專利名稱：乳糖診斷/測定試劑(盒)及乳糖濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種乳糖診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定乳糖濃度的方
法，屬于醫(yī)學/食品檢驗測定技術領域。
背景技術：
乳糖是嬰幼兒主要的能量來源，進入體內(nèi)后經(jīng)小腸乳糖酶作用分解成葡萄糖和半 乳糖，半乳糖是嬰幼兒腦發(fā)育的必需物質，與嬰幼兒大腦的迅速成長有密切聯(lián)系。為防止乳 清粉中摻加用其他還原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的檢測十分必要。 牛奶是一種營養(yǎng)豐富的食品，但如飲用不當，也會給健康帶來不良影B向。很多人在 飲奶后出現(xiàn)腹部不適、腹脹、多屁、腹痛甚至腹瀉等癥狀，這種現(xiàn)象在醫(yī)學上稱為乳糖不耐 受癥，其原因是這些人小腸缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖進入結腸后，經(jīng)結腸 中的細菌發(fā)酵，產(chǎn)生大量氣體、醋酸等物質所致。大量研究證實，患有乳糖不耐受的人還有 大部分沒有任何癥狀、只有人體生化指標改變的隱性不耐受者，醫(yī)學上稱為乳糖吸收不良 或乳糖酶缺乏。 據(jù)統(tǒng)計，全世界都存在乳糖不耐受的問題，其中亞洲人發(fā)生率最高，為 95%-100%。據(jù)中國疾病控制中心調(diào)查，我國北京、上海、廣州等地3_13歲兒童乳糖不耐受 癥和乳糖吸收不良的發(fā)生率約為80%。乳糖不耐受除引起消化道癥狀外，還可造成人體營 養(yǎng)吸收不良。據(jù)國外研究，乳糖不耐受可減少鈣的攝入、減少峰值骨量、增加骨丟失從而引 發(fā)骨質疏松癥，乳糖不耐受可影響鐵和鋅的吸收，造成鐵缺乏和鋅缺乏，并可影響小兒的腦 發(fā)育，對人體健康危害很大。 在食品分析領域中，酶分析法是廣為使用并倍受諸如ISO等國際標準機構推薦的 一種方法。酶析法理論發(fā)展成熟并且已為實驗室普遍接受。使用高質量經(jīng)純化的酶可以實 現(xiàn)對復雜物質中特定成份的檢測。該方法可以檢測的目標代謝物有糖類、酸類及其鹽類、醇 類和其他物質等。由此，各種食品樣品均可被快速檢測并獲得良好的結果。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定乳糖濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn) 該方法的乳糖診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀上進行乳糖濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推 廣應用。 本發(fā)明乳糖濃度測定方法如下 乳糖+尿苷二磷酸乳糖合成酶尿苷二磷酸_半乳糖+葡萄糖 葡萄糖+腺苷三磷酸己糖激酶腺苷二磷酸+葡萄糖6-磷酸 葡萄糖6-磷酸+還原型輔酶醛糖-6-磷酸還原酶山梨醇6-磷酸+輔酶
這種方法應用乳糖合成酶(lactose synthase ;EC 2. 4. 1. 22)酶(偶)聯(lián)己糖激 酶(Hexokinase EC 2.7. 1. 1)、醛糖_6_磷酸還原酶(aldose-6-phosphate reductase ;EC 1. 1. 1. 200)酶促反應比色終點法。乳糖合成酶酶解乳糖反應產(chǎn)生葡萄糖，再通過(偶)聯(lián) 合己糖激酶、醛糖-6-磷酸還原酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化 成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程 度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算乳糖的濃度大小。 實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明乳糖診斷/測定試劑(盒)較為理想 也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶、己糖激酶、醛糖-e-磷酸還原酶。 還原型輔酶、乳糖合成酶、己糖激酶、醛糖-6-磷酸還原酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷
酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解
后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶、醛糖_6-磷酸還原酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶。 還原型輔酶、乳糖合成酶、己糖激酶、醛糖-6-磷酸還原酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷 酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加 水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定乳糖濃度的方法，其還原型輔酶可以是 NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明, 實施例一
本實施例的乳糖診斷/;
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
乳糖合成酶
己糖激酶
醛糖_6-磷酸還原酶 尿苷二磷酸 腺苷三磷酸
J定試劑為單試劑，包括
鹽酸緩沖液100mmol/L 500,1/L 0. 25,1/L 6000U/L 8000U/L
10000U/L 5mmol/L
7mmol/X
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乳糖樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向
為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。 實施例二
J定試劑為雙試劑，包括
本實施例的乳糖診斷/; 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
尿苷二磷酸
腺苷三磷酸
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑 乳糖合成酶 己糖激酶
醛糖_6-磷酸還原酶
鹽酸緩沖液100mmol/L 50mmol/L 0. 25,1/L 5mmol/L 7mmol/L
鹽酸緩沖液100mmol/L 500,1/L 6000U/L 8000U/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乳糖樣品與試劑1 、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右,
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。
實施例三
本實施例的乳糖診斷/; 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
尿苷二磷酸
腺苷三磷酸
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
己糖激酶
醛糖_6-磷酸還原酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑 乳糖合成酶
J定試劑為三試劑，包括
鹽酸緩沖液100,1/L 50mmol/L 0. 25,1/L 5mmol/L 7mmol/L
鹽酸緩沖液100,1/L 500,1/L 8000U/L 10000U/L
鹽酸緩沖液100mmol/L 500,1/L 6000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定乳糖濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始 吸光度1. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乳糖樣品與試劑1、試劑2、試 劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右， 檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0007 ;吸光度時間反應曲線應呈下 降曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達15mmol/L ;試劑測試的不準確 度，其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達O. 0024±0. 0012 AA/mmol/L ;試劑在2-8"下保存，活性可以穩(wěn)定一年；—— 本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應用。
權利要求
一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的乳糖濃度測定方法，其方法如下乳糖+尿苷二磷酸 乳糖合成酶 尿苷二磷酸-半乳糖+葡萄糖葡萄糖+腺苷三磷酸 己糖激酶 腺苷二磷酸+葡萄糖6-磷酸葡萄糖6-磷酸+還原型輔酶 醛糖-6-磷酸還原酶 山梨醇6-磷酸+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出乳糖的濃度大小測定結果。
2. —種乳糖診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶乳糖合成酶己糖激酶醛糖_6-磷酸還原酶尿苷二磷酸腺苷三磷酸-500,1/L20——1-4000mmol/L0. 1-0. 35,1/L1000-80000U/L1000-80000U/L1000-80000U/L1-50mmol/L1-50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、乳糖合成酶、己糖激酶、醛糖_6-磷酸還原酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、乳糖合成酶、己糖激酶、醛糖_6-磷酸還原酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶、己糖激酶、醛糖-6-磷酸還原酶組成。還原型輔酶、乳糖合成酶、己糖激酶、醛糖-6-磷酸還原酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸在試劑l或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、乳糖合成酶、己糖激酶、醛糖-6-磷酸還原酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶、醛糖-6-磷酸還原酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖合成酶組成。還原型輔酶、乳糖合成酶、己糖激酶、醛糖-6-磷酸還原酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的乳糖診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定乳糖濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、尿苷二磷酸、腺苷三磷酸、乳糖合成酶、己糖激酶、醛糖-6-磷酸還原酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。
文檔編號G01N35/00GK101793701SQ20091002821
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優(yōu)先權日2009年2月4日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司