專利名稱：一種海參及海參制品中海參多糖含量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大分子化合物的測(cè)定方法，特別是涉及一種海參 及海參制品中海參多糖含量的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
海參多糖是海參中一種重要的活性成分。海參中多糖類化合物結(jié) 構(gòu)復(fù)雜，且因海參種類和生長(zhǎng)環(huán)境的不同而有差別。不同種類海參中
的多糖結(jié)構(gòu)不同，而同種海參中海參巖藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)和海 參硫酸軟骨素(SC-CHS)的含量也不盡相同。另外，海參中還含有大 量的蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、微量元素等復(fù)雜成分，這必然會(huì)給海參中 總多糖的測(cè)定帶來(lái)很多困難。
目前已有關(guān)于海參中多糖含量測(cè)定方法的報(bào)道，如申請(qǐng)?zhí)枮?200410036250.7的"測(cè)定海參多糖含量的方法"，該方法對(duì)干海參樣 品經(jīng)堿溶，超聲提取，二次醇沉等步驟，最后將樣品干燥至恒重后測(cè) 得多糖含量，但該方法對(duì)目標(biāo)測(cè)定物的選擇性不強(qiáng)，樣品中的雜質(zhì)如 鹽、微量元素、蛋白質(zhì)等成分易引起較大的測(cè)定誤差，且不適合海參 制品中海參多糖含量的測(cè)定；申請(qǐng)?zhí)枮?00410048001的"測(cè)定盧薈多 糖的新方竭"采用了分光光度法測(cè)定蘆薈多糖，具有較好的重復(fù)性和 精密度，然而因?yàn)楹⒍嗵侵泻衅咸烟侨┧岷桶被牵谠摲椒ㄖ?不顯色，所以也不適合海參多糖含量的測(cè)定；近年來(lái)以高效液相為基 礎(chǔ)的海參多糖的定量方法發(fā)展較快，如申請(qǐng)?zhí)枮?00410052907.9的 "一種多糖定量檢測(cè)方法與系統(tǒng)"，該方法靈敏準(zhǔn)確，但對(duì)設(shè)備要求較 高，而且該方法通常適用于以中性糖含量為主的多糖，海參多糖中的 含有較高含量的糖醛酸和氨基糖，用該方法不能夠柱后顯色。另外， 海參多糖中兩種糖的種間差異大，無(wú)法確定具體以何種多糖作為標(biāo)準(zhǔn) 品進(jìn)行分光光度或者液相色譜測(cè)定。隨著人們生活水平的提高，與海 參相關(guān)的食品、保健品和藥品日益成為市場(chǎng)消費(fèi)的熱點(diǎn)和主流。海參 多糖作為主要的活性成分，其含量對(duì)其食用及藥用價(jià)值影響很大，是 不可或缺的海參營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)指標(biāo)。因此迫切需要建立一種簡(jiǎn)便可信的海 參多糖測(cè)定方法。而市面上目前的海參制品品種復(fù)雜，因此采用簡(jiǎn)單 的分光光度法或稱重法很難滿足以海參多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)建立海參制品 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種海參及海參制品中海參多糖含量的測(cè)定 方法，它無(wú)需復(fù)雜的前處理，取樣少、簡(jiǎn)便、靈敏、快速、準(zhǔn)確，能 滿足以海參多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)建立海參制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。
一種海參及海參制品中海參多糖含量的測(cè)定方法，其特征在于 (l)取海參或海參制品，用蛋白酶于緩沖業(yè)液中酶解，將酶解液離心， 取上清液用2-5倍體積的乙醇使海參多糖沉淀，離心，所得沉淀用水
溶解后定容至l-100ml; (2)取O.l-lml所得水溶液，加入等體積 0.5-6mol/L的三氟乙酸水溶液，氮?dú)夥夤埽?00-120。C下水解1-12h; 將所得水解液吹干和/或加堿中和，用水定容至0.1-10ml，過(guò)濾，作為 供試液；(3)精確稱取巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，配成濃度為0.01mmol/L-lmmol/L 呈梯度的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)水溶液；(4)分別精密吸取相同體積的上述多個(gè)標(biāo) 準(zhǔn)水溶液，分別加入0. 