專利名稱：：人乳轉(zhuǎn)鐵蛋白及其檢測試劑盒在鼻咽癌診斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及乳轉(zhuǎn)鐵蛋白在鼻咽癌早期診斷中的應(yīng)用以及一種用于鼻咽癌早期診斷的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白檢測試劑盒。技術(shù)背景鼻咽癌(NasopharyngealCarcinoma,NPC)是我國南方常見的惡性腫瘤，為鼻咽粘膜上皮發(fā)生的癌腫，大多數(shù)為低分化鱗狀細(xì)胞癌，其惡性程度高，發(fā)病部位隱蔽，特別是在咽隱窩和鼻咽頂部者，早期癥狀不明顯，因而難以早期發(fā)現(xiàn)，誤診誤治率較高。鼻咽癌的五年生存率近年來一直徘徊在50~60%左右，而鼻咽癌早期確診病人五年生存率可達(dá)90%以上，因此對鼻咽癌進(jìn)行高危人群篩查和早期診斷，以便進(jìn)行早期治療，可顯著提高患者生存率，這一直是NPC臨床研究的重要課題。目前鼻咽癌的早期檢測方法有多種，包括EB病毒血清學(xué)標(biāo)記物、鼻咽癌相關(guān)腫瘤標(biāo)記物如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、細(xì)胞間黏附分子以及端粒酶等的檢測。雖然這些指標(biāo)的單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用為鼻咽癌的診斷提供了有用的信息，但它們均缺乏足夠的靈敏度和特異性。比如EB病毒不但與鼻咽癌的發(fā)生有關(guān)，而且與Burkitt淋巴瘤、上呼吸道的感染等密切相關(guān)，近來也有報(bào)導(dǎo)在各種T細(xì)胞淋巴瘤中檢測到EB病毒DNA，而且并非所有鼻咽癌的發(fā)生均與EB病毒相關(guān)，90X以上的人群在成年前都感染過EBV，在NPC患者血清中檢測到EBV也并不能證明EBV直接與NPC有關(guān)，鼻咽癌患者EB病毒抗體與病理診斷相比陽性符合率僅為72.6%~77.3%。因此，雖然EB病毒相關(guān)抗體滴度與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有很高的相關(guān)性，其檢測方法也有優(yōu)越性，但仍然只能作為一種相關(guān)指標(biāo)而起提示作用，不能用來作為鼻咽癌的確診指標(biāo)。如果缺少病理診斷，即使EB病毒相關(guān)抗體滴度再高，也難以作為實(shí)施放療和化療的依據(jù)。除了對晚期鼻咽癌的病理診斷外，目前尚沒有其他的早期、無創(chuàng)性檢查方法；即使是病理性診斷，也難以一次性取到病變組織，無法避免對微小病灶的多次有創(chuàng)性取樣。鼻咽癌非典型病灶型或粘膜下型的病例雖經(jīng)多次活檢，常因無病理切片陽性結(jié)果而延誤治療；對于放療后的病例，當(dāng)其鼻咽癌組織表現(xiàn)不典型時(shí)，在判斷其病變是復(fù)發(fā)還是放療反應(yīng)上，也左右為難，尤其是某些放療后出現(xiàn)顱腦癥狀的患者，各項(xiàng)檢查(包括病理檢查)都很難準(zhǔn)確判斷到底是放射性腦病還是病灶向顱內(nèi)發(fā)展，極大的影響治療決策。因此，如果能建立一種能對鼻咽癌患者進(jìn)行篩查、診斷的無創(chuàng)性檢査方法，則對鼻咽癌的早期篩查、診斷、預(yù)防及治療均具有極其重大的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于通過研究證實(shí)人乳轉(zhuǎn)鐵蛋白LTF基因在鼻咽癌組織中特異表達(dá)下調(diào)，從而提出乳轉(zhuǎn)鐵蛋白LTF可用于鼻咽癌診斷、篩查和患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的用途。本發(fā)明的另一的在于提出人乳轉(zhuǎn)鐵蛋白ELISA檢測試劑盒在鼻咽癌的早期診斷、篩查和患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的應(yīng)用，以解決目前對鼻咽癌沒有靈敏有效的早期、無創(chuàng)性檢査方法的問題。經(jīng)過多年的研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)鼻咽癌特異表達(dá)下調(diào)基因LTF(lactotransferrin，基因存取號NM—002343;GI:54607119),并證明該基因編碼一種分泌性蛋白，能在正常人鼻咽分泌物中檢測出，但在鼻咽癌患者鼻咽分泌物中表達(dá)下調(diào)或缺失。