專利名稱：用于直接測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的電化學(xué)生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在不單獨(dú)測(cè)量總血紅蛋白的情況下用于測(cè)量血樣中糖化血紅蛋白 (HbAlc)百分比的電化學(xué)生物傳感器。HbAlc生物傳感器可以用于在醫(yī)生辦公室或患者家 的糖尿病監(jiān)控。
背景技術(shù)：
糖化蛋白質(zhì)是通過(guò)將構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的氨基與還原糖諸如醛醣的醛基非酶 促地且不可逆地結(jié)合而產(chǎn)生的物質(zhì)。例如，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6，127，138。這樣一種非酶促且 不可逆的結(jié)合反應(yīng)也稱為“Amadori重排”，因此在一些情況下上述糖化蛋白質(zhì)也可以稱為 "Amadori 化合物，，。蛋白質(zhì)的非酶促糖化作用已經(jīng)涉及某些疾病的發(fā)生，例如糖尿病并發(fā)癥和衰老過(guò) 程(Takahashi 等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志),272(19) :12505-7(1997)；以及 Baynes 和 Monnier, Prog. Clin. Biol. Res.(臨床生物學(xué)研究進(jìn)展),304 1-410 (1989))。該反應(yīng)通 過(guò)形成糖加合物和交聯(lián)而導(dǎo)致目標(biāo)分子功能障礙。相當(dāng)大的興趣已經(jīng)集中在Amadori產(chǎn)物 上，所述Amadori產(chǎn)物是體外和體內(nèi)非酶促糖化作用期間最重要的“早期”修飾。多種用于糖化蛋白質(zhì)的測(cè)定是已知的。例如，美國(guó)專利號(hào)6，127，138公開(kāi)了將含 有糖化蛋白質(zhì)的樣品用蛋白酶XIV或來(lái)自曲霉菌屬的蛋白酶處理，其后(或當(dāng)用上述蛋白 酶處理樣品時(shí))使FAOD (果糖基氨基酸氧化酶)與樣品起反應(yīng)以便測(cè)量被FAOD反應(yīng)消耗 的氧的量或得到的反應(yīng)產(chǎn)物的量，從而測(cè)量糖化蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)例中，美國(guó)專利號(hào)6，008，006公開(kāi)了，可以通過(guò)將樣品首先與作為蛋 白酶和過(guò)氧化物酶組合的試劑反應(yīng)，其次與酮胺氧化酶反應(yīng)而定量樣品中糖化蛋白質(zhì)的 量。美國(guó)專利號(hào)6，008, 006還公開(kāi)了含有所述組合的過(guò)氧化物酶/蛋白酶試劑以及酮胺氧 化酶的試劑盒。美國(guó)公開(kāi)號(hào)2005/0014935公開(kāi)了使用嵌合阿馬多里酶(amadoriase)測(cè)量 糖化蛋白質(zhì)量的方法和試劑盒。美國(guó)公開(kāi)號(hào)2003/0162242和EP1304385 Al也公開(kāi)了選擇 性測(cè)定糖化血紅蛋白的方法。已經(jīng)描述了用于測(cè)定糖化血紅蛋白Alc百分比的方法，所述方法需要單獨(dú)測(cè)量樣 品中的總血紅蛋白。當(dāng)化學(xué)分析儀用于測(cè)定糖化血紅蛋白Alc百分比的值時(shí)，需要雙通 道形式。在該形式中，進(jìn)行兩個(gè)單獨(dú)的測(cè)定以測(cè)定樣品中的1)糖化血紅蛋白Alc濃度， 和2)總血紅蛋白濃度；并且接著計(jì)算糖化HbAlc對(duì)于總血紅蛋白的比例以獲得HbAlc的 百分比。在不單獨(dú)測(cè)量總血紅蛋白情況下的直接測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的方法描述在 W02008/013874 中。已知多種電化學(xué)生物傳感器使用特異性酶反應(yīng)通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)方法測(cè)定用作酶 底物的分析物的量。使用最多的生物傳感器是用于葡萄糖測(cè)試的生物傳感器，其利用葡萄糖氧化酶與血液中的葡萄糖反應(yīng)并且產(chǎn)生H2O2用于在有或者沒(méi)有介體或催化劑情況下使 用設(shè)計(jì)的電極的電化學(xué)檢測(cè)，所述設(shè)計(jì)的電極包括工作電極、對(duì)電極和參比電極。已經(jīng)充 分開(kāi)發(fā)了用于H2A檢測(cè)的電極傳感器，并且用于H2A檢測(cè)的電極條目前已經(jīng)變成可商購(gòu) 的。參見(jiàn)，例如，Luo等，Biosensors and Bioelectronics (生物傳感器和生物電子學(xué))22 482-488,2006 ；Wang 等，Chem. Rev.(化學(xué)評(píng)述)108 :814-825,2008 ；美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) 2009/0090623。除葡萄糖測(cè)試以外，HbAlc測(cè)試已經(jīng)成為更好監(jiān)控糖尿病病況的另一種重要測(cè)試。 葡萄糖測(cè)試報(bào)告特定時(shí)刻的血液中葡萄糖水平，因此HbAlc測(cè)試給出過(guò)去3個(gè)月的平均葡 萄糖水平。通過(guò)測(cè)試HbAlc水平，醫(yī)生可以對(duì)在過(guò)去3個(gè)月中如何控制他們的患者的葡萄 糖水平具有更好的理解，其隨后幫助醫(yī)生做出治療決策。最近，對(duì)于使用HbAlc測(cè)試作為鑒 別糖尿病病況的篩選測(cè)試存在增長(zhǎng)的趨勢(shì)。因此，像葡萄糖計(jì)一樣簡(jiǎn)單并且可以被患者用 作自測(cè)試裝置的HbAlc測(cè)試裝置是高度合乎需要的。發(fā)明概述本發(fā)明提供在用于測(cè)量樣品中糖化血紅蛋白(HbAlc)百分比的電化學(xué)傳感器中 使用的電極裝置，所述電極裝置包括電極載體；放置在所述電極載體上的工作電極，其中 將果糖基氨基酸氧化酶放置(諸如沉積)在所述工作電極上或附近；并且對(duì)電極或參比電 極放置在所述電極載體上并且與所述工作電極隔開(kāi)。在一些實(shí)施方案中，所述裝置還包括放置在電極載體上并且與所述載體上的其它 電極隔開(kāi)的參比電極或?qū)﹄姌O。在一些實(shí)施方案中，所述工作電極和/或所述對(duì)電極還包括介體，所述介體在從 果糖基氨基酸氧化酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫和所述工作電極之間穿梭電子，以產(chǎn)生表示 樣品中糖化血紅蛋白量的電流。所述介體可以包括選自由二茂鐵、普魯士藍(lán)、金屬酞青和四 硫富瓦烯(TTF)組成的組的一種或多種試劑。還可以使用能夠在反應(yīng)介質(zhì)和電極之間穿梭 電子的其它介體。在一些實(shí)施方案中，工作電極和/或?qū)﹄姌O還包括催化過(guò)氧化氫的氧化還原反應(yīng) 的催化劑。催化劑包括一種或多種鉬族金屬諸如Ir-碳、1 -碳、和Ru-碳。在一些實(shí)施方 案中，Ir-碳、Rh-碳、和Ru-碳是納米顆粒。在一些實(shí)施方案中，所述裝置還可以包括選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第一氧 化劑和/或選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)的第二氧化劑，將其放置(諸如沉積)在工作電 極上或附近。例如，可以將第一氧化劑和/或第二氧化劑放置在電極載體上。在一些實(shí)施 方案中，所述裝置還可以包括將糖化血紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基酸的一種或多種蛋 白酶，將其放置(諸如沉積)在工作電極上或附近。例如，所述一種或多種蛋白酶可以放置 在所述電極載體上。在一些實(shí)施方案中，所述裝置還可以包括溶解血樣中紅細(xì)胞并且釋放 血紅蛋白的去污劑，其中將所述去污劑放置(諸如沉積)在工作電極上或附近，或與所述電 極隔開(kāi)的樣品槽中。在一些實(shí)施方案中，將果糖基氨基酸氧化酶配制在基質(zhì)中并且放置在所述工作電 極上或附近。在一些實(shí)施方案中，將糖化血紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基酸的一種或多 種蛋白酶被配制在基質(zhì)中并且被放置在工作電極上含有所述果糖基氨基酸氧化酶的基質(zhì) 的頂部。在一些實(shí)施方案中，所述基質(zhì)包括酶固定化試劑(諸如連接劑)和增稠聚合物。
