專利名稱：用于通過檢測網格蛋白途徑成分的片段來觀察凋亡的方法和材料的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般地涉及用于觀察暴露于凋亡誘導劑的哺乳動物細胞(諸如人 癌細胞)中的凋亡的方法。
背景技術：
哺乳動物中對細胞數(shù)的控制部分地由細胞增殖和細胞死亡之間的平衡 來決定。細胞死亡的一種形式(有時稱為壞死性細胞死亡)的典型特征在于 由有些創(chuàng)傷或細胞損傷引起的病理形式的細胞死亡。與之相反，存在另一種 "生理"形式的細胞死亡，其通常以有序或受控的方式進行。這種有序或受控 形式的細胞死亡常常稱為"凋亡，，(參見例如Barr等，Bio/Technology， 12:487-493 (1994); Steller等，Science, 267:1445-1449 (1995))。凋亡性細胞死亡 在許多生理過程中天然發(fā)生，包括胚胎發(fā)育和免疫系統(tǒng)中的克隆選擇(Itoh 等，Cell, 66:233-243 (1991))。
已經有多種分子鑒定為肺瘤壞死因子("TNF，)細胞因子家族的成員，諸 如腫瘤壞死因子-a ("TNF-a")、腫瘤壞死因子-(3 ("TNF-(3"或"淋巴毒素-a")、 淋巴毒素-(3 ("LT-(3")、 CD30配體、CD27配體、CD40配體、OX-40配體、4-1BB 配體、Apo-l配體(也稱作Fas配體或CD95配體)、Apo-2配體(也稱作TRAIL )、 Apo-3配體(也稱作TWEAK )、護骨蛋白(osteoprotegerin, OPG)、 APRIL、 RANK 配體(也稱作TRANCE)和TALL-1 (也稱作BlyS、 BAFF或THANK)(參見 例如Gruss和Dower， Blood, 85:3378-3404 (1995); Pitti等，J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley等，Immunity, 3:673-682 (1995); Browning等, Cell, 72:847-856 (1993); Armitage等,Nature, 357:80-82 (1992); WO97/01633, 公布于1997年1月16日；W097/25428,公布于1997年7月17日；Marsters等,Curr. Biol" 8:525-528 (1998); Simonet等，Cell, 89:309-319 (1997); Chicheportiche等，Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne等，J. Exp. Med. 188:1185-1190 (1998); W098/28426,公布于1998年7月2日；W098/46751,公 布于1998年10月22日；WO/98/18921，公布于1998年5月7日；Moore等,Science 285:260-263 (1999); Shu等，J. Leukocyte Biol" 65:680 (1999); Schneider等,J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay等，J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999))。在這些分子中，TNF-a、 TNF-卩、CD30配體、4-1BB 配體、Apo-l配體、ApoJ配體(Apo2L/TRAIL)和Apo-3配體(TWEAK)已有報 道說牽涉凋亡性細胞死亡。TNF-ct和TNF-P都已有報道說在易感性腫瘤細胞 中誘導凋亡性死亡(Schmid等，Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry 等，Eur. J. Immunol.， 17:689 (1987))。
認為是TNF細胞因子家族成員的別的分子有報道說牽涉凋亡。例如，在 Pitti等，J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996)中記載了稱為Apo-2配體的一 種分子。還可參見W097/25428，公布于1997年7月17日。全長人Apo-2配體據 報道是281個氨基酸的多肽，其在多種哺乳動物細胞中誘導凋亡。其它調查 人員已經描述了稱為TRAIL ( Wiley等，Immunity, 3:673-682 (1995); WO97/01633,公布于1997年1月16日)和AGP-1 ( W097/46686,公布于1997 年12月11日)的相關多肽。
TNF家族中的多種分子還據說在免疫系統(tǒng)的功能或發(fā)育中起作用(Gruss 等，Blood, 85:3378 (1995) )。 Zheng等已經報道了TNF-a牽涉CD8陽性T細胞的 刺激后凋亡(Zheng等，Nature, 377:348-351 (1995))。其他調查人員已經報道 了CD30配體可能牽涉胸腺中自我反應性T細胞的缺失(Amakawa等，Cod Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death,摘要號IO, (1995))。 CD40配體激活B細胞的許多功能，包括增殖、免疫球蛋白分泌和存 活(Renshaw等，J. Exp. Med., 180:1889 (1994))。另 一種最近鑒定的TNF家族 細胞因子，即TALL-1 (BlyS)已有報道說在某些條件下誘導B細胞增殖和免疫 球蛋白分泌(Moore等，見上文；Schneider等，見上文；Mackay等，J. Exp. Med., 190:1697 (1999))。
小鼠Fas/Apo-l受體或配體基因(分別稱作lpr和gld)中的突變已經與一 些自身免疫性病癥聯(lián)系起來，表明Apo-l配體可能在調節(jié)外周中自身反應性 淋巴細胞的克隆缺失中起作用(Krammer等，Curr. Op. Immunol., 6:279-289(1994); Nagata等，Science, 267:1449-1456 (1995) )。 Apo-l配體還報道說在CD4 陽性T淋巴細胞和在B淋巴細胞中誘導刺激后凋亡，而且可能牽涉不再需要其 功能的活化的淋巴細胞的消除(Krammer等，見上文；Nagata等，見上文)。特 異性結合Apo-l受體的激動性小鼠單克隆抗體已有報道說展現(xiàn)出與TNF-a相 當或相似的細胞殺傷活性(Yonehara等,J. Exp. Med" 169:1747-1756 (1989))。 由此類TNF家族配體介導的對多種細胞應答的誘導典型地是通過它們 與特定細胞受體結合而啟動的。有些但非所有TNF家族配體結合細胞表面 "死亡受體，，以活化胱天蛋白酶或者執(zhí)行細胞死亡或凋亡途徑的酶，并由此 誘發(fā)多種生物學活性(Salvesen等，Cell, 91:443-446 (1997))。在迄今為止已經 鑒定的TNF受體超家族成員中包括TNFR1、 TOPR2、 TACI、 GITR、 CD27、 ()X-40、 CD30、 CD40、 HVEM、 Fas (也稱作Apo-1或CD95 )、 DR4 (也稱作 TRAIL-Rl )、 DR5(也稱作Apo-2或TRAIL-R2 )、 DcRl 、 DcR2、護骨蛋白(OPG)、 RANK和Apo-3(也稱作DR3或TRAMP )(參見例如Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi和Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi 詳口 Dixit, Cum Opin. Cell Biol, 11:255-260 (2000); Golstein， Curr. Biol" 7:750-753 (1997); Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000，頁 377-411; Locksley等，Cell, 104:487-501 (2001); Gruss和Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); HohMan等，J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus等,Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3127-3131 (1990); EP 417,563,公布于 簡年3月20日；Loetscher等,Cell, 61:351 (1990); Schall等,Cell, 61:361 (1990); Smith等，Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis等，Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin等，Cell. Biol" 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic等，EMBO J., 8:1403-1410 (1989); Mallett等，EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson等，Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche等, J. Biol. Chem.， 272:32401-32410 (1997); Pan等，Science, 276:111-113 (1997); Pan等，Science, 277:815-818 (1997); Sheridan等，Science 277: 818-821 (1997); Degli-Esposti等，J. Exp. Med" 186:1165-1170 (1997); Marsters等，Curr. Biol" 7:1003-1006 (1997); Tsuda等,BBRC, 234: 137-142 (1997); Nocentini等，Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 6216-6221 (1997); vonBulow等，Science, 278:138-141 (1997))。
大多數(shù)這些TNF受體家族成員共享細胞表面受體的典型結構，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)，而發(fā)現(xiàn)其它成員天然是缺少跨膜和胞內結構域的可溶
性蛋白質。典型TNFR的胞外部分包含自NH2-末端起始的多個富含半胱氨酸 結構域(CRD)的重復氨基酸序列樣式。
數(shù)年前將稱為Apo2L或TRAIL的配體鑒定為TNF細胞因子家族的成員 (參見例如Wiley等，Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti等,丄Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); WO97/01633; W097/25428;美國專利5,763，223,公 告于1998年6月9日；美國專利6,284,236,公告于2001年9月4日)。全長天然序 列人Apo2L/TRAIL多肽是長281個氨基酸的II型跨膜蛋白質。有些細胞能通過 酶促切割多肽的胞外區(qū)而生成該多肽的天然可溶形式(Mariani等，J. Cell. Biol" 137:221-229 (1997))。
對可溶形式Apo2L/TRAIL的晶體學研究揭示了與TNF及其它相關蛋白 質的結構類似的同三聚體結構(Hymowitz等，Molec Cell, 4:563-571 (1999); Cha等，Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya等，Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz等，Biochemistry, 39:633-644 (2000))。然而， 與其它TNF家族成員不同，發(fā)現(xiàn)Apo2L/TRAIL具有獨特的結構特征，即三個 半胱氨酸殘基(同三聚體中每個亞基的第230位) 一起與鋅原子配位，而且 鋅結合對于三聚體的穩(wěn)定性和生物學活性來說是重要的(Hymowitz等，見上 文；Bodmer等，J. Biol. Chem.， 275:20632-20637 (2000))。
文獻中已有報道說Apo2L/TRAIL可能在免疫系統(tǒng)的調節(jié)中起作用，包括 自身免疫病，諸如類風濕性關節(jié)炎(參見例如Thomas等，J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen等，Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith等，J. Exp. Med" 189:1343-1353 (1999); Song等,J. Exp. Med" 191:1095-1103 (2000))。
還有報道說可溶形式的Apo2L/TRAIL在多種癌細胞中誘導凋亡，包括結 腸、肺、乳房、前列腺、膀胱、腎、卵巢和腦腫瘤，以及黑素瘤、白血病和 多發(fā)性骨髓瘤(參見例如Wiley等，見上文；Pitti等，見上文；美國專利 6,030,945，公告于2000年2月29日；美國專利6,746,66S,公告于2004年6月8日； Rieger等，F(xiàn)EBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashke認i等，J. Clin. Invest" 104:155-162 (1999); Walczak等,Nature Med" 5:157-163 (1999); Keane等， Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani等，Clin. Cancer Res" 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu等,Cancer Res"60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan等，Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000))。在鼠腫瘤模型中進行的體內研究進一步表明，單獨的或者聯(lián)合化療 或放療的Apo2L/TRAIL能發(fā)揮實質性的抗胂瘤效果(參見例如Ashkenazi等, 見上文；Walczak等，見上文；Gliniak等,Cancer Res" 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan等，見上文；Roth等，Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); PCT申請lJS/00/15512; PCT申請US/01/23691 )。與許多類型的癌細胞 相反，大多數(shù)正常人細胞類型表現(xiàn)出對某些重組形式Apo2L/TRAIL的凋亡誘 導作用有抗性(Ashkenazi等，見上文；Walczak等，見上文)。Jo等人4艮道說帶 多組氨酸標簽的可溶形式Apo2L/TRAIL在體外在正常的分離的人肝細胞中 誘導凋亡，但在非人的情況中則不然(Jo等，Nature Med., 6:564-567 (2000); Nagata， Nature Med.， 6:502-503 (2000))。認為某些重組Apo2L/TRAIL制備物 在生物化學特性和生物學活性方面對患病細胞和正常細胞可能有所不同，這 取決于例如標簽分子的存在與否、鋅含量和三聚體含量百分比(參見 Lawrence等，Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001》Qin等，Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001))。
已經發(fā)現(xiàn)Apo2L/TRAIL結合至少五種不同受體。至少兩種結合 Apo2L/TRAIL的受體包含功能性胞質死亡結構域。 一種此類受體稱作"DR4" (或者稱作TR4或TRAIL-R1 ) ( Pan等，Science, 276:111-113 (1997); W098/32856,公布于1998年7月30日；W099/37684,公布于1999年7月29日； WO00/73349,公布于2000年12月7日；US 2003/0036168,公布于2003年2月20 日;US 6,433,147,公告于2002年8月13日；US 6,461,823,公告于2002年10月8 曰；及US 6,342,383,公告于2002年1月29日)。
Apo2L/TRAIL的另一種此類受體稱為DR5 (或者稱作Apo-2、 TRAIL-R 或TRAIL-R2 、 TR6 、 Tango-63 、 hAP08 、 TRICK2或KILLER X參見例如Sheridan 等，Science, 277:818-821 (1997); Pan等，Science, 277:815-818 (1997), W098/51793,公布于1998年11月19日；W098/41629,公布于1998年9月24日； Screaton等,Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walcak等，E認O J" 16:5386-5387 (1997); Wu等,Nature Genetics, 17:141-143 (1997); W098/35986,公布于1998 年8月20日；EP870，827,公布于1998年10月14日；W098/46643，公布于1998 年10月22日-;WO99/02653,公布于1999年1月21日；WO99/09165,公布于 1999年2月25日；W099/11791,公布于1999年3月11日；WO03/042367,公布于2003年5月22曰;WO02/097033,公布于2002年12月5日；WO03/038043,公 布于2003年5月8日；US 2002/0072091,公布于2002年8月13日；US 2002/0098550,公布于2001年12月7日；US 6,313,269,公告于2001年12月6日； US 2001/0010924，公布于2001年8月2日；US 2003/01255540,公布于2003年7 月3日；US 2002/0160446,公布于2002年10月31日；US 2002/0048785，公布于 2002年4月25日；US 2004/0141952,公布于2004年7月21日；US 2005/0129699, 公布于2005年6月16日；US 2005/0129616,公布于2005年6月16日；US 6,342,369,公告于2002年2月；US 6,569,642,公告于2003年5月27日；US 6,072,047,公告于2000年6月6日；US 6，642，358，公告于2003年11月4日；US 6,743,625,公告于2004年6月1日)。像DR4—樣，DR5有報道說包含胞質死亡 域且能夠在配體結合后(或在結合模擬配體活性的分子諸如激動性抗體后) 發(fā)出凋亡信號。Apo-2L/TRAIL和DR5之間形成的復合物的晶體結構記載于 Uymowitz等，Molecular Cell, 4:563-571 (1999)。另 一種已鑒定的含死亡域受體 稱為DR6 ( Pan等,FEBS Letters, 431:351-356 (1998))。
配體結合后，DR4和DR5都能經由稱作FADD/Mortl的含死亡域的銜接物 (adaptor)分子通過募集和活化凋亡起始物胱天蛋白酶-8而獨立地觸發(fā)凋亡 (Kischkel等，Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick等，Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer, Nature Cell Biol.， 2:241-243 (2000))。
Apo2L/TRAIL已有報道說還結合那些稱作DcRl、 DcR2和OPG的受體， 認為這些受體發(fā)揮信號傳導的抑制物而非轉導器的功能(參見例如DCRl(也 稱作TRID、 LIT或TRAIL-R3 ) (Pan等，Science, 276:111-113 (1997); Sheridan 等，Science, 277:818-821 (1997); McFarlane等，J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider等，F(xiàn)EES Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti等，J. Exp. Med" 186:1165-1170 (1997);及Mongkolsapaya等，J. Immunol., 160:3-6 (1998)); DCR2 (也稱作TRUNDD或TRAIL-R4 ) ( Marsters 等，Curr. Biol" 7:1003-1006 (1997); Pan等，F(xiàn)EES Letters, 424:41-45 (1998); I)egli-Esposti等，Immunity, 7:813-820 (1997));和OPG( Simonet等，見上文))。 與DR4和DR5相反，DcRl和DcR2受體不發(fā)出凋亡信號。
文獻中已經報道了結合DR4、 DR5和/或Fas受體的某些抗體。例如，針 對DR4受體且在某些哺乳動物細胞中具有激動或凋亡活性的抗DR4抗體記載 于例如W099/37684， ^>布于1999年7月29日；WO00/73349, ^>布于2000年7月12日；WO03/066661,公布于2003年8月14日;Griffith等,J. Immunol" 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai等，J. Immunol., 166:4891-4898 (2001); WO02/097033,公布于2002年12月2日；WO03/042367,公布于2003年5月22 日;WO03/038043,公布于2003年5月8日;WO03/037913,公布于2003年5月8 日;US 2003/0073187,公布于2003年4月17日；US 2003/0108516,公布于2003 年6月12日。同樣已經記載了某些抗DR5抗體，參見例如W098/51793,公布 于1998年11月8日；Griffith等，J. Immunol" 162:2597-2605 (1999); Ichikawa等, Nature…Med., 7:954-960 (2001); Hylander等，"An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice",摘要，2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, 2002年8月29日—9月1日，Banff, Alberta, Canada; WO03/038043,公布于2003年5月8曰；WO03/037913,公布于2003年5月8日； US 2003/0180296,公布于2003年9月25日。另外，已經記載了對DR4和DR5 受體都具有交叉反應性的某些抗體(參見例如美國專利6,252,050，公告于 2001年6月26日)。誘導表達Fas的靶細胞凋亡的激動性抗Fas抗體包括但不限 于單抗M2和M3 (IgG; Alderson等，1995， J. Exp. Med.， 181:71-77 );抗Fas單 抗(IgM; Yonehara等,1989, J. Exp. Med" 169:1747-1756 );單抗CHll (IgM; Aldcrson等，1994, Int. Immunol" 6:1799-806 );和抗APO-l( IgG; Dhein等，1992, 丄Immunol., 149:3166-3173 )。
凋亡在多細胞生物體的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關重要的作用(參見例如 Danial, N.N.等，Cell, 116:205-19(2004))。兩種主要的信號傳導機制，即細胞 內在和外在途徑，控制著凋亡誘導(參見例如Strasser, A.等，Annu Rev Biochem, 69:217-45 (2000))。這些途徑活化稱為胱天蛋白酶的半胱氨酸蛋白 酶，其切割多種對于細胞完整性至關重要的細胞蛋白質。胱天蛋白酶識別包 含天冬氨酸的特定四肽序列并切割鄰近的肽鍵(參見例如Thornberry， N.A. 等，Science, 281:1312-6 (1998))。細胞外在途徑的激活應答配體諸如Fas配體 (FasL)和Apo2配體/TNF相關凋亡誘導配體(Apo2L/TRAIL)經由其各自細胞表 面"死亡受體，，F(xiàn)as (Apol/CD95)和DR4或DR5而發(fā)生(參見例如Nagata, S., Cell: 88:355-65 (1997)及LeBlanc, H.N.等，Cell Death Differ, 10:66-75 (2003))。配體 結合觸發(fā)銜接物FADD (Fas相關"死亡，，域)到達受體胞質尾內死亡域的募 集。FADD募集起始物蛋白酶胱天蛋白酶-8來形成"誘導死亡信號傳導復合物"(DISC)(參見例如Kischkel,F.C.等，EmboJ， 14:5579-88 (1995))。 DISC中 胱天蛋白酶-8的接近刺激了酶活性，導致自我加工(參見例如Boatright, K.M. 等，Mol Cell, 11:529-41 (2003))。然后經過切割的胱天蛋白酶-8自DISC釋放至 細胞質并通過蛋白水解活化效應器胱天蛋白酶諸如胱天蛋白酶-3和-7。在某 些細胞類型中，DR刺激產生強烈的胱天蛋白酶-8活性，其有力地活化了效應 器胱天蛋白酶并使得細胞凋亡(參見例如Scaffidi, C.等，J Biol Chem, 274:1541-8(1999))。其它細胞類型需要通過內在途徑進行的信號放大胱天 蛋白酶-8切割Bcl-2僅含同源域3 (BH3)的蛋白質Bid,其通過多BH結構域的蛋 白質Bax和Bak而參與內在途徑，增強效應器胱天蛋白酶活化和凋亡(參見例 如Danial, N.N.等，Cell， 116:205-19 (2004)及Strasser, A.等，Annu Rev Biochem， 69:217-45 (2000))。
凋亡的共同特征在于細胞核染色質的縮合(condensation)和邊緣化 (margination)，及細胞核結構破碎成所謂的凋亡小體。這種凋亡形態(tài)可以使 用常規(guī)染色劑(即在細胞核中選擇性積累的染料，諸如碘化丙啶或Hoechst 33258 )或者通過電子顯微鏡檢術而觀察到。DNA的核小體間斷裂(常常與 通過凋亡進行的細胞死亡有關，但不能作為其診斷)也用于凋亡的鑒定和定 里。
發(fā)明概述
申請人鑒定出了正在經歷凋亡(apoptosis)的細胞中所產生的蛋白質片 段，所述蛋白質片段可以用作凋亡性細胞死亡(apoptotic cell death)的生物標 志物(biomarker)。本發(fā)明的實施方案提供了用于觀察這些蛋白質片段的方法 和材料，用以例如觀察暴露于一種或多種凋亡誘導劑的哺乳動物細胞中的凋 亡性細胞死亡。在本發(fā)明的說明性實施方案中，在人癌細胞中觀察了凋亡的 這些生物標志物以檢查如下療法的功效，所述療法包括施用凋亡誘導劑諸如 Apo2L/TRAIL、 FasL或Apo2L/TRAIL或FasL激動劑。
申請人的發(fā)明具有許多實施方案。本發(fā)明的一個實施方案是^r測哺乳動 物細胞中的凋亡的方法，即使細胞成分與結合凋亡過程中所產生的蛋白質片 段的抗體接觸，其中所述抗體結合AP2-ot(SEQIDNO: 1)、網格蛋白(clathrin) 重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2卩(SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(dynamin) (SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段；測定凋亡過程中所產生的所述蛋白質片段所結合的所述抗體量；并比較該步驟中所結合的所述抗體量與無凋亡的哺乳動物細胞中 所述蛋白質片段所結合的所述抗體量，其中如果該量大于無凋亡的細胞中的 所述量，那么檢測出凋亡。任選地，通過這種方法所檢查的哺乳動物細胞是 人結腸、結腸直腸、肺、乳腺或乳房、前列腺、膀胱、腎、卯巢、腦、黑素 瘤、白血病或骨髓瘤癌細胞。
如下文所詳細描述的，本發(fā)明的方法可用于觀察由許多不同細胞受體啟
動的凋亡。在這種方法的一些實施方案中，細胞中的凋亡是經由死亡受體4 (SEQ ID NO: 5)或死亡受體5 (SEQ ID NO: 6)啟動的，例如通過Y吏該細胞與 Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7)或結合死亡受體4 (SEQ ID NO: 5)或死亡受體5 (SEQ ID NO: 6)的抗體接觸而啟動的。在本發(fā)明的其它實施方案中，細胞中 的凋亡是經由Fas (SEQ ID NO: 8)啟動的，例如通過使細胞與FasL (SEQ ID NO: 9)或結合Fas的抗體接觸而啟動的。