發(fā)明人通過對經(jīng)顯微切割純化的人正常鼻咽粘膜上皮和各個(gè)臨床分期的鼻咽癌活檢組織，進(jìn)行全基因組基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)人乳轉(zhuǎn)鐵蛋白基因是在正常鼻咽上皮和鼻咽癌組織中表達(dá)差異最明顯的基因(p〈9.28X10—11)。經(jīng)組織微陣列大樣本驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)所有的正常鼻咽部腺體均能檢測到LTF蛋白的存在，證實(shí)LTF蛋白在鼻咽部高表達(dá)、且為細(xì)胞分泌性蛋白，但不論在mRNA水平或者蛋白水平，LTF的表達(dá)在鼻咽癌活檢標(biāo)本或病理切片中均顯著下調(diào)或缺失。此外，LTF蛋白的表達(dá)與鼻咽癌臨床分期存在顯著相關(guān)性(p<0.01)，臨床I期和II期鼻咽癌中LTF蛋白的表達(dá)明顯高于臨床in和IV期。另外LTF還與鼻咽癌轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(p〈0.05)，提示LTF它與鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移和臨床進(jìn)展有關(guān)，可作為鼻咽癌侵襲、轉(zhuǎn)移和臨床進(jìn)展預(yù)測的分子靶標(biāo)。發(fā)明人進(jìn)一步的研究表明，正常人群的鼻咽分泌物中LTF蛋白濃度大約為30~165ug/ml，而鼻咽癌患者的鼻咽分泌物中LTF蛋白濃度小于10ug/ml。發(fā)明人在上述研究基礎(chǔ)上，制備了抗人LTF的抗體，進(jìn)一步經(jīng)雙抗夾心法制備LTF蛋白的ELISA檢測試劑盒。本發(fā)明用于鼻咽癌早期診斷的人乳轉(zhuǎn)鐵蛋白ELISA檢測劑盒包括兔抗人LTF多抗包被好的酶標(biāo)板，鼠抗人LTF多肽單抗，辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)標(biāo)記二抗，通用試劑Tween—20和顯色底物如鄰苯二胺(ortho-phenylenediamine-Hcl，OPD)等。該試劑盒的酶標(biāo)板孔內(nèi)為經(jīng)包被液處理和阻滯液處理的兔抗人LTF融合蛋白抗體；試劑盒酶標(biāo)板孔內(nèi)LTF融合蛋白抗體的濃度以2ug/ml最為合適。用本發(fā)明制備的LTF蛋白的ELISA檢測試劑盒，從鼻咽部取分泌物進(jìn)行ELISA檢測，可以定量檢測各人群鼻咽分泌物中LTF蛋白表達(dá)量，從而預(yù)測鼻咽癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，篩査易感者，并對鼻咽癌患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。研究結(jié)果表明該試劑盒能檢測出0.01ug/mlLTF蛋白的濃度，這說明本發(fā)明的試劑盒具有較高的靈敏度；該試劑盒對門診初診病人的診斷與病理結(jié)果一致，且檢測快速，對被檢者不造成損傷，病人及正常人均可接受。因而，該試劑盒不但可用于鼻咽癌的早期診斷，而且適用于鼻咽癌的早期大規(guī)模人群篩査與患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測，為鼻咽癌的早期診斷與防治提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，具有極大的經(jīng)濟(jì)與社會價(jià)值。另外發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)LTF的表達(dá)量和鼻咽癌患者的臨床分期及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此，本發(fā)明的ELISA檢測試劑盒還可作為鼻咽癌預(yù)后預(yù)測的指標(biāo)。圖1:免疫組織化學(xué)方法檢測LTF在正常鼻咽上皮標(biāo)本中的表達(dá)結(jié)果圖；圖2:免疫組織化學(xué)方法檢測LTF在鼻咽癌活檢標(biāo)本中的表達(dá)結(jié)果圖；圖3:WesternBlot檢測LTF在正常鼻咽分泌物和鼻咽癌患者鼻咽分泌物中的表達(dá)結(jié)果；圖4:對本發(fā)明試劑盒特異性檢測的結(jié)果。