在一些實(shí)施方案中，所述裝置還包括在工作電極、對(duì)電極和/或參比電極上限定 封閉空間的絕緣/覆蓋層，其中所述絕緣/覆蓋層形成用于接收樣品的槽，其中所述樣品槽 位于電極上或在電極附近。在一些實(shí)施方案中，所述裝置還包括在所述樣品槽和所述工作 電極之間的樣品傳遞路徑。在一些實(shí)施方案中，樣品槽含有選擇性氧化低分子量還原物質(zhì) 的第一氧化劑和選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)的第二氧化劑。在一些實(shí)施方案中，樣品槽 還含有將糖化血紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基酸的一種或多種蛋白酶。在一些實(shí)施方案 中，樣品槽還含有溶解血樣中的紅細(xì)胞并且釋放血紅蛋白的去污劑。在一些實(shí)施方案中，所 述裝置包括通過(guò)毛細(xì)管作用接收樣品的毛細(xì)管填充通道，其中所述通道的一端與所述工作 電極接觸。在一些實(shí)施方案中，本文所描述的裝置中的工作電極和/或?qū)﹄姌O包括選自由 Ir-碳、他-碳、和Ru-碳組成的組的金屬化碳。在一些實(shí)施方案中，所述裝置中的參比電極 包括 Ag/AgCl。在一些實(shí)施方案中，使用厚膜技術(shù)或使用薄膜平版印刷術(shù)將所述電極絲網(wǎng)印刷。本發(fā)明還提供測(cè)量樣品中糖化血紅蛋白(HbAlc)百分比的方法，所述方法包括a) 將血樣施加到本文所描述的電極裝置的工作電極，其中所述血樣已經(jīng)用下列物質(zhì)處理或在 所述裝置中用下列物質(zhì)處理1)溶解來(lái)自血樣中的紅細(xì)胞并且從紅細(xì)胞釋放血紅蛋白的 去污劑；幻選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第一氧化劑；幻選擇性氧化高分子量還原物質(zhì) 的第二氧化劑；和4)將糖化血紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶；b)在工作電極 和參比電極之間施加電勢(shì)，所述電勢(shì)適合于監(jiān)控由果糖基氨基酸氧化酶催化的反應(yīng)產(chǎn)生的 過(guò)氧化氫；c)測(cè)量工作電極和對(duì)電極之間的電流和在所述工作電極處通過(guò)的電荷；并且由 此在不單獨(dú)測(cè)量血樣中總血紅蛋白的情況下，基于與基準(zhǔn)(諸如校正曲線)相比的測(cè)量的 電流或電荷確定樣品中的糖化血紅蛋白百分比。通過(guò)將樣品吸移到工作電極上，通過(guò)將電 極裝置浸漬到樣品中，或者通過(guò)經(jīng)由毛細(xì)管填充通道的毛細(xì)管作用，可以將血樣施加到工 作電極。本發(fā)明還提供測(cè)量樣品中糖化血紅蛋白(HbAlc)百分比的方法，所述方法包括a) 將血樣施加到本文所描述的電極裝置的樣品接收槽，其中所述血樣已經(jīng)用下列物質(zhì)處理或 在所述裝置中用下列物質(zhì)處理1)溶解來(lái)自血樣中的紅細(xì)胞并且從紅細(xì)胞釋放血紅蛋白 的去污劑；幻選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第一氧化劑；幻選擇性氧化高分子量還原物 質(zhì)的第二氧化劑；和4)將糖化血紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶；b)在工作電 極和參比電極之間施加電勢(shì)，所述適合于監(jiān)控由果糖基氨基酸氧化酶催化的反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò) 氧化氫；c)檢測(cè)或測(cè)量工作電極和對(duì)電極之間的電流或在所述工作電極處通過(guò)的電荷；并 且由此在不單獨(dú)測(cè)量血樣中總血紅蛋白的情況下，基于與基準(zhǔn)(諸如校正曲線)相比的測(cè) 量的電流或電荷確定樣品中的糖化血紅蛋白百分比。在一些實(shí)施方案中，將血樣在單獨(dú)的 管或小瓶中的溶解緩沖液中溶解，并且然后將血液溶解產(chǎn)物施加到樣品接收槽中。在本文所描述的任一項(xiàng)方法中，經(jīng)由介體或催化劑直接或間接地電化學(xué)檢測(cè)由果 糖基氨基酸氧化酶催化的反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫。在本文所描述的任一項(xiàng)方法中，以時(shí)延方 式在工作電極和參比電極之間施加電勢(shì)。在一些實(shí)施方案中，本文所描述的電極裝置還可以包括第二工作電極和另外的與 葡萄糖反應(yīng)的酶，諸如葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶，以使用單個(gè)裝置測(cè)量HbAlc和葡萄糖兩者。本發(fā)明還提供包括本文所描述的電極裝置和用于信號(hào)檢測(cè)的裝置(諸如讀數(shù)器) 的電化學(xué)生物傳感器。在一些實(shí)施方案中，用于信號(hào)檢測(cè)的裝置還可以包括將測(cè)試結(jié)果傳 送到數(shù)據(jù)庫(kù)或傳送到一個(gè)或多個(gè)電子郵件地址的無(wú)線數(shù)據(jù)連接。本發(fā)明還提供用于測(cè)量樣品中的糖化血紅蛋白(HbAlc)百分比的試劑盒，所述試 劑盒包括本文所描述的電極裝置，和用于由電極裝置產(chǎn)生的檢測(cè)電流或電荷的讀數(shù)器。所 述試劑盒還可以包括溶解血細(xì)胞以釋放血紅蛋白的試劑；選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的 第一氧化劑；選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)的第二氧化劑；和/或?qū)⑻腔t蛋白消化成 糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶。所述試劑盒還可以包括實(shí)施本文所描述的方法的說(shuō)明書(shū)。應(yīng)當(dāng)理解，可以組合本文所描述的多種實(shí)施方案的一個(gè)、一些或全部性質(zhì)以形成 本發(fā)明的其它實(shí)施方案。本發(fā)明的這些及其它方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見(jiàn)。附圖的數(shù)幅視圖的簡(jiǎn)述

圖1顯示具有下列三個(gè)電極的電極裝置工作電極、參比電極和對(duì)電極。圖2顯示具有下列兩個(gè)電極的電極裝置工作電極和參比電極。圖3顯示具有三個(gè)電極(工作電極、參比電極和對(duì)電極)、單獨(dú)的樣接收槽、以及樣 品接收槽和工作電極之間的微通道的電極裝置。圖4顯示具有毛細(xì)管填充微通道的電極裝置。通過(guò)在電極載體的頂部上的夾層形 成所述微通道。圖5顯示具有已知的HbAlc百分比的血樣的電流分析法。將溶解的樣品吸移到電 化學(xué)測(cè)量的生物傳感器上。圖6顯示具有已知的HbAlc百分比的血樣的電流分析法。將生物傳感器浸沒(méi)到用 于電化學(xué)測(cè)量的溶解血樣中。圖7顯示具有已知的HbAlc百分比的血樣的電流分析法。生物傳感器具有由夾層 形成的毛細(xì)管填充微通道，并且被浸沒(méi)到溶解血樣中達(dá)數(shù)秒，然后用于電化學(xué)測(cè)量。發(fā)明詳述本發(fā)明提供，在不單獨(dú)測(cè)量總血紅蛋白情況下用于測(cè)量血樣中糖化血紅蛋白 (HbAlc)百分比的電化學(xué)生物傳感器，以及使用這些生物傳感器的方法。生物傳感器是基于 從糖化血紅蛋白分子酶促地產(chǎn)生H2A并且使用電化學(xué)生物傳感器電化學(xué)檢測(cè)H2A的原理。