專(zhuān)利名稱(chēng)：：水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于水產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)，是一種利用高效液相色譜-氬化物發(fā)生原子熒光光譜聯(lián)用(HPLC-HGAFS)形態(tài)分析技術(shù)測(cè)定水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷的方法。
背景技術(shù)：
：當(dāng)前，元素分析化學(xué)的一項(xiàng)前沿內(nèi)容是對(duì)元素的不同形態(tài)進(jìn)行定性和定量，而不僅僅是測(cè)定元素的總量，這主要是因?yàn)橥辉氐牟煌螒B(tài)可能具有完全不同的化學(xué)和毒理性質(zhì)，砷是其中的一個(gè)典型元素。砷的主要形態(tài)有砷酸鹽As(V)、亞砷酸鹽As(III)、一曱基砷化合物(醒A)、二曱基砷化合物(DMA)、三曱基砷的氧化物(TMAO)、砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿(AsC)和砷糖(AsS)等，其中無(wú)機(jī)砷(iAs)[包括As(V)、As(III)]的毒性很高；而有機(jī)砷中僅有畫(huà)A和DMA有較小的毒性，其它有機(jī)形態(tài)大多無(wú)毒，所以無(wú)機(jī)砷的含量基本能夠反映有毒砷的含量，這也是測(cè)量無(wú)機(jī)砷的衛(wèi)生學(xué)基礎(chǔ)。砷在水產(chǎn)品中的主要存在形式有5種iAs(劇毒)、DMA(低毒)、固A(低毒)、AsB(無(wú)毒)、AsC(無(wú)毒)、AsS(無(wú)毒)?，F(xiàn)行的檢測(cè)方法"氫化物發(fā)生法"(GB/T5009.11-2003第一法)和"銀鹽法"(第二法)，在具體^^測(cè)結(jié)果方面存在較大缺陷。我們研究發(fā)現(xiàn)①氫化物原子熒光法，在測(cè)量砷糖(AsS)含量較高的海藻類(lèi)樣品時(shí)會(huì)出現(xiàn)誤報(bào)，原因在于在前處理過(guò)程中，砷糖(AsS)降解成小分子有機(jī)砷一一二曱基砷(DMA)，在氫化物原子熒光光度計(jì)上有響應(yīng)值，使得測(cè)量結(jié)果顯著偏高；②銀鹽法因受裝置配套不完善、環(huán)境溫度、鋅粒大小不均勻、手工操作精密度較差的影響，導(dǎo)致平行樣間誤差較大。無(wú)機(jī)砷是水產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中主要的安全衛(wèi)生指標(biāo)，是產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中重要的限制性指標(biāo)之一，其含量測(cè)定在質(zhì)量檢測(cè)中具有重要的意義。2006年關(guān)于海藻食品中現(xiàn)國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB19643-2005《藻類(lèi)制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中的限量指標(biāo)和對(duì)國(guó)標(biāo)GB/T5009.11-2003《食品中總砷和無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)方法》的爭(zhēng)議，已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)各方面廣泛重視；目前國(guó)際上ISO和CAC標(biāo)準(zhǔn)中尚無(wú)測(cè)定水產(chǎn)中無(wú)機(jī)砷的方法標(biāo)準(zhǔn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是借助元素形態(tài)分析儀，使用高效液相色語(yǔ)-氬化物發(fā)生原子熒光光譜聯(lián)用(HPLC-HGAFS)形態(tài)分析技術(shù)，對(duì)其砷的不同形態(tài)進(jìn)行定性和定量分析，準(zhǔn)確測(cè)定水產(chǎn)品中有劇毒的無(wú)機(jī)砷砷酸鹽As(V)、亞砷酸鹽As(III),準(zhǔn)確測(cè)定其有低毒的醒A和DMA，從而給出更為準(zhǔn)確可靠的生物學(xué)特性。本發(fā)明是按照以下操作方法完成的本發(fā)明為高效液相色譜-氫化物發(fā)生原子焚光光語(yǔ)聯(lián)用(HPLC-HGAFS)形態(tài)分析方法，包括1、選用的儀器及設(shè)備，2、配置試劑與標(biāo)準(zhǔn)溶液，3、進(jìn)行測(cè)試步驟，4、實(shí)驗(yàn)所用的儀器條件，5、結(jié)果計(jì)算lj義器及設(shè)備HPLC-HGAFS聯(lián)用系統(tǒng)；(1)、HPLC部分，使用LC-10ATVP高壓液相泵；配有100iiL定量環(huán)的7725i六通進(jìn)樣閥；配有相同材質(zhì)填并+保護(hù)柱(25mmx2.3mmi.d，12-20jum)的PRP-X100(250mmx4.lmmi.d,10jum)陰離子交