具體實(shí)施方式前期研究中，發(fā)明人利用18個(gè)湖南鼻咽癌高發(fā)家系，通過連鎖分析，首次發(fā)現(xiàn)染色體3p21部分區(qū)域與鼻咽癌發(fā)病緊密連鎖，經(jīng)單倍型分析和精細(xì)定位，將鼻咽癌易感基因區(qū)域定位于微衛(wèi)星標(biāo)記D3S1289-D3S1298之間。此結(jié)果提示染色體3p21區(qū)域可能存在鼻咽癌的候選易感基因。為了篩査與鑒定染色體3p21區(qū)域鼻咽癌的候選易感基因，發(fā)明人制備了兩種不同的基因芯片，一種是基于鼻咽癌抑制消減雜交文庫的cDNAMicroArray，另一種是包含染色體3p21區(qū)域(D3S1289-D3S1298)288個(gè)基因的專制芯片。為提高芯片篩查結(jié)果的可靠性，用兩種不同的基因芯片對相同的試驗(yàn)樣本進(jìn)行研究。首先，以4個(gè)鼻咽癌相關(guān)的抑制消減雜交文庫(NNTDH12、TRP19DHNE1、TNPCDNN119和TNN119DNPC)為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增點(diǎn)制cDNA芯片所需的克隆，每個(gè)文庫約300個(gè)、總共1200余個(gè)克隆，克隆純化后點(diǎn)制基于鼻咽癌抑制消減雜交文庫的cDNAMicroArray。10例鼻咽慢性炎癥組織和19例鼻咽癌組織標(biāo)本以及3例鼻咽癌細(xì)胞樣本與定制好的cDNA芯片雜交，基本數(shù)據(jù)利用GenepixPro3.0(AxonInstruments)來收集和基礎(chǔ)處理。數(shù)據(jù)分析前，去掉芯片中的污點(diǎn)/壞點(diǎn)。為降低由于低表達(dá)基因點(diǎn)所造成的實(shí)驗(yàn)偏倚，只選擇Cy5和Cy3信號值皆大于200的基因點(diǎn)，并對符合條件基因點(diǎn)的信號值進(jìn)行均一化處理。經(jīng)過上述處理后，共獲得1097個(gè)有效克隆信號值。對上述已預(yù)處理的芯片雜交數(shù)據(jù)，挑取在所有樣本中存在>85%的信號值的克隆作進(jìn)一步分析，898個(gè)(898/1097)克隆通過濾過。使用Euclideandistanceandaveragelinkageclustering方法，對每個(gè)樣本和每個(gè)基因取平均值和均化處理，然后Hierarchicalclustering聚類。聚類結(jié)果顯示898個(gè)克隆能夠把鼻咽慢性炎癥組織和鼻咽腫瘤組織很清晰的分為兩大類，T01—F，T01—S作為兩重復(fù)樣本聚在一起，N8，N9和N10樣本因均為鼻咽慢性炎癥上皮，聚為一小束，再與其他正常鼻咽上皮聚類；三種鼻咽癌細(xì)胞系C1，C2和C3聚在一起，再與其他鼻咽癌組織樣本聚為一大類。發(fā)明人進(jìn)一步利用Genesis軟件的ANOVA功能(選擇p<0.001為統(tǒng)計(jì)差異標(biāo)準(zhǔn))對898個(gè)克隆進(jìn)行了篩選，其中105個(gè)克隆滿足要求。利用105個(gè)差異表達(dá)克隆進(jìn)行Hierarchicalclustering聚類。聚類結(jié)果表明105個(gè)克隆仍然能夠很好地把鼻咽慢性炎癥組織和鼻咽腫瘤組織很清晰的分為兩大類，T01_F，T01—S作為兩重復(fù)樣本聚在一起，N8，N9和N10樣本因均為鼻咽慢性炎癥上皮，先聚為一小類，再與其他正常鼻咽上皮聚類；三種鼻咽癌細(xì)胞系C1，C2和C3聚在一起，再與其他鼻咽癌組織樣本進(jìn)行聚類，說明該105個(gè)克隆能夠達(dá)到898個(gè)克隆相同的檢驗(yàn)效能。為進(jìn)一步鑒定上述105個(gè)差異表達(dá)克隆，利用PCR方法擴(kuò)增出相應(yīng)的克隆片段，然后將PCR產(chǎn)物純化后測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。通過同源比對，篩查到包括染色體3p21鼻咽癌易感基因區(qū)LTF基因在內(nèi)的32個(gè)鼻咽癌差異表達(dá)基因。此外，利用包含染色體3p21區(qū)域288個(gè)基因的專制芯片對上述相同的實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在3p21區(qū)域288個(gè)基因中，4個(gè)基因在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)，其中之一為乳轉(zhuǎn)鐵蛋白LTF。