將所述生物傳感器設(shè)計(jì)成使用涉及下列產(chǎn)生H2A的反應(yīng)或過(guò)程的方法測(cè)量血樣 中糖化血紅蛋白(HbAlc)百分比a)用溶解緩沖液溶解血樣中的紅細(xì)胞以釋放血紅蛋白； b)用選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第一氧化劑氧化溶解產(chǎn)物；c)用選擇性氧化高分子 量還原物質(zhì)的第二氧化劑氧化所述溶解產(chǎn)物；d)將溶解產(chǎn)物與蛋白酶接觸以形成含有糖 化肽和/或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)碎片和/或氨基酸；和e)將所述蛋白質(zhì)碎片與果糖基氨基 酸氧化酶(諸如果糖基纈氨酸氧化酶(FVO))接觸以產(chǎn)生過(guò)氧化氫(H2O2)。使用生物傳感器 測(cè)量產(chǎn)生的H2O2，并且使用由生物傳感器測(cè)量的電流或電荷，通過(guò)將所測(cè)量的電流或電荷與 基準(zhǔn)(諸如校正曲線)比較，從而在不單獨(dú)測(cè)量血樣中總血紅蛋白的情況下測(cè)定樣品中總 的糖化血紅蛋白的百分比或糖化血紅蛋白Alc的百分比。通過(guò)使用基準(zhǔn)(諸如校正曲線)， 可以在不需要單獨(dú)測(cè)量總血紅蛋白的情況下，通過(guò)使用H2A檢測(cè)電極裝置和信號(hào)檢測(cè)計(jì)直 接報(bào)告樣品中的HbAlc。
A.定義除非另外限定，本文中使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。將本文中參考的全部專利、申請(qǐng)、公布的申請(qǐng)和其他出 版物整體地通過(guò)引用結(jié)合。如果此部分中陳述的定義與通過(guò)引用結(jié)合在本文中的專利、申 請(qǐng)、公布的申請(qǐng)及其它出版物中陳述的定義相反或以其它方式不一致，則此部分中陳述的 定義優(yōu)先于通過(guò)引用結(jié)合在本文中的定義。如本文所用，“一個(gè)(a) ”或“一個(gè)(an) ”指的是“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)”。如本文所用，“果糖基氨基酸氧化酶”或“FA0D”指的是催化阿馬多里(Amadori)產(chǎn) 物的氧化去糖化以得到相應(yīng)的氨基酸、葡糖醛酮和H2A的酶，如下列反應(yīng)所示R1-CO-CH2-NMJOfH2O — R1-C0-CH0+R2-NH2+H202其中R1表示還原糖的醛糖殘基并且&表示氨基酸、蛋白質(zhì)或肽的殘基。FAOD的 實(shí)例是果糖基纈氨酸氧化酶(FVO)。阿馬多里酶(Amadoriase)的其它同物異名包括阿馬 道里酶(amadoriase)和果糖基胺氧氧化還原酶(FAOO)。為了本文的目的，雖然全部這樣 的化學(xué)同物異名均可以考慮，但是本文中使用名稱“果糖基氨基酸氧化酶”?！肮腔被?酸氧化酶”還包括仍然基本上保持它的催化Amadori產(chǎn)物的氧化去糖化以得到相應(yīng)的氨基 酸、葡糖醛酮和H2A的酶活性的功能片段或衍生物。典型地，功能片段或衍生物保持其阿 馬多里酶活性的至少50%。優(yōu)選地功能片段或衍生物保持其阿馬多里酶活性的至少60%、 70 %、80 %、90 %、95 %、99 %或100 %。還預(yù)期的是，果糖基氨基酸氧化酶可以包括基本上不 改變它的活性的保守氨基酸置換。適合的氨基酸保守置換對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的并 且一般可以在不改變所得分子的生物活性的情況下進(jìn)行。通常，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，多肽 的非必要區(qū)域的單一氨基酸置換基本上不改變生物活性(見(jiàn)，例如，Watson等，Molecular Biology of the Gene (基因分子生物學(xué))，第 4版，1987，the Benjamin/Cummings Pub. Co., 第2 頁(yè))。優(yōu)選依照如下表1中陳述的那些進(jìn)行這樣的例舉性置換表1原始?xì)埢Ｊ刂脫QAla(A)Gly ；SerArg(R)LysAsn(N)Gln ；HisCys(C)SerGln(Q)AsnGlu(E)AspGly(G)Ala ；ProHis(H)Asn ；GlnIle(I)Leu ；ValLeu(L)Ile ；ValLys(K)Arg ；Gln ；GluMet (M)Leu ；Tyr ；IlePhe (F)Met ；Leu ；TyrSer(S)Thr
Thr (T)Trp (W)Tyr (Y)Val (V)
Ser Tyr
Trp ；Phe Ile ；Leu其它置換也是可允許的并且可以經(jīng)驗(yàn)性地或根據(jù)已知的保守置換確定。如本文所用，“過(guò)氧化物酶”指的是催化反應(yīng)主體的酶，在所述反應(yīng)中，過(guò)氧化氫是 特異的氧化劑并且許多底物作為電子供體。旨在包括具有保守氨基酸置換的過(guò)氧化物酶， 所述保守氨基酸置換基本上不改變它的活性。主要的商售過(guò)氧化物酶是辣根過(guò)氧化酶。如本文所用，“組合物”指的是兩種或多種產(chǎn)物或化合物的任意混合物。它可以是 溶液、懸浮液、液體、粉末、糊劑、水性的、非水性的，或其任何組合。B.用于直接測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的電化學(xué)生物傳感器在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供供電化學(xué)檢測(cè)器所用的電極裝置，所述電化學(xué)檢測(cè)器 用于在不需要單獨(dú)測(cè)量血紅蛋白總量的情況下測(cè)量血樣中的糖化血紅蛋白(HbAlc)百分 比。設(shè)計(jì)所述電極裝置以便它具體地測(cè)量由果糖基氨基酸氧化酶(諸如果糖基纈氨酸氧化 酶(FVO))催化的特異性酶促反應(yīng)所產(chǎn)生的H2O2量。電極裝置包括電極載體，在所述電極載 體上放置工作和參比電極，工作和對(duì)電極，或工作、參比和對(duì)電極。電極在電極載體上是相 互隔開(kāi)的。將酶FAOD放置(諸如沉積或澆注)在工作電極之上或附近(包括周圍)?？梢?用絕緣層覆蓋電極以保護(hù)電連接路徑并且限定電極區(qū)域或電極接頭。見(jiàn)圖1-4。電極裝置 還可以包括覆蓋層以形成具有限定空間的樣品槽。見(jiàn)圖3。樣品槽可以定位在工作電極周 圍或單獨(dú)位置中，所述單獨(dú)位置經(jīng)由樣品傳送路徑(諸如微通道)連接到工作電極。見(jiàn)圖 3。樣品槽也可以是毛細(xì)管填充通道的形式，其容許通過(guò)毛細(xì)管作用的樣品接收。毛細(xì)管填 充通道的一端與工作電極接觸?？梢酝ㄟ^(guò)層壓由層產(chǎn)生毛細(xì)管填充通道。這樣的毛細(xì)管填 充通道的實(shí)例顯示在圖4中。本領(lǐng)域已知的任何其它樣品槽或毛細(xì)管填充通道設(shè)計(jì)可以包 括在所述裝置中。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)6，270，637。電化學(xué)生物傳感器一般包括電極裝置和用于信號(hào)檢測(cè)的裝置(讀數(shù)器)。用于信 號(hào)檢測(cè)的裝置還可以包括將測(cè)試結(jié)果傳送到數(shù)據(jù)庫(kù)或傳送到一個(gè)或多個(gè)電子郵件地址的 無(wú)線數(shù)據(jù)連接。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法制造所述電極。例如，可以通過(guò)電極載體(諸如 聚酯基片)上的厚膜技術(shù)(諸如絲網(wǎng)印刷和噴墨印刷)或薄膜平版印刷術(shù)制造所述電極。 在一些實(shí)施方案中，電極的電接頭是銀，并且將電極(工作電極、對(duì)電極和/或參比電極) 印刷在銀電極基體的頂部上。在一些實(shí)施方案中，將工作電極和/或?qū)﹄姌O用金屬化碳諸 如Ir-碳、Rh-碳和Ru-碳絲網(wǎng)印刷。在一些實(shí)施方案中，Ir-碳、Rh-碳、和Ru-碳是納米 顆粒。在一些實(shí)施方案中，參比電極是用Ag/AgCl絲網(wǎng)印刷的。在一些實(shí)施方案中，催化劑諸如鉬族金屬(他、Ir、Ru、Os)包括在工作電極和/或 對(duì)電極中。例如，可以通過(guò)組合成用于印刷所述電極的導(dǎo)電組合物而沉積所述催化劑。