1-0.5mol/L的NaOH水溶液和等體積的1_苯 基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生試劑，50-70"C下水浴衍生0.2-2h，冷卻， 用酸的水溶液中和至中性，用氯仿萃取，吸棄下層，重復(fù)萃取2-6次， 將水層過(guò)濾，進(jìn)行液相色譜分析，得到分離譜圖，以所得譜圖中巖藻 糖的峰面積對(duì)巖藻糖的濃度進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程；(5)取上 述供試液進(jìn)行衍生和液相色譜分析，以巖藻糖衍生物的峰面積代入上 述回歸方程中，求出樣品中巖藻糖的含量；將巖藻糖的含量乘以轉(zhuǎn)化 系數(shù)即得海參樣品中海參多糖的含量。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)操作簡(jiǎn)便，只需對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的粗提取 等預(yù)處理，便可以直接經(jīng)過(guò)酶解進(jìn)行水解。(2)靈敏度高，巖藻糖衍 生物在250nm有很強(qiáng)的吸收，檢測(cè)限可以達(dá)到0.37 y M。 (3)取樣少， 所需海參樣品可小于0.01克干重。(4)適用范圍，可同時(shí)應(yīng)用于固態(tài)、 液態(tài)等多種海參制品中海參多糖含量的測(cè)定。(5)檢測(cè)時(shí)間短，單個(gè) 測(cè)定耗時(shí)僅為3h左右；由于可同時(shí)進(jìn)行水解、衍生等步驟，因此也適 用于大批量測(cè)定。(6)穩(wěn)定性好，24小時(shí)內(nèi)巖藻糖衍生物峰面積穩(wěn)定， RSD〈2.5%。 (7)本方法可同時(shí)測(cè)定海參制品中葡萄糖醛酸的含量，可 同時(shí)用于鑒定海參制品中的實(shí)際添加海參樣品量。


附圖1為單糖標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜分離圖。
附圖2為刺參粗多糖的單糖組成分析圖。
附圖3為海參肽中海參多糖的單糖組成液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1海參肽中多糖含量的測(cè)定 (1)精確稱取樣品A海參肽6g，研細(xì)，加入30ml的濃度為0.05M/L、 pH為6的醋酸鈉緩沖液和100mg的木瓜蛋白酶，于37。C反應(yīng)24h后， 離心，取上清液并加入2倍體積的乙醇，使酶解后產(chǎn)生的海參多糖沉淀，離心所得沉淀用水溶解后定容至3ml;
(2) 取0. 5ml所得的液體加入等體積2mol/L的三氟乙酸(TFA)水 溶液于12(TC水解2小時(shí)，將所得水解液以氮?dú)獯蹈桑設(shè). 3M氫氧化 鈉水溶液中和，用水定容至2ml后作為樣品供試液。
(3) 精確稱取巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品用水配成lmmol/L的水溶液作為儲(chǔ)備液。 進(jìn)一步依次稀釋成0. 01mmol/L、 0. 05mmol/L、 0. lmmol/L、 0. 2mmol/L、 0.4mmol/L、 0. 6mmol/L、 0. 8mmol/L和1. 0mmol/L的8個(gè)濃度梯度的 標(biāo)準(zhǔn)水溶液。
(4) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的衍生分別吸取上述濃度的標(biāo)準(zhǔn)水溶液各250u L， 分別加入濃度為0. 5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液 250 uL和等體積的0.3mol/L的氫氧化鈉水溶液，70°C衍生反應(yīng) 30min，冷卻10min,用0.3mol/L鹽酸中和至中性；加入lmL氯仿萃 取，充分震蕩，吸棄下層，重復(fù)萃取3次，水層過(guò)濾后作高效液相色譜分 析。
液相色譜分離和所得工作曲線Z0RBAX Eclipse XDB-C18型色譜 柱；流動(dòng)相采用梯度洗脫模式，流動(dòng)相采用乙腈-0. 05mol/L磷酸二氫 鉀緩沖溶液，30分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)從15%-40%的乙腈梯度；溫度25。C;流 速1 mL / min，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。上述8個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)水溶液的 衍生液經(jīng)液相色譜分析，得到巖藻糖的出峰時(shí)間為22.5min，以巖藻 糖峰面積對(duì)巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程y = 9675x + 9.0095(R2 = 0.9986)，其中x為巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，y 為巖藻糖峰面積。