綜合分析兩組結(jié)果，發(fā)現(xiàn)LTF基因在兩種基因芯片中得到相同的表達(dá)變化——在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào)。為了驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性，發(fā)明人利用real-timequantitativeRT-PCR技術(shù)，選擇LTF基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果與芯片結(jié)果一致，說明芯片結(jié)果可靠。為了在大樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證基因芯片篩查出來的差異表達(dá)基因，發(fā)明人利用組織微陣列芯片(TMA)和免疫組織化學(xué)技術(shù)對LTF基因蛋白水平的表達(dá)情況在較大樣本中進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)LTF在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)(參見附圖2)，在正常鼻咽組織(參見附圖1)、鼻咽癌癌旁和鼻咽慢性炎癥組織中存在高表達(dá)。幾乎所有的鼻咽部腺體均能檢測到LTF蛋白的存在，證實(shí)LTF蛋白在腺體中高表達(dá)，為一細(xì)胞分泌性蛋白。此外，LTF蛋白的表達(dá)與鼻咽癌轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(p<0.05)。LTF蛋白的表達(dá)與鼻咽癌臨床分期存在顯著相關(guān)性(p<0.01)。臨床I期和II期鼻咽癌中LTF蛋白的表達(dá)明顯高于臨床m和IV期(P<0.01)。提示它可能與鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移和臨床進(jìn)展有關(guān)，為鼻咽癌候選易感基因，可作為鼻咽癌侵襲、轉(zhuǎn)移和臨床進(jìn)展預(yù)測的分子靶標(biāo)。實(shí)施例l:制備LTF的ELISA試劑盒(一)LTF抗體的制備1.制備鼠抗人LTF蛋白的多肽抗體(1)將LTF的氨基酸序列輸入DNAStar軟件，得到該蛋白免疫原性最強(qiáng)的一段21個(gè)氨基酸的多肽，該多肽的序列為NYKSQQSSDPDPNCVDRPVEG，化學(xué)合成該多肽，將多肽與鑰戚血藍(lán)素(Keyholelimpethemocyanin,KLH)交聯(lián)以增加免疫原性。(2)將多肽溶于磷酸鹽緩沖液(PBS),注射小鼠，首次劑量為300ug/kg，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量的1/4左右。每23周加強(qiáng)免疫一次，共免疫4次，然后取鼠脾臟B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，在HAT培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，經(jīng)過克隆選擇，篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，繼續(xù)體外培養(yǎng)，大量制備單克隆抗體；2.制備兔抗人的LTF融合蛋白抗體(1)PCR擴(kuò)增LTF基因的開放閱讀框序列，將其克隆至帶GST耙標(biāo)志的原核表達(dá)載體PGEX中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,于30匸下用異丙基-8-0-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)LTF-GST融合蛋白的表達(dá)，用發(fā)瑪西亞公司的GST蛋白純化試劑盒純化出LTF-GST融合蛋白，具體操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。(2)用該融合蛋白免疫新西蘭白兔，制備兔抗人LTF融合蛋白的抗體，獲得的抗血清用Pierce公司的親和層析純化試劑盒，具體步驟嚴(yán)格按Pierce公司的說明書進(jìn)行，純化出抗LTF的IgG，并用親和層析純化。