載，需要大約25或30次擴(kuò)增循環(huán)。
該循環(huán)數(shù)量不保持所涉及的細(xì)胞的基因穩(wěn)定性，以致產(chǎn)生具有不同裂 解表型的亞群。本發(fā)明教導(dǎo)如果解決這一問(wèn)題。事實(shí)上，能夠在生長(zhǎng)程序 的不同階段重復(fù)細(xì)胞的功能性選擇，并且例如當(dāng)在10或12個(gè)生長(zhǎng)周期后， 能夠獲得數(shù)千個(gè)細(xì)胞。能夠通過(guò)以上公開的功能性選擇的擴(kuò)展應(yīng)用恢復(fù)細(xì) 胞系的純化。事實(shí)上可能維持通過(guò)活組織切片獲得的靶細(xì)胞系，并重復(fù)所 提出的方法，以消除具有不希望的表型的裂解性細(xì)胞。以該擴(kuò)增水平消除 裂解性細(xì)胞與基于電子技術(shù)的選擇技術(shù)相一致，并且因此再次獲得純的品 系。進(jìn)一步擴(kuò)增等于10或12次的循環(huán)數(shù)量產(chǎn)生對(duì)于治療應(yīng)用具有足夠數(shù) 量的裂解性細(xì)胞。即使在這一點(diǎn)，細(xì)胞數(shù)量用于防止以單細(xì)胞水平檢驗(yàn)裂 解表型的穩(wěn)定性，極大地減少了在不控制表型條件下的生長(zhǎng)周期次數(shù)，并 且因此能夠?qū)⒓?xì)胞視為是原始細(xì)胞的適當(dāng)繁殖。
本發(fā)明進(jìn)一步預(yù)期了適合于細(xì)胞操作的任何裝置的應(yīng)用，所述細(xì)胞操 作不改變效應(yīng)細(xì)胞(在該情形中，CTL)的生物學(xué)活性。
從另一方面，本發(fā)明涉及能夠裂解靶細(xì)胞的各種類型細(xì)胞(包括NK 細(xì)胞)的分離。
最后，本發(fā)明適用于所有的病理學(xué)，如上所觀察地，對(duì)于所述病理學(xué)， 能夠再將效應(yīng)細(xì)胞(NK或CTL)的細(xì)胞裂解活性主要指引到急性和慢性 類型的贅生性病理學(xué)、傳染性病理學(xué)、自體免疫病理學(xué)和炎癥病理學(xué)。
以下，最后提供了關(guān)于迄今為止我們所引用的公布文件的書目列表， 以它們的參考文獻(xiàn)編號(hào)顯示它們，意欲通過(guò)參考，將它們的內(nèi)容引入本說(shuō)明書中需要的部分。 參考文獻(xiàn)
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1.用于選擇預(yù)先從人類收集的、特別有效用于獲得用于腫瘤患者疾病狀態(tài)的診斷/預(yù)后檢查的重要信息的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的方法，所述方法包括下列步驟a)使預(yù)先收集的免疫系統(tǒng)細(xì)胞與各種靶粒子相互作用，由于所述相互作用引起的所述靶粒子的修飾是所述免疫系統(tǒng)細(xì)胞所需特性的指示；b)檢查所述相互作用對(duì)所述靶粒子的影響；和c)在經(jīng)歷了與所述靶粒子相互作用的免疫系統(tǒng)細(xì)胞中，選擇在所述靶粒子中誘導(dǎo)了所述修飾、因此作為效應(yīng)細(xì)胞對(duì)其起作用的那些。
2. 按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述能夠在所述靶粒子中獲得 的修飾是預(yù)先已知的。
3. 按照權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述細(xì)胞是由于它們的 效應(yīng)器/靶點(diǎn)裂解特性而被選擇的；所述免疫系統(tǒng)細(xì)胞的所需特性僅是裂 解選自由細(xì)胞、微生物組成的組的靶粒子的特性。
4. 按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于進(jìn)行了所述相互作用和選擇 步驟，以容許量化在外周血、炎性贅生性滲入物、引流區(qū)域性淋巴結(jié)中 和在任何其他位置中或可到達(dá)的生物流體中的細(xì)胞毒性效應(yīng)器(除其他 夕卜，諸如T和NK細(xì)胞)的存在。
5. 按照權(quán)利要求3或4的方法，其特征在于進(jìn)行了所述相互作用和 選擇步驟，以容許確定剩余最小疾病，同時(shí)提供對(duì)在危險(xiǎn)患者中的抗腫 瘤T和NK效應(yīng)器的細(xì)胞裂解活性的直接和實(shí)時(shí)的測(cè)量。
6. 按照前述權(quán)利要求3或4中任一項(xiàng)的方法，其特征在于至少所述 相互作用步驟和所述選擇步驟是利用任何類型的小型化裝置進(jìn)行的，所 述裝置容許在不改變效應(yīng)細(xì)胞和耙細(xì)胞或微生物的生物學(xué)活性的條件下 操作效應(yīng)細(xì)胞和耙細(xì)胞或微生物。