導(dǎo) 電組合物包括，但不限于，金屬化碳，聚合物(包括粘合劑和水-強(qiáng)度聚合物)和水或無(wú)機(jī) 溶劑(諸如0. 1Μ，ρΗ7.0磷酸鹽緩沖液)。金屬化碳中的金屬可以是純金屬諸如鉬、金、銀、 鈀、釕、銠、銥，它們的氧化物或合金。例如，所述金屬化碳包括在具有納米大小尺度的碳顆 粒表面上涂層的金屬。粘合劑包括羥乙基纖維素或羥丙基纖維素。濕-強(qiáng)度聚合物包括聚乙烯亞胺；聚(丙烯酸)，鉀鹽；聚(丙烯酸)，鈉鹽；聚(丙烯酸-丙烯酰胺共聚物)，鉀 鹽；聚(丙烯酸)，鈉鹽-聚(環(huán)氧乙烷)接枝聚合物；聚O-甲基丙烯酸羥乙酯) ’聚0甲 基丙烯酸-羥丙酯)；聚(異丁烯-順丁烯二酸共聚物)或其組合。一般地，所述粘合劑用 濕-強(qiáng)度聚合物交聯(lián)的。因此，在通過(guò)絲網(wǎng)印刷在條上形成電極以后，通過(guò)隨后步驟蒸發(fā)水 或無(wú)機(jī)溶劑。在一些實(shí)施方案中，在工作電極和/或?qū)﹄姌O中包括介體，并且所述介體可以選 自通常使用的介體諸如二茂鐵、普魯士藍(lán)，和任何其它的已知介體。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào) 6，863，800 ；和 6，329，161。在一些實(shí)施方案中，電極裝置包括條，所述條具有作為電極載體的基片；配置在 基片上以限定樣品區(qū)域的至少兩個(gè)電極；配置在樣品區(qū)域上的試劑，其中所述電極具有 0. 1-5重量％范圍內(nèi)的金屬、小于55重量％范圍內(nèi)的石墨、和聚合物。在一些實(shí)施方案中， 石墨是細(xì)粒度的，并且將金屬涂布在具有納米大小尺度的石墨顆粒的表面上。金屬可以包 括鉬、金、銀、鈀、釕、銠、銥，它們的氧化物或合金。所述聚合物可以包括粘合劑(包括羥乙 基纖維素或羥丙基纖維素)和濕-強(qiáng)度聚合物(包括聚乙烯亞胺 ’聚(丙烯酸)，鉀鹽；聚 (丙烯酸)，鈉鹽；聚(丙烯酸-丙烯酰胺共聚物)，鉀鹽；聚(丙烯酸)，鈉鹽-聚(環(huán)氧乙 烷)接枝聚合物；聚O-甲基丙烯酸羥乙酯)；聚O-甲基丙烯酸羥丙酯)；聚(異丁烯-順 丁烯二酸共聚物)或其組合)。電極裝置還可以包括配置在電極和基片之間的導(dǎo)電層；并 且可以用分散在有機(jī)溶劑中的石墨將所述導(dǎo)電層絲網(wǎng)印刷。在一些實(shí)施方案中，導(dǎo)電層和 電極以不同的步驟通過(guò)絲網(wǎng)印刷形成。在一些實(shí)施方案中，所述試劑包括酶(諸如果糖基 氨基酸氧化酶)。電極裝置的實(shí)例描述在美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2009/0090623，將其通過(guò)引 用全部結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，將酶果糖基氨基酸氧化酶(諸如FV0)配制在含有酶固定化試 劑諸如戊二醛和增稠聚合物諸如2-羥乙基纖維素的基質(zhì)中，并且將其沉積或澆注在工作 電極附近或之上。在一些實(shí)施方案中，酶果糖基氨基酸氧化酶(諸如FV0)還包括在單獨(dú)試 劑層中，所述單獨(dú)試劑層被放置在工作電極上的固定化酶層的頂部上。參與測(cè)量糖化血紅蛋白(HbAlc)百分比的反應(yīng)使用從血樣中的紅細(xì)胞釋放血紅 蛋白的溶解緩沖液，選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第一氧化劑，選擇性氧化高分子量還 原物質(zhì)的第二氧化劑，和將糖化血紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶。這些試劑 的一種或多種可以放置(諸如沉積或澆注)在工作電極附近或之上。在一些實(shí)施方案中， 將蛋白酶配制在含有酶固定化試劑和增稠聚合物的基質(zhì)中，并且沉積或澆注在工作電極附 近或之上。在一些實(shí)施方案中，在單獨(dú)試劑層中還包括蛋白酶，所述單獨(dú)試劑層被放置在工 作電極附近或之上的固定化FAOD酶層的頂部上。在一些實(shí)施方案中，所述電極裝置還可以 包括樣品槽、從樣品槽到工作電極的樣品傳送路徑(諸如微通道)、或毛細(xì)管填充通道，并 且所述試劑的一種或多種可以放置(諸如沉積或澆注)在樣品槽、樣品傳送路徑或毛細(xì)管 填充通道中。例如，在到達(dá)工作電極以前將血樣中的血紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基酸。 在一些實(shí)施方案中，將這些試劑的一種或多種放置(諸如沉積或澆注)在圍繞工作電極的 區(qū)域中或在對(duì)電極和工作電極之間和/或最參比電極和工作電極之間的區(qū)域中的條載體 上。例如，這些試劑可以與墨水基溶液混合并且絲網(wǎng)印刷在所述條載體上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將電極裝置配置為含有兩個(gè)工作電極、一個(gè)對(duì)電極和一個(gè)參比電極的生物恒電位儀。一個(gè)工作電極用于HbAlc測(cè)試并且將另一個(gè)用于葡萄糖測(cè)試。 用于葡萄糖測(cè)試的酶可以是葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶，并且用于HbAlc測(cè)試的酶是果 糖基氨基酸氧化酶(諸如FV0)。本發(fā)明的電極裝置可以是采取不同的電極結(jié)構(gòu)并且可以使用本領(lǐng)域已知的方 法制成。例如，電極裝置可以用絲網(wǎng)印刷方法制成。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5，682，884; 5，120，420 ；5, 320，732?？梢允褂秒姌O裝置測(cè)定的血樣包括全血或收集的血細(xì)胞。將血樣中的紅細(xì)胞溶解 以釋放血紅蛋白?？梢允褂萌魏慰梢匀芙饧t細(xì)胞并且釋放血紅蛋白的溶解緩沖液(例如， 在酸性或堿性PH范圍內(nèi))。溶解緩沖液一般含有去污劑，諸如曲拉通(Triton)(例如Triton X-100)、吐溫(例如，吐溫20)、十二烷基硫酸鈉(SDQ、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)、溴化 十四烷基三甲基銨(TTAB)、聚氧乙烯十二烷基醚(POEs) JPNonidet P_40 (NP-40)?？梢允褂萌魏芜m合的蛋白酶?？梢允褂脙?nèi)型蛋白酶或外型蛋白酶。例舉性的內(nèi)型 蛋白酶包括胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、組織蛋 白酶B、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、蛋白酶XVII、蛋白酶XXI、賴氨酰-內(nèi)肽酶、prolether和 菠蘿蛋白酶F。例舉性的外型蛋白酶包括氨基肽酶或羧肽酶。在一個(gè)實(shí)施例中，所述蛋白酶 是蛋白酶K，鏈霉蛋白酶F，ananine，嗜熱菌蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶或牛胰腺蛋白酶。也可 以使用來(lái)自曲霉菌屬、脂環(huán)酸芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬的金屬蛋白酶和中性蛋白酶。蛋白酶可用于產(chǎn)生任何適合大小的糖化肽。例如，蛋白酶可用于產(chǎn)生約2至約30 個(gè)氨基酸殘基的糖化肽。在另一個(gè)實(shí)施例中，蛋白酶用于產(chǎn)生糖化甘氨酸、糖化纈氨酸或糖 化賴氨酸殘基，或包括糖化甘氨酸、糖化纈氨酸或糖化賴氨酸殘基的糖化肽。將糖化肽和/或糖化氨基酸與果糖基氨基酸氧化酶接觸?？梢允褂萌魏喂腔?氨基酸氧化酶(FAOD)?？梢约兓蛑亟M生產(chǎn)果糖基氨基酸氧化酶?？梢允褂萌魏翁烊淮?在的種類。在一個(gè)實(shí)施例中，使用的FAOD是曲霉菌屬來(lái)源的(參見(jiàn)，例如，Takahashi等， J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)272 (6) =3437-43,1997) 0還可以使用其它果糖基氨基酸 氧化酶，例如，在GenBank登錄號(hào)U82830 (Takahashi等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)， 272(19) :12505-12507(1997)和公開(kāi)的美國(guó)專利號(hào)6，127，138中所公開(kāi)的。