專利名稱：：一種實驗動物短途運輸應激評價和干預方法
技術領域：
：本發(fā)明屬實驗動物領域，涉及實驗動物短途運輸，具體涉及一種實驗動物短途運輸應激評價和干預方法。技術背景實驗大鼠和小鼠是生命科學研究和生物醫(yī)藥產品檢定中用量最多、用途最廣泛的實驗動物，約占實驗動物使用總數量的80%。據報道，美國、歐洲、日本每年實驗大鼠和小鼠的使用量約2500萬只，僅在英國，2000年實驗大鼠和小鼠的使用量就達2141，935只。隨著生命科學的飛速發(fā)展及生物醫(yī)藥支柱產業(yè)的迅猛擴張，我國每年實驗大鼠和小鼠的使用量目前已達IOOO萬只以上。在國外，由于社會分工和市場化的日漸成熟，常用實驗動物往往是由少數幾家大型企業(yè)集中規(guī)?；a，然后依據客戶需求，運輸至使用單位以供實驗運用。絕大多數使用單位一般自己不生產實驗動物，完全依賴市場外購。例如，英國以BK公司為主，美國以CharlesRiver公司為主，實行市場化供應?？紤]到運輸應激對動物健康的影響，一些發(fā)達國家就如何運輸實驗動物作出了相應規(guī)定或者提出指導性意見，其內容主要涉及交通工具、籠具材料、運輸空間、長途運輸中食物和水的供應以及獸醫(yī)觀察等，且對象主要為犬、猴等大型實驗動物，對于用途最廣、用量最大的實驗大鼠和小鼠的常見短途運輸問題并無建立在實驗評估科學依據下的具體技術規(guī)范。在我國，由于實行了實驗動物生產許可證和使用許可證制度，常用實驗動物生產和使用分離已成大勢所趨，運輸成為銜接生產(上游)和應用(下游)的必要環(huán)節(jié)。但是，我國實驗動物國家標準僅覆蓋了實驗動物在生產和使用期間的環(huán)境及營養(yǎng)控制，對于實驗動物的運輸過程尚無具體技術規(guī)范。在此狀況下，實驗動物生產供應機構普遍采用專用運輸車和運輸包裝箱運送實驗動物，以滿足運輸期間實驗動物對溫度、濕度和空間等基本要素的需求。事實上，經歷運輸的動物不可避免地受到諸多生理性和心理性激源的復合刺激，由此引發(fā)的相應應激反應不同程度地威脅到動物的身心健康。目前，國內外均缺乏運輸應激對實驗大鼠和小鼠影響的系統(tǒng)全面科學評價，對于在運輸過程中及到達目的地后如何減輕或消除運輸應激，亦無相應的有效技術措施。短途運輸是實驗動物最常見的運輸形式，在我國，每年約有iooo多萬只實驗大鼠和小鼠經歷短途運輸過程，其中絕大多數是由占實驗動物專業(yè)機構95%以上的使用單位向就近的生產單位購買以供實驗使用，約65%的短途運輸時間為1.5小時左右，隨后依次為1小時和0.5小時。由于短途運輸應激的影響，動物的生理狀況和功能指標發(fā)生變異，抵達目的地后需要有相當的健康適應期(periodofacclimatizationfollowingtransportation)用于休養(yǎng)調整，待恢復后才能應用于實驗，否則不僅會對動物實驗產生背景性干擾，影響科學研究的真實性和可靠性以及生物醫(yī)藥產品檢定的安全性和有效性，也會損害實驗動物的福利和健康。由于缺乏相應的科學依據和技術規(guī)范，使用單位對健康適應期限的設定各不相同，有調査顯示，約有67%的使用單位把實驗大鼠和小鼠的健康適應期定為1天，25%的使用單位定為1周。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種實驗動物短途運輸應激評價和干預方法。本發(fā)明能提供評價嚙齒類實驗動物短途運輸應激反應的技術指標體系和經歷短途運輸后實驗動物的健康適應期以及緩解短途運輸應激專用營養(yǎng)補充劑。本發(fā)明所述的嚙齒類實驗動物優(yōu)選實驗大鼠和小鼠。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現本發(fā)明通過觀察短途運輸應激對實驗大鼠和小鼠的影響，建立短途運輸應激評價的技術指標體系，確定實驗大鼠和小鼠經歷短途運輸應激后的健康適應期，提供減輕短途運輸應激不良反應的干預措施。