(5) 樣品測(cè)定吸取供試液250iiL，按步驟(4)進(jìn)行衍生反應(yīng)和液 相色譜分析，將巖藻糖峰面積帶入工作曲線算得樣品中巖藻糖的含量， 再乘以轉(zhuǎn)化系數(shù)，得樣品A中海參多糖含量。所測(cè)巖藻糖的峰面積為 1230，帶入工作曲線計(jì)算表明，樣品A中巖藻糖含量為5.12 mg/g， 由于該樣品為剌參制品，所以轉(zhuǎn)化系數(shù)為7.01。測(cè)定結(jié)果為樣品A中 含海參多糖35.89 mg/g。
實(shí)施例2 干刺參中海參多糖含量的測(cè)定
(1) 精確稱取市售干參(刺參)樣品B10g，加入60ml的濃度為 0.05M/L、 pH為7.5的醋酸鈉緩沖液和lg胰蛋白酶于60'C酶解24小 時(shí)，將所得酶解液離心后，采用3倍體積的乙醇，使所得上清液中的 海參多糖沉淀，所得沉淀定容至5ml。
(2) 取0.5ml上述液體，加入等體積的6mol/LTFA，氮?dú)夥夤埽?10 'C下水解8h;水解液以氮?dú)獯蹈?，?. 5M氫氧化鈉中和，定容至100ml， 作為樣品供試液。(3) 取供試液250 u L,按實(shí)施例1中(3) — (5)步驟進(jìn)行衍生 和液相色譜分離，并得到相關(guān)的工作曲線y = 9675x + 9.0095 (R2 = 0.9986)。所測(cè)巖藻糖的峰面積為10000，帶入工作曲線計(jì)算表明，樣 品B中巖藻糖含量為8.41mg/ml，由于該種制品為刺參制品，所以轉(zhuǎn) 化系數(shù)為7.01，測(cè)定結(jié)果為樣品B中含海參多糖59.11 mg/ml。
實(shí)施例3海參沖劑中海參多糖含量的測(cè)定
(1) 取海參沖劑樣品C和海參沖劑樣品D各lg，加入60ml的濃度 為0.05M/L、 pH為6.5的醋酸鉀緩沖液加lmg木瓜蛋白酶酶解，將所 得酶解液離心后，采用2倍體積的乙醇，使所得上清液中的海參多糖 沉淀，離心，沉淀定容至lOOml。
(2) 取0.5ml上述液體，加入等體積的lmol/L三氟乙酸，氮?dú)夥夤埽?ll(TC下水解lh;水解液以氮?dú)獯蹈?，?.3M氫氧化鈉中和，定容至 2ml為樣品供試液。
取供試液250 u L，按實(shí)施案1中(3) — (5)步驟進(jìn)行衍生和液 相色譜分離，并得到相關(guān)的工作曲線y = 9675x + 9. 0095 (R2 = 0. 9986)。 所測(cè)巖藻糖的峰面積為865和725，帶入工作曲線計(jì)算結(jié)果表明，海 參沖劑樣品C中巖藻糖含量為0.806 mg/g，樣品D中巖藻糖含量為 0.687 mg/g，由于該兩種樣品均為刺參制品，所以轉(zhuǎn)化系數(shù)為7.01。 測(cè)定結(jié)果為海參沖劑樣品C中含海參多糖5.654 mg/g， 海參沖劑樣 品D中含海參多糖4.819 mg/g。 實(shí)施例4海參牛奶中海參多糖含量的測(cè)定
(1) 精確量取樣品E海參牛奶60ml，加入等體積0.3MNaAc緩沖 溶液(pH6.0)于60"C木瓜酶解24h，將所得酶解液離心后，采用2 倍體積的乙醇，使所得上清液中的海參多糖沉淀，離心，所得沉淀定 容至100ml;
(2) 取0.5ml上述液體，加入等體積的6mol/L三氟乙酸溶液置于 IO(TC水解I小時(shí)，水解液以氮?dú)獯蹈桑?. 3M氫氧化鈉水中和，定 容至一定體積后作為樣品供試液。
(3) 取供試液250 u L，按實(shí)施案例中(2) — (6)步驟進(jìn)行衍生和 液相色譜分離，并得到相關(guān)的工作曲線y = 9675x + 9.0095(R2 = 0.9986)。計(jì)算結(jié)果表明，樣品E巖藻糖含量為0.705mg/100ml，該樣 品為剌參制品。因此樣品E中多糖含量為4.95mg/100ml。
同種海參多糖中的巖藻糖含量一定，因此同種海參中的多糖含量 和巖藻糖含量之間存在固定的轉(zhuǎn)換系數(shù)，能夠直接以巖藻糖的含量來(lái) 比較和評(píng)價(jià)其中的海參總多糖的含量。按Marao等人的方法提取的海 參多糖，轉(zhuǎn)化系數(shù)為100/PMP測(cè)定海參多糖中巖藻糖百分含量。對(duì)己知海參品種可以按照提取后的多糖中的巖藻糖含量，以其倒數(shù)算得轉(zhuǎn)
化系數(shù)，如日本刺參多糖(^^W/c/zo/7ws /apom'cws)中巖藻糖的含量 為14.26%,其轉(zhuǎn)換系數(shù)可算得為7.01;墨西哥肉參(Zso^/c/zopw /mcw)中巖藻糖含量為18. 26%，其轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.47。
本法除了使用實(shí)施例中說(shuō)明的樣品外，同樣適用于海參酒、海參 原漿等海參水解樣品，且無(wú)需酶解這一步驟，直接采用一定體積沉淀， 其它步驟如衍生和液相色譜分離同實(shí)施例1即可。
本發(fā)明所述蛋白酶為海參或海參制品干重的0.1%-10%。所述的 蛋白酶為木瓜蛋白酶胰蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶。所述的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生試劑的濃度為0.卜O. 5mol/L甲醇溶液。 所述的轉(zhuǎn)化系數(shù)為1/所測(cè)海參或海參制品中海參多糖所含的巖藻糖 百分含量。