還可以使用阿 馬多里酶的功能片段或衍生物，所述功能片段或衍生物仍然基本上保留它的催化阿馬多里 產(chǎn)物的氧化去糖化的酶活性以得到相應(yīng)的氨基酸、葡糖醛酮和H202。通常，阿馬多里酶的功能片段或衍生物保留它的酶活性的至少50%。優(yōu)選地，阿 馬多里酶的功能片段或衍生物保留它的酶活性的至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、 99% 或 100%?？梢允褂妹绹?guó)公開(kāi)號(hào)2005/0014935中描述的具有FVO酶活性的嵌合蛋白質(zhì)的任 意一種。在一些實(shí)施方案中，果糖基氨基酸氧化酶從N-末端至C-末端包括a)包括約5至 約30個(gè)氨基酸殘基的細(xì)菌前導(dǎo)序列的第一肽基片段；和b)包括FVO的第二肽基片段。在 一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VO包括下列氨基酸序列MGGSGDDDDLALAVTKSSSLLIVGAGTWGTSTALHLARRGYTNVTVLDPYPVPSAISAGNDVNKVISS GQYSNNKDEIEVNEILAEEAFNGWKNDPLFKPYYHDTGLLMSACSQEGLDRLGVRVRPGEDPNLVELTRPEQFRKL APEGVLQ⑶FPGWKGYFARSGAGWAHARNALVAAAREAQRMGVKFVTGTPQGRVVTLIFENNDVKGAVTCDGKIW RAERTFLCAGASAGQFLDFKNQLRPTAWTLVHIALKPEERALYKNIPVIFNIERGFFFEPDEERGEIKICDEHPGYTNMVQSADGTMMSIPFEKTQIPKEAETRVRALLKETMPQLADRPFSFARICWCADTANREFLIDRHPQYHSLVL GCGASGRGFKYLPSIGNLIVDAMEGKVPQKIHELIKffNPDIAANRNffRDTLGRFGGPNRVMDFHDVKEffTNVQYR DISKLKGELEGLPIPNPLLRTGHHHHHH(序列編號(hào) 1 (SEQ ID NO :1))?？梢栽诩?xì)菌細(xì)胞諸如大腸桿菌中產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)?？梢詫a(chǎn)生的蛋白質(zhì)純化并 且測(cè)定酶活性。FAOD的酶活性測(cè)定是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如，Takahashi等，J.Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志),272(6) :3437-43(1997)和美國(guó)專利號(hào)6，127，138)。四個(gè)例舉性的 阿馬多里酶的酶活性測(cè)定公開(kāi)在Takahashi等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志),272(6) 3437-43(1997)中。第一氧化劑是選擇性氧化低分子量(分子量< 3000)的還原物質(zhì)的氧化劑類型。 第一氧化劑對(duì)于低分子量還原物質(zhì)比對(duì)于高分子量(分子量> 3000)還原物質(zhì)具有更高氧 化力。血樣中低分子量物質(zhì)的實(shí)例是抗壞血酸和游離的含硫分子。第一氧化劑的實(shí)例是戴 斯-馬丁氧化劑(Dess-Martin periodinane)和N-乙基馬來(lái)酰亞胺。第一氧化劑的其它 實(shí)例是碘乙酸鈉、高碘酸鈉和氯胺-T。在一些實(shí)施方案中，使用多于一種的第一氧化劑(例 如，戴斯-馬丁氧化劑和N-乙基馬來(lái)酰亞胺這兩者)。第二氧化劑是選擇性氧化高分子量(分子量> 3000)還原物質(zhì)的氧化劑類型。第 二氧化劑對(duì)于高分子量還原物質(zhì)比低分子量還原物質(zhì)具有更高的氧化力。血樣中的高分 子量物質(zhì)的實(shí)例是血紅蛋白。第二氧化劑的實(shí)例是四唑鹽(例如，2-(4-碘苯基)-3-(2， 4- 二硝基苯基)-5- (2,4- 二磺苯基)-2H-四唑一鈉鹽，或2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯 基)-5- (2,4- 二磺苯基)-2H-四唑一鈉鹽)。第二氧化劑的其它實(shí)例是十二烷基硫酸鈉，鐵 氰化鉀(III)，和碘酸鉀。在一些實(shí)施方案中，使用多于一種的第二氧化劑。對(duì)于沒(méi)有在電極裝置中放置去污劑、第一氧化劑、第二氧化劑和蛋白酶的實(shí)施方 案，可以將血樣用溶解緩沖液、第一氧化劑、第二氧化劑和蛋白酶處理，之后將所述樣品施 加到電極裝置?？梢詫⑷ノ蹌?、第一氧化劑、第二氧化劑和蛋白酶配制在一種或多種試劑 中，并且可以是液體或凍干粉的形式。這些試劑可以包括在本文描述的試劑盒中。在一些 實(shí)施方案中，可以將溶解緩沖液和第一氧化劑(例如，N-乙基馬來(lái)酰亞胺和/或戴斯-馬 丁氧化劑)配制在一種試劑中。在一些實(shí)施方案中，第二氧化劑和蛋白酶可以是一種或單 獨(dú)的試劑形式。含有去污劑、戴斯-馬丁氧化劑和N-乙基馬來(lái)酰亞胺的溶解緩沖液可以用 于溶解血細(xì)胞。例如，溶解緩沖液可以含有25-100mM CHES pH 9. 4、1_3%曲拉通(Triton) χ-100、0· l-5mM(諸如約0. 1、0· 5、1、2、3、4或5mM中的任一種)戴斯-馬丁氧化劑、禾口 0. 2-5mM(諸如約0. 2、1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5或5mM中的任一種)N-乙基馬來(lái)酰亞胺。 可以將含有緩沖液、CaCl2和蛋白酶的試劑Rla，和含有緩沖液、氯化鈉和WST3的試劑Rlb 以及蛋白酶混合用于將溶解血樣中的糖化血紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基酸。例如，試 劑 Rla 可以含有 pH 6. 5 的 10_50mM MES 緩沖液、5-10mM CaCl2、禾口 500_1500U/ml 中性蛋白 酶(Toyobo有限公司)；并且試劑Rlb可以含有pH 6. 5的10_50mM MES、100_200mM氯化鈉、 和 0. 2-6mM(諸如約 0. 2,0. 5、1、2、3、4、5 或 6mM 中的任一種)WST3 (2-碘苯基)-3-(2， 4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑、一鈉鹽(由Dojindo實(shí)驗(yàn)室(Dojindo Laboratories)制造)，以及l(fā)OOuLpH 7. O的5mM MES緩沖溶液中的10-200單位(諸如約 10、50、60、70、80、90、100、150或200單位中的任一種)的蛋白酶。試劑的實(shí)例描述在本文 的實(shí)施例1和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2008/0096230中。