本發(fā)明的方法在進一步修改后可用于許多背景(context)。例如，這些觀 察凋亡的方法可用于評估細胞對Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7)或結合死亡 受體4 (SEQ ID NO: 5)或死亡受體5 (SEQ ID NO: 6)的抗體的敏感性。在本發(fā) 明的一個具體的說明性實施方案中，這些方法可用于評估如下療法的功效， 所述療法包括施用Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7)或結合死亡受體4 (SEQ ID NO: 5)或死亡受體5 (SEQ ID NO: 6)的抗體。類似地，本發(fā)明的其它實施方案 可用于檢查細胞對FasL (SEQ ID NO: 9)或結合Fas的抗體的敏感性，用以例如 評估如下療法的功效，所述療法包括施用FasL (SEQ ID NO: 9)或結合Fas的抗 體。
如下文所詳細描述的，本發(fā)明的方法可以觀察細胞內許多不同蛋白質的 凋亡性片段化(apoptotic fragmentation),其使用本領域已知的多種技術之任一 種來進行，諸如使用針對這些凋亡性片段之一種或多種的抗體的免疫測定 法。例如，本發(fā)明抗體的某些實施方案結合AP2-a(SEQIDNO: l)的蛋白質 片段，例如約64kDa或33kDa的片段。在本發(fā)明的有些實施方案中，所述抗 體所結合的AP2a蛋白質片段包含SEQ ID NO: l的DVFD或SEQ ID NO: l的 GP八A。本發(fā)明的其它實施方案可以使用結合網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2) 的蛋白質片段的抗體。本發(fā)明的其它實施方案可以使用結合AP1/2(3(SEQID NO: 3)的蛋白質片段的抗體。本發(fā)明的其它實施方案可以使用結合發(fā)動蛋白 (SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段的抗體。本發(fā)明的某些實施方案在修改后^^查特定類型的凋亡活性和/或特定生
理學背景(physiological context)中的凋亡。例如，本發(fā)明的實施方案可用于觀 察哺乳動物細胞中由死亡受體4 (SEQ ID NO: 5)、死亡受體5 (SEQ ID NO: 6) 或Fas(SEQIDNO: 8)所介導的凋亡。典型地，此類方法包括使所述細胞暴 露于死亡受體4、死亡受體5或Fas配體；對暴露于所述配體的所述細力包^r查 AP2-ct (SEQ ID NO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2j3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段的存在；比較所述細胞中所述蛋 白質片段的量與未暴露于所述配體的對照細胞中所述蛋白質片段的量；其中 若存在于暴露于所述配體的所述細胞中的所述蛋白質片段量大于未暴露于 所述配體的所述對照細胞中的所述蛋白質片段量，則觀察到凋亡。典型地， 在此類方法中，死亡受體4、死亡受體5或Fas配體為Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7)、結合死亡受體4或死亡受體5的抗體、FasL(SEQ ID NO: 9)或結合Fas 的抗體。
本發(fā)明的其它實施方案包括觀察哺乳動物細胞對Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7)或FasL (SEQ ID NO: 8)所誘導的凋亡的敏感性，即使所述哺乳動物細 胞暴露于Apo2L/TRAIL或FasL;對暴露于Apo2L/TRAIL或FasL的所述細胞檢 查AP2-a (SEQ ID NO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 AP1/2J3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段的存在；比較所述哺乳動物細胞 中所述蛋白質片段的量與未暴露于Apo2L/TRAIL或FasL的對照哺乳動物細 胞中所述蛋白質片段的量；其中如果存在于暴露于Apo2L/TRAIL或FasL的所 述哺乳動物細胞中所述蛋白質片段量大于未暴露于Apo2L/TRAIL或FasL的 所述對照哺乳動物細胞中所述蛋白質片段量，則觀察到所述哺乳動物細胞對 Apo2L/TRAIL或FasL所介導的凋亡敏感。
本發(fā)明的實施方案還提供了制品和試劑盒，其包括結合AP2-a (SEQ ID NO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 AP1/2J5 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白 (SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段的抗體。 一個說明性的實施方案是用于表征哺 乳動物細胞的試劑盒，該試劑盒包含第一抗體，其結合AP2-a(SEQIDNO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQIDNO: 2)、 AP1/2J3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ IDNO: 4)的蛋白質片段；第二抗體，其結合AP2-a (SEQ ID NO: 1)、網格蛋 白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2(3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4) 的蛋白質片段；其中所述第一抗體和第二抗體不結合相同的表位(而且任選地不結合相同的蛋白質)；(a)和(b)的容器；和關于使用所述試劑盒的說明書。
附圖簡述


圖1顯示了 Apo2L/TRAIL誘導網格蛋白依賴性胞吞機器 (clathrin-dependent endocytosis machinery)的選4奪性+刀割。(a)在37。C用三 聚體Apo2L/TRAIL (Colo205, HCT8)或抗體交聯(lián)的、帶標簽的Apo2L/TRAIL (BJAB, HeLa-M)處理細胞，并通過免疫印跡對細胞溶胞產物分析胱天蛋 白酶-8(C8)、胱天蛋白酶-3 (C3)、銜接蛋白(adaptin, AP)2oc、 APl/2p(抗體 不辨別AP1和2同等型)、網格蛋白重鏈(CHC)或Tf受體(TfR)的切割情況。(b) 如在(a)中那樣處理Colo205細胞，并通過免疫印跡分析多種類型網格蛋白相 關胞吞運輸?shù)奶囟ǔ煞值募庸で闆r。
圖2顯示了不同胱天蛋白酶牽涉對AP2a和CHC的切割。(a)用泛胱天蛋 白酶抑制劑zVAD-fmk (20(iM, 30min)接著用交聯(lián)的Apo2L/TRAIL (l嗎/mL) 處理BJAB細胞，并通過免疫印跡分析胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-3、 AP2a 和CIIC的加工情況。開口箭頭指出切割產物，而實心箭頭指出全長蛋白質。 (b-(!)用Apo2L/TRAIL處理SaZ或Sa;c" HCT116細胞或胱天蛋白酶-3缺陷的 MCF-7細胞，并如在a中那樣分析。
圖3顯示了Apo2L/TRAIL預處理抑制Tf胞吞作用。(a,b)將BJAB (a)或
理指定時間，并在水上冷卻。然后將細胞在冰上用Alexa-647偶聯(lián)的Tf(^TF) 平衡30分鐘，并通過流式細胞術測量在37。C的攝取。自4分鐘攝取動力學曲 線(a，插圖)的初始線性階段的斜率推導出各個胞吞速率。將速率相對于 沒有Apo2L/TRAIL (白色圓圈)時所觀察到的速率(其與所述測定法的預溫 育步驟排除配體但Tf溫育階段存在配體(黑色菱形，0分鐘)時所觀察到的 速率相當)標準化。(c)將BJAB細胞預先暴露于DMSO媒介或zVAD-fmk 30 分鐘，然后用交聯(lián)的Apo2L/TRAIL處理4小時，在冰上冷卻，并分析647丁卩胞 吞速率，如在a和b中那樣。將速率相對于經DMSO處理的樣品標準化(士SEM)。 圖4提供了DR5胞吞作用的表征。(a，b)在沒有(菱形)或存在10嗎/ml 三聚體的(正方形)或交聯(lián)的(三角形)Apo2L/TRAIL時將具有表面結合的 ^5C7單抗的Colo205細胞在冰上溫育30分鐘，然后變動成37。C指定時間，并 在冰上快速冷卻。通過酸剝離(acidstripping)除去表面熒光，并通過流式細胞術定量DR5攝取。將平均值繪圖(土SEM, b中)。(c)將Hela-m細胞與5(ig/ml ^5C7和5嗎/ml交聯(lián)的Apo2L/TRAIL—起在37。C溫育，然后為免疫焚光顯微 鏡;險術進行加工(標尺20nM)。 (d)將Colo205細胞在37。C用未標記的單抗 5C7預平衡30分鐘以結合表面，并再循環(huán)DR5庫。在有或無10嗎/ml Apo2L/TRAIL的條件下繼續(xù)溫育，然后將細胞在冰上快速冷卻。用CY5-抗小 鼠lgG探查細胞表面暴露的單抗5C7，通過流式細胞術定量，并將平均值繪圖 (士SEM)。 (e)將Colo205細胞在37。C用10嗎/mlApo2L/TRAIL預處理，然后在 冰上快速冷卻，并測定胞吞作用，如在a ( 6475C7)和圖3b ( 647Tf)中那樣。 將胞吞速率相對于沒有Apo2L/TRAIL預處理時的數(shù)值標準化(士SEM)。如在c 中那樣制備細胞時觀察到相似的結果，并用表面結合的CY5抗小鼠Fab測定 胞吞作用。(f-h)將具有表面結合的單抗5C7的Colo205細胞與Apo2L/TRAIL 一起在冰上溫育，變動成37。C5分鐘，并固定。用家兔抗小鼠IgG抗體和蛋白 A金(10nm)標記超薄冷凍切片。箭頭指出典型的電子致密網格蛋白外被 (coat)。 P,質膜。比例尺200nm。
圖5顯示了發(fā)動蛋白失活抑制DR5胞吞作用。(a-d)將經Dyn""D轉導的 HcLa-M細胞用。票呤霉素(puromycin)選擇，用多西環(huán)素(doxycycline)誘導，在 所示溫度預溫育20分鐘，然后在存在Alexa-488偶聯(lián)的Tf(，Tf)時再溫育20分 鐘。然后為了免疫焚光顯微鏡檢術，使用發(fā)動蛋白-l特異性抗體加工細胞。 (e, f)通過流式細胞術對未轉導的BJAB細胞(親本)或有(+dox)或無(無dox ) 多西環(huán)素誘導的克隆的經Dyn 1 ^7315轉導的BJAB細胞測定20分鐘期間里在 30°C(白色柱)或38。C(黑色柱)的，Tf或^5C7攝取，并將平均值繪圖(士SD)。
圖6顯示了發(fā)動蛋白失活提升DR介導的胱天蛋白酶活化和凋亡。(a)將 有或無多西環(huán)素誘導的經DynG^D轉導的BJAB細胞在38。C溫育20分鐘以滅 活發(fā)動蛋白，如圖5中那樣，然后在有或無交聯(lián)的Apo2L/TRAIL的條件下再 溫育4小時，并通過免疫印跡分析所示蛋白質的加工情況。(b)將有或無多西 環(huán)素誘導的經DynG^D轉導的BJAB細胞在30。C或38。C溫育20分鐘，然后在有 或無交聯(lián)的Apo2L/TRAIL的條件下再溫育2小時，并測定胱天蛋白酶-3/7活 性。(c)將有或無多西環(huán)素誘導的經DynG^D轉導的BJAB細胞在38。C預溫育
體(D5-sel.)的條件下再溫育4小時，并測定DNA斷裂(土SEM)。
圖7顯示了癌細胞系中網格蛋白途徑成分的加工。(a)用Apo2L/TRAIL處理所示細胞系，并通過免疫印跡分析AP2a或CHC的切割情況。(b)用交聯(lián) 的Apo2L/TRAIL或FasL處理BJAB細胞，并通過免疫印跡分析AP2a或CHC的 加工情況。(c)用交聯(lián)的Apo2L/TRAIL處理BJAB細胞，并通過免疫印跡測定 發(fā)動蛋白的加工情況。
圖8顯示了AP2a和CHC切割需要胱天蛋白酶。(a)將BJAB細胞在有或無 zVAD-fmk (20pM, 30min)的條件下預溫育，并如所示那樣用交聯(lián)的 Apo2L/TRAIL (l嗎/mL)處理24小時。通過免疫印跡對細胞分析胱天蛋白酶 -8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3和AP2a的加工情況。(b)將下列JurkatT細 胞系A3 (wt)、 19.2 (胱天蛋白酶-8缺陷的)和E1 (FADD缺陷的)用交聯(lián) 的Apo2L/TRAIL或FasL處理指定時間，并分析網才各蛋白介導的胞吞途徑的成 分的加工情況，如圖1中那樣。(c)將HT1080纖維肉瘤細胞用胱天蛋白酶-3 特異性siRNA (C3)或對照siRNA轉染，用Apo2L/TRAIL處理指定時間，并通 過免疫印跡分析AP2oc或CHC的切割情況或胱天蛋白酶-3的siRNA消減情況。
圖9顯示了 AP2a切割位點的測定。(a)自經Apo2L/TRAIL刺激的BJAB細 胞免疫沉淀經過切割的AP2oc的C末端片段，并且或是用胰蛋白酶消化并通過 質譜法分析以驗證其身份，或是通過凝膠電泳和Western轉移來分離并進行N 末端測序。通過串聯(lián)質譜法鑒定的胰蛋白酶消化肽與AP2aC末端序列比對。 N末端測序鑒定切割位點為DXXD胱天蛋白酶識別基序(加下劃線的)。(b)切 割位點定位于AP2a的"鉸鏈"區(qū)，其偶聯(lián)功能上不同的"耳"(ear)和"軀干" (t腦k)結構域。
圖10顯示了溫度敏感性DynlG273D和顯性失活(dominant-negative) DynlK"A突變體抑制HeLa-M細胞中的Tf和DR5胞吞作用。(a,b)如實驗規(guī)程 中所述通過流式細胞術在有(+dox)或無(無dox)多西環(huán)素誘導的條件下 對自圖6中經逆轉錄病毒轉導的HeLa-M細胞群衍生的兩個克隆系ts3和tsl測 定20分鐘期間里在30。C (白色柱)或38。C (黑色柱)的488丁"八)或647507(13) 攝取，并將平均值繪圖(士SD)。 (c)在有或無多西環(huán)素誘導的條件下對經 DynK44A轉導的HeLa-M細胞和未轉導的HeLa-M細胞(親本)測定488丁伊口647507 胞吞速率(士SD),如圖5d中所述，沒有進行標準化。
圖ll顯示了沒有胞吞作用時的DISC裝配。(a)將BJAB細胞用^Tf在冰上 平衡，在37。C或在冰上溫育指定攝取時間間隔，然后通過流式細胞術定量熒 光。(b)將BJAB細胞用交聯(lián)的Apo2L/TRAIL (l嗎/mL)在37。C或在水上處理指定時間量，并如材料和方法中所述經由配體免疫沉淀DISC。通過免疫印跡
顯現(xiàn)DISC結合的FADD和胱天蛋白酶-8。 (c，d)將經Dyn""D轉導的BJAB細胞 用緩沖液(無Dox)或多西環(huán)素(Dox)處理，并變動成38。C 20分鐘以滅活 發(fā)動蛋白。將細胞用交聯(lián)的Apo2L/TRAIL處理指定時間量，并免疫沉淀 DISC。通過免疫印跡顯現(xiàn)DISC結合的FADD和胱天蛋白酶-8 (c)或測量DISC 結合的胱天蛋白酶-8活性，如先前所述(Sharp等，JBiol Chem280, 19401-409, 2005)。
圖12顯示了 DNA損傷劑誘導對網格蛋白途徑成分的切割。將BJAB或 Colo205細胞用長春堿(vinblastine)或阿霉素(adriamycin)處理指定時間，并通 過免疫印跡分析，如圖1中那樣。
發(fā)明詳述
本文中所描述或提到的技術和規(guī)程一般得到了本領域技術人員的充分 理解，而且通常利用常規(guī)方法得以采用。適當時，牽涉使用商品化試劑盒和 試劑的規(guī)程一般依照制造商規(guī)定的方案和/或參數(shù)進行，除非另有說明。除非 另有定義，本文所用的所有技術術語、符號及其它科學術語均意圖具有本發(fā)
明所屬領域中技術人員通常所理解的含意。在有些情況中，為了清楚和/或便 于提及，本文對具有通常所理解含意的術語給出了定義，而且本文這些定義 的內含不應必然解釋為代表了與本領域通常所理解含意的實質差異。另外， 本文中使用了某些縮寫，包括488-指偶聯(lián)有Alexa-488的；647-指偶聯(lián)有 Alexa-647的；Apo2L/TRAIL指Apo2配體/TNF相關凋亡誘導配體；BSA指牛 血清清蛋白；DR指死亡受體；PBS指磷酸鹽緩沖鹽水；Tf指運鐵蛋白；而 zVAD-fmk指N-千氧羰基-Val-Ala-Asp-氟曱基酮。
I. 定義
術語"凋亡"和"凋亡活性，，以廣義使用，指哺乳動物中有序或受控形 式的細胞死亡，通常伴隨著一種或多種特征性細胞變化，包括細胞質濃縮、 質膜微絨毛喪失、細胞核節(jié)段化、染色體DNA降解或線粒體功能喪失。此活 性可使用本領域已知的多種技術來測定和測量，例如通過細胞生存力測定 法、FACS分析或DNA電泳，更具體的是通過膜聯(lián)蛋白V結合、DNA斷裂、 細胞收縮、內質網膨脹、細胞碎裂和/或膜嚢(稱為凋亡小體)形成。術語"Apo-2配體"、"Apo-2L"、或"TRAIL"在本文中用于指包含Pitti 等,丄Biol. Chem., 271:12687-126卯(1996)圖1A所示氨基酸序列的氨基酸殘 基95-281 (含端點)、殘基114-281 (含端點)、殘基91-281 (含端點)、殘基 92-281 (含端點)、殘基41-281 (含端點)、殘基15-281 (含端點)或殘基1-281 (含端點)的多肽，以及上述序列的生物學活性片段、刪除、插入或替代變 體。在一個實施方案中，多肽序列包含殘基114-281。任選的是，多肽序列至 少包含殘基91-281或殘基92-281。在另 一個優(yōu)選的實施方案中，生物學活性 片段或變體與任一上述序列具有至少約80%的氨基酸序列同 一性，更優(yōu)選至 少約90。/。的氨基S臾序列同一性，甚至更優(yōu)選至少95%、 96°/。、 97%、 98%或99% 的氨基酸序列同一性。該定義涵蓋包含Pitti等，J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996)圖1A氨基酸91-281的Apo2配體的替代變體，其中第 203、 218或269位(使用Pitti等，見上文中提供的序列編號方式)氨基酸中的 至少一個用丙氨酸殘基替代。該定義涵蓋從Apo-2配體來源(諸如人組織類 型或另一來源)分離的或者通過重組或合成方法制備的Apo-2配體。術語 Apo-2配體還指WO 97/25428,見上文和WO 97/01633,見上文中記載的多 肽。
"Apo-2配體受體"包括本領域稱作"DR4"和"DR5"的受體。Pan等 人描述了稱作"DR4"的TNF受體家族成員(Pan等,Science, 276: 111-113 (1997); WO 98/32856，公布于1998年7月30日)。有報道說DR4受體含有胞質 死亡結構域，它能夠使細胞自殺裝置巻入其中。Pan等人披露了DR4據信是 稱作Apo2L/TRAIL的配體的受體。Sheridan等,Science, 277: 818-821 (1997) 和Pan等，Science, 277: 815-818 (1997)記載了 Apo2L/TRAIL的另 一種受體(還 可參見WO 98/51793,公布于1998年11月19日；WO 98/41629,公布于1998年 9月24日)。此受體稱作DR5 (該受體或者也可稱作Apo-2、 TRAIL-R、 TR6、 Tango-63、 hAP08、 TRICK2或KILLER; Screaton等，Curr. Biol.， 7: 693-696 (1997); Walczak等，EMBO J.， 16: 5386-5387 (1997); Wu等，Nature Genetics, 17: 141-143 (1997); WO 98/35986,公布于1998年8月20日；EP 870,827,公布于 1998年10月14日；WO 98/46643，公布于1998年10月22日；WO 99/02653，公 布于1999年1月21日；WO99/09165,公布于1999年2月25日；WO 99/11791,公 布于1999年3月11日)。與DR4—樣，有報道說DR5含有胞質死亡結構域且能 夠發(fā)出凋亡信號。如上所述，Apo-2L的其它受體包括DcRl、 DcR2和OPG(參見Sheridan等，見上文；Marsters等，見上文；Simonet等，見上文)。術語 "Apo-2L受體"在用于本文時涵蓋天然序列受體和受體變體。這些術語涵蓋 在多種哺乳動物包括人中表達的Apo-2L受體。Apo-2L受體可以是內源表達 的，如在多種人組織語系中天然發(fā)生的，或者可以是通過重組或合成方法表 達的。"天然序列Apo-2L受體"包括與衍生自自然界的Apo-2L受體具有相同 氨基酸序列的多肽。如此，天然序列Apo-2L受體可以具有來自任何哺乳動物 的天然存在Apo-2L受體的氨基酸序列。此類天然序列Apo-2L受體可以從自 然界分離，或者可以通過重組或合成手段生產。術語"天然序列Apo-2L受體，， 明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式的受體(例如含有例如胞外結構域序列 的可溶形式)、天然存在的變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等 位變體。受體變體可包括天然序列Apo-2L受體的片段或刪除突變體。
術語"Fas"在本文中用于指包含NCBI編號AAA63174所示氨基酸殘基 l-319且記載于Itoh等，Cell 66 (2), 233-243 (1991)的多肽，以及上述序列的生 物學活性片段、刪除、插入或替代變體。該多肽在某些技術文獻中稱為 "Apo-l"和"CD95"。術語"Fas配體"或"FasL"在本文中用于指包含NCBI 編號NP—000630所示氨基酸殘基l-281且記載于Suda等，Cell 75 (6), 1169-1178 (1993)的多肽，以及上述序列的生物學活性片段、刪除、插入或替代變體。 FasL對Fas的結合、或Fas與激動性抗體的交聯(lián)誘導凋亡，導致細胞死亡(參 見例如Nagata， S. Ann. Rev. Genet. 33:29, 1999;及Labroille等，Cytometry 39(3): 195-202 (2000))。 FasL對Fas的結合經FADD銜接物(具有死亡結構域 的Fas相關蛋白)激活胱天蛋白酶級聯(lián)反應，導致對多種細胞底物的切割和 DNA斷裂。
關于本文中所鑒定的多肽序列的"百分比(％)氨基酸序列同一性"定義 為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同 一性后，且不將任 何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與多肽序列中的氨基酸 殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基S吏序列同一性目的的對 比可以本領域技術范圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟 件，諸如BLAST、 BLAST-2、 ALIGN、 ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)軟 件。本領域技術人員可決定用于測量對比的適宜參數(shù)，包括對所比較序列全 長獲得最大對比所需的任何算法。任選的是，％氨基酸序列同一性值是通過 使用序列比較計算機程序ALIGN-2獲得的。ALIGN-2序列比較計算機程序由Genentech公司編寫，而且源代碼已經連同用戶文檔 一起提交給美國版權局 (US C叩yright Office, Washington D.C， 20559)，并以美國版權注冊號 TXU510087注冊。公眾可通過Genentecli^司(South San Francisco, California) 得到ALIGN-2程序。ALIGN-2程序應當編譯成在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選數(shù)碼 〔JNIX V4.0D上使用。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設定且不變。然而，
(Altschul等,Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))。 NCBI-BLAST2序列比 較程序可以自http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov下載。NCBI-BLAST2使用數(shù)項搜索 參數(shù)，其中所有那些搜索參數(shù)設置成默認值，包括例如未掩蓋(unmask)^是 (yes)，鏈(strand)二所有(all)，期望發(fā)生(expected occurrences) = 10,最小低復 雜性長度(minimum low complexity length) =15/5,多路e值(multi-pass e-value) =0.01 ，多路常數(shù)(constant for multi-pass) = 25，最終帶缺口比對的截留(dropoff for final gapped alignment) = 25和評分矩陣(scoring matrix) = BLOSUM62。
術語"抗體"以最廣義使用，明確覆蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由 至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段。 術語"單克隆抗體"在用于本文時指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即 構成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變形 式外。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原性位點。此外，與典型的 包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同， 每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性以外，單克隆抗 體的優(yōu)勢在于它們是由雜交瘤培養(yǎng)物合成的，未受到其它免疫球蛋白的污 染。修飾語"單克隆，，指示抗體從基本上同質的抗體群獲得的特征，不應解釋 為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，有待依照本發(fā)明使用的單克隆 抗體可以通過最初由Kohler等，Nature 256:495 (1975)記載的雜交瘤方法來制 備，或者可以通過重組DNA方法來制備(參見例如美國專利No. 4,816,567)。 "單克隆抗體，，也可以使用例如Clackson等，Nature 352:624-628 (1991)及Marks 等，J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)中記載的技術從噬菌體抗體庫分離。"結 合"感興趣抗原的抗體指能夠以足夠親和力和/或親合力結合該抗原，使得該 抗體可作為診斷劑或治療劑用于靶向表達該抗原的細胞的抗體。
"死亡受體抗體，，在用于本文時通常指針對腫瘤壞死因子受體超家族中 包含能夠發(fā)出凋亡信號的死亡結構域的受體的抗體，此類抗體包括DR5抗體、DR4抗體和Fas抗體。
"DR5受體抗體"、"DR5抗體"或"抗DR5抗體"以廣義使用，指結合 至少一種形式的DR5受體的抗體。任選的是，DR5抗體與異源序列或分子融 合或連接。優(yōu)選的是，異源序列容許或幫助抗體形成更高等級的或寡聚的復 合物。任選的是，DR5抗體結合DR5受體但不與任何別的Apo-2L受體(例如 DR4、 DcRl或DcR2)結合或發(fā)生交叉反應。任選的是，該抗體是DR5信號 傳導活性的激動劑(參見例如美國專利申請No. 20040005314和 20060188498 )。
"DR4受體抗體"、"DR4抗體"或"抗DR4抗體"以廣義使用，指結合 至少一種形式的DR4受體或其胞外結構域的抗體。任選的是，DR4抗體與異 源序列或分子融合或連接。優(yōu)選的是，異源序列容許或幫助抗體形成更高等 級的或寡聚的復合物。任選的是，DR4抗體結合DR4受體但不與任何別的 Apo-2L受體(例如DR5、 DcRl或DcR2)結合或發(fā)生交叉反應。任選的是， 該抗體是DR4信號傳導活性的激動劑(參見例如美國專利申請No. 20040005314和20060188498 )。
"Fas抗體"或"抗Fas抗體，，以廣義使用，指結合至少一種形式的Fas 或其胞外結構域的抗體。任選的是，F(xiàn)as抗體與異源序列或分子融合或連接。 優(yōu)選的是，異源序列容許或幫助抗體形成更高等級的或寡聚的復合物。任選 的是，F(xiàn)as抗體結合Fas受體但不與任何別的FasL受體結合或發(fā)生交叉反應。 任選的是，該抗體是Fas信號傳導活性的激動劑(參見例如Nagata, S. Ann. Rev. Genet. 33:29， 1999;及Labroille等，Cytometry 39(3): 195-202 (2000))。
單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈 和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中 的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另 一物種或屬于另 一抗體 類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它 們展現(xiàn)出期望的生物學活性(美國專利No. 4，816,567和Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