換柱(2)、原子熒光光譜j義；配有激發(fā)光源高性能砷空心陰極燈；形態(tài)分析測(cè)量軟件；(型號(hào)HGAFS-9130);(3)、水浴恒溫振蕩器(型號(hào)SHA-C);(4)、砂芯過(guò)濾器(型號(hào)SH/T0093);(5)、循環(huán)式真空泵(型號(hào)SHZ-D);(6)、酸度計(jì)(型號(hào)DELTA320);(7)、數(shù)控超聲清洗器(型號(hào)KQ-600DE);(8)、水系微孔濾膜(O.45jum);(9)、氬氣(純度>99.99%):2、配置試劑與標(biāo)準(zhǔn)溶液；(1)、試劑；a、①鹽酸溶液(50W:量取250mL濃鹽酸，慢慢加入250mL水中，混勻；②鹽酸溶液(7W:量取280mL鹽酸，慢慢加入3720mL水中，混勻b、氫氧化鉀溶液(5g/L):稱(chēng)取氫氧化鉀5g溶于水中，并稀釋至l糊mL:c、硼氫化鉀溶液(15g/L);稱(chēng)取硼氫化鉀15g溶于1000mL氬氧化鉀溶液(5g/L)中d、HPLC流動(dòng)相為15mmol/L(NH4)2^04溶液，pH用10%甲酸調(diào)節(jié)至6，使用之前需經(jīng)過(guò)0.45jum濾膜過(guò)濾并超聲脫氣所有的試劑均是分析純或是優(yōu)級(jí)純，整個(gè)實(shí)驗(yàn)都使用超純水;玻璃儀器使用前需經(jīng)15%硝酸浸泡24h;(2)、砷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液CH3AsO(ONa)26H20(MMA)和Na2HAs047H2OAs(v)從Sigma—Aldrich購(gòu)得，(CH3)2As02H(DMA)從Acros購(gòu)得，1000jug/mL的As(III)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液/人國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心購(gòu)得；a、通過(guò)溶解相應(yīng)量的畫(huà)A、DMA、As(V)得到100卯b/mL的各單標(biāo)溶液；將As(III)也稀釋至100ppb/mL(四種標(biāo)液可在4。C水箱存放備用)；b、混合砷標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制(臨用時(shí)現(xiàn)配)將以上四種標(biāo)液逐級(jí)稀釋至100ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再才艮據(jù)下表1配制表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3、進(jìn)行測(cè)試步驟取經(jīng)粉碎過(guò)40目篩的水產(chǎn)品干樣0.300g-3.OOOg于50mL具塞刻度試管中，加鹽酸(50%)的溶液20mL混勻，或稱(chēng)取鮮樣(需搗碎勻槳)2.000g-5.OOOg于50mL具塞刻度試管中，并用鹽酸(50%)溶液定容至25mL，混勻；至70。C水浴搖床lh，使試樣充分浸提；取出冷卻定容至25ml,脫脂棉過(guò)濾；取0.2mL上清液加入10ml管中；加入3.4mLH20;0.4mLHA混勻后在70。C度水浴放置20min,使As(ni)氧化成As(V);取出后用0.45微米的水系微孔濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定無(wú)機(jī)砷值4、實(shí)驗(yàn)所用的儀器條件(1)、液相色語(yǔ)條件(HPLC):流動(dòng)相15mmol/L(NH4)2HP04(pH6.0),流速lmL/min;進(jìn)才羊體積100pL;輔陰+及46mA;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速65rpm;(2)、氳化物發(fā)生條件(HG):還原劑成分1.5%KBH4+0.5%KOH，流速6.0mL/min;載流成分7%HC1，流速6.0mL/min;(3)、原子熒光光譜條件(AFS):燈高性能砷空心陰極燈，193.7nm;負(fù)高壓285V;燈電流100mA;載氣氬氣，400mL/min;屏蔽氣氬氣，600mL/min;5、結(jié)果計(jì)算(1)、定性開(kāi)機(jī)后按上述條件進(jìn)行設(shè)置，待穩(wěn)定后，先做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)定處理好的樣品溶液；在上述液相色譜和原子焚光條件下用進(jìn)樣針吸取O.3-0.5mL,采用手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行測(cè)定，用峰高或峰面積外標(biāo)法定量；在上述色語(yǔ)條件下亞砷酸鹽As(III)、二曱基砷化合物(DMA)、一曱基砷化合物(醒A)、砷酸鹽As(V)依次保留時(shí)間約為2.599min、3.221min、5.075min、8.994min;(2)、定量待測(cè)樣品中亞砷酸鹽As(III)、二曱基砷化合物(DMA)、一曱基砷化合物(畫(huà)A)、砷酸鹽As(V)的色鐠峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比變化范圍在±5%之內(nèi)即認(rèn)為該待測(cè)定物質(zhì)；結(jié)果計(jì)算與表述用數(shù)據(jù)處理軟件中的外標(biāo)法，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，將標(biāo)準(zhǔn)工作曲線保存，然后將樣品峰分析處理，用外標(biāo)校正，即可得到待測(cè)溶液中的亞砷酸鹽As(III)、二曱基砷化合物(DMA)、一曱基砷化合物(畫(huà)A)、砷酸鹽As(V)的濃度，按式(1)計(jì)算可得試樣中待測(cè)物的含量X=CxVxF/mx1000................................................