本發(fā)明還提供包括本文所述電極裝置的試劑盒。如果并非全部試劑需要被放置在 電極裝置中，則所述試劑盒還可以包括用于使用電極裝置的試劑。試劑盒還可以包括使用 電極裝置和/或試劑的說(shuō)明書(shū)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括本文所描述的電極裝置，用 于檢測(cè)或測(cè)量工作電極和對(duì)電極之間的電流或在電極裝置的工作電極處通過(guò)的電荷的儀 表或讀數(shù)器，和選自由下列各項(xiàng)組成的組的一種或多種試劑1)溶解血樣中的紅細(xì)胞并且 從紅細(xì)胞釋放血紅蛋白的去污劑；幻選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第一氧化劑；；3)選擇 性氧化高分子量還原物質(zhì)的第二氧化劑，和4)將糖化血紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基 酸的蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，所述儀表或讀數(shù)器包括能夠使電極裝置插入其中的分配 器(lot)。例舉性實(shí)施方案圖1顯示用絲網(wǎng)印刷法制造的例舉性電極裝置。該生物傳感器包括工作電極、參 比電極、和對(duì)電極。工作電極和對(duì)電極都是Ir-碳改性的或普魯士藍(lán)改性的；并且參比電極 是Ag/AgCl電極。將這些電極絲網(wǎng)印刷在聚酯基片上。通過(guò)在聚酯基片上絲網(wǎng)印刷而制備工作電極和對(duì)電極。這些電極的電接頭是銀， 并且首先用銀墨水印刷所述電極。進(jìn)一步將Ir-碳墨水或普魯士藍(lán)墨水印刷在銀基電極 上。通過(guò)將0. 5-2. Og的Ir-碳與5-30ml含有0. 5_5ml聚乙烯亞胺和0. 1-1. Og的2-羥乙 基纖維素的墨水基溶液混合并勻化(例如，約5.0分鐘)而制備Ir-碳墨水。例如，通過(guò)將 0. 9g Ir-碳與5ml墨水基溶液(通過(guò)將IOml pH 7. 0磷酸鹽緩沖液與1. 36ml聚乙烯亞胺 和0.34g 2-羥乙基纖維素混合直到已經(jīng)獲得清澈均勻溶液而制備)混合而制備Ir-碳墨 水。通過(guò)將0. 5-2. Og普魯士藍(lán)顆粒與5-30ml商售碳墨水混合并勻化(約5分鐘)而制 備普魯士藍(lán)墨水。使用下列步驟制備普魯士藍(lán)顆粒。將1克石墨粉和IOml 0. IM氯化鐵 (III)在攪拌情況下混合2分鐘。接著，添加2-20ml的0. IM鐵氰化鉀，并將得到的溶液攪 拌10分鐘。將得到的混合物過(guò)濾，并在100°C干燥2-20小時(shí)。也通過(guò)在聚酯基片上絲網(wǎng) 印刷而制備AgClAg參比電極。參比電極的電接頭是通過(guò)用銀墨水印刷而制備的銀。使用 AgCl厚膜并將其印刷在銀基電極上，用作Ag/AgCl參比電極。參見(jiàn)，F(xiàn)ang等，knsors and Actuators (傳感器和驅(qū)動(dòng)器)B 129 :818_825，2008。將上述銥改性的電化學(xué)傳感器結(jié)構(gòu)用作構(gòu)建果糖基氨基酸氧化酶生物傳感器的 基礎(chǔ)。通過(guò)將Iml的Ir-碳墨水與果糖基氨基酸氧化酶混合直到獲得清澈溶液而制備果糖 基氨基酸氧化酶(諸如FV0)墨水。本文中描述的蛋白酶、溶解緩沖液、第一氧化劑、和/或 第二氧化劑也可以包括在FAOD墨水中。將FAOD墨水添加到Ir-碳工作電極上并容許干燥。上述普魯士藍(lán)改性的電化學(xué)傳感器結(jié)構(gòu)也可以用作構(gòu)建果糖基氨基酸氧化酶生 物傳感器的基礎(chǔ)。通過(guò)將Iml的普魯士藍(lán)墨水與果糖基氨基酸氧化酶混合直到獲得清澈溶 液而制備果糖基氨基酸氧化酶(諸如FV0)。本文中描述的蛋白酶、溶解緩沖液、第一氧化 劑、和/或第二氧化劑也可以包括在FAOD墨水中。將FAOD墨水添加到Ir-碳工作電極上 并容許干燥。C.使用電化學(xué)生物傳感器用于測(cè)定糖化血紅蛋白百分比的方法本發(fā)明還提供使用本文中描述的電極裝置測(cè)量血樣中糖化血紅蛋白(HbAlc)百 分比的方法。如果含有去污劑、第一氧化劑、第二氧化劑和蛋白酶的溶解緩沖液包括在電極 裝置中，則可以將血樣直接施加到電極裝置中。如果電極裝置中沒(méi)有包括這些試劑的一種或多種，則可以在施加到電極裝置之前預(yù)處理血樣。例如，可以將血樣用含有去污劑、第一 和第二氧化劑以及一種或多種蛋白酶的緩沖液處理血樣以將血細(xì)胞溶解在試管中。然后通 過(guò)吸移到工作電極上、通過(guò)毛細(xì)管填充到工作電極中、或通過(guò)將電極浸入到溶解樣品中而 將溶解產(chǎn)物施加到工作電極。如果電極裝置具有樣品接收空間，則將溶解產(chǎn)物施加到電極 裝置上的樣品接收空間用于與FAOD進(jìn)一步反應(yīng)以產(chǎn)生H2A用于電流測(cè)量檢測(cè)。將電勢(shì)施加在工作電極和對(duì)電極之間和/或工作電極和參比電極之間。測(cè)量工作 電極和對(duì)電極之間的電流、工作電極和參比電極之間的電流，或測(cè)量在工作電極處通過(guò)的 電荷，并且所測(cè)量的電流或電荷對(duì)應(yīng)于產(chǎn)生的H2A的量。在一些實(shí)施方案中，測(cè)量經(jīng)過(guò)一定 時(shí)期諸如1-5分鐘通過(guò)工作電極的電荷。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括a)將血樣施加到電極裝置的工作電極，其 中已經(jīng)對(duì)血樣用下列各項(xiàng)進(jìn)行處理1)從血樣中的紅細(xì)胞釋放血紅蛋白的溶解緩沖液；2) 選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第一氧化劑；幻選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)的第二氧 化劑，和4)將血紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶；b)在工作電極和所述參比電 極之間施加電勢(shì)(例如經(jīng)電流計(jì)或電壓計(jì))，所述電勢(shì)適合于監(jiān)控由果糖基氨基酸氧化酶 催化的反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫；和c)檢測(cè)工作電極和對(duì)電極之間的電流或在工作電極處通 過(guò)的電荷；并且由此在不單獨(dú)測(cè)量血樣中總血紅蛋白情況下，基于與基準(zhǔn)(諸如校正曲線) 相比的測(cè)量的電流或電荷確定樣品中的糖化血紅蛋白百分比。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將樣品施加到電極裝置的樣品接收空間(例 如，槽、樣品槽、毛細(xì)管填充通道)，其中電極裝置包括1)從血樣中的紅細(xì)胞釋放血紅蛋白 的溶解緩沖液；幻選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第一氧化劑；；3)選擇性氧化高分子量還 原物質(zhì)的第二氧化劑，和4)將糖化血紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶；在工作 電極和對(duì)電極之間或工作電極和參比電極之間施加電勢(shì)(例如經(jīng)電流計(jì)或電壓計(jì))；并且 測(cè)量工作電極和對(duì)電極之間的電流或在工作電極處通過(guò)的電荷；由此在不單獨(dú)測(cè)量血樣中 總血紅蛋白情況下，基于與基準(zhǔn)(諸如校正曲線)相比的測(cè)量的電流或電荷確定糖化血紅 蛋白(HbAlc)百分比。在一些實(shí)施方案中，將工作/參比電極或工作/對(duì)電極上的電勢(shì)的 施加延遲某一段時(shí)間以容許氧化劑和樣品中的還原物質(zhì)(諸如血紅蛋白)之間進(jìn)行反應(yīng)以 達(dá)到完成或接近于完成。通過(guò)將測(cè)量的電流或電荷與基準(zhǔn)(諸如校正曲線)比較而確定血樣中總糖化血紅 蛋白的百分比或糖化血紅蛋白Alc的百分比。使用校準(zhǔn)物，即具有已知的糖化血紅蛋白百 分比或已知的糖化血紅蛋白Alc百分比的樣品(包括血樣和人造校準(zhǔn)物)建立校正曲線。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在不單獨(dú)測(cè)量總血紅蛋白的情況下使用用于校準(zhǔn)樣品的 生物傳感器通過(guò)執(zhí)行與未知樣品的相同步驟測(cè)量電流；并且描繪校準(zhǔn)樣品的電流或電荷和 校準(zhǔn)樣品的已知的糖化血紅蛋白百分比或已知的糖化血紅蛋白Alc百分比之間的相關(guān)性， 制備校正曲線。例如，具有通過(guò)與適合的高階(higher order)參考材料相比而賦予的糖化 血紅蛋白Alc百分比值的全血樣品可以用作校準(zhǔn)物。備選地，可以通過(guò)另一種公認(rèn)方法諸 如HPLC確定糖化血紅蛋白Alc百分比。使用本文所描述的方法以與未知樣品相同的方法 測(cè)試校準(zhǔn)物。對(duì)校準(zhǔn)物測(cè)量的電流或電荷針對(duì)預(yù)期的HbAlc值作圖以建立校正曲線?？梢?將每批裝置的校正曲線信息電子存儲(chǔ)在所述裝置中以便使用者不需要自己構(gòu)建校正曲線。除全血樣品以外的校準(zhǔn)物也可以用于建立校正曲線。具有通過(guò)與適合的高階參考材料相比而賦予的糖化血紅蛋白Alc百分比值的適合的緩沖蛋白質(zhì)基質(zhì)溶液中的溶血產(chǎn) 物樣品(溶解的血樣)、糖化肽、糖化氨基酸、和糖化氨基酸衍生物可以用作人造校準(zhǔn)物。例 如，可以在具有10% BSA和適量的對(duì)應(yīng)于多種HbAlc百分比(例如，5%至12%)的合成果 糖基丙胺(糖化氨基酸)的磷酸鹽緩沖液中制備校準(zhǔn)樣品。以與未知樣品相同的方法測(cè)試 人造校準(zhǔn)物，不同之處在于可以不使用溶解步驟。對(duì)這些校準(zhǔn)物測(cè)量的電流值針對(duì)預(yù)期的 HbAlc值作圖以建立校正曲線?？梢詫⑷嗽煨?zhǔn)物凍干或穩(wěn)定以延長(zhǎng)的保存期?？梢允褂帽景l(fā)明的方法和生物傳感器測(cè)定的血樣包括全血或收集的血細(xì)胞。本發(fā) 明的方法和生物傳感器可以用于任何適合的目的，諸如在疾病或功能障礙(例如，糖尿病) 的預(yù)后和診斷中。