非人(例如鼠)抗體的"人源化，，形式指最低限度包含衍生自非人免疫 球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、 Fab、 Fab，、 F(ab，)2或抗體的其它抗原結合子序列)。在極大程度上，人源化抗體指 人免疫球蛋白(受體抗體)中的互補決定區(qū)(CDR)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或家兔的CDR殘基替 換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基用相 應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體和輸入CDR或框架 序列中都沒有找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進和最大化抗體的 性能。 一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可 變域，其中所有或基本上所有CDR對應于非人免疫球蛋白的CDR,且所有或 基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。最佳的是，人源化抗體還將包含 至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié) 參見Jones等，Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等，Nature 332:323-329 (1988);和Presta， Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。人源化抗體包括 PRIMA丁IZEDtm抗體，其中抗體的抗原結合區(qū)衍生自通過用感興趣抗原免疫 獼猴而生成的抗體。
抗體典型的是展現(xiàn)出對特定抗原的結合特異性的蛋白質或多肽。天然抗 體通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構成的異四聚體糖蛋 白。典型的是，每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而二硫鍵數(shù)目在 不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有所變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律 的鏈內二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個可變域(VH)，接著是多個恒定域。 每條輕鏈在一端具有一個可變域(VO,另一端是一個恒定域。輕鏈恒定域與 重鏈第一恒定域排列在一起，而輕鏈可變域與重鏈可變域排列在一起。認為 特定的氨基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面(Chothia等，J. Mol. Biol. 186:651-663 (1985); Novotny和Haber， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4592-4596 (1985))。根據其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊推動物物種的抗體的"輕 鏈"可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡巾自(K)和拉姆達(X)。根據其重 鏈恒定域氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類。免疫球蛋白分成五大類 IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4; IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對應的重鏈恒定 域分別稱作a、 5、 s、 Y和p。
"抗體片段"包含完整抗體的一部分， 一般是完整抗體的抗原結合區(qū)或 可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、 Fab'、 F(ab'h和Fv片段；雙抗體；單鏈抗 體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
術語"可變的"在用于本文時描述可變域中的某些部分在抗體間序列有差異且用于每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，變異性通常 并非均勻分布于抗體的整個可變域。它典型的集中于輕鏈和重鏈可變域中稱
作互補決定區(qū)(CDR)或高變區(qū)的三個區(qū)段?？勺冇蛑懈痈叨缺Ｊ氐牟糠址Q 作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR,它們大多采取卩-折疊片構象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成(3-折疊片結構一部分的 三個CDR連接。每條鏈中的CDR通過FR非常接近的保持在一起，并與另一 條鏈的CDR —起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat， E.A.等， Se《Meweey /Vofe/zw /附ww"o/c^g7.c"/ /"&reit， National Institutes of Health, Bcthesda,MD(1987))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結合，但展現(xiàn)出多種 效應器功能，諸如抗體依賴性細胞毒性中抗體的參與。
單克隆抗體在本文中包括嵌合的、雜合的和重組的抗體，其通過剪接抗 Apo2L受體抗體的可變域(包括高變區(qū))與恒定域(例如"人源化"抗體)， 或者剪接輕鏈與重鏈，或者剪接來自 一種物種的一條鏈與來自另 一物種的一 條鏈，或者與異源蛋白融合而產生，不管物種起源或者免疫球蛋白類別或亞 類指定，以及抗體片段(例如Fab、 F(ab')2、和Fv)，只要它們展現(xiàn)出期望的 生物學活性或特性。參見例如美國專利No. 4,816,567及Mage等，于 Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,頁79-97, Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987。
"人抗體"指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列和
定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領域已 知的多種技術來生成。在一個實施方案中，人抗體是從噬菌體文庫選擇的， 該噬菌體文庫表達人抗體(Vaughan等，Nature Biotechnology 14:309-314 (1996); Sheets等，PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998); Hoogenboom和Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks等，J. Mol. Biol. 222:581 (1991))。人抗體還可 通過將人免疫球蛋白基因座導入內源免疫球蛋白基因已經部分或完全滅活 的轉基因動物例如小鼠來生成。在受到攻擊時，觀察到人抗體生成，它在所 有方面與在人體中看到的極其相似，包括基因重排、裝配和抗體全集。這種 方法記載于例如美國專利No. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 ， 及以下科學出版物Marks等，Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg等,Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature368:812-13 (1994); Fishwild等，Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg禾口Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)。或者，人抗體可通過生成針對靶抗原的抗體的人 B淋巴細胞的永生化來制備(此類B淋巴細胞可從個體回收，或者可在體外 免疫)。參見伊H口Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss，第77頁(1985); Boerner等，J. Immunol. 147(l):86-95 (1991);美國專利 No. 5，750，373。
術語"Fc區(qū)，，用于定義免疫球蛋白重鏈的C-端區(qū)域，其可以通過用木瓜蛋 白酶消化完整抗體而產生。Fc區(qū)可以是天然序列Fc區(qū)或變體Fc區(qū)。雖然免疫 球蛋白重鏈Fc區(qū)的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為自Fc區(qū)的 大約Cys226位置或大約Pro230位置的氨基酸殘基至羧基末端的區(qū)段(本文中 使用依照Kabat等，見上文的編號系統(tǒng))。免疫球蛋白的Fc區(qū)一般包含兩個恒 定域，即CH2結構域和CH3結構域，而且任選包含CH4結構域。
"Fc區(qū)鏈，，在本文中指Fc區(qū)的兩條多肽鏈之一 。
人IgG Fc區(qū)的"CH2結構域"(也稱為"Of2"結構域)通常自約第231 位氨基酸殘基延伸至約第340位氨基酸殘基。CH2結構域的獨特之處在于它 沒有與另一結構域緊密配對。而是，有兩個N-連接的分支的碳水化合物鏈介 于完整天然IgG分子的兩個CH2結構域之間。推測碳水化合物可能提供結構 域-結構域配對的替代且有助于穩(wěn)定CH2結構域。Burton, Molec. Immunol. 22:
結構域。
"CH3結構域"包含F(xiàn)c區(qū)中CH2結構域C端的一段殘基(即自IgG的約第 341位氨基酸殘基至約第447位氨基酸殘基)。CH3區(qū)在本文中可以是天然序 列CID結構域或變體CH3結構域(例如在其一條鏈中具有引入的"隆起" (protroberance)而在其另一條鏈中具有相應引入的"空腔，，(cavity)的CH3結構 域；參見美國專利No. 5,821,333。
"鉸鏈區(qū)"通常定義為自人IgGl的約Glu216或約Cys226至約Pro230的區(qū) 段(Burton， Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985))。其它IgG同種型的鉸鏈區(qū)可 以通過將第一個和最后一個形成重鏈間S-S鍵的半胱氨酸殘基置于相同位置
變體鉸鏈區(qū)的兩條多肽鏈通常每條多肽鏈保留至少一個半胱氨酸殘基，使得變體鉸鏈區(qū)的兩條多肽鏈可在兩條鏈之間形成二硫鍵。本文中優(yōu)選的鉸鏈區(qū) 是天然序列人鉸鏈區(qū)，例如天然序列人IgGl鉸鏈區(qū)。
"功能性Fc區(qū)"擁有天然序列Fc區(qū)的至少一種"效應器功能"。例示性的"效 應器功能"包括Clq結合；補體依賴性細胞毒性(CDC); Fc受體結合；抗體依 賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受 體；BCR)下調等。此類效應器功能一般要求Fc區(qū)與結合結構域(例如抗體 可變域)聯(lián)合，而且可以使用本領域已知的用于評估此類抗體效應器功能的 多種測定法來評估。
"天然序列Fc區(qū)，，包含與在自然界中找到的Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨 基酸序列。"變體Fc區(qū)"包含由于至少一處氨基酸修飾而與天然序列Fc區(qū)有 所不同的氨基酸序列。優(yōu)選的是，變體Fc區(qū)具有與天然序列Fc區(qū)或與親本多 肽的Fc區(qū)相比至少一處氨基酸替代，例如在天然序列Fc區(qū)中或在親本多肽的 Fc區(qū)中具有約l處至約10處氨基酸替代，優(yōu)選約1處至約5處氨基酸替代。變 體Fc區(qū)在本文中將優(yōu)選的與天然序列Fc區(qū)和/或與親本多肽的Fc區(qū)擁有至少 約80%的序列同一性，且最優(yōu)選至少約90%的序列同一性，更優(yōu)選至少約95% 的序列同一性。
術語"Fc受體"和"FcR"用于描述結合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然 序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結合IgG抗體的FcR (y受體)，包括FcyRI、 FcYRn和FcyRin亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。 FcyRII受體包括FcyRIIA ("活化受體")和Fc丫RIIB ("抑制受體")，它們具有 相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質結構域。活化受體FcyRIIA在其胞 質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcyRIIB 在其胞質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(綜述參見 DaSron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。 FcR的綜述參見Ravetch和 Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等，Immunomethods 4:25-34 (1994);及de Haas等,J. Lab. Clin. Med. 126:330-341 (1995)。術語 "FcR"在本文中涵蓋其它FcR,包括那些未來將會鑒定的。該術語還包括新生 兒受體，F(xiàn)cRii,其負責將母體IgG轉移給胎兒(Guyer等，J. Immunol. 117:587 (1976)及Kim等，J. Immunol. 24:249 (1994))。
"親和力成熟的"抗體指在抗體的一個或多個CDR中具有一處或多處改 變、導致該抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的抗體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體會具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對耙抗原
的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領域已知規(guī)程來生成。Marks等， Bio/Technology 10:779-783 (1992)記載了通過VH和VL結構域改組進行的親 和力成熟。以下文獻記載了CDR和/或框架殘基的隨機誘變Barbas等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier等，Gene 169:147-155 (1995); Yelton等，J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson等，J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); Hawkins等,J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)。
術語"標記物"在用于本文時指與試劑諸如抗體直接或間接偶聯(lián)或融合， 以便于檢測它所偶聯(lián)或融合的試劑的化合物或組合物。標記物可以是自身可 檢測的(例如放射性同位素標記物、焚光標記物)，或者在酶標記物的情況 中，可催化可檢測的底物化合物組合物的化學改變。
術語"拮抗劑"以最廣義使用，包括在體外、原位或在體內部分或完全 阻斷、抑制或中和Apo2L/TRAIL、 DR4或DR5、 FasL或Fas的一種或多種生物 學活性的任何分子。Apo2L/TRAIL、 DR4或DR5的此類生物學活性的例子包 括Apo2L/TRAIL對DR4或DR5的結合、對凋亡的誘導、以及文獻中所報告的 其它活性。FasL和Fas的此類生物學活性的例子包括FasL對Fas的結合、對凋 亡的誘導、以及文獻中所報告的其它活性。拮抗劑可以以直接或間接方式發(fā) 揮功能。例如，拮抗劑可以在體外、原位或在體內由于其直接結合DR4或DR5 的結果發(fā)揮功能而部分或完全阻斷、抑制或中和Apo2L/TRAIL的 一種或多種 生物學活性。拮抗劑還可以在體外、原位或在體內由于例如阻斷或抑制另一 種效應器分子的結果間接發(fā)揮功能而部分或完全阻斷、抑制或中和 Apo2L/TRAIL、 DR4或DR5的一種或多種生物學活性。拮抗劑分子可包括"雙 重"拮抗劑活性，其中該分子能夠部分或完全阻斷、抑制或中和 Apo2L/TRAIL、 DR4或DR5、 Fas或FasL的生物學活性。
術語"激動劑"以最廣義使用，包括在體外、原位、或在體內部分或完 全增強、刺激、或激活Apo2L/TRAIL、 DR4或DR5、 FasL或Fas的一種或多種 生物學活性的任何分子。Apo2L/TRAIL、 DR4或DR5的此類生物學活性的例 子包括Apo2L/TRAIL對DR4或DR5的結合、凋亡、以及文獻中所報告的其它 活性。FasL和Fas的此類生物學活性的例子包括FasL對Fas的結合、對凋亡的 誘導、以及文獻中所報告的其它活性。激動劑可以直接或間接方式發(fā)揮功能。 例如，激動劑可以在體外、原位、或在體內由于其直接結合DR4或DR5從而引起受體活化或信號轉導的結果發(fā)揮功能而部分或完全增強、刺激、或激活
DR4或DR5的一種或多種生物學活性。激動劑還可以在體外、原位、或在體 內由于例如刺激另 一種效應器分子繼而《I起DR4或DR5活化或信號轉導的結 果間接發(fā)揮功能而部分或完全增強、刺激、或激活DR4或DR5的一種或多種 生物學活性。激動劑可作為間接發(fā)揮功能來增強或提高DR4或DR5活化或活 性的增強劑分子。例如，激動劑可增強哺乳動物中內源Apo2L的活性。這可 通過例如預復合DR4或DR5或者通過穩(wěn)、定相應配體與DR4或DR5受體的復合 物(諸如穩(wěn)定Apo2L與DR4或DR5之間形成的天然復合物)來實現(xiàn)。
"分離的"，在用于描述本文中所公開的各種蛋白質時，意指已經鑒定 且與/由其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的蛋白質。其天然環(huán)境的污染 性成分指通常會千擾該蛋白質的診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、 和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優(yōu)選的實施方案中，將蛋白質
氨基酸序列的程、度，或(2)根據-使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染l的非還原:生或還 原性條件下的SDS-PAGE,達到同質。既然蛋白質天然環(huán)境的至少一種成分 不會存在，那么分離的蛋白質包括重組細胞內的原位蛋白質。然而，分離的 蛋白質通常通過至少一個純化步驟來制備。
為了本發(fā)明的目的，"有生物學活性的"或"生物學活性"指(a)有能 力在體內或離體的(ex vivo)在至少一種類型的哺乳動物癌細胞或受到病毒感 染的細胞中誘導或刺激凋亡；(b)能夠引發(fā)抗體，即有免疫原性的；或(c)保 留天然的或天然存在的Apo2配體多肽的活性。
"生長抑制劑"在用于本文時指在體外和/或在體內抑制細胞生長的化合 物或組合物。如此，生長抑制劑可以是顯著降低處于S期的細胞百分比的藥 劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處于S期以外的位置)的藥 劑，諸如誘導G1停滯和M期停滯的藥劑。經典的M期阻斷劑包括長春藥類 (vincas)(長春新石威(vincristine)和長春石咸(vinblastine) )、 TAXOL⑧、和拓樸異 構酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素 (daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯G1的 藥劑也溢出進入S期停滯，例如DNA烷化劑類，諸如他莫昔芬(tamoxifen)、 波尼^^(prednisone)、達卡巴口秦(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、 順柏(cisplatin)、曱氨喋呤(methotrexate)、 5-氟尿嗜咬(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見The Molecular Basis of Cancer, Mendel sohn和Israel編，第l章， 題為"Cd! cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", Murakami等, WB Saunders, Philadelphia (1995),尤其是第13頁。
術語"前體藥物"在用于本申請時指與母藥(parent drug)相比對癌細胞的 細胞毒性較小并能夠酶促活化或轉變?yōu)楦呋钚阅杆幮问降那绑w或衍生物 形式藥用活性物質。參見例:^Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14， pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 和Stella等，"Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt等編,pp. 247-267， Humana Press (1985)。 本 發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽/酯前體藥物、含硫代磷酸鹽/酯前體 藥物、含^5危酸鹽/酯前體藥物、含肽前體藥物、D-氨基酸^^飾前體藥物、糖
基化前體藥物、含p-內酰胺前體藥物、含任選:f又代苯氧基乙酰胺的前體藥物
或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉變?yōu)楦呋钚远鵁o細胞毒性的藥物
的5-氟胞嗜啶和其它5-氟尿苷前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明使用的前體藥物形 式的細胞毒性藥物的例子包括但不限于下文描述的那些化療劑。
術語"細胞毒劑，，在用于本文時指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破 壞的物質。該術語意圖包括放射性同位素(例如At211、 I131、 I125、 Y90、 Re186、 Re188、 Sm153、 Bi212、 P"和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素諸如小分子 毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體。 "化療劑，，指可用于治療像癌癥等疾患的化學化合物?；焺┑睦影?括烷化劑類(alkylating agents), 諸如塞替派(thiotepa)和環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide) (CYTOXAN );磺酸烴基酯類(alky 1 sulfonates),諸如白 消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和。底泊舒凡(piposulfan); 氮丙。定類 (aziridines), 諸如苯佐替派(benzodepa)、 卡波醌(carboquone)、 美妥替派 (meturedepa)和烏瑞替派(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類 (methylamelamines), 包括六曱蜜胺(altretamine)、 三乙撐蜜胺 (tricthylenemelamine)、三乙撐石壽酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐石克 ^粦酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine);番 篇枝內酯類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮 (bullatacinone)); 喜杉于石成(camptothecin)(包4舌合成類似物4乇泊替康 (topotecan));苫蘚抑素(bryostatin); callystatin; CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素 類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8 );多拉司他汀(dolastatin); duocarmycin (包括合成類似物，KW-2189和CBI-TMI );艾榴塞洛素 (eleutherobin); pancratistatin; sarcodictyin;;每纟帛4卬素(spongistatin); 氮芥類 (nitrogen mustards),諸如苯丁酸氮齊(chlorambucil)、萘氮齊(chlornaphazine)、 月旦磷酰胺(cholophosphamide)、 雌莫司汀(estramustine)、 異環(huán)石粦酰胺 (ifosfamide)、 雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、 鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮齊(novembichin)、笨芥月旦甾醇 (phenesterine)、〉發(fā)尼莫司汀(prednimustine)、 曲石粦胺(trofosfamide)、尿口密口定氮 芥(uracil mustard); 亞石肖脲類(nitrosoureas), i者^口卡莫司汀(carmustine)、氯脲 菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀 (nimustine)和雷莫司汀(ranimustine); 抗生素類，諸如烯二炔類抗生素 (enediyne)(例如加利車霉素(calicheamicin),尤其是加利車霉素y,1 ( )和加 利車霉素O11 ( 21,)，參見例如Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994); dynemicin包括dynemicin A; 埃斯波霉素(esperamicin); 以及新制癌素 (neocarzinostatin)發(fā)色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素 (aclacinomycin)、 放線菌素(actinomycin)、 氛茴霉素(anthramycin)、 偶氮絲氛 酉臾(azaserine)、十專來霧素(bleomycin)、》文纟戔菌素C (cactinomycin)、 carabicin、 洋紅霉素(carminomycin)、 嗜癌霉素(carzinophilin)、 色霉素(chromomycin)、 放線菌素D (dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地4乇比星(detorubicin)、 6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰 基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星 (epirubicin)、 依索t匕星(esorubicin) 、 {尹達t匕星(idarubicin)、 麻西羅審素 (marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾拉 .