3.LTF抗體的效價(jià)與特異性檢測(1)將合成的多肽用包被緩沖液(8.4克碳酸氫鈉、3.56克碳酸鈉溶于1升去離子水中，調(diào)pH值至9.05)溶解為10ug/ml，按100ul/孔，加到96孔酶標(biāo)板，(C過夜。(2)取出酶標(biāo)板，倒掉包被緩沖液，用含0.iy。Tween-20的PBS(PBST)沖洗3遍，加入200ul阻滯液(含1%牛血清蛋白的PBST)阻止非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37""C孵育1小時(shí)，PBST洗脫4次。(3)按1:500、1:1,000、1:10,000、1:100,000、1:1,000,000和1:10,000,000共7個(gè)稀釋度(稀釋液在1升去離子水中溶解80克氯化鈉，11.6克磷酸氫二鈉，2克磷酸二氫鈉，2克氯化鉀，調(diào)pH值至7.2)稀釋前面兩種LTF抗體，每種抗體個(gè)每稀釋濃度各取100ul加入前述己包被LTF多肽的酶標(biāo)板孔內(nèi)。37。C孵育l小時(shí)，PBST洗4次。(4)加入HRP標(biāo)記的二抗，37'C孵育30分鐘，PBST洗4次。(5)混合6ml鄰苯二胺(ortho-phenylenediamine-Hcl,OPD)試齊lJA與6mlOPD試劑B，100ul/孔加入96孔板，室溫避光孵育20分鐘，可見抗體檢測陽性的孔呈橙色，制備的抗體的效價(jià)可達(dá)l:l，OOO，OOO。(6)取正常人和鼻咽癌患者鼻咽分泌物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，按常規(guī)程序進(jìn)行WesternBlot分析，ECL顯影，常規(guī)洗片。從WesternBlot檢測結(jié)果(參見附圖3)來看，左邊為正常人鼻咽分泌物檢測結(jié)果，右邊為鼻咽癌患者鼻咽分泌物檢測結(jié)果，均為200ug總蛋白上樣，可見鼻咽分泌物中僅有1條目的帶，說明制作的抗體具有高度的特異性。且正常人鼻咽分泌物種的LTF蛋白含量顯著高于鼻咽癌患者。(二)LTF的ELISA檢測試劑盒的制備1.包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇按照Pierce公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，測定抗體及抗原的濃度。然后采用標(biāo)準(zhǔn)的棋盤測定方法，用包被緩沖液(配方同前)將兔抗人LTF融合蛋白多克隆抗體稀釋至濃度為20.0ug/ml、2.0ug/ml和0.2ug/ml，分別在ELISA板上包被，每個(gè)濃度包括三個(gè)縱行，4'C過夜，PBST洗滌3次。在其中一個(gè)橫行的包被孔中加入強(qiáng)陽性抗原液(10ug/ml的LTF—GST融合蛋白)，另一橫行中加入弱陽性抗原液(0.001ug/ml的LTF—GST融合蛋白)，第三行加入陰性對照。37。C保溫2小時(shí)，PBST洗滌4次。加入鼠抗人LTF多肽單克隆抗體，37"C保溫1小時(shí)，PBST洗滌4次。加入HRP標(biāo)記的二抗，37r保溫孵育30分鐘，PBST洗滌4次，加入OPD底物，室溫避光放置20分鐘，加入中止液(2M硫酸)，酶標(biāo)儀上讀數(shù)，從而選擇包被抗體的最佳濃度為2ug/ml。2.試劑盒的批量制備將兔抗人LTF融合蛋白抗體用包被緩沖液稀釋至2ug/ml，將其加入到96孔酶標(biāo)板，4'C包被過夜。倒去未包被的液體，用PBST洗滌3遍，加入200ul阻滯液阻止非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37'C孵育1小時(shí)，PBST洗脫3次。放入4"C保存?zhèn)溆?。試劑盒還分裝加入鼠抗人LTF多肽單克隆抗體、HRP標(biāo)記的二抗，其它通用試劑如Tween-20和OPD。3.試劑盒靈敏性的檢測將LTF重組蛋白用PBS稀釋成200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、10ug/ml、2ug/ml、0.5ug/ml、0.05ug/ml、0.01ug/ml、Oug/ml，每孔100ul加入到上述包被好的酶標(biāo)板中，37。C孵育2小時(shí)。用含0.1。/。Tween—20的PBS(PBST)沖洗3遍。按1:1000將鼠抗LTF抗體稀釋，每孔加入100ul，37。C孵育1小時(shí)，PBST洗4遍。加入HRP標(biāo)記二抗，37'C孵育30分鐘，PBST洗4遍。