本發(fā)明方法通過下述步驟提供了評價的技術指標體系和健康適應期以及緩解短途運輸應激專用營養(yǎng)補充劑-1)使實驗動物分別經歷不同運輸時間，分別為0.5hr、lhr或1.5hr。2)使實驗動物經歷1.5hr運輸時間到達實驗室后分別恢復不同時間，分別為24hr、48hr、72hr或96hr;或，運輸時進行干預，優(yōu)選營養(yǎng)補充劑進行干預，到達實驗室后分別恢復不同時間，分別為24hr、48hr、72hr或96hr;3)測定所述實驗動物的生長代謝、神經內分泌和免疫功能主要指標，與未經歷運輸的對照組比較，觀察分析短途運輸應激對實驗動物的影響；或與未接受干預的運輸對照組比較，觀察分析營養(yǎng)補充劑對緩解實驗動物短途運輸應激的作用；4)遴選評價的技術指標，建立評價技術指標體系，提出健康適應期以及確定營4養(yǎng)補充劑的干預效果。結果表明，本發(fā)明方法提供了由能量代謝標志物GLU、免疫功能執(zhí)行者WBC、HPA軸終末效應激素CORT、神經內分泌-免疫網絡雙向調控因子P-EP和免疫功能調節(jié)關鍵細胞因子IL-2共同構成的實驗動物短途運輸應激評價技術指標體系，以及通過尾靜脈微量微創(chuàng)采血即刻測定外周血GLU含量和WBC總數的快速評價方法；實驗大鼠和小鼠在經歷1.5hr以內短途運輸后的健康適應期均應至少為72hr;所制成的緩解短途運輸應激專用營養(yǎng)補充劑為凝膠狀營養(yǎng)補充劑，其能夠有效減輕短途運輸應激對動物代謝和免疫功能造成的不良影響，同樣經歷1.5hr運輸，運輸期間獲得營養(yǎng)干預的動物比未獲得營養(yǎng)干預的動物提前三分之一的時間恢復到正常狀態(tài)，說明該營養(yǎng)補充劑具有一定的抗短途運輸應激作用。本發(fā)明方法可為實驗大鼠和小鼠短途運輸科學化和標準化提供實驗依據，避免短途運輸應激對實驗動物健康和福利的損害及對動物實驗的背景性干擾，消除實驗動物生產和使用分離所造成的制約瓶頸，實現實驗動物質量保證的無縫對接，解決生產和使用銜接中的實際問題，以確保事關國計民生的生物醫(yī)藥科學研究和產品檢定的科學性及有效性。具體實施方式實施例l制訂評價的技術指標，建立技術指標評價體系1、動物及日常飼養(yǎng)管理清潔級封閉群雄性Wistar大鼠80只，體重250士15g，由復旦大學實驗動物科學部提供[生產許可證號SCXK(滬)2007—0002]。實驗在復旦大學實驗動物科學部屏障環(huán)境設施內進行[使用許可證號SYXK(滬)2007_0002]。動物飼養(yǎng)于SS4型大鼠專用飼養(yǎng)籠內(尺寸為485mmx350mmx200mm)，每籠5只。飼料釆用經121°C20min高溫高壓蒸汽滅菌的全價顆粒飼料，飼料標準參照《實驗動物小鼠大鼠配合飼料》國家標準GB14924.3-2001，用前篩除碎屑。飲水采用經121°C30min高溫高壓蒸汽滅菌后自然冷卻至室溫的自來水，使用500ml專用聚丙烯PP塑料飲水瓶裝。墊料釆用經121°C45min高溫高壓蒸汽滅菌的刨花，用前篩除粉塵。飼育環(huán)境控制按照實驗動物環(huán)境國家標準GB14925-2001執(zhí)行，其中，照明采用人工控制10/14明暗光制(照明時間為8:0018:00)。2、主要儀器、設備OmnitestEZ血糖儀B.Braun公司；OPTICON2熒光定量PCR儀MJ公司；Bio-TekElx800USA酶標儀(美國)；OLYMPUS顯微鏡(日本)；上海精科MP502B型電子秤，量程0500g，精確度0.01g;3、主要試劑大鼠皮質酮(CORT)、p-內啡肽(P-EP)測定試劑盒(血清型)，ADL公司產品；大鼠免疫球蛋白g(IgG)、白介素l(il-1)、白介素2(il-2)、y干擾素(IFN-y)測定試劑盒(血清型)，RapidBio公司產品；Trizol試劑、01igodT18，invitrogen公司產品；M-MLV5xReactionBuffer,RecombinantRnasin，M-MLV，Promega公司產品；dNTPmix，FQ-PCRPremixKit(熒光染料)，Transhold公司產品；OmnitestEZ血糖儀專用試紙，B.Braun公司產品；白細胞稀釋液按常規(guī)方法配制；DEPC(AR)，EDTA-Na2(AR)，氫氧化鈉(AR)，無水乙醇(AR)，三氯甲烷(AR),異丙醇(AR)，冰乙酸(AR)均為國藥集團化學試劑有限公司產品；4方法1)實驗設經歷不同運輸時間、運輸后不同恢復時間及不經歷運輸的空白對照3個組別經歷不同運輸時間組別(T):共3組，每組10只，編組和處理如下丁0.5組經歷運輸0.5hr后即刻采樣，!Yo組經歷運輸1.0hr后即刻采樣，TYs組經歷運輸1.5hr后即刻采樣，運輸后不同恢復時間組別(R):共4組，每組10只，編組和處理如下R24組經歷運輸1.5hr后，恢復適應24hr再行采樣，R48組經歷運輸1.5hr后，恢復適應48hr再行采樣，R72組經歷運輸1.5hr后，恢復適應72hr再行采樣，R96組經歷運輸1.5hr后，恢復適應96hr再行采樣，空白對照組別(C):共10只，常規(guī)飼養(yǎng)，不經歷運輸。2)動物運輸和處理使用恒溫實驗動物專用運輸車為短途運輸工具，采用實驗大鼠運輸專用包裝箱為運輸容器(尺寸為510mmx320mmxl卯mm),每箱裝運lO只大鼠，箱內預先放置經12rC45min高溫高壓蒸汽滅菌并篩除粉塵的刨花，松散狀態(tài)下刨花厚度約40mm。經歷不同運輸時間組別為To.5、T,.o、T,.5的動物，于連續(xù)運輸0.5hr、lhr、1.5hr時即刻逐組采樣測定；運輸后不同恢復時間組別為R24、R48、R72、R96的動物，經歷1.5hr的連續(xù)運輸后返回實驗室，更換潔凈籠盒，重新放置墊料、飼料和飲水，常規(guī)飼養(yǎng)，于返回后24hr、48hr、72hr、96hr逐組采樣測定。各組采樣均于11:15-12:30進行，每只大鼠的采樣流程為尾靜脈微量采血—眼睚動靜脈叢采血—肝臟組織塊采集，對每只大鼠的采樣處理于3min內完成。3)體重測定經歷不同運輸時間(To.s組、Tu)組、Tl5組)的動物于運輸前、后各測定一次體重，以運輸途中減輕的體重和運輸前體重之比(Rbwlost)表示運輸過程對體重的影響。對照組(C)的體重測定和TY5組同時進行。對經歷運輸1.5h后恢復96hr的動物(R96組)于運輸結束后即刻(Ohr)、24hr、48hr、72hr、96hr5個時間點分別測定體重，同時同步測定對照組(C)體重，計算兩組在實驗期間每24hr的體重增長率。4)血糖(GLU)測定動物清醒安靜狀態(tài)下，從右側尾靜脈距尾尖1/3處微創(chuàng)法采血5^U,以測定試紙吸取血液至充滿測定池后，靜置15s,記錄測定值。5)外周血白細胞(WBC)計數血糖測定采樣后，同部位再次采取20pl血樣，將血樣溶于白細胞稀釋液并振蕩混勻，經40倍稀釋后，于3hr內置低倍鏡下直接計4個大方格內白細胞總數(N)，按下列公式求得外周白細胞數4個大方格內白細胞總數(N)，白細胞數(WBC)=-x稀釋倍數xl0746)激素和細胞因子測定取眼眶動靜脈血2ml，室溫靜置30min，4'C3000轉/分離心15min,分離血清，冰上分裝，置-3(TC保存，于30天內測定血清中大鼠皮質酮(CORT)、(3-內啡肽(p-EP)、免疫球蛋白G(IgG)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-2(IL-2)和Y干擾素(IFN-Y)的含量，測定采用ELISA法，按試劑盒說明書操作。7)應激分子轉錄水平測定按常規(guī)方法采集肝臟標本，投入液氮速凍后轉-70'C保存，Trizol法提取肝臟總RNA，RT-PCR兩步法合成cDNA，采用熒光染料法行real-timePCR，2^"法對Hsp72表達相對定量。