(1)X—樣品中待測(cè)物的含量，mg/kg;C—待測(cè)液中無(wú)機(jī)砷的濃度，ng/mL;m—稱(chēng)樣量，g;V—測(cè)定液體總體積，mL;F—稀釋倍數(shù)。本發(fā)明與已有技術(shù)對(duì)比其特點(diǎn)是1、該實(shí)驗(yàn)條件選擇合理，檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，水產(chǎn)品中的無(wú)機(jī)砷用提取液提取后，通過(guò)陰離子交換色i普柱，由流動(dòng)相將亞砷酸鹽As(III)、二曱基砷化合物(DMA)、一曱基砷化合物(醒A)、砷酸鹽As(V)依次洗脫，由于陰離子交換色譜柱對(duì)砷酸鹽As(V)、亞砷酸鹽As(III)、一曱基砷化合物(固A)、二曱基砷化合物(DMA)和砷糖(AsS)的吸附能力不同，洗脫的溶液經(jīng)過(guò)硼氫化鉀還原劑和鹽酸發(fā)生氬化反應(yīng)，生成氬化物進(jìn)入原子化器，與原子熒光聯(lián)用進(jìn)行分析測(cè)定。2、本發(fā)明不受浸提時(shí)間和溫度影響；選擇用(50%)的鹽酸溶液浸提能使大分子量砷糖(AsS)完全分解，這樣不會(huì)對(duì)無(wú)機(jī)砷的積峰造成干擾；可以使砷提取完全。3、本發(fā)明既能準(zhǔn)確測(cè)無(wú)機(jī)砷(iAs)，同時(shí)也能測(cè)定有機(jī)砷(一曱基砷化合物(固A)、二甲基砷化合物(DMA))。圖l:As形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)分離i普?qǐng)D亞砷酸鹽As(III)、二曱基砷化合物(DMA)、一曱基砷化合物(固A)、砷酸鹽As(V)的依次出峰順序、保留時(shí)間和濃度梯度。圖2:海帶試樣在60°C水浴中浸提時(shí)間與砷形態(tài)變化圖由該譜圖可知①試樣經(jīng)50°/HCl提取后As形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，隨著浸提時(shí)間的增加，砷糖(AsS》降解轉(zhuǎn)化為小分子有機(jī)砷--二曱基砷(DMA)的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無(wú)機(jī)砷UAs)的濃度，甚至達(dá)到了幾十倍的程度。②無(wú)機(jī)砷的峰形非常穩(wěn)定，證明有機(jī)砷不會(huì)隨浸提時(shí)間的增加而降解為無(wú)9機(jī)砷。圖3:海帶樣品加As(III)標(biāo)液氧化前后的梯度疊加譜圖由語(yǔ)圖可知未加&02氧化處理的試樣在AS3+的保留時(shí)間有峰出現(xiàn)；加入HA氧化處理的試樣在AS3+的保留時(shí)間未有峰出現(xiàn)，而在As5+的保留時(shí)間峰值增大，這說(shuō)明As(III)被HA氧化成As(V)，這樣就可以避開(kāi)和一未知有機(jī)砷(AsSl)的出峰接近造成相互千擾。圖4、海帶試樣在70'C水浴中浸提時(shí)間與砷形態(tài)變化圖它再次說(shuō)明①試樣經(jīng)50%HC1提取后As形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，隨著浸提時(shí)間的增加，砷糖(AsS,)降解轉(zhuǎn)化為小分子有機(jī)砷--二曱基砷(DMA)的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無(wú)機(jī)砷(iAs)的濃度，甚至達(dá)到了幾十倍的程度。②無(wú)機(jī)砷的峰形非常穩(wěn)定，證明有機(jī)砷不會(huì)隨浸提時(shí)間的增加而降解為無(wú)機(jī)砷。具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容水產(chǎn)品品種繁多，如貝類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、曱殼類(lèi)、頭足類(lèi)以及各種藻類(lèi)等；在其生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)砷的富集作用和機(jī)理各不相同，其體內(nèi)砷的含量和存在形式也相差很大，這給存在于不同生物體內(nèi)和藻類(lèi)中砷的測(cè)定提出了更高的要求，尤以藻類(lèi)為甚。因此，我們選擇水產(chǎn)品中最有代表性且爭(zhēng)議最大的藻類(lèi)作為驗(yàn)證的實(shí)施例。