霧素(nogalamycin)、 揪攬審素(olivomycin)、 培洛審素(peplomycin)、 泊非審 素(potfiromycin)、嘌P令霉素(puromycin)、三纟失阿霉素(quelamycin)、羅多比星 (rodorubicin)、《連黑菌素(streptonigrin)、 鏈佐星(streptozocin)、 殺結才亥菌素 (tubercidin)、 烏苯美司(ubenimex)、 凈司他丁 (zinostatin)和佐柔比星 (zorubicin);抗代謝物，諸如曱氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉 酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、曱氨喋呤(methotrexate)、蝶羅呤 (pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate); 噪口令類似物，諸如氟達4立濱(nudarabine)、 6-巰基噤呤(mercaptopurine)、碌L咪嘌呤(thiamiprine)和碌L鳥嘌呤 (thioguanine);嘧。定類似物，i者如安西他濱(ancitabine)、阿4LJ包苷(azacitidine)、 6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofbr)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿芬 (dideoxyuridine)、去氧氟尿芬(doxifluridine)、依i若他濱(enocitabine)、 氟尿香 (floxuridine)、 5-FU;雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、表石克名,醇(epitiostanol)、 美名1^完(mepitiostane)和 睪內酯(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托 坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane);葉酸#卜充劑，諸如亞葉酸(folinic acid); 醋葡醛內酉旨(aceglatone); ^磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙 酰丙酉殳(aminolevulinic acid); 安PY 口定(amsacrine); bestrabucil; t匕生群 (bisantrene); {衣達曲沙(edatraxate); i也石岸酰胺(defosfamide); i也美可辛 (demecolcine);;也p丫酉昆(diaziquone); elfornithine;依矛J醋《妄(elliptinium acetate); 埃坡霉素(epothilone);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香 蒜多糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);美登木素生物;威類(maytansinoids)' 諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin); 米才乇胍月宗(mitoguazone); 米托蒽S昆(mitoxantrone);莫哌達醇(mopidamol); 二胺硝吖"定(nitracrine);噴 司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet); p比柔比星(pirarubicin);鬼臼酸 (podophyllinic acid); 2匿乙基酰肼(ethylhydrazide); 丙卡巴肼(procarbazine); PSK ;雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺旋鍺 (spirogermanium);纟田交4連孑包菌酉同酸(tenuazonic acid); 三亞胺酉昆(triaziquone); 2，2',2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌 素(vermcarin) A、 桿孑包菌素(roridin) A禾口蛇4亍菌素(anguidin)); 烏4立坦 (urcthan); 長春地辛(vindesine); 達卡巴。秦(dacarbazine); 甘露莫司汀 (mannomustine); 二溴甘露醇(mitobronitol); 二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);哌泊溴 烷(pipobroman); gacytosine; 阿糖胞苷(arabinoside) ("Ara-C，，)；環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);類紫杉醇類(taxoids)，例如帕利他塞 (paclitaxd) (TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N丄)和多西 他塞(docetaxel) (TAXOTERE , Rh6ne-Poulenc Rorer， Antony, France);苯丁酸 氮芥(chlorambucil);吉西他濱(gemcitabine); 6-碌u烏嘌呤(thioguanine);巰基 噤p令(mercaptopurine);曱氨p粟p令(methotrexate);鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin) 禾口卡4白(carboplatin); 長春石威(vinblastine); 4白(platinum);依4乇泊香(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);絲裂霉素(mitomycin) C;米托蒽醌 (mitoxantrone); 長春新械(vincristine); 長春瑞濱(vinorelbine); 諾維本 (navelbine); 負fe滅瘤(novantrone); 替尼泊芬(teniposide); 道i若霧素 (daunomycin); 氨基蝶呤(aminopterin); 希羅達(xeloda); 伊本膦酸鹽 (ibandronate); CPT-11;拓樸異構酶抑制劑RFS 2000; 二氟甲基鳥氨酸 (difluoromethylomithine) (DMFO) ; #見黃酉臾(retinoic acid); 卡i咅1也濱 (capecitabine);及任何上述物質的藥劑學可4妄受鹽、酸或書于生物。該定義還 包括作用為調節(jié)或抑制激素對肺瘤作用的抗激素劑，諸如抗雌激素類，包括 例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制劑4(5)-咪唑、 4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、 LY117018、奧 那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene) (Fareston);抗雄激素類，諸如氟 他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林 (leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);及任何上述物質的藥劑學可接受鹽、酸或 書T生物。
術語"細胞因子"是由一種細胞群釋放，作為細胞間介質作用于另一細 胞的蛋白質的通稱。此類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多 肽激素。細胞因子中包括生長激素，諸如人生長激素、N-曱硫氨酰人生長激 素和牛生長激素；曱狀旁腺素；曱狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松 弛素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促曱狀腺激素(TSH)和促黃 體激素(LH);肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素； 腫瘤壞死因子-a和-(3;穆勒氏(Mullerian)抑制性物質；小鼠促性腺激素相關 肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO); 神經生長因子，諸如NGF-a;血小板生長因子和血小板衍生生長因子；轉化 生長因子(TGF)，諸如TGF-cc和TGF-p;胰島素樣生長因子-I和-II;紅細胞生 成素(EPO);骨誘導因子(osteoinductive factor);干擾素，諸如干擾素-a、-卩 和-Y;集落刺激因子(CSF),諸如巨噬細胞CSF (M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞 CSF (GM-CSF)和粒細胞CSF (G-CSF);白介素(IL)，諸如IL-1、 IL-la、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL-ll、 IL-12;月中瘤壞死 因子，諸如TNF-a或TNF-!3;及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用 于本文時，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質 及天然序列細胞因子的生物學活性等效物。"治療"或"處理"或"療法"指治療性處理和預防性或防范性措施二者。
術語"治療有效量"指在哺乳動物中有效治療疾病或病癥的藥物量。在
癌癥的情況中，藥物的治療有效量可減少癌細胞的數(shù)目；縮小腫瘤的尺寸； 抑制(即在一定程度上減緩和優(yōu)選阻止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即 在一定程度上減緩和優(yōu)選阻止)胂瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和 /或在一定程度上減輕一種或多種與病癥有關的癥狀。就藥物可阻止生長和/ 或殺死現(xiàn)有癌細胞而言，它可以是細胞抑制性的和/或細胞毒性的。對于癌癥 療法，可通過例如評估肺瘤負荷或體積、疾病進展前時間(time to disease progression, TTP)和/或測定響應率(response rate, RR)來測量體內功效。
為了治療或療法目的，"哺乳動物"指歸入哺乳類的任何動物，包括人， 家畜和牲畜，及動物園、運動或寵物動物，諸如犬、馬、貓、牛等。優(yōu)選的 是，哺乳動物指人。
"受試者"或"患者"指需要治療的任何單個受試者，包括人。還意圖 作為受試者包括的有參加臨床研究試驗而沒有顯示出任何疾病臨床征候的 任何受試者、參加流行病學研究的受試者、或作為對照的受試者。
術語"癌癥"、"癌性"或"惡性胂瘤"指向或描述哺乳動物中特征通常 為細胞生長不受調控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、 母細胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌癥的更具體例子包括結腸癌、結腸直腸癌、 直腸癌、鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、何杰金氏和非何杰金氏 淋巴瘤、睪丸癌、食管癌、胃腸癌、腎癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、 卵巢癌、膠質瘤、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、子 宮內膜癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀 月泉癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各種類型的頭和頸癌。
術語"生物標志物"在用于本申請時一般指其在哺乳動物組織或細胞中 /上的表達可以通過標準方法(或本文所披露的方法)來檢測且預示哺乳動物 組織或細胞對凋亡誘導劑諸如Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體的敏感性的分 子，包括基因、蛋白質或蛋白質片段、碳水化合物結構或糖脂。本發(fā)明所涵 蓋的此類生物標志物包括但不限于本文中所公開的(參見例如圖1和圖2 ) AP2-a(SEQIDNO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2(3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段。"組織或細胞樣品"指從受試者或患者的組織得到的相似細胞的集合。 組織或細胞樣品的來源可以是實體組織，像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的
器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如 腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液；來自受試者的妊娠或 發(fā)育任何時間的細胞。組織樣品還可以是原代的或培養(yǎng)的細胞或細胞系。任 選的是，組織或細胞樣品是從原發(fā)性或轉移性腫瘤得到的。組織樣品可以包 含在自然界中天然不與組織混雜的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩沖劑、 固定劑、營養(yǎng)物、抗生素、等等。
為本發(fā)明目的，組織樣品的"切片"指一塊或一片組織樣品，例如從組 織樣品上切下來的一薄片組織或細胞。應當了解，可以制作多片組織樣品切 片并依照本發(fā)明進^f亍分析。
"關聯(lián)，，或"聯(lián)系，，指以任何方式將第一分析或方案的性能和/或結果與 第二分析或方案的性能和/或結杲進行比較。例如，可以將第一分析或方案的
結果用于實施第二分析或方案，和/或，可以使用第一分析或方案的結果來決 定是否應當實施第二分析或方案。就本文中所公開的各個實施方案而言，可 以使用分析性測定法(諸如鑒定凋亡過程中產生的AP2-ot(SEQ ID NO: 1)、 網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2(3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)片段的測定法)的結果來決定是否應當實施使用凋亡誘導劑諸如 Apo2L/TRAIL、 FasL、死亡受體抗體等等的特定治療方案。
II. 材料與方法
A.方法
一般地，本發(fā)明的方法和材料用于檢測和/或監(jiān)測哺乳動物細胞中的凋 亡，例如通過使該細胞與結合凋亡過程中所產生的蛋白質片段的抗體接觸， 其中所述抗體結合AP2-a (SEQ ID NO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 八Pl/2卩(SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段；測定凋亡 過程中所產生的所述蛋白質片段所結合的所述抗體量；然后比較所述哺乳動 物細胞中所結合的所述抗體量與無凋亡的哺乳動物細胞中所述蛋白質片段 所結合的所述抗體量，其中如果正在檢查的細胞中的所述量大于無凋亡的細 胞中的所述量，那么檢測出凋亡。如本文所提供的實施例中說明的，使所述 細胞與結合凋亡過程中所產生的蛋白質片段的抗體接觸包括接觸所述細胞的細胞成分的方法。典型地，通過例如提取來預處理所述細胞(例如如本文
所記錄的Western印跡規(guī)程中那樣)以促進細胞成分與抗體的接觸。
本文所/>開的方法和測定法可用于許多背景。例如，存在一些對 Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體的細胞死亡誘導效應有抗性的患病人類細胞 類型群體(諸如癌細胞的某些群體)。因此，據信所公開的方法和測定法可 以提供方便、有效且潛在劃算的手段以獲得可用于評估用于治療患者的合適 或有效療法的數(shù)據和信息。例如，可以給診斷有癌癥或免疫相關疾患的患者 施行活組織檢查以獲得組織或細胞樣品，并通過本發(fā)明的多種體外測定法來 檢查所述樣品以測定患者的細胞是否對治療劑諸如Apo2/TRAIL或死亡受體 抗體敏感。
對于樣品制備，可以使用來自哺乳動物(典型地是人患者)的組織或細 胞樣品。樣品的例子包括但不限于癌細胞，諸如結腸、乳腺、前列腺、卵巢、 肺、胃、胰腺、淋巴瘤和白血病癌細胞。任選地，所述樣品包括非小細胞肺 癌細胞、胰腺癌細胞或非何杰金氏淋巴瘤癌細胞。所述樣品可以通過本領域 已知的多種規(guī)程來獲得，包括但不限于手術切除、抽吸(aspiration)或活組織 檢查。
本文所公開的發(fā)明具有許多實施方案。例如，本發(fā)明的某些實施方案可 用于觀察細胞凋亡，及受試者諸如哺乳動物且特別是人受試者中的有關疾 患。在一個說明性的實施方案中，本發(fā)明的方法用于觀察凋亡在哺乳動物細 胞中的存在(或不存在)以檢查哺乳動物細胞對一種或多種凋亡誘導劑諸如 Apo2/TRAIL或FasL的敏感性，例如用以評估包括施用此類藥劑的療法的功 效。本發(fā)明的方法還可用于測定候選化合物在提高或降低哺乳動物細胞中凋 亡活性方面的活性程度，例如調節(jié)凋亡誘導劑諸如Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7)、 FasL(SEQIDNO: 9)、 Fas激動性抗體、DR4激動性抗體或DR5激動 性抗體的活性的化合物。本發(fā)明的實施方案還可用于鑒定抑制或刺激凋亡性 細胞死亡的化合物，這通過測定所述化合物抑制或刺激凋亡產生的蛋白質片 段的形成來進行。
本發(fā)明的一個典型實施方案是檢測哺乳動物細胞中的凋亡的方法，即使 所述細胞與結合凋亡過程中所產生的蛋白質片段的抗體接觸，其中所述抗體 結合AP2-a (SEQ ID NO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2(3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段；測定凋亡過程中所產生的所述蛋白質片段所結合的所述抗體量；然后比較所述哺乳動物細胞中所結合 的所述抗體量與無凋亡的哺乳動物細胞中所述蛋白質片段所結合的所述抗 體量，其中如果在該哺乳動物細胞中的所述量大于無凋亡的細胞中的所述 量，那么檢測出凋亡。在此類方法中可以使用極其多種哺乳動物細胞。在本 發(fā)明的某些實施方案中，所述細胞是人結腸、結腸直腸、肺、乳腺、前列腺、 膀胱、.腎、卵巢、腦、黑素瘤、白血病或骨髓瘤癌細胞。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種用于鑒定對在人癌細胞中誘導凋亡的 治療劑可能發(fā)生響應或為響應性的人癌細胞的方法。本發(fā)明的這種實施方案
包括如下步驟使所述人癌細胞暴露于所述治療劑；對暴露于所述治療劑的 所述人癌細胞檢查AP2-a (SEQ ID NO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 八Pl/2卩(SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段的存在；比 較所述人癌細胞中的所述蛋白質片段量與未暴露于所述配體的對照人癌細 胞中的所述蛋白質片段量。在這種實施方案中，若存在于暴露于所述治療劑 的所述人癌細胞中的所述蛋白質片段量大于未暴露于所述治療劑的所述對 照人癌細胞中的所述蛋白質片段量，則觀察到凋亡；且在所述人癌細胞中觀 察到凋亡則所述人癌細胞鑒定為對所述治療劑可能發(fā)生響應或為響應性的。 在本發(fā)明的某些實施方案中，所述人癌細胞獲自診斷有癌癥的個體，并已經 在體外培養(yǎng)物中培養(yǎng)了不到一個月，并且典型地是不到2周，或不到1周。在
備選的實施方案中，所述人癌細胞是獲自體外培養(yǎng)物的永生化細胞系。
在本發(fā)明的典型實施方案中，比較正在觀察凋亡存在情況的哺乳動物細 胞(例如暴露于凋亡誘導劑的哺乳動物細胞)中所結合的所述抗體量與無凋 亡的哺乳動物細胞(例如未曾暴露于所述凋亡誘導劑的對照細胞)中所述蛋 白質片段所結合的所述抗體量。本領域的技術人員理解的是，此類對照細胞 是如下的那些，即除了正在測試的變量(例如暴露于凋亡誘導劑)外像正在 觀察凋亡存在情況的實驗性哺乳動物細胞那樣。在本發(fā)明的一個實施方案 中，所述對照細胞是與正在觀察凋亡存在情況的實驗性哺乳動物細胞來自相 同來源(例如來自原發(fā)性腫瘤或轉移性肺瘤部位的活組織檢查樣品)的細胞 和/或屬于相同譜系的細胞，只是所述對照哺乳動物細胞不暴露于啟動死亡受 體4 (SEQ ID NO: 5)、死亡受體5 (SEQ ID NO: 6)或Fas (SEQ ID NO: 8)的信號 傳導的藥劑。在本發(fā)明的某些實施方案中，AP2-a(SEQIDNO: 1)、網格蛋 白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 AP1/2J3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)在此類對照細胞中的斷裂樣式(pattem of fragmentation)早已被表征，并且與 正在觀察凋亡存在情況的哺乳動物細胞中的AP2-a (SEQ ID NO: 1)、網格蛋 白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 AP1/2P (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4) 的斷裂樣式進行比較的正是所述對照細胞中的這種先前表征的斷裂樣式。此 類實施方案用于例如消除不必要且多余的細胞對照(例如表征為無凋亡細胞 的對照)表征。
本發(fā)明的實施方案可用于檢查正在經歷凋亡的細胞，所述凋亡是由已知 啟動這種程序性細胞死亡(programmed cell death)的才及其多種因子(例如熱、 輻射和化學試劑)之任一種誘導的。這些實施方案典型地觀察所述細胞中經 由細胞表面上的受體，例如死亡受體4 (SEQ ID NO: 5)、死亡受體5 (SEQ ID NO: 6)或Fas(SEQIDNO: 8)啟動的凋亡。在本發(fā)明的某些實施方案中，使所 述細胞與多肽諸如Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7)、 FasL (SEQ ID NO: 9)、 Fas 激動性抗體、DR4激動性抗體或DR5激動性抗體接觸，并使用用于檢測凋亡 的所述方法(其包括檢測無凋亡)來例如獲得關于如下療法的功效的信息， 所述療法包括施用此類藥劑。
本發(fā)明的方法還可用于鑒定新的凋亡誘導劑和/或凋亡誘導劑調節(jié)劑。說 明性的實施方案可以包括如下步驟使哺乳動物細胞暴露于一種或多種測試 藥劑，然后使用本發(fā)明的方法來觀察凋亡，在所述哺乳動物細胞中檢測到凋 亡則所述一種或多種測試藥劑鑒定為所述哺乳動物細胞中的凋亡誘導物。本 發(fā)明的方法還可以與補充性的(complimentary)細胞分析方法例如遺傳序型分 析(genetic profiling)聯(lián)合。本發(fā)明的這樣一個實施方案包括如下步驟，即檢 查至少 一種mRNA在觀察到凋亡的哺乳動物細胞中的表達。
本發(fā)明的方法包括觀察如本文所示在正在經歷凋亡的細胞中斷裂的細 胞蛋白。這些蛋白質片段，例如AP2-a(SEQIDNO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQID NO: 2)、 AP1/2P (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的片段可以通過 本領域已知的極其多種測定法之任一種來觀察。典型地，使用免疫印跡法、 酶聯(lián)免疫吸附測定法或免疫組織化學來觀察此類片段。另外，本發(fā)明的方法 可用于檢查本文所鑒定的許多蛋白質片段，例如具有約64 kDa或33 kDa分子 量的AP2a蛋白質片段。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述抗體所結合的蛋 白質片段是通過該片段特異性的氨基酸序列來鑒定的，例如SEQIDNO: l的 AP2-a氨基酸序列DVFD或SEQ ID NO: 1的GPAA。如上文所記錄的，本發(fā)明的實施方案包括測定診斷有癌癥的人患者是否
對使用 一種或多種凋亡誘導劑例如APO-2/TRAIL的治療可能發(fā)生響應的方 法。可以修改這些方法以與便于測定診斷有癌癥的患者是否對使用藥劑諸如 凋亡誘導劑的治療可能發(fā)生響應的本領域已知的多種其它方法一起使用，例 如那些檢查至少一種基因在診斷有癌癥的人患者中(例如在原發(fā)性腫瘤或轉
移中)的表達(例如mRNA或由該mRNA編碼的蛋白質的存在或水平)的方 法。此類遺傳序型分析方法在本領域中是公知的，并記載于例如美國專利申 請No. 20060015952。
本發(fā)明方法的這樣一個實施方案可以包括如下步驟，即在獲自患者的癌 細胞中觀察凋亡過程中所產生的片段，包^"AP2-ot (SEQ ID NO: 1 )、網格蛋 白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2卩(SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4) 的蛋白質片段；與如下步驟聯(lián)合，即獲得多基因的基因表達序型，并比較它 與相同譜系的非癌細胞和/或獲自已知對使用 一種或多種凋亡誘導劑的治療 有響應(或者無響應)的動物模型的癌細胞的基因表達序型。典型地，此類 方法可以包括如下步驟，即例如若獲自患者的癌細胞所具有的基因表達序型 是否與獲自已知受益于使用 一 種或多種凋亡誘導劑的治療的患者(或癌癥的 動物模型)的癌細胞的基因表達序型相似，則進一步鑒定所述患者為可能受 益于使用一種或多種凋亡誘導劑的治療。
為了本文的目的，"相似的"指表達序型以一種或多種方式相互類似或 追蹤(track),其顯示為根據用于測量基因表達序型的測定法或技術(如下文 進一步詳細描述的)，在量或者其它可測量的表達參數(shù)上是在約80%至00% 內同 一的，更優(yōu)選在約90%至100%內，且更優(yōu)選在約95%至100°/。內同 一的 表達樣式。來自患者的和獲自動物模型的癌細胞的基因表達序型 一般地通過 相同的技術或測定法來獲得以便于其比較。
基因表達序型分析的方法在本領域中是公知的，并且典型地基于多核苷 酸的雜交分析或多核苷酸的測序。本領域中已知的用于樣品中mRNA表達定 量的最常用方法包括Northern印跡和原位雜交(Parker和Barnes, Methods in Molecular Biology, 106:247-283 (1999)) ; RNA酶保護測定法(Hod, Biotechniques， 13:852-854 (1992));及逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR) (Weis 等，Trends in Genetics, 8:263-264 (1992))。或者，可以采用能識別特定雙鏈體 的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白質雙鏈體?；跍y序的基因表達分析的代表性方法包括基因表 達系列分析(Serial Analysis of巧gfte Expression, SAGE)，和通過大規(guī)模平行信 號測序(massively parallel signature sequencing) (MPSS)進4亍的基因表達分才斤。 可以使用任何這些方法或本領域已知的其它方法來測定腫瘤細胞的基因表 達序型，所述腫瘤細胞獲自患者諸如人患者，和充當對TGF-P拮抗劑有響應 的癌癥模型的動物，諸如小鼠模型。在人患者的情況中，腫瘤細胞的來源可 以是新鮮的、冷凍的或經固定和石蠟包埋的組織樣品，從中可以提取mRNA 并進行基因表達分析。
或者，也可以使用蛋白質組學技術來比較癌細胞中人和參照(例如小鼠) 蛋白的表達序型。蛋白質組序型是多種蛋白質在生物學樣品(例如癌組織) 中的表達樣式的表現(xiàn)。表達序型可以例如以質譜表示，但基于蛋白質的任何 物理化學或生物化學性質的其它表現(xiàn)也包括在內。如此，表達序型可以例如 基于蛋白質電泳性質的差異(如通過二維凝月交電泳例如通過2-D PAGE所測 定的)，并可以以例如二維電泳凝膠中的多個點表示。蛋白質組學技術是本 領域中乂〉知的，并記載于例如下列教科書Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics (Principles and Practice), M R. Wilkins等編，Springer Verlag， 1007; 2-D Proteome Analysis Protocols, Andrew L Link編,Humana Press, 1999; Proteome Research: Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods (Principles and Practice), T. Rabilloud編，Springer Verlag, 2000; Proteome Research: Mass Spectrometry (Principles and Practice), P. James 編，Springer Verlag, 2001; Introduction to Proteomics, D. C. Liebler編，Humana Press, 2002; Proteomics in Practice: A Laboratory Manual of Proteome Analysis, R. Westermeier等編，John Wiley & Sons, 2002。