8)統(tǒng)計學處理結果以均值±標準差表達，采用STATA軟件統(tǒng)計，兩組均數比較采用t檢驗，檢驗水準01=0.05，a-O.Ol。結果顯示實驗期間T0.5組、T1.0組和T1.5組的RBWLOST均極顯著高于C組(PO.Ol)。表l是不同運輸時間對體重的影響。表1__組別運輸時間"BW々BW2/gABW/gRbwlost/hrT0.50.5254.56±8.51247.70±7.686.86±1.580.0269±0.0059"T101.0255.14±11.32246.93±11.148.20±1.210.0322土0,0047"TL51.5255.22±13.26244.25±13.0210.98±1.940.0430±0.0074"_^_-—254.30±9.21252.20±9.212.10±0.730.0083±0.0029其中①BW,運輸前體重；BW2運輸后體重；ABW=BW廣BW2;Rbwlost=ABW/BW1;②與C組比較，"P〈0.01;n=10。在運輸后024hr、24~48hr、48~72hr3個恢復時段內，R96組的體重增長率均高于C組且差異極顯著(P<0.01)，運輸后7296hr，R96組的體重增長率和對照組差異不顯著(P>0.05)。表2是運輸后不同恢復時段體重增長率的變化。表2組別測量時段0~24hr24~48hr48~72hr72~96hrR960.0584土0.016"0.0307±0.0082"0.0348土0.0012"0.0193±0.0063C0.0206±0.00670.0190±0.00590.0232±0.00700.0194±0.0064其中與C組比較，尸O.01;n=108GLU測定顯示，與空白對照組(C組)比較，T0.5組顯著升高(P<0.05)，T1.0組和R24組均極顯著升高(PO.Ol),而T1.5組極顯著降低(P<0.01),R48、R72和R963組的GLU水平與C組差異不顯著(P>0.05)。WBC測定顯示，與空白對照組(C組)比較，T0.5組、T1.0組和T1.5組均極顯著減少(PO.Ol)，R24組和R48組均顯著減少(P<0.05)，R72組和R96組的WBC與C組差異不顯著(P>0.05)。表3是GLU和WBC的測定結果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其中和C組比較，><0.05,"O.01;n=10CORT測定顯示，與空白對照組(C組)比較，T0.5組和T1.0組血清CORT含量升高，T1.5組血清CORT含量降低，差異均極顯著(P〈0.Q1)，R24、R48、R72、R964組和C組的差異均不顯著(P>0.05)。e-EP測定顯示，與空白對照組(C組)比較，T0.5組、T1.0組和T1.5組的血清e-EP含量均降低且差異極顯著(PO.Ol)，R24組血清P-EP的含量降低且差異顯著(P<0.05)，R48、R72以及R963組和C組的差異均不顯著(P>0.05)。表4是血清中CORT和e-EP的含量。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>R721.572188.50±34.9815.23±1.83R961.596192.70±38.6214.78±1.76C_==z:__187.43±27.91_14.02±1.79其中和C組比較，'尸<0.05，*><0.01;n=10與空白對照組(C組)比較，R24組和R48組血清中IgG、IL-2和IFN-Y含量，以及R24組血清中IL-1含量均極顯著降低(P<0.01)，R48組血清中IL-1含量顯著降低(P<0.05),不同運輸時間的3組(T0.5組、Tl.O組、T1.5組)和運輸后分別恢復72hr、96hr的R72組、R96組與C組的差異均不顯著(P〉0.05)。表5是血清中4種免疫因子的含量。