加入100ulOPD底物室溫放置15分鐘，加入2M的硫酸，490nm波長的酶標(biāo)儀下讀數(shù)。檢測最低的LTF的量，結(jié)果顯示，該試劑能檢測出0.01ug/mlLTF蛋白的濃度，這說明本發(fā)明的試劑盒具有較高的靈敏度。實(shí)施例2:LTF的ELISA試劑盒的使用步驟及特異性、穩(wěn)定性的檢測取待測鼻咽分泌物，具體方法為用生理鹽水沖洗鼻腔后，將一根細(xì)棉簽在鼻視鏡下插到鼻咽部(疑似腫瘤表面)，放置58分鐘，快速取出棉簽，將棉球放入底部空心的小離心管，離心管外再套上稍大的離心收集管，在4'C下7500Xg離心l分鐘，就可獲得鼻咽分泌物。該方法為無創(chuàng)性取材，能普遍被人接受。純化定量的LTF基因重組蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，將抗原(鼻咽分泌物)按LIO稀釋后，加入到前面已經(jīng)包被好的酶標(biāo)板中，37'C孵育2小時(shí)，用洗板液PBST洗去未結(jié)合的抗原，吸干殘余液體。加入鼠抗人的LTF多肽單克隆抗體37'C孵育1小時(shí)，PBST洗去未結(jié)合的抗體，吸干殘余液體。加入HRP標(biāo)記的二抗，37-C孵育30分鐘，PBST洗漆4次，吸干殘余液體。加入顯色底物OPD，室溫放置IO分鐘，可見各孔顯示不同深度的黃色(參附圖4)，加入2M硫酸中止反應(yīng)，酶標(biāo)儀在490nm波長讀數(shù)，計(jì)算樣本中LTF蛋白的含量。可得到在正常人群的鼻咽分泌物中LTF蛋白濃度為30165ug/ml,而鼻咽癌患者的鼻咽分泌物中LTF蛋白濃度小于10ug/ml。通過該方法，發(fā)明人檢測了100例鼻咽癌患者鼻咽分泌物中LTF蛋白含量，僅3例放療后的鼻咽癌患者鼻咽分泌物中LTF蛋白含量大于10ug/ml，因而診斷鼻咽癌的準(zhǔn)確率達(dá)到97。％以上，具有良好的特異性。分別取同一正常人和同一鼻咽癌患者的鼻咽分泌物，利用本方法進(jìn)行了ELISA測定，每天測定一次，共重復(fù)10次，按公式變異系數(shù)(CV)二S/XX100%(S為標(biāo)準(zhǔn)差，X為平均值)計(jì)算批間及批內(nèi)變異系數(shù)。最終得到批內(nèi)與批間變異系數(shù)分別為4.63和4.98%，說明該檢測方法穩(wěn)定性好。實(shí)施例3:LTF的ELISA試劑盒的臨床應(yīng)用某一疑似鼻咽癌患者鼻咽部用生理鹽水沖洗，按前述方法取患者鼻咽分泌物40ul，同時(shí)對患者進(jìn)行病理活檢。將取得的鼻咽分泌物用PBS稀釋成400ul，開始利用本試劑盒對分泌物中的LTF蛋白進(jìn)行定量檢測；冰箱中取出已經(jīng)包被好的酶標(biāo)板，室溫下放置20分鐘，同時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)品按如下濃度稀釋12.8ug/ul、6.4ug/ml、3.2ug/ml、1.6ug/ml、0.8ug/ml、0.4ug/ml、0.2ug/ml、Oug/ml(空白對照)，將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品各取lOOul按照表2中的順序(下表中的96格即為酶標(biāo)板中的96孔)加入到酶標(biāo)板，3次重復(fù)；取自正常人的鼻咽分泌物50倍稀釋液(已定量，含LTF蛋白12ug/ml)加入到4個(gè)酶標(biāo)板(標(biāo)準(zhǔn)孔)，每孔100ul，再在另外的4個(gè)孔中加入病人的待測樣本各lOOul。表2加入稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品的96孔酶標(biāo)板<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>37"C孵育2小時(shí)后，用洗板液PBST洗去未結(jié)合的抗原，吸干殘余液體;1:1000將鼠抗LTF抗體稀釋，每孔加入lOOul，37'C孵育1小時(shí)，PBST洗4遍；加入HRP標(biāo)記二抗，37。C孵育30分鐘，PBST洗4遍；加入lOOulOPD底物室溫放置20分鐘，加入2M硫酸(中止液)，490nm波長酶標(biāo)儀下讀數(shù)。根據(jù)測得的LTF蛋白濃度乘稀釋倍數(shù)，得出該病人鼻咽分泌物中LTF蛋白含量為4.27ug/ml。