可以通過本領域公知的許多手段來分析樣品中在凋亡過程中所產生的 蛋白質片段，所述蛋白質片段包括AP2-a (SEQ ID NO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2(3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段。 例如在A聰bel等編，1995, Current Protocols In Molecular Biology,第15單元 (免疫印跡法)中找到了用于評估此類蛋白質片段的典型方案?？捎煤醣景l(fā) 明某些實施方案的免疫測定法包括但不限于Western印跡、免疫沉淀、狹線 或斑點印跡測定法、免疫染色、RIA、閃爍接近度測定法、使用熒光物質(諸 如熒光素或羅丹明)的抗體偶聯(lián)物或抗原偶聯(lián)物的熒光免疫測定法、Ouchterlony雙重擴散分析、ELISA、基于細胞的ELISA、濾膜結合ELISA、 抑制ELISA、和采用親合素-生物素或鏈霉親合素-生物素4企測系統(tǒng)的免疫測定法。
在本發(fā)明的有些實施方案中，用于免疫測定法的抗體結合完整的蛋白質 和蛋白質片段二者，并且所述蛋白質片段通過其特征性的較小尺寸被識別， 例如在Westem印跡規(guī)程中。例如，用于本發(fā)明實施方案的抗體可以是本文所 公開的例示性抗體之一，或結合由本文所公開的例示性抗體之一所結合的表 位的抗體。在本發(fā)明的其它實施方案中，可以使用特異性識別凋亡所產生的 蛋白質片段而不是完整蛋白質的抗體。此類抗體可以通過標準免疫接種法來 制備，其中使用片段作為免疫原，然后鑒定那些結合凋亡所產生的蛋白質片 段而不是完整蛋白質的所產生抗體。
在本發(fā)明的典型實施方案中，對獲自溶解細胞的蛋白質進行分析，所述 蛋白質已經通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳("PAGE")的方法分開。使所述蛋白 質與抗體接觸，并進行分析(優(yōu)選通過免疫測定法)以測定結合所述抗體的 蛋白質片段的存在。可以與由來自已知無凋亡的相似溶解細胞(例如相同來 源和/或譜系的細胞)的蛋白質組成的對照進行比較?？梢允褂蒙衔乃龅娜?何免疫測定法來分析來自活受試者的組織樣品?？赡苡糜谶@種分析的生物學 樣品包括血細胞或活組織檢查的細胞或組織樣品，它們可以通過標準方法獲 得。可以以上文所述的任何免疫測定法測定凋亡所產生的肽片段在上文所述 的生物學樣品中的水平，其中采用特異性結合AP2-a(SEQIDNO: 1)、網格 蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2卩(SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4) 的蛋白質片段的抗體。將來自正在分析的受試者的生物學樣品中所測定的凋 亡所產生的肽片段水平與未受染患者細胞中或已知標準品中發(fā)現(xiàn)的水平進 行比較。例示性的標準品可以是例如在未經歷凋亡的細胞中(例如在未暴露 于凋亡誘導劑的對照細胞中)典型地觀察到的一種或多種蛋白質片段的存在 和/或濃度?？梢允褂么祟悓嵤┓桨竵砝缭\斷特征為異常凋亡的疾患。在本 發(fā)明的某些實施方案中，在細胞內觀察到一定水平的凋亡，例如與對照樣品 相比，將至少10%、 20%、 30%、 40%或50%、 100%或150%的凋亡所產生肽 片段增量視為病理學疾患的指標。在本發(fā)明的其它實施方案中，在細胞內觀 察到一定水平的凋亡，例如與對照樣品相比，將至少10倍、100倍或1000倍 的凋亡所產生肽片段增量視為病理學疾患的指標?？梢孕薷谋景l(fā)明的實施方案以用于免疫測定法，其可用于AP2-a (SEQ ID NO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2卩(SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋 白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段的檢測和定量。此類測定法可以在適當時包 含一種或多種能夠識別和結合蛋白質片段的抗體。這些測定法在本領域公知 的多種免疫學測定法形式內實施，包括但不限于各種類型的Westem印跡測定 法、放射性免疫測定法、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光測定 法(ELIFA)等。
在說明性的方法中，可以在足以使抗體-生物標志物復合體形成的條件 下使樣品與對生物標志物特異性的抗體接觸，所述生物標志諸如AP2-a (SEQ IDNO:l)、網格蛋白重鏈(SEQIDNO: 2)、 AP1/2P (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋 白(SEQIDNO:4)的蛋白質片段；然后檢測所述復合體。檢測蛋白質片段-生 物標志物的存在可以以許多方式實現(xiàn)，諸如通過用于測定多種組織和樣品 (包括血漿或血清)的Western印跡法(含或不含免疫沉淀步驟)和ELISA規(guī) 程進行。使用此類測定法形式的一系列免疫測定技術是可獲得的，參見例如 美國專利No. 4,016,043、 4，424,279及4，018,653。這些包括非竟爭類型的單個 位點和兩個位點或"三明治"/ "夾心式，，測定法，以及傳統(tǒng)的竟爭性結合測 定法二者。這些測定法也包括經標記抗體對靶生物標志物的直接結合。
三明治測定法是最有用且最常用的測定法之一。三明治測定技術存在許 多變化形式，意圖將所有的變化形式涵蓋于本發(fā)明內。簡言之，在一種典型 的正向測定法(forwardassay)中，將未標記的抗體固定化于固體基片上，并使 待檢測的樣品與所結合分子接觸。溫育合適的一段時間后，即足以容許抗體 -抗原復合體形成的一段時間，然后添加經能夠產生可;f企測信號的報道分子 標記的、對所述抗原特異性的第二抗體，并溫育，容許足以形成抗體-抗原-經標記抗體的另一種復合體的時間。洗掉任何未反應的物質，并通過觀察由 所述報道分子所產生的信號來測定所述抗原的存在。結果可以是定性的(通 過對可視信號的簡單觀察進行)，或者可以是定量的(通過與含有已知量生 物標志物的對照樣品比較來進行)。
樣品和經標記的抗體兩者添加至所結合的抗體。這些技術對本領域技術人員 是公知的，包括會容易明白的任何微小變化。在一種典型的正向三明治測定 法中，將具有對所述生物標志物特異性的第一抗體或是共價地或是被動地結合至固體表面。典型地，所述固體表面是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是 纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固體支持物可 以采用試管、珠、微量板盤的形式，或者適于進行免疫測定法的任何其它表 面。結合方法是本領域公知的，并且一般包括交聯(lián)、共價結合、物理吸附， 清洗聚合物-抗體復合體以為測試樣品做好準備。然后將測試樣品的等分試 樣添加至固相復合體，并在合適的條件(例如從室溫至40。C，諸如包括端點
在內的25。C和32。C之間)下培養(yǎng)足夠的一段時間(例如2-40分鐘或者過夜， 如果更方便的話)，所述條件和時間適于或足以容許存在于抗體中的任何亞 基的結合。溫育期后，清洗抗體亞基固相并干燥，并與對生物標志物一部分 特異性的第二抗體一起溫育。所述第二抗體連接有用于指示第二抗體對分子 標志物結合的報道分子。
一種備選的方法包括將樣品中的耙生物標志物固定化，然后使固定化 的靶物暴露于特異性抗體，該特異性抗體可以是或不是經^^艮道分子標記的。 根據靶物的量和報道分子信號的強度，可以通過用所述抗體直接標記，使所 結合的靶物變成可檢測的?；蛘撸箤Φ谝豢贵w特異性的經標記第二抗體暴 露于輩巴物-第一抗體復合體以形成把物-第一抗體-第二抗體三元復合體。通過 報道分子所發(fā)出的信號檢測所述復合體。"報道分子"在用于本說明書時指 通過其化學性質提供分析上可鑒定的信號的分子，所述信號容許結合至抗原 的抗體的檢測。這種類型的測定法中最常用的報道分子是酶、焚光團或含發(fā) 射性核素的分子(即放射性同位素)和化學發(fā)光分子。
在酶免疫測定法的情況中，酶是偶聯(lián)至第二抗體的， 一般藉戊二醛或高 碘酸鹽進行。然而，會容易認可的是，存在極其多種不同的偶聯(lián)技術，它們 對技術人員是輕易可獲得的。常用的酶包括辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、 半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等。 一般選擇與特定酶一起使用的底物以在相應酶 的水解作用后產生可纟企測的顏色變化。合適酶的例子包括石成性^^酸酶和過氧 化物酶。還可能采用產生焚光產物的熒光底物而不是上文所記錄的顯色底 物。在典型的情況中，將酶標記的抗體添加至第一抗體-分子標志物復合體， 容許結合，然后洗掉過量的試劑。然后將含有合適底物的溶液添加至抗體-抗原-抗體復合體。底物會與連接至第二抗體的酶起反應，給出定性的視覺 信號，其可以被進一步地定量(通常通過分光光度法)以給出存在于樣品中 的生物標志量的指標?；蛘撸瑹晒饣衔?諸如熒光素和羅丹明)可以以化學方法偶聯(lián)至抗體，而不改變所述抗體的結合能力。通過使用特定波長的光 線光照來激發(fā)時，熒光染料標記的抗體吸收光能，在分子中將狀態(tài)誘導至激 發(fā)態(tài)，接著發(fā)出光線，其特征性顏色是用光學顯微鏡在視覺上可檢測的。如 在EIA中那樣，容許焚光標記的抗體結合至第一抗體-分子標志物復合體。洗 掉未結合的試劑后，然后使剩余的三元復合體暴露于適當波長的光線，觀察
到的熒光表明感興趣的分子標志物的存在。免疫熒光和EIA技術在本領域中
都是非常完善建立的。然而，還可以采用其它報道分子，諸如放射性同位素、 化學發(fā)光或生物發(fā)光分子。
如上文所記錄的，本發(fā)明的實施方案可以使用結合AP2-a (SEQ ID NO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2卩(SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段；而不是完整蛋白質的抗體(例如結合通過切割全長 蛋白質所產生的表位的抗體)?？梢允褂么祟悓嵤┓桨竵硗ㄟ^免疫組織化學 染色技術檢查細胞中的蛋白質片段。在此類技術中，組織樣品可以通過常規(guī) 方法學來固定(即保存)(參見例如"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology,"第3版(1960) Lee G. Luna, HT (ASCP)編，The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel編，Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.)。本領域的才支術人員將領會 的是，固定劑的選擇是根據該組織將要組織學染色或是以別的方式分析的目 的而確定的。本領域技術人員還將領會的是，固定的(時間)長度取決于組 織樣品的大小和所使用的固定劑。舉例而言，可以使用中性緩沖的福爾馬林、 Bouin氏或低聚曱醛來固定組織樣品。組織制備之后，組織切片可以進行本 領域已知的多種免疫組織化學技術之一。
B.材料
多種材料可以用于實施本發(fā)明，包括極其多種凋亡誘導劑以及結合凋亡 性細胞死亡過程中所產生的、本文所公開的蛋白質片段的抗體之任一種。例 示性的凋亡誘導劑包括Apo2L、抗DR4或DR5激動性抗體、FasL和抗Fas激動 性抗體?？梢栽谒龇椒ㄖ胁捎玫腁po-2L包括Pitti等，見上文；WO 97/25428， 見上文；及W097/01633，見上文(稱為TRAIL的多肽)中所記載的Apo-2L多肽?？梢允褂酶鞣N形式的Apo-2L,諸如全長多肽以及包含胞外結構域(ECD) 序列的可溶性形式Apo-2L。此類可溶性ECD序列的例子包括包含Pitti等，J. Biol. Chem.， 271:12687-126卯(1996)圖lA所示Apo-2L序列氨基酸l 14-281 、 95-281、 91-281或92-281的多肽。目前認為包含氨基酸92-281的多肽是Apo-2L 的天然切割形式。申請人已經在CHO細胞中表達了人Apo-2L,并發(fā)現(xiàn)92-281 多肽是Apo-2L的表達形式。Apo-2L的經修飾形式諸如記載于WO 97/25428中 的共價修飾形式是包括在內的。特別地，為了用于本發(fā)明，連接至非蛋白質 性質聚合物諸如聚乙二醇的Apo-2L是包括在內的。Apo-2L多肽可以依照記 載于WO 97/25428中的任何方法來制備。
可以用于所述方法的、具有凋亡活性的Apo-2配體變體包括例如那些通 過丙氨酸掃描技術鑒定的。具體的替代變體包含Pitti等，J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996)圖1A的氨基酸91-281 ，其中用丙氨酸殘基替代第203 位、第218位或第269位氨基酸中的至少一處。任選地，Apo-2配體變體可以 包含這三處不同位點替代之一處或多處。
或者，可以在當前公開的方法中采用模擬Apo-2L和/或FasL的凋亡活性 的分子。此類分子的例子包括能以至少與Apo-2L相當或相似的方式誘導凋亡 的激動性抗體。特別地，這些激動性抗體包括一種或多種Apo-2L受體的抗體。 優(yōu)選地，所述激動性抗體是針對包含胞質死亡結構域的Apo-2L受體的，諸如 DR4或DR5。甚至更優(yōu)選地，此類激動性抗體結合此類受體，并可以測定結 合，例如使用FACS分析或ELISA進行。針對稱為DR5 (或Apo-2 )的受體的 激動性抗體已經使用融合技術(諸如下文描述的)得以制備。DR5或Apo-2 受體激動性抗體之一稱為3F11.39.7,并已經在1998年1月13日以保藏號 HB-12456保藏于ATCC。 Apo-2L受體抗體的激動劑活性可以使用用于測定凋 亡活性的多種方法來測定，并且任選地，可以通過使用Fc免疫球蛋白或補體 測定抗體(單獨的或交聯(lián)形式的)來測定此類抗體的凋亡活性。
另外，還已經制備了針對稱為DR4的另 一種Apo-2L受體的激動性抗體。 例示性的DR4激動性抗體稱為4H6.17.8，并已經在1998年1月13日以保藏號 1IB-12455保藏于ATCC。 Apo-2L受體抗體的激動劑活性可以使用用于測定凋 亡活性的多種方法來測定，并且任選地，可以通過使用Fc免疫^求蛋白或補體 測定抗體(單獨的或交聯(lián)形式的)來測定此類抗體的凋亡活性。
本發(fā)明所涵蓋的激動性抗體包括結合單一Apo-2L受體或超過一種八po-2L受體的抗體。結合超過一種Apo-2L受體的抗體可以被表征為與兩種
或更多不同抗原"交叉反應"，并能夠結合每種不同抗原的抗體，例如如下
文實施例中的ELISA或FACS所測定的。任選地，與兩種或更多不同抗原"特 異性交叉反應，，的抗體是如下抗體，該抗體結合第一抗原，并進一步結合第 二種不同抗原，其中在約10ng/mL的抗體濃度，所述抗體對第二抗原的結合 能力是對第 一抗原的結合能力的約50%至約100% (優(yōu)選約75%至約100% ), 如捕捉ELISA (諸如下文實施例中的)中所測定的。例如，所述抗體可以特 異性結合DR5("第一抗原")，并與另一種Apo-2L受體諸如DR4("第二抗原") 特異性交叉反應，其中在本文捕捉ELISA中約IO ing/mL所述抗體對DR4的結 合程度是所述抗體對DR5的結合能力的約50%至約100%。多種對Apo-2L受體 有交叉反應性的抗體進一步的詳細記載于國際專利申請?zhí)朠CT/US99/13197。 如下所述，可用于實施本發(fā)明實施方案的例示形式的抗體包括多克隆、 單克隆、人源化、雙特異性、和異源偶聯(lián)抗體。
1. 多克隆抗體
實施本發(fā)明所用的抗體可以包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是 熟練技術人員知道的。多克隆抗體可以在哺乳動物中生成，例如通過一次或 多次注射免疫劑和(需要時的)佐劑。典型地，免疫劑和/或佐劑會通過多次 皮下或腹膜內注射而注射在哺乳動物中。免疫劑可以包括例如完整的或部分 的AP2-oc ( SEQ ID NO: 1 )、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2 )、 AP1鄰(SEQ ID N():3)或發(fā)動蛋白(SEQIDNO:4)多肽或其融合蛋白。將免疫劑與已知 在所免疫哺乳動物中有免疫原性的蛋白質偶聯(lián)可能是有用的。此類免疫原性 蛋白質的例子包括但不限于匙孔i戚血藍蛋白、血清清蛋白、牛曱狀腺球蛋白 和大豆胰蛋白酶抑制劑?？刹捎玫淖魟┑睦影ǜナ贤耆魟┖?MPL-TDM佐劑(單磷酰脂質A、合成二棒分枝菌酸海藻糖)。免疫方案可以 由本領域技術人員無需過度試驗就選出。然后可以對哺乳動物采集血液，并 對血清測定抗體滴度。如果需要，可以對哺乳動物進行加強免疫直到抗體滴 度升高或達到平臺(plateau)。
2. 單克隆抗體
或者，實施本發(fā)明時所使用的抗體可以是單克隆抗體。單克隆抗體可使 用雜交瘤方法來制備，諸如那些由Kohier和Milstein, Nature, 256:495 (1975) 記載的。在雜交瘤方法中，通常用免疫劑免疫小鼠、倉鼠、或其它適宜的宿主動物以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結合 所述免疫劑。或者，可以在體外免疫淋巴細胞。
一般而言，若想要人起源的細胞，則使用外周血淋巴細胞(PBL);或者， 若想要非人哺乳動物來源，則使用脾細胞或淋巴結細胞。然后，使用合適的 融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與永生化細胞系融合，以形成雜交瘤細胞 (Goding， Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986， pp.59-103)。永生化細胞系通常是經轉化的哺乳動物細胞，特別是嚙齒類、 牛、和人起源的骨髓瘤細胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。雜交瘤 細胞可以在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的永生化 細胞生長或存活的一種或多種物質。例如，若親本細胞缺乏酶次黃噪呤鳥。票 呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT),則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的將含有 次黃噤呤、氨基喋呤和胸苦(HAT培養(yǎng)基)，這些物質阻止HGPRT缺陷細胞 生長。
優(yōu)選的永生化細胞系是那些高效融合、支持所選抗體生成細胞穩(wěn)定的高 水平表達抗體、并對諸如HAT培養(yǎng)基的培養(yǎng)基敏感的。更優(yōu)選的永生化細胞 系是鼠骨髓瘤系，其可以從例如索爾克研究所細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA)和美詞典型培養(yǎng)物保藏中 '"、(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA)獲《尋。ot匕類t氛骨 髓瘤細胞系的一個例子是P3X63AgU. 1 。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞 系也已記載用于生成人單克隆抗體(Kozbor， J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987， pp. 51-63)。
然后可以對雜交瘤細胞在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)液測定針對期望免疫原的單 克隆抗體的存在。優(yōu)選地，通過免疫沉淀或通過體外結合測定法，諸如放射 免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的 單克隆抗體的結合特異性。此類技術和測定法是本領域已知的。單克隆抗體 的結合親和力可通過例如Munson和Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980)的 Scatchard分析來測定。
在鑒定出想要的雜交瘤細胞后，該克隆可通過有限稀釋規(guī)程進行亞克隆 并通過標準方法進行培養(yǎng)(Goding，見上文)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例 如Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基?；蛘?，雜交瘤細胞可在哺乳動物中作為腹水進行體內培養(yǎng)。
可通過常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石 層析、凝膠電泳、透析或親和層析，自培養(yǎng)液或腹水分離或純化亞克隆分泌 的單克隆抗體。
單克隆抗體還可以通過重組DNA方法來制備，諸如美國專利No. 4,816，567中所記載的。編碼實施本發(fā)明時所使用的單克隆抗體的DNA可以容 易的使用常規(guī)規(guī)程分離和測序(例如通過使用能夠特異性結合編碼鼠抗體重 鏈和輕鏈的基因的寡核苦酸探針)。以本發(fā)明的雜交瘤細胞作為此類DNA的 優(yōu)選來源。 一旦分離，可將DNA置于表達載體中，然后將該表達載體轉染到 原本不生成免疫球蛋白蛋白質的宿主細胞中，諸如猿COS細胞、中國倉鼠卵 巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。 還可以修飾DNA,例如通過替代即用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列代替同 源鼠序列(美國專利No. 4,816,567; Morrison等，見上文)，或通過將非免疫3求 蛋白多肽的整個或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價連接?？梢杂么?類非免疫球蛋白多肽替代本發(fā)明抗體的恒定域，或者可以用它們替代本發(fā)明 抗體的一個抗原結合位點的可變域，以產生嵌合二價抗體。任選地，可以構 建包含抗體的至少一個可變域或高變區(qū)(諸如本文中所公開的抗體的)的嵌 合抗體。
任選地，本發(fā)明的抗體會與任何本文中所公開的抗體結合相同的表位。 這可以通過實施多種測定法來確定，諸如本文中所描述的。例如，為了確定 某單克隆抗體是否與本文具體所指抗體具有相同的特異性，可以在凋亡測定 法中比較其活性。
實施本發(fā)明時所使用的抗體包括"交聯(lián)"抗體。術語"交聯(lián)"在用于本 文時指至少兩個IgG分子結合在一起以形成一個(或單個)分子。抗體可以 使用多種接頭分子來交聯(lián)。任選地，使用抗IgG分子、補體、化學修飾或分 子工程來交聯(lián)抗體。本領域技術人員會領會， 一旦抗體結合至細胞表面膜， 補體具有相對較高的針對抗體分子的親和力。因而，認為補體可以作為交聯(lián) 分子來連接結合至細胞表面膜的兩個或更多抗體。在各種鼠Ig同種型中，已 知lgM、 IgG2a和IgG2b固定補體。
實施本發(fā)明時所使用的抗體可以任選地包含二聚體抗體，以及多價形式 的抗體。本領域沖支術人員可以通過本領域已知才支術和^f吏用本文中的抗Apo-2L受體抗體來構建此類二聚體或多價形式。
實施本發(fā)明時所使用的抗體還可以包括單價抗體。用于制備單價抗體的 方法是本領域公知的。例如， 一種方法牽涉重組表達免疫球蛋白輕鏈和經修
飾的重鏈。所述重鏈一般在Fc區(qū)中任何位點處截短以防止重鏈交聯(lián)?；蛘?，
將相關半胱氨酸殘基用另 一種氨基酸殘基替代或者刪除以防止交聯(lián)。
體外方法也適用于制備單價抗體。消化抗體以生成其片段，特別是Fab 片段，可以使用本領域已知的常規(guī)技術來實現(xiàn)。例如，可以使用木瓜蛋白酶 實施消化。木瓜蛋白酶消化的例子記載于WO 94/29348,公布于12/22/94及美 國專利No. 4,342,566。用木瓜蛋白酶消化抗體典型地產生兩個相同的抗原結 合片段，稱為Fab片段，各自具有一個抗原結合位點，及一個剩余的Fc片段。 胃蛋白酶處理產生一個F(ab')2片段，它具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯(lián) 抗原。
在抗體消化中產生的Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第 一恒定域 (CH1)。 Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結構域的羧基末端增加 了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab'-SH是本文中 對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab')2抗體片段 最初是作為在成對Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab'片段生成的。還 知道抗體片段的其它化學偶聯(lián)形式。
也可以生成單鏈Fv片段，諸如Iliades等，F(xiàn)EBS Letters, 409:437-441 (1997) 中所述。此類單鏈片段使用各種接頭的偶聯(lián)記載于Kortt等，Protein Engineering, 10:423-433 (1997)。
在上文所述抗體之外，還可以使用已知的合成蛋白質化學方法(包括牽 涉交聯(lián)劑的那些)在體外制備嵌合或雜合抗體。例如，可使用二硫化物交換 反應或通過形成硫醚鍵來構建免疫毒素。適于此目的的試劑的例子包括亞氨 基硫醇酯/鹽(iminothiolate)和4-巰基丁酰亞氨酸曱酯 (methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
實施本發(fā)明時所使用的抗體可以進一步包括人源化抗體或人抗體。非人 (例如鼠)抗體的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列 的嵌合免疫^^蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、 Fab、 Fab'、 F(ab')2或 抗體的其它抗原結合子序列)。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)
中的互補決定區(qū)(CDR)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或家兔的CDR殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況 中，將人免疫球蛋白的Fv框架殘基用相應的非人殘基替換。人源化抗體還可 包含在受體抗體或者在輸入CDR或框架序列中都沒有找到的殘基。 一般而 言，人源化抗體會包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變域，其中所 有或基本上所有CDR區(qū)對應于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，且所有或基本上所 有FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的FR。人源化抗體最好還會包含至少部分 免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Jones等，Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等，Nature, 332:323-329 (1988);及Presta， Curr. Op. Struct. Biol" 2:593-596 (1992))。
體具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常 稱作"輸入"殘基，它們典型地取自"輸入"可變域。人源化可基本上遵循 Winter及其同事的方法進行(Jones等，Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann 等，Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen等，Science, 239:1534-1536 (1988)), 通過用嚙齒類CDR或CDR序列替代人抗體的相應序列。因而，此類"人源化" 抗體是嵌合抗體(美國專利No. 4,816,567),其中基本上少于整個人可變域用 來自非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體典型地是其中一些 CDR殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代的 人抗體。