本發(fā)明為高效液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光謙聯(lián)用(HPLC-HGAFS)形態(tài)分析方法，包括1、選用的儀器及設(shè)備，2、配置試劑與標(biāo)準(zhǔn)溶液，3、進(jìn)行測(cè)試步驟，4、實(shí)驗(yàn)所用的儀器條件，5、結(jié)果計(jì)算。實(shí)施例1:海帶中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定1.選用的儀器及設(shè)備HPLC-HGAFS聯(lián)用系統(tǒng)(1)、HPLC部分，使用LC-10ATVP高壓液相泵；配有100jiL定量環(huán)的7725i六通進(jìn)樣閥(Rheodyne，Cotati，CA，USA);配有相同材質(zhì)填料保護(hù)柱(25mmx2.3隱i.d，12-20jum)的PRP-XIOO(250mmx4.lmmi.d，10j_im)陰離子交4灸柱(Hamilton,Reno，NV);(2)、AFS-9130原子熒光光i瞽儀；配有激發(fā)光源高性能砷空心陰極燈；形態(tài)分析測(cè)量軟件(北京吉天儀器有限公司)；(3)、水浴恒溫振蕩器(上海和欣儀器儀表有限公司，型號(hào)SHA-C);(4)、砂芯過(guò)濾器(砂芯過(guò)濾裝置、型號(hào)SH/T0093);(5)、循環(huán)式真空泵(循環(huán)式真空泵、型號(hào)SHZ-D);(6)、酸度計(jì)(梅特勒-托力多儀器上海有限公司，型號(hào)DELTA320);(7)、數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有些公司，型號(hào)KQ-600DE);(8)、水系微孔濾膜(0.45jum);(9)、氬氣(純度>99.99%)。2、配置試劑與標(biāo)準(zhǔn)溶液；(1)、試劑；a、①、鹽酸溶液(50%):量取250mL濃鹽酸，慢慢加入25OmL水中，混勻；②、鹽酸溶液(7%):量取280mL鹽酸，慢慢加入3720mL水中，混勻。b、氫氧化鉀溶液(5g/L):稱(chēng)取氫氧化鉀5g溶于水中，并稀釋至1000mL。c、硼氫化鉀溶液(15g/L);稱(chēng)取硼氫化鉀15g溶于1000mL氬氧化鉀溶液(5g/L)中。d、HPLC流動(dòng)相為15mraol/L(NH》21^04溶液，pH用10%曱酸調(diào)節(jié)至6，使用之前需經(jīng)過(guò)0.45iam濾膜過(guò)濾并超聲脫氣。所有的試劑均是分析純或是優(yōu)級(jí)純，整個(gè)實(shí)驗(yàn)都使用超純水;玻璃儀器使用前需經(jīng)15%硝酸浸泡24h。(2)、砷的混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液CH3AsO(0Na)26H20(固A)和Na2HAs(h.7H2OAs(V)從Sigma-Aldrich購(gòu)得，(CH3)2As02H(DMA)從Acros購(gòu)得，1000pg/mL的As(III)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液從國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心購(gòu)得；a、通過(guò)溶解相應(yīng)量的畫(huà)A、DMA、As(V)得到100ng/ml的各單標(biāo)溶液；將As(III)也稀釋至100ng/mL(四種標(biāo)液可在4。C冰箱存放備用)；b、混合砷標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制(臨用時(shí)現(xiàn)配)將以上四種標(biāo)液逐級(jí)稀釋至100ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再根據(jù)下表1配制表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3、進(jìn)行測(cè)試步驟:取經(jīng)粉碎過(guò)40目篩的干海帶樣品2.0000g左右于50mL具塞刻度試管中，加鹽酸溶液(50%)20mL混勻，置70。C水浴恒溫振蕩器中l(wèi)h,使試樣充分浸提(見(jiàn)附圖4)。取出冷卻定容至25ml，脫脂棉過(guò)濾。取O.2mL上清液與10ml管中，加入3.4mLH20,0.4mLHA混勻后置70。C度水浴20min,使As(III)被氧化成As(V)，(見(jiàn)附圖3)。取出后用0.45微米的水系微孔濾膜過(guò)濾，取lQOjuL上機(jī)測(cè)定無(wú)機(jī)砷值。4、實(shí)驗(yàn)所用的儀器條件；(1)、液相色語(yǔ)條件(HPLC):流動(dòng)相15mmol/L(亂跳(pH6.0),流速lmL/min;進(jìn)才羊體積100juL;輔陰極46mA;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速65rpm;(2)、氫化物發(fā)生條件(HG):還原劑成分1.5%KBH4+0.5%KOH，流速6.0mL/min;載流成分7%HC1，流速6.0mL/min;(3)、原子熒光光鐠條件(AFS):燈高性能砷空心陰極燈，193.7rnn;負(fù)高壓285V;燈電流100mA;載氣氬氣，400mL/min;屏蔽氣氬氣，600mL/min。