表5^尿運輸時間/hr處理恢復時間/hrIgG/mg'L.1IL國2/ng,1/1IFN-Y/ng'L'1IL-l/ng.L"To.50.50643.29±863.81±631.06±99.45330.89±54.5112.67140.281.00650.96±910.98±641.34±58.19345.78±48.74124.78146.55T151.50652.75±847.53±625.73±348.73±75.14118.04162.44120.92R241.524464.67±67.10646.78±456.69±244.33±85.1175.90**38.02**R481.548530.34±68.44699.75±471.69±270.55±47.33*94.58**78.2廣R721.572617.31±63.63916.72±607.15±83.06320.21±53.44185.55R961.596619.68±61.28883.20±626.39±70.37331.23±41.78紙卯C----____633.59±83.09850.36±96.57638.08±321.39±41.45_103.25_其中和C組比較，><0.05，"PO.01;n=10與空白對照組(C組)比較，不同運輸時間的各組(T0.5、Tl.O、T1.5)以及R24組和R48組的hsp72mRNA表達量均極顯著上升(P<0.01)，而R72和R962組的表達量和對照組差異不顯著(P>0.05)。10表6是肝臟hsp72mRNA的表達情況。表6處理組別-:-hsp72mRNA運輸時間/hr恢復時間/hrT0.50.500.0338±0.0114**Ti.o1.000.0876±0.0266"丁L51.500.3036±0.聽**R241.5240.0330士0.0137"R481.5480.0074±0.0019"R721.5720.0059±0.0015R961.5960.0056±0.0015C——0.0052±0細2注和C組比較，"PO.01;n=10實驗證實，短途運輸應激對實驗大鼠的生長代謝、神經內分泌和免疫功能均有不利影響，經歷常規(guī)短途運輸(1.5hr以內)的實驗大鼠，到達目的地后的健康適應期至少應為72hr;外周血中白細胞總數(WBC)、血糖(GLU)、皮質酮(CORT)、e-內啡肽(P-EP)、免疫球蛋白G(IgG)、白介素2(IL-2)、Y干擾素(IFN-Y)及白介素l(IL-1)的含量可作為評價短途運輸應激的指標，本發(fā)明優(yōu)選外周血中白細胞總數(WBC)、血糖(GLU)、皮質酮(CORT)、P-內啡肽(P-EP)、白介素2(IL-2)建立實驗動物短途運輸應激評價技術指標體系。實施例2驗證評價的技術指標體系，評價實驗小鼠的短途運輸應激1、動物及日常飼養(yǎng)管理清潔級雄性近交系BALB/c小鼠80只，體重20士2g;清潔級雄性封閉群ICR小鼠80只，體重20±2g，均由中國科學院上海實驗動物中心提供[生產許可證號SCXK(滬)2007—0005]，實驗在復旦大學實驗動物科學部屏障環(huán)境設施內進行[使用許可證號SYXK(滬)2007—0002]。動物飼養(yǎng)于M1型小鼠專用飼養(yǎng)籠內(尺寸為2卯mmX178mmX160mm),每籠飼養(yǎng)4只。飼料采用經121°C20min高溫高壓蒸汽滅菌的全價顆粒飼料，飼料標準參照《實驗動物小鼠大鼠配合飼料》國家標準GB14924.3-2001，用前篩除碎屑。飲水采用經121°C30min高溫高壓蒸汽滅菌后自然冷卻至室溫的自來水，使用200ml專用聚丙烯PP塑料飲水瓶裝。墊料采用經121°C45min高溫高壓蒸汽滅菌的刨花，用前篩除粉塵。詞育環(huán)境控制按照實驗動物環(huán)境國家標準GB14925-2001執(zhí)行，其中，照明采用人工控制10/14明暗光制(照明時間為8:00-18:00)。