用于構建人源化抗體的人可變域的選擇，包括輕鏈和重鏈二者，對于降 低抗原性是非常重要的。依照"最適"(best-fit)方法，用嚙齒類抗體的可變 域序列對已知的人可變域序列的整個文庫進行篩選。然后接受與嚙齒類序列
151:2296-2308 (1993); Chothia和Lesk， J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987》。另一 種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框 架。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992); Presta等，J. Immunol" 151:2623-2632 (1993》。
抗體在人源化后保持對抗原的高親和力和其它有利的生物學特性是更 為重要的。為了實現(xiàn)這一目標，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源
源化抗體。三維免疫球蛋白模型是公眾可獲得的且為本領域技術人員所熟悉?？色@得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的計算 機程序。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中 的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。這樣， 可以從共有和輸入序列選出FR殘基并進行組合，從而獲得期望的抗體特征，
諸如對靶抗原的親和力提高。 一般而言，CDR殘基直接且最實質的涉及對抗 原結合的影響(參見例如WO 94/04679,公布于1994年3月3日)。
人單克隆抗體可以經最初由Kohler和Milstein記載的雜交瘤方法改良方 法來制備，其中使用人B淋巴細胞作為融合配偶。生成感興趣抗體的人B淋 巴細胞可以例如自人個體分離(在獲得知情同意書后)。例如，該個體可以 是正在生成針對自身抗原的抗體，正如某些病癥所發(fā)生的，諸如系統(tǒng)性紅斑 狼瘡(Shoenfeld等J. Clin. Invest., 70:205 (1982))、免疫介導的血小板減少性紫 癜(ITP) (Nugent等Blood, 70(1):16-22 (1987))、或癌癥?；蛘?另外，可以在 體外免疫淋巴細胞。例如，可以在體外將分離的人外周血淋巴細胞暴露于抗 溶酶體劑(lysomotrophic agent)(例如L-亮氨酸-O-曱基酯、L-谷氨酸二曱基酯 或L-亮氨酰-L-亮氨酸-O-曱基酯)(美國專利No. 5,567,610, Borrebaeck等)；和 /或可以在體外用佐劑諸如8-巰基鳥苷和細胞因子處理消減了T細胞的人外周 血淋巴細胞(美國專利No. 5，229，275， Goroff等)。
單克隆抗體。用于永生化B淋巴細胞的技術包括但不限于(a)人B淋巴細胞 與人、鼠骨髓瘤或小鼠-人異源骨髓瘤細胞的融合；(b)病毒轉化(例如用EB 病毒；參見例如Nugent等，見上文)；(c)與成淋巴細胞樣細胞系融合；或(d) 與〉林巴瘤細月包融合。
可以使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以 形成雜交瘤纟田月包(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986))。將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養(yǎng)基 中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選的含有一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤
細胞生長或存活的物質。例如，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥噪呤磷 酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT),則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的會含有次黃 嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質阻止HGPRT缺陷細胞生長。 合適的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系已有記載(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications, pp. 51-63 (Marcel Dekker， Inc., New York, 1987))。對雜交瘤細胞 正在其中生長的培養(yǎng)液測定針對抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選地，通過免 疫沉淀或通過體外結合測定法(諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附 測定法(ELISA))測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結合特異性。
在鑒定到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞 后，該克隆可通過有限稀釋規(guī)程進行亞克隆并通過標準方法進行培養(yǎng) (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986))。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。 通過常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程(諸如例如蛋白A層析、凝膠電泳、透析或親 和層析)將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當分開。
人抗體也可以使用能夠生成人抗體的非人宿主(諸如小鼠)來生成。如 上所述，現(xiàn)在可獲得在缺乏內源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成 人抗體完整全集的轉基因小鼠。例如，已經記載了嵌合和種系突變小鼠中抗 體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導致內源抗體生成的完全抑制。在此類種 系突變小鼠中轉移大量人種系免疫球蛋白基因會導致在抗原攻擊后生成人 抗體。參見例如Jakobovits等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits等，Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann等,Year in Immuno.， 7:33 (1993);美國專利No. 5,591,669;美國專利No, 5,589,369;及美國專利No. 5,545,807 。人抗體也可使用SCID-hu小鼠來制備(Duchosal等，Nature 355:258-262(1992))。
在另一個實施方案中，人抗體可以選自人抗體噬菌體展示庫?？贵w或其 片段的文庫的制備是本領域眾所周知的，而且可以使用任何已知方法來構建 一族可以導入宿主細胞的轉化載體?？贵w輕鏈和重鏈在噬菌體中的文庫 (Huse等，Science, 246:1275 (1989))或者融合蛋白在噬菌體或噬菌粒中的文庫 可以依照已知規(guī)程來制備。參見例如Vaughan等，Nature Biotechnology 14:309-314 (1996); Barbas等，Proc. Natl. Acad. Sci" USA, 88:7978-7982 (1991); Marks等，J. Mol. Biol.， 222:581-597 (1991); Hoogenboom和Winter， J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992); Barbas等，Proc. Natl. Acad. Sd., USA, 89:4457-4461 (1992); Griffiths等，EMBO Journal, 13:3245-3260 (1994); de Kmif等，J. Mol. Biol" 248:97-105 (1995); WO 98/05344; WO 98/15833; WO 97/47314; WO 97/44491; WO 97/35196; WO 95/34648;美國專利No. 5,712.089;美國專利No.5,702,892;美國專利No. 5,427,908;美國專利No. 5，403，484;美國專利No. 5,432,018;美國專利No. 5,270,170; WO 92/06176; WO 99/06587;美國專利 No. 5,514,548; WO97/08320;及美國專利No. 5,702,892。使用本領域已知規(guī)程 用感興趣抗原淘選噬菌體文庫，以選擇結合靶抗原的噬菌體抗體。
本文所述抗體任選地會具有一項或多項期望的生物學活性或特性。此類 抗體可以包括但不限于嵌合的、人源化的、人的、和親和力成熟的抗體。如 上所述，可以使用各種技術來構建或改造抗體以實現(xiàn)這些期望的活性或特 性。在一個實施方案中，抗體會具有至少l(^M-'的結合親和力，優(yōu)選至少在 106 M"到107 M-'的范圍內，更優(yōu)選至少在108 M"到1012 M"的范圍內，且甚 至更優(yōu)選至少在109 M"到1012 VT'的范圍內?？贵w的結合親和力可以通過依 照本領域已知的技術測試抗體無需過度試驗就測定，包括Scatchard分析(參 見Munson等，見上文)。
在另 一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可以與本文中所公開的抗體結合相 同的表位，或者結合與本文中所公開的抗體結合的表位重合或交疊的表位。 本發(fā)明抗體的表位結合特性可以使用本領域已知技術來測定。例如，可以在 體外測定法(諸如竟爭性抑制測定法)中測試抗體，以測定抗體阻斷或抑制 已知結合相互作用的能力。
3.雙特異性抗體
雙特異性抗體指對至少兩種不同抗原具有結合特異性的單克隆抗體，優(yōu) 選人抗體或人源化抗體。用于構建雙特異性抗體的方法是本領域已知的。傳 統(tǒng)的是，雙特異性抗體的重組生產基于兩對免疫球蛋白重鏈/輕鏈的共表達， 其中兩種重鏈具有不同的特異性(Millstein和Cuello, Nature 305:537-539 (1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤 (quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確 的雙特異性結構。通常通過親和層析步驟來進行正確分子的純化。類似的規(guī) 程披露于1993年5月13日公布的WO 93/08829及Traunecker等，EMBO J. 10:3655-3659 (1991)。
可以將具有期望結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變域與免 疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū) 的免疫球蛋白重鏈恒定域進行融合。優(yōu)選的是，在至少一種融合物中存在包 含輕鏈結合所必需的位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體，并共轉
染到合適的宿主生物體中。關于生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如
Suresh等，Methods in Enzymology 121:210 (1986)。
4. 異源偶聯(lián)抗體
異源偶聯(lián)抗體也在本發(fā)明的范圍內。異源偶聯(lián)批體由兩種共價連接的抗 體構成。此類抗體建議例如用于將免疫系統(tǒng)細胞靶向不想要的細胞(美國專 利No. 4,676,980)及用于治療HIV感染(WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 )?？梢栽隗w外使用合成蛋白質化學的已知方法制備抗體，包括那些涉 及交聯(lián)劑的方法。例如，可以使用二碌"匕物交換反應或通過形成石克醚4建來構 建免疫毒素。適于此目的的試劑的例子包括亞氨基硫醇酉旨/鹽(iminothiolate) 和4-巰基丁酰亞氨酸曱酉旨(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美國專利No. 4,676,980中所公開的。
5. 三鏈抗體
三鏈抗體也在本發(fā)明的范圍內。此類抗體記載于例如Iliades等，見上文 及Kortt等，見上文。
6. 其它^f奮飾
抗體的其它修飾也在本發(fā)明的范圍內。可用于本發(fā)明方法的某些抗體可 以通過將抗體與細胞毒劑(像毒素分子)或前體藥物活化酶偶聯(lián)而進行修飾， 所述前體藥物活化酶將前體藥物(例如肽基化療劑，參見WO 81/01145)轉 變?yōu)榛钚钥拱┧帯⒁娎鏦O 88/07378和美國專利No. 4,975,278。這種技 術也稱為"抗體依賴性酶介導的前體藥物療法"(ADEPT)。
可用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物的酶組分包括能夠以這樣一種方式作用于 前體藥物從而將其轉變?yōu)楦谢钚缘募毎拘孕问降娜魏蚊??？捎糜诒景l(fā)明
方法的酶包括但不限于可將含磷酸鹽/酯的前體藥物轉變?yōu)橛坞x藥物的堿性 磷酸酶；可將含硫酸鹽/酯的前體藥物轉變?yōu)橛坞x藥物的芳基硫酸酯酶；可將 無毒5-氟胞嘧啶轉變?yōu)榭拱┧?-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；可將含肽的前體 藥物轉變?yōu)橛坞x藥物的蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草 桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B和L);胱天蛋白酶， 諸如胱天蛋白酶-3;可轉化含D-氨基酸替代的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶； 可將糖基化前體藥物轉變?yōu)橛坞x藥物的碳水化合物切割酶，諸如(3-半乳糖苷 酶和神經氨酸酶；可將用{3-內酰胺衍生的藥物轉變?yōu)橛坞x藥物的P-內酰胺酶；及可將在其胺氮處分別用苯氧乙?；虮揭阴；苌乃幬镛D變成游離藥
物的青霉素酰胺酶，諸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶?；蛘?，可使用
具有酶活性的抗體，本領域也稱作"抗體酶"，將本發(fā)明的前體藥物轉變?yōu)?br> 游離活性藥物(參見例如Massey, Nature 328: 457-458 (1987))。可如本文所述 制備抗體—抗體酶偶聯(lián)物，用于將抗體酶^:遞至腫瘤細胞群。
可通過本領域眾所周知的技術將酶與抗體共價結合，諸如使用異雙功能 交聯(lián)劑?；蛘?，可使用本領域眾所周知的重組DNA技術構建包含與本發(fā)明酶 的至少功能活性部分連接的本發(fā)明抗體的至少抗原結合區(qū)的融合蛋白(參見 例如Neuberger等，Nature 312: 604-608 (1984))。
正如本領域已知的，用于檢測AP2-a (SEQ ID NO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2卩(SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段 的抗體諸如免疫測定法中所使用的抗體可以偶聯(lián)至多種成像劑。偶聯(lián)可以在 抗體與成像劑之間直接地實現(xiàn)，或者可以在抗體與活性劑之間提供連接或中
間分子基團。常用的交聯(lián)劑通過為每種模塊提供附著位點而便于偶聯(lián)。交聯(lián) 劑可以包括別的分子基團，其充當間隔物，用以彼此分隔各模塊以防止彼此
干擾活性。
成像可以通過本領域技術人員眾所周知的多種規(guī)程來實施，而且可用于 此類規(guī)程的適宜成像劑可以通過眾所周知的手段偶聯(lián)至抗體。成像可以例如 通過顯現(xiàn)Westem規(guī)程的結果、通過放射性閃爍照相術、核磁共振成像(MRI) 或計算機斷層照相術(CT掃描)來實施。常用的放射性核素成像劑包括放射 性的碘和銦。通過CT掃描進行的成像可以采用重金屬，諸如鐵螯合物。MRI 掃描可以采用釓或錳的螯合物。另外，正電子發(fā)射斷層照相術(PET)是可能 的，其使用氧、氮、鐵、碳或鎵的正電子發(fā)射體。可用于成像規(guī)程的放射性 核素的例子包括43K、 52Fe、 57Co、 67Cu、 67Ga、 68Ga、 77Br、 8IRb、川In、 mIn、 123I、 125I、 127Cs、 129Cs、 131I、 132I、 197Hg、 2Q3pb和，Bi。
Magerstadt, M. (1991) Antibody Conjugates And Malignant Disease, CRC Press, Boca Raton, Fla.及Barchel, S. W.和Rhodes, B. H.， (1983) Radioimaging and Radiotherapy, Elsevier, NY, N.Y.(都收入本文作為參考)教授了將各種治 療性和診斷性放射性核素偶聯(lián)至抗體的氨基酸。此類反應可以應用于以適宜 接頭將放射性核素偶聯(lián)至抗體。合適的標記物包括例如放射性核素、酶(例 如辣根過氧化物酶)、底物、輔因子、抑制物、焚光劑、化學發(fā)光劑和/或磁性粒子。教授此類標記物的使用的專利的例子參見美國專利No. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3，996，345; 4，277，437; 4,275,149;及4，366,241,都收入本 文作為參考。
還涵蓋其它抗體修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質性質聚合物中的 一種連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的 共聚物?？贵w還可以包載入例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠嚢 (例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(甲基丙烯酸曱酉旨)微膠嚢)、膠 狀藥物投遞系統(tǒng)(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠 嚢)、或粗滴乳狀液。此類技術披露于例如《Remington's Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol,A.編，1980。為了提高抗體的血清半衰期，可如例 如美國專利5,739,277中所述將補救受體結合表位摻入抗體(尤其是抗體片 段)。在用于本文時，術語"補救受體結合表位"指IgG分子(例如IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4 ) Fc區(qū)中負責提高IgG分子體內血清半衰期的表位。
7.重組方法
技術領域：
本發(fā)明還提供了編碼感興趣多肽例如本文中所公開的蛋白質、蛋白質片 段(例如AP2-a(SEQIDNO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 AP1/2(3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段)和/或抗體的分離的核 酸，包含該核酸的載體和宿主細胞，及用于生產感興趣多肽的重組技術。
為了重組生產感興趣多肽,分離編碼它的核酸，并插入可復制載體，用 于進一步克隆(DNA擴增)或表達。編碼感興趣多肽的DNA易于使用常規(guī) 規(guī)程分離和測序(例如通過使用能夠與編碼感興趣多肽的基因特異性結合的 寡核苷酸探針)?？梢垣@得許多載體。載體構件通常包括但不限于下列一種 或多種信號序列、復制起點、 一種或多種標志基因、增強子元件、啟動子 和轉錄終止序列。
本文中的方法包括用于生產結合AP2-a(SEQIDNO: 1)、網格蛋白重鏈 (SEQ ID NO: 2)、 APl/2卩(SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質 片段的嵌合或重組抗體的方法，其包括如下步驟提供包含編碼抗體輕鏈或 重鏈(或者輕鏈和重鏈二者)的DNA序列的載體；用該載體轉染或轉化宿主 細胞；并在足以產生重組產物的條件下培養(yǎng)該宿主細胞。
(i)信號序列構件
感興趣多肽不僅可以直接重組生產，而且可以作為與異源多肽的融合多肽來重組生產，所述異源多肽優(yōu)選的是成熟蛋白質或多肽的N-末端處的信號 序列或具有特異性切割位點的其它多肽。所選^^的異源信號序列優(yōu)選的是受 到宿主細胞識別并加工(即受到信號肽酶切割)的。對于不識別和加工天然 信號序列的原核宿主細胞，所述信號序列用例如選自下組的原核信號序列替
代堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導序列。為了酵母分泌， 天然信號序列可以用例如酵母轉化酶前導序列、a因子前導序列(包括糖酵 母屬和克魯維氏酵母屬a因子前導序列)、酸性磷酸酶前導序列、白色假絲酵 母葡萄糖淀粉酶前導序列、或WO 90/13646中記載的信號替代。在哺乳動物 細胞表達中，可以利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純 皰發(fā)gD信號。
將此類前體區(qū)(precursor region)的DNA以符合讀碼框的方式與編碼感興 趣多肽的DNA連接。
復制起點構件
表達和克隆載體都包含使能夠載體在一種或多種所選擇的宿主細胞中 復制的核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列是使能夠載體不依賴于宿 主染色體DNA而復制的序列，包括復制起點或自主復制序列。眾所周知多種 細菌、酵母和病毒的此類序列。來自質粒pBR322的復制起點適合于大多數(shù) 革蘭氏陰性細菌，2fi質粒起點適合于酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤 病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。 一般而言， 哺乳動物表達載體不需要復制起點構件(SV40起點的使用通?？赡苤皇且驗?它包含早期啟動子)。
選擇基因構件
表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標志。典型的選擇基因編 碼如下蛋白質(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如氨千青霉素、新霉 素、甲氨蝶呤或四環(huán)素；(b)補足營養(yǎng)缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由復合培 養(yǎng)基獲得的必需營養(yǎng)物，例如用于芽孢桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。
選擇方案的一個例子利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。用異源基因成功 轉化的那些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質，因而幸免于選擇方案。此類顯 性選擇的例子使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
適于哺乳動物細胞的選擇標志的另 一 個例子是那些能夠鑒定有能力攝 取核酸的細胞的選擇標志，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II (優(yōu)選的是靈長類金屬硫蛋白基因)、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。
例如，首先通過將所有轉化子在含有曱氨蝶呤(Mtx) (DHFR的一種竟爭 性拮抗劑)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)來鑒定經DHFR選擇基因轉化的細胞。在采 用野生型DHFR時，適宜的宿主細胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)
細胞系。
或者，可以通過細胞在含有針對選擇標志的選擇劑(諸如氨基糖苷抗生 素例如卡那霉素、新霉素或G418)的培養(yǎng)基中的生長來選擇經編碼感興趣多 肽、野生型DHFR蛋白質和另一種選擇標志(諸如氨基糖苷3'-磷酸轉移酶 (APH))的DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞(特別是包含內源DHFR的野 生型宿主)。參閱美國專利No. 4,965,199。
一種適用于酵母的選擇基因是存在于酵母質粒Yrp7中的trpl基因 (Stinchcomb等，Nature 282:39 (1979))。 trpl基因為缺乏在色氨酸中生長能力的 酵母突變4朱(例如ATCC No. 44076或PEP4-1 )提供了選擇標志。Jones, Genetics 85:12 (1977)。酵母宿主細胞基因組中存在trpl損傷隨之提供了用于 通過在缺乏色氨酸時的生長來檢測轉化的有效環(huán)境。類似的，用攜帶Leu2 基因的已知質粒補足Leu2缺陷型酵母菌林(ATCC 20，622或38，626 )。
此外，衍生自1.6pm環(huán)狀質粒pKDl的載體可用于轉化克魯維氏酵母屬酵 母?；蛘撸瑘髮Я擞糜谠谌樗峥唆斁S氏酵母中大規(guī)模生產重組小牛凝乳酶的 表達系統(tǒng)。Van den Berg, Bio/Technology 8:135 (1990)。還披露了用于由克魯 維氏酵母屬的工業(yè)用菌抹分泌成熟重組人血清清蛋白的穩(wěn)定多拷貝表達載 體。Fleer等，Bio/Technology 9:968-975 (1991)。
(iv)啟動子構件
表達和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別的啟動子，而且它與核酸 可操作連接。適用于原核宿主的啟動子包括phoA啟動子、(3-內酰胺酶和乳糖 啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、和雜合啟動子(諸如tac 啟動子)。然而，其它已知的細菌啟動子也是合適的。用于細菌系統(tǒng)的啟動 子還將包含與編碼感興趣多肽的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno (S.D.)序 列。
已知真核細胞的啟動子序列。事實上，所有真核基因都具有富含AT區(qū)， 它位于起始轉錄的位點上游大約25至30個堿基處。在許多基因的轉錄起點上 游70至80個堿基處找到的另 一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端 添加polyA尾的信號。所有這些序列合適的插入真核表達載體。
適用于酵母宿主的啟動序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵 解酶的啟動子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氬酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧 酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激 酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡糖激酶。
作為具有通過生長條件控制轉錄的額外優(yōu)點的誘導型啟動子的其它酵 母啟動子是醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關的降解酶、 金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負責麥芽糖和半乳糖利用的酵的啟動 子區(qū)。適用于酵母表達的載體和啟動子進一步記載于EP 73,657。酵母增強子 也可以有利的與酵母啟動子一起使用。
在哺乳動物宿主細胞中由載體轉錄受到例如從病毒(諸如多瘤病毒、禽 痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、 逆轉錄病毒、乙肝病毒和最優(yōu)選的猿病毒40(SV40))基因組、異源哺乳動物 啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)、及熱休克啟動子獲得 的啟動子的控制，倘若此類啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容的話。