5、結(jié)果計(jì)算(1)、定性開(kāi)機(jī)后按上述條件進(jìn)行設(shè)置，待穩(wěn)定后，先做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)定處理好的樣品溶液。在上述液相色語(yǔ)和原子熒光條件下用進(jìn)樣針吸取O.3-0.5mL，采用手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行測(cè)定，用峰高或峰面積外標(biāo)法定量。在上述色譜條件下亞砷酸鹽As(III)、二曱基砷化合物(DMA)、一曱基砷化合物(固A)、砷酸鹽As(V)依次保留時(shí)間約為2.599min、3.221min、5.075min、8.994min。標(biāo)準(zhǔn)溶液的圖i普見(jiàn)附圖1;配制(見(jiàn)表1)、混合砷標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制；(2)、定量待測(cè)樣品中亞砷酸鹽As(ni)、二曱基砷化合物(DMA)、一曱基砷化合物(謝A)、砷酸鹽As(V)的色鐠峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比變化范圍在±5%之內(nèi)即認(rèn)為該待測(cè)定物質(zhì)。結(jié)果計(jì)算與表述用數(shù)據(jù)處理軟件中的外標(biāo)法，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，將標(biāo)準(zhǔn)工作曲線保存，然后將樣品峰分析處理，用外標(biāo)校正，即可得到待測(cè)溶液中的亞砷酸鹽As(in)、二曱基砷化合物(DMA)、一曱基砷化合物(MMA)、砷酸鹽As(V)的濃度，按式(1)計(jì)算可得試樣中待測(cè)物的含量X-CxVxF/mx1000..............................(1)式中X—樣品中待測(cè)物的含量，mg/kg;C—待測(cè)液中無(wú)機(jī)砷的濃度，ng/mL;m—稱(chēng)樣量，g;V—測(cè)定液體總體積，mL;F—稀釋倍數(shù)。6、結(jié)果與討論表2、儀器的分析性能<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表2可知該儀器的分析性能完全符合測(cè)定四種砷形態(tài)要求;表3、海帶加標(biāo)回收率的測(cè)定結(jié)果:測(cè)定元素本底測(cè)定值ng/mL加標(biāo)濃度ng/mL測(cè)定值ng組回收率％含量mg/KgAS(III)0.005046.993.80DMA13.7545057.5087.33.8醒A0.005050.28100.60As(V)2.22555051.1697.90.54由表3可知我們加標(biāo)的四種砷形態(tài)的回收率在87.3%--100.6°/。，回收效果非常理想。為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠我們采取的措施有①、樣品粉碎過(guò)40目篩這樣可使樣品均勻，浸提完全(見(jiàn)表3);②、對(duì)海帶我們選用(50%)的鹽酸溶液浸提它能使大分子量砷糖(AsS)完全分解，這樣不會(huì)對(duì)無(wú)^l砷的積峰造成干擾；可以使無(wú)機(jī)砷提取完全(見(jiàn)附圖3和表3);③、取O.2mL上清液與10ml管中，加3.4mLH20,0.4mLH2O2混勻后置70。C度水浴20min,取0.2mL上清液是為了降低酸度保護(hù)色語(yǔ)柱；加入O.4mLHA是使As(III)氧化成As(V),因?yàn)樵贏s(III)出峰時(shí)間附近有一個(gè)有機(jī)砷峰，這樣可以避免干擾(見(jiàn)附圖3和附圖4)。實(shí)施例2:對(duì)壞中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定稱(chēng)取試樣(需搗碎勻漿)3.OOOOg于50mL具塞刻度試管中，并加入10%鹽酸溶液20mL，混勻。置70。C水浴恒溫振蕩器中l(wèi)h，使試樣充分浸提。取出冷卻定容至25ml，脫脂棉過(guò)濾。取2mL上清液與10ml管中，加入1.6mLH20，0.4mLHA混勻后置70。C度水浴20min,取出后用0.45微米的水系微孔濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定無(wú)機(jī)砷值。其它條件均與海帶的相同，其對(duì)奸加標(biāo)回收率的測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)表4)。表4、對(duì)奸加標(biāo)回收率的測(cè)定結(jié)果(以鮮基計(jì))測(cè)定元素本底測(cè)定值ng/mL加標(biāo)濃度ng/mL觀'J定值ng/mL回收率％AS(III)0.0010095.8795.9■11.610095.8784.214<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由表4可知我們加標(biāo)的四種砷形態(tài)的回收率在84.2%--95.9°/。