7. 按照權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述方法進(jìn)一步 包括擴(kuò)增在步驟c)結(jié)束時(shí)選擇出的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的步驟，從而創(chuàng)建上述 選擇的抗腫瘤效應(yīng)器的克隆，所述抗腫瘤效應(yīng)器是關(guān)于裂解機(jī)制的特殊 效力從單核細(xì)胞的異源群體(循環(huán)或"停留"在引流淋巴區(qū)域中)中選擇的。
8. 按照權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述擴(kuò)增步驟是通過(guò)下列階 段進(jìn)行的，在離體擴(kuò)增可能不穩(wěn)定的克隆群體過(guò)程中，在一個(gè)階段和下 一個(gè)階段之間進(jìn)行了對(duì)這樣的效應(yīng)器的再選擇，所述效應(yīng)器具有最佳特 性，特別地，對(duì)至少一種所述可能不穩(wěn)定的克隆群體重復(fù)步驟a)、 b)和 C)。
9. 按照權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法用于制備包括在載體中的免疫系統(tǒng)細(xì)胞和/或它們的克隆的藥物的應(yīng)用，所述免疫系統(tǒng)細(xì)胞是經(jīng)過(guò)所述步驟a)、 b)和c)選擇的，所述載體適合于以治療為目的的體內(nèi)再輸注， 所述體內(nèi)再輸注可能發(fā)生在用樹突細(xì)胞刺激后。
10. 按照權(quán)利要求9的應(yīng)用，其特征在于所述藥物是使用各種細(xì)胞類型獲得的，所述各種細(xì)胞類型的目的活性由裂解耙細(xì)胞組成。
11. 按照權(quán)利要求8或9的應(yīng)用，用于制備治療各種類型病理的藥物， 所述病理能夠用輸注所選擇的和擴(kuò)增的裂解性效應(yīng)細(xì)胞而進(jìn)行治療。
12. 任何類型的小型化裝置用于進(jìn)行選擇具有理想類型和強(qiáng)度的活性 的效應(yīng)細(xì)胞的應(yīng)用，所述小型化裝置容許在不改變效應(yīng)細(xì)胞和耙細(xì)胞的 生物學(xué)活性的條件下操作效應(yīng)細(xì)胞和耙細(xì)胞。
13. 小型化裝置制備用于在各種類型病理中體內(nèi)再輸注的藥物的應(yīng)用， 所述小型化裝置容許在不改變效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的生物活性的條件下操 作效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，所述病理能夠用輸注所選擇的和擴(kuò)增的裂解性效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行治療，所述應(yīng)用的特征在于所述藥物包括預(yù)先選擇的效應(yīng)細(xì)胞和/或預(yù)先選擇的效應(yīng)細(xì)胞的克隆，所述預(yù)先選擇的效應(yīng)細(xì)胞和/或所 述預(yù)先選擇的效應(yīng)細(xì)胞的克隆都具有基本相似的裂解活性。
14. 選擇的和擴(kuò)增的裂解性效應(yīng)細(xì)胞用于制備治療病理的藥物的應(yīng) 用，所述病理可以通過(guò)體內(nèi)再輸注所選擇的和擴(kuò)增的裂解性效應(yīng)細(xì)胞的 方法進(jìn)行治療，所述應(yīng)用的特征在于所述藥物僅包括預(yù)先選擇的效應(yīng)細(xì)胞和/或預(yù)先選擇的效應(yīng)細(xì)胞的克隆，所述預(yù)先選擇的效應(yīng)細(xì)胞和/或所 述預(yù)先選擇的效應(yīng)細(xì)胞的克隆都具有基本相似的裂解活性。
全文摘要
本發(fā)明提出了基于使用由于能夠在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)裂解作用而被選擇出的效應(yīng)細(xì)胞(例如CTL和NK細(xì)胞)的新型治療和診斷方法。具體地，本發(fā)明教導(dǎo)如何按照它們的裂解特性選擇免疫系統(tǒng)效應(yīng)細(xì)胞株。本發(fā)明還教導(dǎo)了如何能夠通過(guò)考慮所顯示的內(nèi)容來(lái)改進(jìn)用于檢查治療疫苗活性的診斷程序。最后，顯示了如何通過(guò)利用該方法改進(jìn)目前使用的細(xì)胞治療法。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101495864SQ200780021495
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2007年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月12日
發(fā)明者羅伯托·圭列拉, 羅伯托·甘巴里 申請(qǐng)人:硅生物系統(tǒng)股份公司;羅伯托·甘巴里