方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子， 該片段還包含SV40病毒復制起點。方便的以HindIII E限制性片段的形式獲得 人巨細胞病毒的立即早期啟動子。美國專利No. 4，419,446中披露了使用牛乳 頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統(tǒng)。美國專利No. 4,601,978中記載了該系統(tǒng)的一種改良。關于在小鼠細胞中在來自單純皰滲病 毒的胸苦激酶啟動子的控制下表達人P-干擾素cDNA還可參見Reyes等， Nature 297:598-601 (1982)。或者，可以使用勞氏肉瘤病毒長末端重復序列作 為啟動子。
(v)增強子元件構件
常常通過將增強子序列插入載體來提高高等真核細胞對編碼感興趣多 肽的DNA的轉錄?，F(xiàn)在知道來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋 白、曱胎蛋白和胰島素)的許多增強子序列。然而，典型的是，使用來自真 核細胞病毒的增強子。例子包括SV40復制起點晚期一側的增強子(bp 100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒復制起點晚期一側的增 強子、和腺病毒增強子。關于激活真核啟動子的增強元件還可參見Yaniv，Nature 297:17-18 (1982)?？梢詫⒃鰪娮蛹艚尤胼d體，位于編碼序列的5'或3' 位置，但是優(yōu)選地位于啟動子的5'位點。
(vi) 轉錄終止構件
用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多 細胞生物體的有核細胞)的表達載體還將包含終止轉錄和穩(wěn)定mRNA所必需 的序列。此類序列通?？梢詮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA非翻譯區(qū)的5'端和偶 爾的3'端獲得。這些區(qū)i《包含在編碼多價抗體的mRNA的非翻譯部分中轉錄 成聚腺苷酸化片段的核香酸區(qū)段。 一種有用的轉錄終止構件是牛生長激素聚 腺苷酸化區(qū)。參見WO94/11026及其中披露的表達載體。
(vii) 宿主細胞的選擇和轉化
適于克隆或表達本文載體中的DNA的宿主細胞是上文描述的原核生物、 酵母或高等真核細胞。適于此目的的原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性 或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)例如大 腸埃希氏菌或大腸桿菌(E. coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬 (Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬 (Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌屬 (Serratia)例如粘質沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志賀氏菌屬(Shigella)、 以 及芽孢桿菌屬(Bacilli)諸如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢桿菌 41P)、假單胞菌屬(Pseudomonas)諸如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、和鏈霉菌 屬(Streptomyces)。 一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294 (ATCC 31，446)，盡管其它菌^^朱諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776 (ATCC 31,537)和大 腸桿菌W3110 (ATCC 27,325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限 制性的。
在原核生物以外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)也是載體的合適 克隆或表達宿主。釀酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母在 最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通?？色@得許多其它屬、種和菌 抹且可用于本發(fā)明，諸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe);克 魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，諸如例如乳酸克魯維酵母(K. lactis)、脆壁 克魯維酵母(K. fragilis) (ATCC l2,424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16,045)、威克克魯維酵母(K. wickeramii) (ATCC 24,178)、 K. waltii(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilamm) (ATCC 36,906)、耐熱克 魯維酵母(K. thermotolerans)和馬克思克魯維酵母(K. marxianus);亞羅酵母屬 (Yarrowia) (EP 402,226);巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) (EP 183,070);假絲 酵母屬(Candida);瑞氏木霉(Trichoderma reesia) (EP 244,234);粗糙脈孢菌 (Neurospora crassa); "i午旺酵母屬(Schwanniomyces)， 諸如Schwanniomyces occidentalis ; 和絲狀真菌，諸如例如脈孢菌屬(Neurospora)、 青霉屬 (Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、和曲霉屬(Aspergillus)宿主諸如構巢 曲霉(A. nidulans)和黑曲霉(A. niger)。
適于表達感興趣多肽的宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊推動物細胞 的例子包括植物和昆蟲細胞。已經鑒定了許多桿狀病毒抹和變體及相應的允 許昆蟲宿主細胞，它們來自諸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃 及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果 蟲菱(Drosophila melanogaster)(果蟲乾)和家香(Bombyx mori)等宿主。,A眾可獲 得多種病毒抹用于轉染，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica) NPV的L-1變 體和家蚤(Bombyx mori) NPV的Bm-5抹，而且此類病毒可依照本發(fā)明用作本 文中的病毒，特別是用于轉染草地夜蛾細胞。
還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細胞培 養(yǎng)物作為宿主。
然而，脊稚動物細胞得到最多關注，而且培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊推動物 細胞的繁殖已經成為常規(guī)流程。有用哺乳動物宿主細胞系的例子是用SV40 轉化的猴腎CVl系(COS-7,ATCCCRL1651);人胚腎系(293或為了在懸浮培 養(yǎng)中生長而亞克隆的293細胞，Graham等，J.GenVirol. 36:59(1977));幼倉鼠 腎細胞(BHK, ATCC CCL 10);中國倉鼠卯巢細胞/-DHFR (CHO, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980));小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4， Mather， Biol. Reprod. 23:243-251 (1980));猴腎細胞(CV1， ATCC CCL 70);非 洲綠猴腎細胞(VERO-76， ATCC CRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL2);犬腎細胞(MDCK，ATCCCCL34);牛鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442);人肺細胞(W138, ATCC CCL 75);人肝細胞(Hep G2, HB 8065);小鼠乳瘤(MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI細胞(Mather等，Annals N.Y.Acad. Sci. 383:44-68 (1982); MRC5細胞；FS4細月包；人肝瘤系(HepG2); 和骨髓瘤或淋巴瘤細胞(例如Y0、 J558L、 P3和NS0細胞)(參見美國專利No.5,807，715 )。
用上文所述用于生產感興趣多肽的表達或克隆載體轉化宿主細胞，并在 為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當更改的常規(guī) 營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
(viii) i咅養(yǎng)宿主細月包
可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產感興趣多肽的宿主細胞。商品化培養(yǎng) 基諸如Ham氏FlO (Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM, Sigma)、 RPMI-1640 (Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM， Sigma)適于培養(yǎng)宿主細 胞。另外，可以使用下列文獻中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細胞的培養(yǎng)基 Ham等,Meth. Enz, 58:44 (1979); Barnes等，Anal. Biochem. 102:255 (1980);美 國專'利No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655;或5，122,469; WO 90/03430; WO 87/00195;或美國專利Re. 30,985。任何這些培養(yǎng)基可以根據 需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、 鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如 腺苦和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCESFM藥物)、痕量元素(定義為通 常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可 以以適宜濃度包含本領域技術人員知道的任何其它必需補充物。培養(yǎng)條件 (諸如溫度、pH等)就是先前為表達而選擇用于宿主細胞的，這對于普通技 術人員而言是顯而易見的。
(ix) 純化
在使用重組技術時，可以在細胞內、在周質空間中生成感興趣多肽，或 者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細胞內生成感興趣多肽，那么作為第一步， 通過例如離心或超濾清除宿主細胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等， Bio/Technology 10: 163-167 (1992)描述了用于分離分泌到大腸桿菌周質空間 的抗體的規(guī)程。簡單的說，在存在乙酸鈉(pH3.5)、 EDTA和苯基曱基磺酰氟 (PMSF)時使細胞糊融化約30分鐘。可以通過離心除去細胞碎片。如果將感興 趣多肽分泌到培養(yǎng)基中，那么通常首先使用商品化蛋白質濃縮濾器，例如 Amicon或Millipore Pellicon超濾單元濃縮來自此類表達系統(tǒng)的上清液。在任 何上述步驟中，可以包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF來抑制蛋白水解，而且可 以包括抗生素來防止外來污染物的生長。
可以使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析、和親和層析來純化由細胞制備的組合物，優(yōu)選的純化技術是親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜
性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用于 純化基于人yl、 Y2或y4重鏈的抗體(Lindmark等，J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人y3 (Guss等，EMBO J. 5: 1567-1575 (1986))。親和配體所附著的基質最常用的是瓊脂糖，但是可以使 用其它基質。物理穩(wěn)定的基質諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯容許 獲得比瓊脂糖所能實現(xiàn)的更快的流速和更短的加工時間。對于包含Ch3結構 域的抗體而言，可使用Bakerbond ABXtm樹脂(J.T.Baker, Phillipsburg, NJ ) 進行純化。根據待回收的感興趣多肽，也可使用其它蛋白質純化技術諸如離 子交換柱上的分級、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素 SEPHAROSETM上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱) 上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸銨沉淀。
III.制品
在本發(fā)明的另 一個實施方案中，提供了包含可用于實施上文所述方法的 實施方案的物質的制品。制品包括容器和標簽。合適的容器包括例如瓶子、 小管、注射器和試管。容器可用各種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器中裝 有有效觀察凋亡的組合物，而且可具有無菌存取口 (例如容器可以是具有皮 下注射針頭可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組合物中的典型藥劑包 括一種或多種結合AP2-a (SEQ ID NO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2j3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)蛋白質片段的抗體。容器 上的或與容器相關的標簽指示該組合物用于觀察凋亡和/或評估選擇的疾患。 制品可進一步包括第二容器，其中裝有藥學可接受的緩沖劑，諸如磷酸鹽緩 沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它還可包括商業(yè)和用戶立場上 所需的其它物質，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和印有 使用說明書的包裝插頁。
在這樣的一個實施方案中，本發(fā)明提供了可用于檢測細胞凋亡和診斷與 其有關的疾病的試劑盒。這樣的一個試劑盒包括(1)能夠結合凋亡過程中 所產生的蛋白質片段的一抗(primary antibody); (2)偶聯(lián)有信號生成標記物的 二抗(secondary antibody),該二抗是結合前述一抗的抗體；和(3)能夠識別帶 標簽的二抗的信號生成三級試劑(tertiary reagent)。依照本發(fā)明可用于檢測凋亡產生的蛋白質片段的另一種試劑盒包括(1)能夠結合凋亡過程中所產生 的蛋白質片段的一抗；和(2)偶聯(lián)有信號生成標記物的二抗，該二抗也具有 針對凋亡產生的蛋白質片段的反應性，但是結合的位點與前述一抗結合的位
點不同。
在本發(fā)明試劑盒的實施方案中，連接至二抗的信號生成標記物可以是例 如酶，諸如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。優(yōu)選地，酶和底物都在試劑盒中 提供。試劑盒還可以包括未包被的支持物，可以在其上面固定化待測定的樣 品或第一抗體。
IV.使用本發(fā)明的方法和材料來檢查與凋亡有關的細胞過程
可以使用本發(fā)明的方法和材料來檢查多種細胞過程，諸如胞吞作用。例 如，本發(fā)明的某些實施方案觀察細胞胞吞速率的變化作為凋亡的指標，對胞 吞的抑制提供了凋亡的證據。胞吞作用對細胞穩(wěn)態(tài)的多個方面是至關重要 的。胞吞作用經由膜結合的小泡內在化質膜(PM)結合蛋白質，這支持了多種 細胞功能，包括養(yǎng)分攝取、生長因子信號傳導和膜穩(wěn)態(tài)(參見例如Conner， S.D. 等，Nature 422, 37-44 (2003))。最好表征的胞吞途徑之一依賴于蛋白質網格蛋 白(參見例如Bonifacino， J.S.等，Annu Rev Biochem 72, 395-447 (2003))。在 已知為披有網格蛋白的小窩的PM內陷的形成過程中，網格蛋白銜接物諸如 銜接蛋白2 (AP2)連接網格蛋白至胞吞貨物的胞質決定子。銜接物還通過募集 輔助蛋白或調節(jié)蛋白而在胞吞作用中執(zhí)行支架功能(參見例如Owen, D丄等, RR. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 153-91 (2004))。由發(fā)動蛋白進行的GTP水解 驅動深深內陷的有被(coated)小窩破裂，以自PM釋放胞吞運輸小泡。脫被 (uncoating)后，所述小泡停靠早期內體，并與早期內體融合，在那里貨物分 選至不同的命運(fate)，例如小管泡狀(tubulo-vesicular)內體膜用于再循環(huán)至 PM，或者多泡晚期內體的內膜用于溶酶體降解。
使用本發(fā)明的方法和材料，顯示了促凋亡的死亡受體(DR)觸發(fā)網格蛋白 依賴性胞吞機器的選擇性破壞。DR刺激誘導了關鍵的網格蛋白途徑成分的 快速、胱天蛋白酶介導的切割，這使經典貨物蛋白運鐵蛋白的細胞攝取停止。 DR接近的啟動物胱天蛋白酶在功能上不同的結構域之間切割網格蛋白銜接 物亞基AP2oc,而效應器胱天蛋白酶加工網格蛋白的重鏈。顯示了DR5經歷配 體誘導的網格蛋白介導的胞吞作用，這提供了 DR信號傳導復合體的內在化促進胱天蛋白酶的網格蛋白途徑靶向的證據。阻斷胞吞的、溫度敏感性的發(fā)
動蛋白-1突變體減弱了DR內在化，增強了DR下游的胱天蛋白酶刺激，并增 加了凋亡。如此，DR觸發(fā)的胱天蛋白酶活性破壞了網格蛋白依賴性胞吞作 用，這導致程序性細胞死亡的放大。
本發(fā)明方法和材料的進一步說明性應用在下文有描述。
DR活化誘導網M白依賴性胞吞機器的胱天蛋白酶介導的切割
在關于DR5胞吞作用的研究中，觀察到DR5配體Apo2L/TRAIL觸發(fā)了 AP2的oc亞基(AP2a)的蛋白水解切割。對數(shù)種癌細胞系的分析顯示了 Apo2L/TRAIL不僅促進了胱天蛋白酶-8和-3的期望加工，而且還促進了 AP2a、 AP1/2P和網格蛋白重鏈(CHC)的切割(圖la)。這些事件發(fā)生在2小時 內，而且與抗性細胞系諸如HCT8相比，局限于對Apo2L/TRAIL誘導的凋亡 易感的細胞系,諸如Co1。205 、 BJAB和HeLa-M (圖1 a )。別的細胞系證實了 這種觀察(圖7a )。 FasL在BJAB細胞中刺激了與Apo2L/TRAIL相當?shù)貙P2a 和CHC的切割(圖7b)。 Apo2L/TRAIL還誘導了對發(fā)動蛋白的切割，這導致 在刺激l小時內開始的全長蛋白質消減(圖7c )。在相似的時間框架(timeframe) 中，Apo2L/TRAIL沒有誘導介導其它類型的網格蛋白依賴性嚢泡輸運事件的 結構上類似的銜接物的蛋白水解(圖lb)。這些包括APla、 AP3P和S、及AP4s (它們支持跨高爾基體網絡和內體之間的轉運)，及COP-I亞基P-COP或 COP-II亞基Sec23 (它們介導內質網和高爾基體之間的轉運)(參見例如 Bonifacino, J.S.等，Annu Rev Biochem 72， 395-447 (2003)及McMahon， H.T.等， Curr Opin Cell Biol 16, 379-91 (2004))。因此，DR活化促進牽涉網格蛋白依 賴性胞吞作用的蛋白質的快速且特異性切割。
以抑制配體誘導的胱天蛋白酶-8和-3加工的劑量使用泛胱天蛋白酶抑制 劑N-千氧羰基-Val-Ala-Asp-氟曱基酮(zVAD-fmk)的預處理預防了 AP2a和 CIIC的切割(圖2a)以及AP2a在BJAB細胞中的切割(圖8a),這表明需要胱 天蛋白酶活性。另外，雖然Apo2L/TRAIL和FasL誘導了 AP2a和CHC在wt Jurkat T細胞中的切割，但這兩種配體都不刺激這些靶物在胱天蛋白酶-8缺陷 的或FADD缺陷的突變型Jurkat細胞系中的加工(圖8b )。 AP2a切割是快速的， 且在時間上與胱天蛋白酶-8加工相關，盡管它先于胱天蛋白酶-3加工(圖1 a )。 相比之下，CHC切割是相對較慢的，且在時間上與胱天蛋白酶-3加工更好地
64相關。在HCT116細胞中，由Apo2L/TRAIL進行的胱天蛋白酶-3活化和凋亡 誘導需要Bax，雖然胱天蛋白酶-8刺激不需要(參見例如LeBlanc, H.N.等，Cell Death Differ 10， 66-75 (2003))。如所期望的，Apo2L/TRAIL刺激了胱天蛋白 酶-8和—3兩者在^似+/- HCT116細胞中的加工，但僅刺激了胱天蛋白酶-8在 / o^-HCT116細胞中的加工(圖2b, c)。 AP2ct切割不依賴于Bax,而CHC切 割需要Bax (圖2b, c)。在MCF7細胞(其是胱天蛋白酶-3缺陷的)中， Apo2L/TRAIL誘導了相對弱的且緩慢的胱天蛋白酶-8和AP2a加工，但不刺激 CI-IC切害'j (圖2d )(參見例如Kischkel， RC.等,Immunity 12, 611-20 (2000))。 此外，在HT1080細胞中胱天蛋白酶-3的siRNA敲低阻斷了配體誘導的CHC加 工而不是AP2a加工(圖8c)。這些發(fā)現(xiàn)提供了DR途徑中的啟動物胱天蛋白酶 切割AP2a,而效應器胱天蛋白酶加工CHC的證據。
AP2a包含由"鉸鏈"區(qū)所連接的兩個主要的功能性部分C末端"耳" 和N末端"軀干，，結構域(參見例如Owen, D丄等，P.R. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 153-91 (2004))。為了確定AP2ot切割的主要位點(primary site),自BJAB細 胞免疫純化C末端33KDa切割產物，并通過質譜分析法證實了其胰蛋白酶消 化肽的身份(圖9a)。 N末端測序揭示了GPAAQPSLGPTPEEAFLS,即緊接 著DVFD的上游序列(圖9a),所述DVFD是類似于充分表征的胱天蛋白酶識 別位點的四肽序列(參見例如Stennicke, H.R.等，Biochem J 350 Pt 2， 563-8 (2000))。切割位點在易裂鍵(scissile bond)側翼的Pl和Pl，位置上分別有Asp和 Gly,及P4位置上的Asp,胱天蛋白酶-8對其耐受良好(參見例如Blanchard, H. 等，J Mol Biol 302, 9-16 (2000))。雖然這種四肽切割位點序列存在于AP2a的 同等型A中，但其不存在于同等型C中。與這種差異一致，Apo2L/TRAIL不 誘導對同等型C的切割，所述同等型C在BJAB、 Colo205、 LS1034和SW948 細胞中遠不及同等型A豐富。這種AP2a切割位點位于鉸鏈內(圖9b)，這提 供了其水解可能破壞AP2功能的證據。某些細胞系的較長的配體刺激導致 AP2a在次要位點(secondary site)上的進一步加工，這似乎是在起始的33 kDa 片段內的(圖7a和b)。
為了評估這些胱天蛋白酶介導的切割事件的功能后果，研究了運鐵蛋白 (Tf)的攝取。受體結合的Tf的內在化經由披有網格蛋白的小窩發(fā)生，并嚴格 需要AP2 (參見例如Bonifacino, J.S.等，Annu Rev Biochem 72， 395-447 (2003))。為了測定經焚光標記的Tf的胞吞速率，測量限于攝取開始時的線性階段，在內在化的蛋白質經歷胞吞再循環(huán)至PM之前(圖3a,插圖)。 Apo2L/TRAIL抑制了BJAB和Colo205細胞中75-85。/。的Tf胞吞速率(圖3a， b); 用zVAD-fmk進行的預處理基本上逆轉了這種抑制(圖3c)。因此，DR活化導 致網格蛋白介導的胞吞作用的胱天蛋白酶依賴性破壞。
Apo2L/TRAIL誘導網^^白介導的DR5胞吞作用。
網格蛋白途徑成分的快速且選擇性切割提供了 DR與網格蛋白外被蛋白 的物理接近可能促進蛋白水解事件的證據。因此，提出問題，DR5在配體刺 激后是否經歷網格蛋白介導的胞吞作用。使用識別受體的胞外結構域而不竟 爭配體結合的一種單克隆抗體(mAb 5C7)(參見例如Kischkel, F.C.等， Immunity 12, 611-20 (2000))。在37。C與飽和量的5C7—起溫育沒有影響表面 DR5水平(正如另一種非交疊的單抗所檢測的)，這證明5C7本身不改變DR5 胞吞作用。制備了單抗5C7的萸光偶聯(lián)物(647507),將其在0。C結合至Co10205 細胞，接著測量在37。C的DR5胞吞動力學(圖4a)。暴露于三聚體或多聚體 (抗體交聯(lián)的)形式的Apo2L/TRAIL同樣地使DR^包吞速率加速了約2倍(圖 4a)，這導致約l/3的受體在2小時里(大部分在開始的30分鐘內)內在化(圖 4b)。相應地，細胞表面DR5在刺激的前30分鐘期間下降，之后此DR5庫穩(wěn)定 了 (圖4c)。在BJAB細胞中觀察到類似的結果。與在37。C短暫暴露于配體后 所獲得的數(shù)據形成對比(圖4a), 2小時的延長暴露抑制了DR5胞吞，伴隨地 抑制了Tf胞吞，分別使速率降低了2.5倍或5倍(圖4d)。這些結果提供了網格 蛋白途徑支持DR5胞吞的證據。確實在用Apo2L/TRAIL短暫處理的Colo205 細胞中，通過電子顯微鏡檢術(EM)，小部分的細胞表面5C7定位于披有網格 蛋白的小窩，沒有可檢測地定位于無被表面內陷或胞膜窖(圖4f-h)。