，回收效果非常理想。對(duì)對(duì)壞的前處理，我改用10%鹽酸溶液浸提，是因?yàn)樗拇蠓肿恿可樘?AsS)較低，用10%的鹽酸溶液浸提足可以使砷提取完全(見(jiàn)表4)。綜上所述，由表2可知該儀器的分析性能完全符合測(cè)定四種砷形態(tài)要求，由表3和表4可知我們加標(biāo)的四種砷形態(tài)的回收率在84.2%--100.6%，回收效果非常理想。這得益于我們選用的儀器及儀器條件、試劑濃度、試樣的前處理非常合理到位。該方法的亮點(diǎn)水產(chǎn)品中的無(wú)機(jī)砷用提取液提取后，通過(guò)陰離子交換色鐠柱，由于陰離子交換色i普柱對(duì)砷酸鹽As(V)、亞砷酸鹽As(III)、一曱基砷化合物(固A)、二曱基砷化合物(DMA)和砷糖(AsS)的吸附能力不同，流動(dòng)相將亞砷酸鹽As(III)、二曱基砷化合物(DMA)、一曱基砷化合物(畫(huà)A)、砷酸鹽As(V)依次洗脫，洗脫的溶液經(jīng)過(guò)硼氳化鉀還原劑和鹽酸發(fā)生氫化反應(yīng)，生成氫化物進(jìn)入原子化器，與原子熒光聯(lián)用進(jìn)行分析測(cè)定。因此要想準(zhǔn)確的測(cè)定水產(chǎn)品中的無(wú)機(jī)砷，必須使用高效液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光語(yǔ)聯(lián)用(HPLC-HGAFS)形態(tài)分析方法。這種方法除了能準(zhǔn)確測(cè)定中水產(chǎn)品的無(wú)機(jī)砷，還能準(zhǔn)確測(cè)定其中的固A和DMA,從而給出更為完整的生物學(xué)特性，特別是當(dāng)前海藻中的無(wú)機(jī)砷(iAs)測(cè)量已引起多方糾紛的情況下，采用更為清晰、準(zhǔn)確的HPLC-HGAFS聯(lián)用形態(tài)分析法是最佳首選。我們目前正承擔(dān)我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)一海藻產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定方法的制定，以填補(bǔ)國(guó)際上ISO和CAC標(biāo)準(zhǔn)中尚無(wú)測(cè)定水產(chǎn)中無(wú)機(jī)砷的方法標(biāo)準(zhǔn)這一空白。權(quán)利要求1.一種水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定方法，其特征在于它的方法為高效液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光譜HPLC-HGAFS聯(lián)用形態(tài)分析方法，包括(1)、選用的儀器及設(shè)備，(2)、配置試劑與標(biāo)準(zhǔn)溶液，(3)、進(jìn)行測(cè)試步驟，(4)、實(shí)驗(yàn)所用的儀器條件，(5)、結(jié)果計(jì)算；(1)、儀器及設(shè)備HPLC-HGAFS聯(lián)用系統(tǒng)；1)、HPLC部分，使用LC-10ATVP高壓液相泵；配有100μL定量環(huán)的7725i六通進(jìn)樣閥；配有相同材質(zhì)填料保護(hù)柱25mm×2.3mmi.d，12-20μm的PRP-X100250mm×4.1mmi.d，10μm陰離子交換柱2)、HGAFS-9130原子熒光光譜儀；配有激發(fā)光源高性能砷空心陰極燈；形態(tài)分析測(cè)量軟件3)、SHA-C水浴恒溫振蕩器；4)、SH/T0093砂芯過(guò)濾器；5)、SHZ-D循環(huán)式真空泵；6)、DELTA320酸度計(jì)；7)、KQ-600DE數(shù)控超聲清洗器；8)、0.45μm水系微孔濾膜；9)、氬氣純度≥99.99％(2)、配置試劑與標(biāo)準(zhǔn)溶液；1)、試劑；a、①、50％的鹽酸溶液，量取250mL濃鹽酸，慢慢加入250mL水中，混勻；②、7％的鹽酸溶液量取280mL鹽酸，慢慢加入3720mL水中，混勻b、5g/L的氫氧化鉀溶液稱(chēng)取氫氧化鉀5g溶于水中，并稀釋至1000mLc、15g/L的硼氫化鉀溶液；取硼氫化鉀15g溶于1000mL的5g/L氫氧化鉀溶液中d、HPLC流動(dòng)相為15mmol/L(NH4)2HPO4溶液，pH用10％甲酸調(diào)節(jié)至6，使用之前需經(jīng)過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾并超聲脫氣所有的試劑均是分析純或是優(yōu)級(jí)純，整個(gè)實(shí)驗(yàn)都使用超純水；玻璃儀器使用前需經(jīng)15％硝酸浸泡24h；2)、砷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液CH3AsO(ONa)2·6H2O(MMA)和Na2HAsO4·7H2OAs(v)，(CH3)2AsO2H(DMA)，1000μg/mL的As(III)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液a、通過(guò)溶解相應(yīng)量的MMA、DMA、As(V)得到100