實(shí)施例棚列1細(xì)浦M翻卜觀胃入騰口口口 Φ·摩 傳感HbAlc制備具有工作電極、參比電極和對(duì)電極的生物傳感器。工作電極和對(duì)電極都是 Ir-碳改性的；并且參比電極是Ag/AgCl電極。通過(guò)在聚酯基片上絲網(wǎng)印刷而制備工作電 極和對(duì)電極。這些電極的電接頭是銀，并且首先將所述電極用銀墨水印刷。將Ir-碳墨水 進(jìn)一步印刷在銀基電極上。通過(guò)將0.5-2g Ir-碳與5-30ml墨水基的溶液(含有聚乙烯亞 胺和2-羥乙基纖維素)混合并且勻化而制備Ir-碳墨水。工作電極還含有果糖基氨基酸 氧化酶。通過(guò)將Iml的Ir-碳墨水與果糖基氨基酸氧化酶混合直到獲得清澈溶液而制備果 糖基氨基酸氧化酶(諸如具有SEQ ID NO 1中顯示的氨基酸序列的FV0)墨水。也通過(guò)在聚酯基片上絲網(wǎng)印刷而制備Ag/AgCl參比電極。參比電極的電接頭是通 過(guò)用銀墨水印刷而制備的。使用AgCl厚膜并且將其印刷在銀基電極上，用作Ag/AgCl參比 電極。為了測(cè)試生物傳感器，將具有已知HbAlc百分比的血樣用溶解緩沖液(50mM CHES pH 9. 4和2% Triton X-100)在室溫溶解10分鐘。將溶血產(chǎn)物用氧化劑和蛋白酶 CToyobo有限公司)在37°C處理10分鐘。例如，將IOOul血樣在900ul含有50mM CHES pH 9. 4,2% Triton Χ_100、0· l_5mM(諸如 0. 1、0. 5、1、2、3、4、或 5mM)戴斯-馬丁氧化劑、 和 0. 2-5mM(such as 0. 2、1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5 或 5mM)N-乙基馬來(lái)酰亞胺的溶解 緩沖液中溶解。將溶解產(chǎn)物與來(lái)自5ml試劑Rla(pH 6. 5的25mM MES緩沖液，5mM CaCl2, 和1000U/ml中性蛋白酶(Toyobo有限公司))的凍干粉、來(lái)自2. 5mL試劑Rlb (pH 6. 5的 25mM MES, 150mM 氯化鈉，和 0. 2_6mM(諸如 0. 2,0. 5、1、2、3、4、5 或 6mM)WST3 (2-碘苯 基)-3- (2，4- 二硝基苯基)-5- (2,4- 二磺苯基)-2H-四唑，一鈉鹽(由Dojindo實(shí)驗(yàn)室制 造))的凍干粉，和在IOOuL pH 7. O的5mM MES緩沖溶液中的10-200單位(諸如10、50、 60、70、80、90、100、150或200單位)的蛋白酶混合。最終溶液具有1. ImL的總體積并且將 其在37°C的溫度下溫育10分鐘。將;3uL的溫育溶液放置(通過(guò)吸移)到具有酶FAOD的工作電極上用于電化學(xué)測(cè) 量。以相對(duì)于Ag/AgCl參比電極+0.25V進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量120秒。對(duì)于每個(gè)樣品測(cè)量的工作 電極和對(duì)電極之間的電流顯示在圖4中。備選地，將生物傳感器浸入到溫育溶液用于電化 學(xué)測(cè)量。以相對(duì)于Ag/AgCl參比電極+0.25V進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量120秒。對(duì)于每個(gè)樣品測(cè)量的電流顯示在圖5中。圖5和6中的數(shù)據(jù)表明，從生物傳感器測(cè)量的電流與血樣中的HbAlc 百分比符合線性模型，并且生物傳感器和所述方法可以用于在不單獨(dú)測(cè)量總血紅蛋白的情 況下測(cè)定糖化血紅蛋白百分比。 ^mm 2 ^mn^^Mmt^Mwm^.mm^A^muhkic將實(shí)施例1中描述的生物傳感器手工層壓以形成毛細(xì)管填充裝置。見(jiàn)圖4。將生物傳感器浸入到實(shí)施例1的溫育溶液中達(dá)數(shù)秒以通過(guò)毛細(xì)管作用將微通道 用溶血產(chǎn)物填充。然后將生物傳感器用于電化學(xué)測(cè)量。以相對(duì)于Ag/AgCl參比電極+0.25V 進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量120秒。對(duì)于每個(gè)樣品測(cè)量的電流顯示在圖7中。圖7中的數(shù)據(jù)證明，從 生物傳感器測(cè)量的電流與血樣中的HbAlc百分比符合線性模型，并且生物傳感器和所述方 法可以用于在不單獨(dú)測(cè)量總血紅蛋白的情況下測(cè)定糖化血紅蛋白百分比。雖然為了清楚和理解的目的，已經(jīng)通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例在一些細(xì)節(jié)中描述了上述發(fā) 明，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)的是，可以實(shí)施某些改變和修改。因此，說(shuō)明和實(shí) 施例不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制由后附權(quán)利要求所敘述的本發(fā)明范圍。
權(quán)利要求
1.在電化學(xué)傳感器中使用的電極裝置，所述電化學(xué)傳感器用于測(cè)量樣品中糖化血紅蛋 白(HbAlc)的百分比，所述電極裝置包括電極載體；放置在所述電極載體上的工作電極，其中在所述工作電極上或附近放置果糖基氨基酸 氧化酶；放置在所述電極載體上的對(duì)電極；和放置在所述電極載體上的參比電極，其中所述工作電極、對(duì)電極和參比電極是相互隔 開(kāi)的。
2.權(quán)利要求1所述的裝置，所述裝置還包括在所述工作電極、所述對(duì)電極和所述參比 電極上限定封閉空間的絕緣/覆蓋層，其中所述絕緣/覆蓋層形成用于接收樣品的槽，其中 所述樣品槽位于所述電極上或所述電極附近。
3.權(quán)利要求1所述的裝置，所述裝置還包括通過(guò)毛細(xì)管作用接收樣品的毛細(xì)管填充通 道，其中所述通道的一端與所述工作電極接觸。
4.權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述工作電極和所述對(duì)電極還包括介體，所述介體在 從所述果糖基氨基酸氧化酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫和所述工作電極之間穿梭電子，以產(chǎn) 生表示所述樣品中糖化血紅蛋白量的電流。
5.權(quán)利要求4所述的裝置，其中所述介體包括選自由二茂鐵、普魯士藍(lán)、金屬酞青和四 硫富瓦烯(TTF)組成的組的一種或多種試劑。
6.權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述工作電極和/或所述對(duì)電極還包括催化過(guò)氧化氫 氧化還原反應(yīng)的催化劑。
7.權(quán)利要求6所述的裝置，其中所述催化劑包括選自由Ir-碳、1 -碳和Ru-碳組成的 組的一種或多種試劑。
8.權(quán)利要求7所述的裝置，其中所述Ir-碳、Rh-碳和Ru-碳是納米顆粒。
9.權(quán)利要求1所述的裝置，其中在所述工作電極上或附近放置選擇性氧化低分子量還 原物質(zhì)的第一氧化劑和選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)的第二氧化劑。