權(quán)利要求
1. 一種海參及海參制品中海參多糖含量的測(cè)定方法，其特征在于(1)取海參或海參制品，用蛋白酶于緩沖業(yè)液中酶解，將酶解液離心，取上清液用2-5倍體積的乙醇使海參多糖沉淀，離心，所得沉淀用水溶解后定容至1-100ml；(2)取0.1-1ml所得水溶液，加入等體積0.5-6mol/L的三氟乙酸水溶液，氮?dú)夥夤?，?00-120℃下水解1-12h；將所得水解液吹干和/或加堿中和，用水定容至0.1-10ml，過(guò)濾，作為供試液；(3)精確稱取巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，配成濃度為0.01mmol/L-1mmol/L呈梯度的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)水溶液；(4)分別精密吸取相同體積的上述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)水溶液，分別加入0.1-0.5mol/L的NaOH水溶液和等體積的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生試劑，50-70℃下水浴衍生0.2-2h，冷卻，用酸的水溶液中和至中性，用氯仿萃取，吸棄下層，重復(fù)萃取2-6次，將水層過(guò)濾，進(jìn)行液相色譜分析，得到分離譜圖，以所得譜圖中巖藻糖的峰面積對(duì)巖藻糖的濃度進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程；(5)取上述供試液進(jìn)行衍生和液相色譜分析，以巖藻糖衍生物的峰面積代入上述回歸方程中，求出樣品中巖藻糖的含量；將巖藻糖的含量乘以轉(zhuǎn)化系數(shù)即得海參樣品中海參多糖的含量。
2、 按權(quán)利要求1所述的海參及海參制品中海參多糖含量的測(cè)定方法，其特征在于所 用蛋白酶的重量為海參或海參制品干重的0.1%-10%。
3、 按權(quán)利要求1所述的海參及海參制品中海參多糖含量的測(cè)定方法，其特征在于所 述的蛋白酶為木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶。
4、 按權(quán)利要求1所述的海參及海參制品中海參多糖含量的測(cè)定方法，其特征在于所 述的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生試劑的濃度為0. 1-0. 5mol/L甲醇溶液。
5、 按權(quán)利要求書1所述的海參及海參制品中海參多糖含量的測(cè)定方法，其特征在于 所述的液相色譜分離的條件為色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18型；流動(dòng)相為 梯度洗脫模式，采用乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液，30分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)從15 %-40%的乙腈梯度，溫度25。Cj流速1 mL / min，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。
6、 按權(quán)利要求1所述的海參及海參制品中海參多糖含量的測(cè)定方法，其特征在于所 述的轉(zhuǎn)化系數(shù)為1/所測(cè)海參或海參制品中海參多糖所含的巖藻糖百分含量。
7、 按照權(quán)利要求書1所述的海參及海參制品中海參多糖含量的測(cè)定方法，其特征在 于所述的海參制品為海參粉、海參酶解肽、海參酒、海參牛奶、海參原漿或海參口 服液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海參及海參制品中海參多糖含量的測(cè)定方法，其特征在于先將海參及海參制品用蛋白酶酶解，采用醇沉分離出酶解產(chǎn)生的海參多糖，再用三氟乙酸水解制出供試液，配制巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生，所得衍生物經(jīng)高效液相色譜測(cè)定其中巖藻糖衍生物的峰面積，以巖藻糖為基準(zhǔn)計(jì)算得出樣品中海參制品中的海參多糖含量。本發(fā)明為各種海參及海參制品中海參多糖的測(cè)定提供了一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠的標(biāo)準(zhǔn)化定量分析方法。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101285826SQ20081001662
公開日2008年10月15日 申請(qǐng)日期2008年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者尹利昂, 常耀光, 杰 徐, 李兆杰, 平 董, 勇 薛, 薛長(zhǎng)湖, 陳士國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)