ppb/mL的各單標(biāo)溶液；將As(III)也稀釋至100ppb/mL，以上四種標(biāo)液可在4℃冰箱存放備用b、混合砷標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制，臨用時(shí)現(xiàn)配將以上四種標(biāo)液逐級(jí)稀釋至100mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再根據(jù)下表1配制表1<table-cwuid="table1"><tablewidth="741"><tgroupcols="6"><thead></column></row><row><column><entrycolwidth="11%"morerows="1"morelines="1"><p>序號(hào)</p></entry><entrycolwidth="13%"morerows="1"morelines="1"><p>濃度mg/mL</p></entry><entrycolwidth="13%"morerows="1"morelines="1"><p>定容體積/mL</p></entry><entrycolwidth="15%"morerows="1"morelines="1"><p>加入水體積/mL</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>加入10％HCl體積/mL</p></entry><entrycolwidth="31%"morerows="1"morelines="1"><p>加入100mg/mL四種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL</p></entry></column></row></thead><tbody></column></row><row><column><entrycolwidth="11%"morerows="1"morelines="1"><p>1</p></entry><entrycolwidth="13%"morerows="1"morelines="1"><p>5</p></entry><entrycolwidth="13%"morerows="1"morelines="1"><p>10</p></entry><entrycolwidth="15%"morerows="1"morelines="1"><p>7.0</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>2.5</p></entry><entrycolwidth="31%"morerows="1"morelines="1"><p>0.5</p></entry></column></row></column></row><row><column><entrycolwidth="11%"morerows="1"morelines="1"><p>2</p></entry><entrycolwidth="13%"morerows="1"morelines="1"><p>20</p></entry><entrycolwidth="13%"morerows="1"morelines="1"><p>10</p></entry><entrycolwidth="15%"morerows="1"morelines="1"><p>4.5</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>2.5</p></entry><entrycolwidth="31%"morerows="1"morelines="1"><p>2.0</p></entry></column></row></column></row><row><column><entrycolwidth="11%"morerows="1"morelines="1"><p>3</p></entry><entrycolwidth="13%"morerows="1"morelines="1"><p>50</p></entry><entrycolwidth="13%"morerows="1"morelines="1"><p>10</p></entry><entrycolwidth="15%"morerows="1"morelines="1"><p>2.5</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>2.5</p></entry><entrycolwidth="31%"morerows="1"morelines="1"><p>5.0</p></entry></column></row></column></row><row><column><entrycolwidth="11%"morerows="1"morelines="1"><p>4</p></entry><entrycolwidth="13%"morerows="1"morelines="1"><p>75</p></entry><entrycolwidth="13%"morerows="1"morelines="1"><p>10</p></entry><entrycolwidth="15%"morerows="1"morelines="1"><p>/</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>2.5