2、主要儀器、設備Bio-TekElx800USA酶標儀(美國)。OmnitestEZ血糖儀(德國)。OLYMPUS顯微鏡(日本)。3、主要試劑小鼠皮質酮(CORT)、e-內啡肽(e-EP)測定試劑盒(血清型)，ADL公司產品；小鼠白介素2(IL-2)測定試劑盒(血清型)，RapidBio公司產品；OmnitestEZ血糖儀專用試紙，B.Braun公司產品；白細胞稀釋液按常規(guī)方法配制；4方法1)每個品系(品種)均設5組，每組16只，編組和處理如下TRO組經歷1.5hr運輸后即刻采樣，TR24組經歷1.5hr運輸后，恢復適應24hr再行采樣，TR48組經歷1.5hr運輸后，恢復適應48hr再行采樣，TR72組經歷1.5hr運輸后，恢復適應72hr再行采樣，C組不經歷運輸，常規(guī)飼養(yǎng)，作為空白對照組。2)運輸及采樣處理使用恒溫實驗動物專用運輸車為短途運輸工具，采用實驗小鼠運輸專用包裝箱為運輸容器(尺寸為510mmX320mmX190mm)，箱內預先放置經121'C45min高溫高壓蒸汽滅菌并篩除粉塵的刨花作墊料，松散狀態(tài)下刨花厚度約30mm。動物按品系(品種)分開裝運，每箱32只。連續(xù)運輸1.5hr后，即刻對2個品系(品種)的TRO組采樣測定，其余小鼠送入實驗室按組常規(guī)飼養(yǎng)，并于運輸后24hr、48hr、72hr逐組采樣測定?？瞻讓φ誄組常規(guī)飼養(yǎng)，采樣處理與各實驗組相同。各組采樣均于11:3(M2:30進行，對每只小鼠采樣處理控制在3min內完成。3)血糖(GLU)測定和外周血白細胞(WBC)計數同實施例14)激素和細胞因子測定12取眼眶動靜脈血1.2ml左右，室溫靜置30min，4'C3000轉/分離心15min，分離血清，冰上分裝，置-3(TC保存，于30天內測定血清中小鼠皮質酮(CORT)、P-內啡肽(e-EP)、白細胞介素-2(IL-2)含量，測定均采用ELISA法，按試劑盒說明書操作。5)統(tǒng)計學處理結果以均值土標準差表示，采用STATA軟件進行統(tǒng)計，兩組均數比較采用t檢驗，檢驗水準a=0.05，a=0.01。結果顯示，BALB/c小鼠和ICR小鼠的TRO組、TR24組GLU均比各自的對照組(C組)極顯著降低(PO.Ol),TR48組和TR72組與各自對照組(C組)比較差異不顯著(P>0.05)。表7是運輸應激小鼠GLU的變化。組別運輸后恢復時間/hr—aLU/mmd'L-1BALB/cICR其中和C組比較，PO.01;n=16與各自對照組(C組)比較，BALB/c小鼠的TRO組、TR24組、TR48組，以及ICR小鼠的TRO組WBC均極顯著減少(P<0.01)，ICR小鼠的TR24組WBC顯著減少(P<0.05)。BALB/c小鼠的TR72組、ICR小鼠的TR48組和TR72組與各自對照組(C組)比較差異均不顯著(P〉0.05)。表8是運輸應激小鼠WBC的變化。表8_組別運輸后恢復時間/hr——~~WBC/109'L-1-BALB/cICR其中和C組比較，戶<0.05,PO.01;n=16與各自對照組(C組)比較，BALB/c小鼠和ICR小鼠的TRO組、TR24組血清IL-2含量均極顯著減少(PO.Ol)，ICR小鼠的TR48組血清IL-2含量顯著減少(P<0.05)。137.41±0.668.21土0.6(T9.01±0.759.01±0.429.15士0.466.29±0.728.34±0.55*9.33±0.959.34±0.679.26±0.6603.68±0.775.63±1.082412.78土4.05"10.85±2.15*4814.80±2.51"11.89±2.297216.78±2.8511.62±2.11——17.93±2.4212.59±1.42D482!c247i力4g2TTTTwM82wRcBALB/c小鼠的TR48組、TR72組以及ICR小鼠的TR72組與各自對照組(C組)比較差異均不顯著(P>0.05)。