接著，使用了已建立的干涉策略，其基于經逆轉錄病毒感染的細胞中 GTP酶發(fā)動蛋白-l的溫度敏感性突變體(dynGs"D)的多西環(huán)素調節(jié)的表達。自 許可溫度(30。C)變動至非許可溫度(38。C)后，這種突變體快速且可逆地抑制 網格蛋白依賴性胞吞作用(參見例如Damke, H.等，J Cell Biol 131， 69-80 (1995))。在HeLa-M細胞中進行的初始實驗證實了多西環(huán)素誘導阻斷了 38°C 時在具有dynG^D表達的細胞中的Tf攝取，但在鄰近的、不表達的細胞中則 不然，在30。C也不然(圖5a-d，和圖10a)。雖然dynG2"D在HeLa-M或Co10205 細胞中的誘導性表達是不夠穩(wěn)定的，但它在經轉導的BJAB細胞系中是穩(wěn)定的，且在38。C對Tf攝取有強烈的阻斷(圖5e)。多西環(huán)素刺激的dyr^"d表達 還減少了配體誘導的DR5攝取，自30。C時的約25Q/。至38。C時的約10。/c)。相比 之下，沒有多西環(huán)素時在這兩個溫度的胞吞作用是相似的(圖5f)。在HeLa-M 細胞中，dyn^"d誘導接著變動至38。C也減弱了配體誘導的DR5攝??；這種效 應比在BJAB細胞中的弱，可能是因為dynG^d表達的減少(圖10b)。為了排 除不太可能的概率，即這些20分鐘攝取實驗中減少的DR5攝取歸因于增多的 胞吞再循環(huán)，而不是歸因于最好在4分鐘攝取間期里測量的胞吞速率的降低， 使用了無條件地阻斷網格蛋白依賴性胞吞作用的顯性失活發(fā)動蛋白突變體 (發(fā)動蛋白-l"4a)(參見例如Damke, H.等，J Cell Biol 127,915-34 (1994))。 發(fā)動蛋白-1腿a抑制了HeLa-M細胞中Tf和配體誘導的DR5胞吞作用兩者。連同EM數(shù)據，這些結果表明Apo2L/TRAIL誘導的DR5攝取主要通過網 格蛋白依賴性胞吞作用來發(fā)生。如此，有被小窩內DISC與網格蛋白外被成分 的物理接近可以促進對它們的切割。如果正確的話，DISC裝配和啟動物胱天 蛋白酶活化應該不需要有被小窩的實際內在化。為了測試這點，將BJAB纟田 胞在冰上冷卻以阻斷Tf胞吞(圖lla)。盡管有所述阻斷，Apo2L/TRAIL和FasL 仍募集FADD和胱天蛋白酶-8至它們各自的受體，并加工胱天蛋白酶-8 (圖 llb)。此外，Apo2L/TRAIL在38。C時誘導了相當?shù)腄ISC形成、胱天蛋白酶-8 加工、及DISC中的胱天蛋白酶-8活性，盡管有dynG"犯抑制了胞吞作用(圖 llc和d)。網M白介導的胞吞作用的抑制提升了 DR誘導的胱天蛋白酶活化和凋亡網格蛋白途徑蛋白質的快速切割提供了胞吞作用的破壞可能促進配體 誘導的胱天蛋白酶活化和凋亡的證據。確實，dyn^"d介導的胞吞阻斷明顯 地提升了來自全細胞溶胞產物的總的細胞胱天蛋白酶-8庫、Bid、 AP2a和效 應器胱天蛋白酶-3和-7的配體"i秀導的加工(圖6a)，而沒有顯著地改變DISC 本身的形成或活化(圖llc和d)。定量分析顯示了與30。C相比dynW"d誘導和 溫度變動至38。C后配體刺激的胱天蛋白酶-3/7酶活性的實質性增加(圖6b)。 此外，這種條件還導致提升的凋亡(圖6c),即用wt配體或DR5選擇性變體 刺激后所觀察到的效應(參見例如Kelley， R.F.等,J Biol Chem 280， 2205-12 (2005))。致敏作用是明顯的，不僅根據劑量-響應曲線的左移，而且根據具 有斷裂DNA的細胞最大百分比更大(圖6c)。這些結果表明網格蛋白依賴性胞吞作用的胱天蛋白酶介導的破壞放大了 DISC下游的胱天蛋白酶活化，這 導致更強的凋亡剌激。如上文所述的，使用本發(fā)明的方法和材料，揭開了細胞外在凋亡途徑和網格蛋白依賴性胞吞機器之間意想不到的相互作用。在促凋亡的DR參加 (engagement)的數(shù)分鐘內，被活化的胱天蛋白酶開始切割介導網格蛋白依賴 性胞吞作用的蛋白質。相對快速的AP2ot切割動力學、這個事件對FADD和胱 天蛋白酶-8的需要、及不依賴于Bax和胱天蛋白酶-3提供了DR接近的胱天蛋 白酶(最可能是胱天蛋白酶-8和/或胱天蛋白酶-10 ).執(zhí)行初始的AP2a力口工。 確實，AP2a鉸^^中的胱天蛋白酶切割位點與胱天蛋白酶-8能夠識別的序列相 吻合(參見例如Nicholson, D.W" Cell Death Differ 6， 1028-42 (1999))。DR活化對網格蛋白依賴性胞吞作用的抑制在與胱天蛋白酶剌激相同的 時間框架中發(fā)生，并由zVAD-fmk逆轉，這證明其依賴于胱天蛋白酶活性。 主要的AP2ot加工位點定位于鉸鏈區(qū)。所述鉸鏈連接耳結構域(其支持輔助 蛋白募集)至軀干結構域(其與其它AP2亞基一起介導PM結合和貨物結合) (參見例如Owen, D丄等,RR. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 153-91 (2004))。 AP2a耳結構域在COS7細胞中的過表達抑制網格蛋白依賴性胞吞作用，即一 種由預防輔助蛋白結合的突變所消除的效應(參見例如Owen, D丄等，Cell 97, 805-15 (1999))。相反地，在其中有些細胞僅表達無耳AP2a的果蠅中進行的 研究提供了 一般性胞吞作用中不需要耳結構域的證據(參見例如Berdnik, D. 等，Dev Cell 3, 221-31 (2002))。如此，尚不清楚單獨地AP2a的胱天蛋白酶切 割是否足以擾亂胞吞作用，或者其它網格蛋白途徑成分的加工是否也有貢 獻。無論如何，DR介導的胱天蛋白酶活化快速地破壞網格蛋白依賴性胞吞 作用。在考慮被活化的胱天蛋白酶如何接近網格蛋白外被底物時，有數(shù)據提供 了在Apo2L/TRAIL刺激后，顯著比例的表面DR5經由網格蛋白依賴性胞吞作 用移入細胞的證據。初步的EM研究證實了DR5與披有網格蛋白的小窩結合 在一起。最近的工作表明了RNAi介導的網格蛋白和AP2敲低經由Fas抑制凋 亡信號傳導，該結果解釋為揭示了受體信號傳導對胞吞作用的需要(參見例 如Lee, K.H.等，Embo J 25, 1009-23 (2006))。根據Apo2L/TRAIL DISC裝配、 活化和凋亡在通過冰上溫育或通過發(fā)動蛋白失活來抑制胞吞作用時仍可以 發(fā)生的觀察結果，推測DR5在仍在細胞表面上(可能在披有網格蛋白的小窩內)時可結合FADD和胱天蛋白酶-8。確實，通過水上溫育或使用溫度敏感 性發(fā)動蛋白阻斷胞吞作用不干擾有被小窩形成和貨物募集(參見例如Damke, H.等，J Cell Biol 131， 69-80 (1995))。 DR活化引起了幾乎完全的AP2oc破壞。 相比之下，CHC和AP1/2P加工僅牽涉部分的總細胞蛋白質，可能是直接參與 DRJ包吞作用的部分。如此，在內在化DR結合的DISC附近的胱天蛋白酶活化 可以導致特定網格蛋白途徑成分的局部破壞。胱天蛋白酶破壞網格蛋白介導的胞吞作用的發(fā)現(xiàn)的 一個直接含意是這 種機制的消除可以表示先前未認識的凋亡程序部分；即實施凋亡的細胞不再 需要吸收營養(yǎng)物、響應生長因子或維持膜穩(wěn)態(tài)。然而，這些切割獨自地觸發(fā) 凋亡是不太可能的，因為許多不同的實驗室使用siRNA已經有效地敲低了網 格蛋白和AP2兩者，但無一報道凋亡的增加。值得注意地，細胞毒性的DNA 損傷藥物長春堿和阿霉素也誘導網格蛋白機器成分的切割，雖然動力學比 DR配體慢得多(圖12)。另一方面，胱天蛋白酶介導的網格蛋白銜接物加工 還可以在非凋亡性細胞調控中發(fā)揮作用。在未成熟樹突細胞中，基礎的胱天 蛋白酶活性導致數(shù)種銜接蛋白亞基的切割，雖然這種效應的zVAD抑制促進 樹突細胞成熟(參見例如Santambrogio, L.等，Nat Immunol 6, 1020-8 (2005))。I)R和網格蛋白胞吞機器之間相互影響的第二個(可能是更意外的)含 意是這種相互作用提供了通過外在途徑加強胱天蛋白酶活化的正反饋環(huán)。依 照這種模型，被活化的DR的胞吞作用對抗凋亡信號傳導以保持細胞存活， 如果網格蛋白機器保持完整的話，例如響應閾下配體水平。然而，如果DR 刺激產生足夠的胱天蛋白酶活性以破壞胞吞作用，那么信號持續(xù)，這進一步 放大了胱天蛋白酶活化并促進凋亡。想得到地，DR胞吞作用可以通過溶酶 體降解、 一些其它形式的信號終止、或竟爭抗凋亡信號的誘導來對抗DR信 號傳導。胞吞作用在初始DISC結合水平不調節(jié)胱天蛋白酶活化。但是，發(fā)動 蛋白失活增強了總細胞胱天蛋白酶-8的加工，且漸進地增強了胱天蛋白酶-3 和-7的加工，并導致更強的凋亡活化，這提供了胞吞作用進一步調節(jié)初始 DISC下游的胱天蛋白酶活化的證據。綜上所述，本文公開了 DR誘導的凋亡和網格蛋白依賴性胞吞作用之間 的雙向關系DR活化導致網格蛋白胞吞機器的重要成分的胱天蛋白酶介導 的破壞，由此停止這種過程。網格蛋白依賴性胞吞作用的破壞提升了DR下 游的胱天蛋白酶活化并增加了凋亡，這提供了放大胱天蛋白酶活化和凋亡執(zhí)提供下列實施例是為了說明而不是為了限制。明確地將說明書中所有引 用的公開內容收入本文作為參考。實施例實施例l:說明性的材料和方法^尸2a應乂蛋^傘勿萄^t《的#定將BJAB細胞(5 x 1()S)用Apo2L/TRAIL刺激30分鐘，然后溶胞，使用C末 端特異性抗AP2ot (AP6, #MAl-064， ABR)來免疫沉淀，并在蛋白A/G瓊脂糖 (Pierce)上收集。將C末端片段通過SDS-PAGE解析，并且或是洗脫供胰蛋白 酶切割和液相層析-電噴射離子化-離子阱串聯(lián)質譜 (liquid-chromatography-electrospray ionization-ion trap tandem mass spectrometry)分析用，或是在分開的IP中轉移至PVD膜供N末端測序用。應在、凝承和4面r源W;t法對于常規(guī)Tf測量，在37。C用1-10嗎/ml Apo2L/TRAIL對l(^個懸浮細胞預 處理指定時間。在有些研究中，在37。C用0.25% DMSO +/- 50mM zVADfmk 對細胞預處理30分鐘，之后添加Apo2L/TRAIL。 Apo2L/TRAIL刺激后，將細 胞在冰上用結合培養(yǎng)基(無血清DME、 3%BSA、 20mM Hepes pH 7.2 )中的 5)ug/ml焚光Tf平衡30分鐘，如所示的那樣變動至37。C 0-5分鐘，然后在冰上 快速冷卻以停止胞吞。在冷的2。/。低聚曱醛/PBS中重懸沉降的細胞，并用 Coulter Epics Elite-ESP流式細胞儀(Hialeah， FL)定量10,000個細胞的平均熒 光強度。胞吞速率是從穩(wěn)定狀態(tài)內部/表面曲線的線性斜率測定的(參見例如 Wiley， H.S.等，J Biol Chem 257, 4222-9 (1982))。對于溫度變動實驗，取消冰 結合溫育。替代地，將細胞預先調節(jié)(precondition) 20分鐘，并于30。C或38。C 在結合培養(yǎng)基中維持，與""Tf一起再溫育0分鐘(對照)或20分鐘，在冰上 冷卻30分鐘，并為流式細胞術進行處理以測定內部/表面^Tf比率。對于常規(guī)DR5測量，將細胞在水上用結合培養(yǎng)基中的5pg/ml 647507飽和， 用冷的結合培養(yǎng)基清洗3次，然后在有或無10pg/ml Apo2L/TRAIL的條件下在 水上溫育30分鐘。然后將細胞變動成37。C指定時間，快速冷卻，并用冷的pH 2.4的2M尿素、50mM甘氨酸、150mM NaCl進行三次酸剝離，或者不進行酸剝離。為流式細胞術處理細胞，并且類似于先前所述的方法用如下方程計算內在化％攝取=100x[(St-S0)/(N-S0)]，其中St和So分別是酸剝離樣品溫 育時間=1和時間=0時的數(shù)值，且N是非剝離的熒光，其在37。C溫育過程期間 保持基本上不變(參見例如Austin, C.D.等，Mol Biol Cell 15, 5268-82 (2004))。 對于溫度變動，將細胞預先調節(jié)20分鐘，并維持在30。C或38。C，用5嗎/ml ^5C7預先平衡3分鐘，用10嗎/ml Apo2L/TRAIL處理0分鐘(對照)或20分鐘， 然后在冰上冷卻30分鐘。將細胞進行酸剝離或不進行酸剝離，并通過流式細 胞術定量。對于表面DR5下調測定法，將懸浮細胞在37。C用未標記的5C7預先平衡 30分鐘以結合表面并再循環(huán)的DR5庫，用或不用10ug/ml Apo2L/TRAIL處理 指定時間，并在冰上冷卻。將表面5C7用CY5-抗小鼠IgG探查，并通過流式 細胞術定量。采用這種技術以避免可歸因于Apo2L/TRAIL誘導的受體簇集 (clustering)的表面探查效率降低，如在用6475 07直接探查時所看到的。應犬蛋冷癉法^豸;t法使用Apo-l均質胱天蛋白酶-3/7測定法(Promega)實施胱天蛋白酶-3/7測 定法。收獲細胞，計數(shù)，為每個處理等分相等數(shù)目，并用不同劑量的 Apo2L/TRAIL在30。C或38。C處理4小時，然后在均質胱天蛋白酶-3/7試劑(含 有胱天蛋白酶-3/7底物Z-DEVD-Rl 10 )中溶胞。將溶胞產物在室溫溫育1小時， 之后用熒光計在485/530nm讀數(shù)。源亡>直定法將細胞在乙醇固定和RNA酶處理后用碘化丙啶染色，并通過使用Expo32 軟件以及Epics XL.MCL細胞計(Coulter Beckman)的流式細胞術分析亞二倍 體I)NA的量，如先前所記載的(參見例如Nicholson, D.W.， Cell Death Differ 6, 1028-42 (1999))。將BJAB細胞(每個時間點l x 107個)用由抗FLAG M2抗體所交聯(lián)的 Flag-Apo2L/TRAIL處理，收集，溶胞，免疫沉淀，并分析DISC,如記載的 那樣(參見例如Kischkel, F.C.等，Immunity 12, 611-20 (2000))。勿/^^和試身將人結腸直腸腺癌Colo205細胞、人B細胞淋巴瘤BJAB細胞和人T細胞癌 瘤Jurkat野生型細胞(A3克隆)、FADD缺陷的(El)和胱天蛋白酶-8缺陷的(19.3) 培養(yǎng)于RPMI 1640 + 10%胎牛血清(FBS) + 2mM谷氨酰胺+ 1000U/ml青霉 素-鏈霉素(Life Technologies)中。將人宮頸癌瘤HeLa-M細胞，人乳腺腺癌 MCF7和人結腸直腸腺癌HC丁15、 HCT8、 SW948、 Colo320，人纖維肉瘤HT180 (ATCC)、 HCT116 Bax(V-)、 HCT116 ^ ^+/一培養(yǎng)于50:50 Dulbecco氏改良 Eagle氏和FK12培養(yǎng)基+ 10% FBS + 1000U/ml青霉素-鏈霉素。編碼溫度敏 感性發(fā)動蛋白的cDNA克隆是G273D突變體和顯性失活K44A突變體發(fā)動蛋 白-l (分別是DynG2"D和DynK44A)。 DynG2"D表達自pHUSH-ProEx,即一種在 Genentech構建的單個逆轉錄病毒質粒四環(huán)素誘導型表達系統(tǒng)。首先將該 cDNA克隆入具有兩拷貝四環(huán)素操縱基因Tet02的含CMV增強子-啟動子序列 的穿梭質粒，然后通過體外的基于噬菌體入的重組或Gateway 技術 (Invitrogen， Carlsbad)來4爭移至莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒主鏈(backbone) 載體，其中通過分開的{3-肌動蛋白啟動子接著是內部核糖體進入序列和噪呤 霉素選擇盒驅動野生型Tet阻抑物。使用連續(xù)感染(serial infection)從2載體四 環(huán)素誘導型逆轉錄病毒表達系統(tǒng)pRevTet-On/pRev-Tre (Clontech)表達 DynK44A。使用Lipofectamine 2000 (Stratagene)將逆轉錄病毒載體轉染入 Phoenix雙嗜性(amphotropic)莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒包裝細胞。收獲逆 轉錄病毒顆粒，并用于HeLa-M和BJAB細胞感染，如先前所述的(Simpson 等，J Cell Biol 137, 835-45， 1997)。將受Dyn""感染的細胞用嘌呤霉素(2-3 叱/ml)選擇l-2周，并如下克隆，即或是手工挑選各個HeLa-M集落或是FACS 分選抗性BJAB細胞(門控為排除碘化丙咬(gated for exclusion of propidium iodide))并使用裝備有Autoclone儀器(Coulter, Hialeah, FL)的EPICS ELITE-ESP將單細胞接種在96孔細胞培養(yǎng)板中。通過免疫熒光顯微術，對細 胞克隆篩選多西環(huán)素誘導型發(fā)動蛋白-1表達的均勻性(uniformity)。對受 DynK44A感染的細胞用潮霉素B (400嗎/ml)和G418 (lmg/ml)選擇l-2周。多西 環(huán)素(l叱/ml)誘導在32。C實施72小時，如先前所述的(Damke等，J Cell Biol 131,69-80,1995)。硫酸長春新堿(#丁-117)、鹽酸阿霉素(GR-319)購自Biomol, 無四環(huán)素的FBS購自Hyclone ，嘌呤霉素購自Clontech,而多西環(huán)素購自Sigma。 zVAD-fmk( asN-千氧羰基-Val-Ala-Asp-氟曱基酮)獲自MD Biosciences (#FK-009)。重組蛋白、抗體和焚光標志物制備了未帶標簽型式的或帶Flag標簽型式的人重組體可溶性 Apo2L/TRAIL和帶Flag標簽的FasL，正如所記載的(Sharp等，J Biol Chem 280, 19401-409, 2005 )。對于免疫印跡分析，使用了下列抗體購自Cell Signaling 的抗胱天蛋白酶-8 (1C12,糾746)和抗胱天蛋白酶-7 (C7， #9494),購自 Immunotech的抗胱天蛋白酶-8 (5F7, #IM3148)，購自BD Transduction的抗 FADD (#610399)、抗AP2a (#610501)、抗APl/2a (#610381)、抗APly (#610385)、抗AP35(弁611328)、抗CHC (#610499)、抗AP4s (#612018)、抗Bid (#550365)和抗發(fā)動蛋白1/2 (#610245),購自Biomol的抗胱天蛋白酶3 (SA-320)，購自Oncogene的抗胱天蛋白酶9 (Ab2, #AM47)，購自Zymed的抗 Tf受體(^13-6800),購自Sigma的抗(3Cop (M3A5, #G2279)，購自Gentex的抗 Sec23 (#GTX22913)，抗DR5 (3H3和5C7)單克隆抗體是在Genentech公司產 生的，及如先前所述的抗AP3P (參見例如Simpson等,J Cell Biol. 137(4): 835-845 (1997))。作為二級試劑，使用了下列辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的 抗體購自BD Bioscience的抗小鼠IgGl (#559626);及購自Southern Biotechnology Associates的4元小鼠IgG2b (#190-05), 購自Jackson ImmunoResearch的抗家兔IgG(r711-035-152)。對于免疫沉淀實驗，使用了下 列抗體購自ABR的抗Flag (M2, Sigma)和抗AP2a (AC1-Mil,弁MA3-061)或 (AP6，#MAi-064)。對于流式細胞術和免疫焚光顯微術，488Tf(T-13342)、 647Tf (T-23366)、州抗家兔IgG (弁A-11037)和狄抗山羊IgG (存A-11058)購自Molecular Probes。片段抗小鼠IgG (#115-177-003)購自Jackson ImmunoResearch，抗發(fā)動 蛋白-1 (弁sc-6402)購自Santa Cruz Biotechnology,而抗Alexa 647家兔多克隆抗 體是在Genentech公司產生的，使用Alexa 647偶聯(lián)的牛血清清蛋白(Molecular Probes, Inc.)作為抗原，并在Alexa-647 Sepharose柱上親和純化，所述 Alexa-647 S印harose柱通過(CNBr)活化的Sepharose與Alexa Fluor 647尸胺 (cadaverin) (Molecular Probes, Inc.)起反應來產生。通過與Alexa-647琥銷酰亞 氨基酯(Molecular Probes, Inc.)起反應依照制造商的說明書將Alexa-647偶聯(lián) 至單抗5C7 (6475 C7)。名瘦處^i凝^將用于W5C7攝取成像的細胞在37。C與^5C7和交聯(lián)的Apo2L/TRAIL— 起溫育指定時間。將用于溫度敏感性實驗的細胞在30。C與38。C在結合培養(yǎng)基 中預處理20分鐘，然后添加柳Tf，并在相應溫度繼續(xù)溫育指定時間。然后將 細胞用3%低聚曱醛固定20分鐘，用0.4%皂苷透化，并用家兔抗Alexa647 IgG 接著用州抗家兔IgG染色(^5C7攝取)或者用抗發(fā)動蛋白-1抗體接著用594抗 山羊IgG染色(溫度敏感性實驗)。使用配備有Plan-Apochromat 1.4NA 63x物 4竟、CCD相詳幾(AxioCam; Carl Zeiss Microimaging, Inc.)和四通5吝濾光器(quad pass filter)裝置(Chroma Technology Corp.)6々顯《鼓4竟(Axiovert 200; Cari Zeiss Microimaging, Inc.)(所有裝置均由AxioVison 3.1軟件 (Carl Zeiss Microimaging, Inc.)控制)獲得圖像。名;^^子i微術'將懸浮的Colo205細胞在冰上與結合培養(yǎng)基中的10嗎/ml 5C7—起溫育30 分鐘，清洗，在冰上與結合培養(yǎng)基中的10iag/ml Apo2L/TRAIL—起溫育30分 鐘，然后變動至37。C 5分鐘，在2°/。低聚曱醛/0.2%戊二醛中固定，并如先前 所述的那樣加工(Austin等，Mol Biol Cell 15， 5268-82， 2004)，用于用家兔抗小 鼠IgG (Dako, Glostmp， Denmark)進行的超薄冷凍切片免疫金標記。認為前述書面說明足以使本領域技術人員能夠實施本發(fā)明。本發(fā)明的范 圍不受本文中所提出的實施例的限制。實際上，根據上述描述，在本文所顯 示和描述的那些以外，本發(fā)明的各種更改對于本領域技術人員是顯而易見 的，而且落在所附權利要求的范圍內。表表l:可用于實施本發(fā)明的例示性多肽AP2-a (SEO ID NO: 1) NCBI登記號CAB66859MPAVSKGDGMRGLAVFISD麗CKSKEAEIKRINKELANIRSKFKGDKALDLEKIVLDNSVFSEHRNLQNLLILTAIKADRTRVMEYINRLDNYDAPDIANIFGYGYTAPPYGQPQPGFGYSMAPl/2[3 (SEQ ID NO: 3) NCBI登記號P63010GNPNYTLSLKCRAPEVSQYIYQVYDSILKN發(fā)動蛋白(SEOIDNO:4) NCBI登記號NP 001005336IEAETDRVTGTNKGISPVPINLRVYSPHVLNLTLVDLPGMTKVPVGDQPPDDTYELSGGARINRIFHERFPFELVKMEFDEKELRREISYAIKNIHGIRTGLFTI丄ANLYSCGDQNTLMEESAEQAQRRDEMLRMYHALKEALSIIGD證TT
VSTPMPPPVDDSWLQVQSVPAGRRSPTSSPTPQRRAPAVPPARPGSRGPAP
GPPPAGSALGGAPPVPSRPGASPDPFGPPPQVPSRPNRAPPGVPRITISDP
死亡受體4 (SEO ID NO: 5) NCBI登記號000220
RLLVPANGADPTETLMLFFDKFANIVPFDSWDQLMRQLDLTKNEIDVVRA
GTAGPGDALYAMLMKWVNKTGRNASIHTLLDALERMEERHAKEKIQDL
LVDSGKFIYLEDGTGSAVSLE
死亡受體5 (SEO ID NO: 6) NCBI登記號AAB67103
FMYLEGNADSALSAP02L/TRAIL (SEO ID NO: 7) NCBI登記號NP 003801
TISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGR
ENDRIF VS VTNEHLIDMDHE ASFFG AFLVG
FAS (SEQ ID NO: 8) NCBI登記號AAA63174
GLHHDGQFCHKPCPPGERKARDCTVNGDEPDCVPCQEGKEYTDKAHFSS
KKANLCTLAEKIQTIILKDITSDSENSNFRNEIQSLV
FAS配體(SEO ID NO: 9) NCBI登記號NP 000630
PPLPPPPPPPPLPPLPLPPLKKRGNHSTGLCLLVMFFMVLVALVGLGLGMF
NLTSADHLYVNVSELSLVNFEESQTFFGLYKL
權利要求
1. 一種在哺乳動物細胞中檢測凋亡的方法，包括(a)使所述細胞與結合凋亡過程中所產生的蛋白質片段的抗體接觸，其中所述抗體結合AP2-α(SEQ ID NO1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO2)、AP1/2β(SEQ ID NO3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO4)的蛋白質片段；(b)測定凋亡過程中所產生的所述蛋白質片段所結合的所述抗體量；和(c)比較步驟(b)中所結合的所述抗體量與無凋亡的哺乳動物細胞中所述蛋白質片段所結合的所述抗體量，其中如果步驟(b)中的所述量大于無凋亡的細胞中的所述量，那么檢測出凋亡。
2. 權利要求l的方法，其中所述細胞中的凋亡是經由死亡受體4 (SEQ IDNO: 5)、死亡受體5 (SEQ ID NO: 6)或Fas (SEQ ID NO: 8)啟動的。
3. 權利要求2的方法，其中所述細胞中的凋亡是通過使所述細胞與Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7)、 FasL (SEQ ID NO: 9)、 Fas激動性抗體、DR4激動性抗體或DR5激動性抗體接觸而啟動的。
4. 權利要求3的方法，該方法還包括使用凋亡檢測以獲得關于療法功效的信息的步驟，所述療法包括施用Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7)、 FasL(SEQ ID NO: 9)、 Fas激動性抗體、DR4激動性抗體或DR5激動性抗體。
5. 權利要求l的方法，其中所述抗體結合AP2-a(SEQIDNO: l)的蛋白質片段，且所述抗體所結合的AP2-a蛋白質片段為64kDa或33 kDa。
6. 權利要求l的方法，其中所述抗體所結合的蛋白質片段包含SEQIDNO:1的DVFD或SEQ ID NO: 1的GPAA。
7. 權利要求l的方法，其中所述細胞是人結腸、結腸直腸、肺、乳腺、前列腺、膀胱、腎、卵巢、腦、黑素瘤、白血病或骨髓瘤癌細胞。
8. 權利要求l的方法，其中使用免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附測定法或免疫組織化學來觀察AP2-a (SEQ ID NO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、AP1/2P (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段。
9. 權利要求l的方法，該方法還包括在所述哺乳動物細胞中檢查至少一種mRNA的表達。
10. 權利要求l的方法，該方法還包括在4吏所述細胞與所述抗體接觸之前，使所述哺乳動物細胞暴露于一種或多種測試藥劑，使得在所述哺乳動物細胞中^r測出凋亡則所述一種或多種測試藥劑鑒定為所述哺乳動物細胞中的凋亡誘導物。
11. 一種用于薈定對在人癌細胞中誘導凋亡的治療劑可能發(fā)生響應或為響應性的人癌細胞的方法，該方法包括 使所述人癌細胞暴露于所述治療劑；對暴露于所述治療劑的所述人癌細胞檢查AP2-a(SEQIDNO: 1)、網格 蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 AP1/2(3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO:4)的蛋白質片段的存在；比較所述人癌細胞中所述蛋白質片段的量與未暴露于所述配體的對照 人癌細胞中所述蛋白質片段的量；其中若存在于暴露于所述治療劑的所述人癌細胞中的所述蛋白質片段量大 于未暴露于所述治療劑的所述對照人癌細胞中的所述蛋白質片段 量，則觀察到凋亡；且在所述人癌細胞中觀察到凋亡則所述人癌細胞鑒定為對所述治療劑可 能發(fā)生響應或為響應性的。
12. 權利要求ll的方法，其中所述治療劑誘導死亡受體4(SEQIDNO: 5)、死 亡受體5 (SEQ ID NO: 6)或Fas (SEQ ID NO: 8)的信號傳導。
13. 權利要求ll的方法，其中使用免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附測定法或免疫 組織化學來觀察AP2-a(SEQIDNO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2(3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片段。
14. 權利要求ll的方法，該方法還包括在所述人癌細胞中檢查至少一種 mRNA的表達。
15. 權利要求ll的方法，該方法還包括在所述人癌細胞中檢查至少兩種不同 mRNA的表達。
16. 權利要求ll的方法，其中所述人癌細胞是結腸、結腸直腸、肺、乳腺、 前列腺、膀胱、腎、卵巢、腦、黑素瘤、白血病或骨髓瘤癌細胞。
17. 權利要求ll的方法，其中所述人癌細胞中的凋亡是通過使所述細胞與 Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7)、 FasL (SEQ ID NO: 9)、 Fas激動性抗體、 DR4激動性抗體或DR5激動性抗體接觸而啟動的。
18. 權利要求ll的方法，其中所述人癌細胞獲自活扭織檢查，并已經在體外 培養(yǎng)物中培養(yǎng)了不到一個月。
19. 權利要求ll的方法，其中所述蛋白質片段是AP2-a的蛋白質片段，其包 含SEQ ID NO: 1的DVFD或SEQ ID NO: 1的GPAA。
20. —種用于觀察哺乳動物細胞中凋亡的試劑盒，該試劑盒包含a) 第一抗體，其結合AP2-a(SEQIDNO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2(3 (SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片 段，b) 第二抗體，其結合AP2-a(SEQIDNO: 1)、網格蛋白重鏈(SEQ ID NO: 2)、 APl/2卩(SEQ ID NO: 3)或發(fā)動蛋白(SEQ ID NO: 4)的蛋白質片 段；其中所述第一和第二抗體不結合相同的蛋白質；c) (a)和(b)的容器，d) 說明書，其關于使用所述試劑盒中的所述抗體來觀察哺乳動物細胞 中的凋亡。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于觀察凋亡過程中產生的蛋白質片段的方法和材料，以在哺乳動物細胞中觀察該過程。本發(fā)明的實施方案可用于例如觀察凋亡以檢查哺乳動物癌細胞對凋亡誘導劑的敏感性。
文檔編號G01N33/50GK101535805SQ200780030709
公開日2009年9月16日 申請日期2007年6月20日 優(yōu)先權日2006年6月20日
發(fā)明者卡里·D·奧斯丁, 戴維·A·勞倫斯, 阿維·阿什克納齊 申請人:健泰科生物技術公司