根據(jù)如實(shí)施例1所述的對100例鼻咽癌和正常人群鼻咽分泌物L(fēng)TF蛋白濃度所測定的標(biāo)準(zhǔn)，即正常人群的鼻咽分泌物中LTF蛋白濃度為30165ug/ml，而鼻咽癌患者的鼻咽分泌物中LTF蛋白濃度小于10ug/ml，即可判斷該患者患有鼻咽癌。兩天后，病理結(jié)果顯示該患者患鼻咽低分化鱗癌。權(quán)利要求1.人乳轉(zhuǎn)鐵蛋白在鼻咽癌診斷中的用途，其特征在于所述應(yīng)用方法為取待測鼻咽分泌物，檢測鼻咽分泌物中LTF蛋白濃度，當(dāng)鼻咽分泌物中LTF蛋白濃度小于10ug/ml時(shí)判斷為鼻咽癌陽性。2.—種鼻咽癌檢測的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白檢測試劑盒，包括包被有抗體的酶標(biāo)板，檢測抗體，酶標(biāo)二抗，通用試劑Tween-20和顯色底物，其特征在于所述酶標(biāo)板孔內(nèi)為經(jīng)包被的兔抗人LTF融合蛋白抗體，所述檢測抗體為鼠抗人LTF單克隆抗體，所述酶標(biāo)二抗為HRP標(biāo)記的抗鼠免疫球蛋白二抗。3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒酶標(biāo)板孔內(nèi)的兔抗人LTF融合蛋白抗體的濃度為2ug/ml。4.一種如權(quán)利要求2或3所述的試劑盒的制備方法，包括鼠抗人LTF多肽單克隆抗體的制備，兔抗人LTF融合蛋白抗體的制備，其特征在于所述制備鼠抗人LTF多肽抗體的過程是根據(jù)人LTF的氨基酸序列，合成氨基酸序列為Asn-了yr—Lys—Ser誦Gln-Gln陽Ser—Ser-Asp-Pro陽Asp-Pro-Asn-Cys—Val—Asp-Arg-Pro-Val-Glu-Gly的多肽，免疫小鼠，用鼠脾臟B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，選擇性培養(yǎng)，克隆選擇，篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，體外培養(yǎng)，得到鼠抗人LTF單克隆抗體；所述制備兔抗人的LTF融合蛋白抗體過程為PCR擴(kuò)增LTF基因的開放閱讀框序列，將其克隆至帶GST靶標(biāo)志的原核表達(dá)載體PGEX中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，異丙基-B-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)LTF-GST融合蛋白的表達(dá)，純化；用LTF-GST融合蛋白免疫兔，制備兔抗人LTF融合蛋白的抗體。5.如權(quán)利要求2或3所述的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白檢測試劑盒作為鼻咽癌早期診斷、篩査和患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測檢測裝置的用途，其特征在于取待測鼻咽分泌物，用所述試劑盒檢測鼻咽分泌物中LTF蛋白濃度是否小于10ug/ml。全文摘要本發(fā)明公開了人乳轉(zhuǎn)鐵蛋白LTF及其ELISA檢測試劑盒在鼻咽癌診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明通過研究證實(shí)人乳轉(zhuǎn)鐵蛋白LTF基因在鼻咽癌組織中特異表達(dá)下調(diào)，從而提出乳轉(zhuǎn)鐵蛋白LTF用于鼻咽癌診斷、篩查和患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的用途。并制備出抗人LTF的抗體，進(jìn)一步經(jīng)雙抗夾心法制備出用于鼻咽癌診斷的LTF蛋白ELISA檢測試劑盒，從鼻咽部取分泌物進(jìn)行ELISA檢測，可以定量檢測各人群鼻咽分泌物中LTF蛋白表達(dá)量，從而預(yù)測鼻咽癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，篩查易感者，并對鼻咽癌患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。文檔編號G01N33/531GK101231292SQ200810030668公開日2008年7月30日申請日期2008年2月25日優(yōu)先權(quán)日2008年2月25日發(fā)明者鳴周,周厚德,周艷宏,張文玲,曾朝陽,李小玲,李桂源,沈守榮,煒熊,嵐肖,范松青申請人:中南大學(xué)