</p></entry><entrycolwidth="31%"morerows="1"morelines="1"><p>7.5</p></entry></column></row></tbody></tgroup></column></row><table></table-cwu>(3)、進(jìn)行測(cè)試步驟取經(jīng)粉碎過(guò)40目篩的水產(chǎn)品干樣0.300g-3.000g于50mL具塞刻度試管中，加50％鹽酸的溶液20mL混勻，或取搗碎勻漿鮮樣2.000g-5.000g于50mL具塞刻度試管中，并用鹽酸(50％)溶液定容至25mL，混勻；至70℃水浴搖床1h，使試樣充分浸提；取出冷卻定容至25ml，脫脂棉過(guò)濾；取0.2mL上清液加入10ml管中；加入3.4mLH2O；0.4mLH2O2混勻后在70℃度水浴放置20min，使As(III)氧化成As(V)；取出后用0.45微米的水系微孔濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定無(wú)機(jī)砷值(4)、實(shí)驗(yàn)所用的儀器條件；1)、HPLC液相色譜條件流動(dòng)相15mmol/L(NH4)2HPO4(pH6.0)，流速1mL/min；進(jìn)樣體積100μL；輔陰極46mA；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速65rpm；2)、HG氫化物發(fā)生條件還原劑成分1.5％KBH4+0.5％KOH，流速6.0mL/min；載流成分7％HCl，流速6.0mL/min；3)、AFS原子熒光光譜條件燈高性能砷空心陰極燈，193.7nm；負(fù)高壓285V；燈電流100mA；載氣氬氣，400mL/min；屏蔽氣氬氣，600mL/min；(5)、結(jié)果計(jì)算1)、定性開(kāi)機(jī)后按上述條件進(jìn)行設(shè)置，待穩(wěn)定后，先做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)定處理好的樣品溶液；在上述液相色譜和原子熒光條件下用進(jìn)樣針吸取0.3-0.5mL，采用手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行測(cè)定，用峰高或峰面積外標(biāo)法定量；在上述色譜條件下亞砷酸鹽As(III)、二甲基砷化合物DMA、一甲基砷化合物MMA、砷酸鹽As(V)依次保留時(shí)間約為2.599min、3.221min、5.075min、8.994min；2)、定量待測(cè)樣品中亞砷酸鹽As(III)、二甲基砷化合物DMA、一甲基砷化合物MMA、砷酸鹽As(V)的色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比變化范圍在±5％之內(nèi)即認(rèn)為該待測(cè)定物質(zhì)；結(jié)果計(jì)算與表述用數(shù)據(jù)處理軟件中的外標(biāo)法，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，將標(biāo)準(zhǔn)工作曲線保存，然后將樣品峰分析處理，用外標(biāo)校正，即可得到待測(cè)溶液中的亞砷酸鹽As(III)、二甲基砷化合物DMA、一甲基砷化合物MMA、砷酸鹽As(V)的濃度，按下面式(1)計(jì)算，可得試樣中待測(cè)物的含量X＝C×V×F/m×1000………………(1)式中X-樣品中待測(cè)物的含量，mg/kg；C-待測(cè)液中無(wú)機(jī)砷的濃度，ng/ml；m-稱(chēng)樣量，g；V-測(cè)定液體總體積，mL；F-稀釋倍數(shù)。全文摘要一種水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定方法，水產(chǎn)品中的無(wú)機(jī)砷用(1+1)的鹽酸溶液提取后，通過(guò)陰離子交換色譜柱，由流動(dòng)相將亞砷酸鹽As(III)、二甲基砷化合物DMA、一甲基砷化合物MMA、砷酸鹽As(V)依次洗脫，由于陰離子交換色譜柱對(duì)砷酸鹽As(V)、亞砷酸鹽As(III)、一甲基砷化合物MMA、二甲基砷化合物DMA和砷糖AsS的吸附能力不同，洗脫的溶液經(jīng)過(guò)硼氫化鉀還原劑和鹽酸發(fā)生氫化反應(yīng)，生成氫化物進(jìn)入原子化器，與原子熒光聯(lián)用進(jìn)行分析測(cè)定；該實(shí)驗(yàn)條件選擇合理，檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，不受浸提時(shí)間和溫度影響；本發(fā)明既能準(zhǔn)確測(cè)無(wú)機(jī)砷iAs，同時(shí)也能測(cè)定有機(jī)砷一甲基砷化合物MMA和二甲基砷化合物DMA，可以應(yīng)用于水產(chǎn)品中砷的形態(tài)測(cè)定。文檔編號(hào)G01N30/88GK101261258SQ200810013738公開(kāi)日2008年9月10日申請(qǐng)日期2008年1月4日優(yōu)先權(quán)日2008年1月4日發(fā)明者冷凱良,寧勁松,尚德榮,王聯(lián)珠,翟毓秀申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所