10.權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的裝置，其中在所述工作電極上或附近放置將糖化血 紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基酸的一種或多種蛋白酶。
11.權(quán)利要求1、2和10中任一項(xiàng)所述的裝置，其中將溶解血樣中紅細(xì)胞并且釋放血紅 蛋白的去污劑放置在所述工作電極上或附近，或放置在與所述電極隔開(kāi)的樣品槽中。
12.權(quán)利要求1所述的裝置，其中將所述果糖基氨基酸氧化酶配制在基質(zhì)中并且放置 在所述工作電極上或附近。
13.權(quán)利要求12所述的裝置，其中將糖化血紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基酸的一種 或多種蛋白酶被配制在基質(zhì)中并且被放置在所述工作電極上含有所述果糖基氨基酸氧化 酶的基質(zhì)的頂部。
14.權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的裝置，其中所述基質(zhì)包括酶固定化試劑和增稠聚 合物。
15.權(quán)利要求2所述的裝置，所述裝置還包括所述樣品槽和所述工作電極之間的樣品 傳遞路徑。
16.權(quán)利要求15所述的裝置，其中所述樣品槽含有選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第一氧化劑和選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)的第二氧化劑。
17.權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的裝置，其中所述樣品槽還含有將糖化血紅蛋白消 化成糖化肽或糖化氨基酸的一種或多種蛋白酶。
18.權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述樣品槽還含有溶解血樣中紅細(xì)胞并且釋放血紅 蛋白的去污劑。
19.權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述工作電極和/或所述對(duì)電極包括選自由Ir-碳、 Rh-碳和Ru-碳組成的組的金屬化碳。
20.權(quán)利要求19所述的裝置，其中Ir-碳、Rh-碳和Ru-碳是納米顆粒。
21.權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述參比電極是Ag/AgCl。
22.權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)所述的裝置，其中使用厚膜技術(shù)或使用薄膜平版印刷術(shù) 將所述電極絲網(wǎng)印刷。
23.權(quán)利要求1所述的裝置，所述裝置還包括第二工作電極和葡萄糖氧化酶或葡萄糖 脫氫酶以使用單個(gè)裝置測(cè)量HbAlc和葡萄糖兩者。
24.一種電化學(xué)生物傳感器，所述電化學(xué)生物傳感器包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的電極 裝置，用于所述電極裝置的檢測(cè)計(jì)，其中所述檢測(cè)計(jì)包括將測(cè)試結(jié)果傳送到數(shù)據(jù)庫(kù)或傳送 到一個(gè)或多個(gè)電子郵件地址的無(wú)線數(shù)據(jù)連接。
25.一種測(cè)量樣品中糖化血紅蛋白(HbAlc)百分比的方法，所述方法包括a)將血樣施加到權(quán)利要求2所述的電極裝置的樣品接收槽，其中所述血樣已經(jīng)用下列 進(jìn)行了處理1)溶解緩沖液，所述溶解緩沖液將血紅蛋白從所述血樣中的紅細(xì)胞釋放；2) 第一氧化劑，所述第一氧化劑選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)；幻第二氧化劑，所述第二氧 化劑選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)，和4)蛋白酶，所述蛋白酶將糖化血紅蛋白消化成糖化 肽或糖化氨基酸；b)在所述工作電極和所述參比電極之間施加電勢(shì)，所述電勢(shì)適合于監(jiān)控由果糖基氨基 酸氧化酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫；c)測(cè)量所述工作電極和所述對(duì)電極之間的電流或在所述工作電極處通過(guò)的電荷；和 由此在不單獨(dú)測(cè)量所述血樣中的總血紅蛋白情況下，基于與基準(zhǔn)相比較的所測(cè)量的電流或電荷確定所述樣品中的糖化血紅蛋白的百分比。
26.一種測(cè)量樣品中糖化血紅蛋白(HbAlc)百分比的方法，所述方法包括a)將血樣施加到權(quán)利要求11或權(quán)利要求18所述的電極裝置的樣品接收槽；b)在所述工作電極和所述參比電極之間施加電勢(shì)，所述電勢(shì)適合于監(jiān)控由果糖基氨基 酸氧化酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫；c)測(cè)量所述工作電極和所述對(duì)電極之間的電流或在所述工作電極處通過(guò)的電荷；和 由此在不單獨(dú)測(cè)量所述血樣中的總血紅蛋白情況下，基于與基準(zhǔn)相比較的所測(cè)量的電流或電荷確定所述樣品中的糖化血紅蛋白的百分比。
27.一種測(cè)量樣品中糖化血紅蛋白(HbAlc)百分比的方法，所述方法包括a)將血樣施加到權(quán)利要求1所述的電極裝置的工作電極，其中所述血樣已經(jīng)用下列進(jìn) 行了處理1)溶解緩沖液，所述溶解緩沖液將血紅蛋白從所述血樣中的紅細(xì)胞釋放；2)第 一氧化劑，所述第一氧化劑選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)；幻第二氧化劑，所述第二氧化 劑選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)，和4)蛋白酶，所述蛋白酶將糖化血紅蛋白消化成糖化肽或糖化氨基酸；b)在所述工作電極和所述參比電極之間施加電勢(shì)，所述電勢(shì)適合于監(jiān)控由果糖基氨基 酸氧化酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫；C)測(cè)量所述工作電極和所述對(duì)電極之間的電流或在所述工作電極處通過(guò)的電荷；和由此在不單獨(dú)測(cè)量所述血樣中的總血紅蛋白情況下，基于與基準(zhǔn)相比較的所測(cè)量的電 流或電荷確定所述樣品中的糖化血紅蛋白的百分比。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中將所述處理的血樣吸移到所述工作電極上。
29.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述電極裝置包括通過(guò)毛細(xì)管作用接收樣品的毛細(xì) 管填充通道，并且所述通道的一端與所述工作電極接觸，并且其中通過(guò)毛細(xì)管填充通道將 所述處理的血樣施加到所述工作電極。
30.權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中經(jīng)由介體或催化劑直接地或間接地電 化學(xué)檢測(cè)由所述果糖基氨基酸氧化酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫。
31.權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中以時(shí)延方式將所述電勢(shì)施加在所述工 作電極和所述參比電極之間。
32.權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基準(zhǔn)是校正曲線。
全文摘要
本發(fā)明提供電化學(xué)生物傳感器，所述電化學(xué)生物傳感器用于直接測(cè)定血樣中糖化血紅蛋白百分比，不需要單獨(dú)測(cè)量血樣中總血紅蛋白含量。本發(fā)明提供使用所述電化學(xué)生物傳感器的方法。
文檔編號(hào)G01N33/72GK102076867SQ200980123476
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月13日
發(fā)明者劉利民, 尼爾·K·布盧, 方磊, 袁崇生, 阿比吉特·達(dá)塔 申請(qǐng)人:通用原子公司