表9是運輸應激小鼠血清IL-2含量的變化。表9其中和C組比較，><0.05，><0.01;n=16與各自對照組(C組)比較，BALB/c小鼠和ICR小鼠的TR0組血清CORT含量均極顯著減少(PO.Ol)，TR24、TR48、TR72各組與各自對照組(C組)比較則無顯著差異(P>0.05)。表10是運輸應激小鼠血清CORT含量的變化。表10_組別運輸后恢復時間/hr—CX)RT/nmol'L-lBALB/cICR其中和C組比較，'P<0.05，P〈0.01;n-16與各自對照組(C組)比較，BALB/c小鼠和ICR小鼠的TRO組、TR24組血清e-EP含量均極顯著減少(PO.Ol)，TR48、TR722組與各自對照組(C組)比較則無顯著差異(P>0.05)。表ll是運輸應激小鼠血清e-EP含量。表11注和C組比較，尸<0.01;11=16運輸后恢復時間/hr<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實驗證實，短途運輸應激對不同遺傳背景實驗小鼠的代謝、神經內分泌和免疫功能均會產生不利影響，其中免疫功能所受的影響較大，運用本方法建立的實驗動物短途運輸應激評價技術指標體系能夠客觀評價這些影響。經歷常規(guī)短途運輸(1.5hr以內)的實驗小鼠，到達目的地后的健康適應期至少應為72hr。實施例3制備緩解短途運輸應激的凝膠狀專用營養(yǎng)補充劑1、動物及日常飼養(yǎng)管理清潔級雄性近交系BALB/c小鼠72只，體重20土2g，由中國科學院上海實驗動物中心提供[生產許可證號SCXK(滬)2007—0005]，實驗在復旦大學實驗動物科學部屏障環(huán)境設施內進行[使用許可證號SYXK(滬)2007—0002]。日常飼養(yǎng)管理同實施例2。2、主要儀器、設備和試劑同實施例23、凝膠狀營養(yǎng)補充劑每支長約8cm,直徑1.5cm，圓柱狀，重量約12g士lg，具體配方如下氨基酸L-色氨酸(1.25%);L-精氨酸(3%);?；撬?5%)。均為分析純試劑，日本進口分裝，由上海伯奧生物科技有限公司提供。維生素Bl(13mg/100g);B2(12mg/100g);B6(12mg膽g);B12(0.022mg/100g);C(1800mg/100g)。上海信誼藥業(yè)有限公司產品。葡萄糖(AR):4%，國藥集團化學試劑有限公司產品。瓊脂(AR):5%，國藥集團化學試劑有限公司產品。生理鹽水81.75%,四川科倫藥業(yè)股份有限公司產品4、方法1)實驗設營養(yǎng)干預、運輸對照和空白對照3個組別，具體如下運輸同步營養(yǎng)干預的分組共4組，每組8只，編組和處理如下TIO組經歷運輸及同步營養(yǎng)干預1.5hr后即刻采樣，TI24組經歷運輸及同步營養(yǎng)干預1.5hr后，恢復適應24hr再行采樣，TI48組經歷運輸及同步營養(yǎng)干預1.5hr后，恢復適應48hr再行采樣，TI72組經歷運輸及同步營養(yǎng)干預1.5hr后，恢復適應72hr再行采樣，運輸對照動物的分組共4組，每組8只，編組和處理如下15TR0組經歷運輸1.5hr后即刻采樣，TR24組經歷運輸1.5hr后，恢復適應24hr再行采樣，TR48組經歷運輸1.5hr后，恢復適應48hr再行采樣，TR72組經歷運輸1.5hr后，恢復適應72hr再行采樣，空白對照組(C組)共8只小鼠，常規(guī)飼養(yǎng)，不經歷運輸。2)運輸處理及采樣使用恒溫實驗動物專用運輸車為短途運輸工具，采用實驗小鼠運輸專用包裝箱為運輸容器(尺寸為510mmX320mmX190mm)，箱內放置經高溫高壓滅菌的刨花作墊料。營養(yǎng)干預和運輸對照的小鼠各裝l箱，每箱均為32只。營養(yǎng)干預組別的包裝箱內放置4支營養(yǎng)補充劑，懸空固定，自由取食，運輸結束后即刻取出剩余部分。運輸對照組別的包裝箱按常規(guī)短途運輸布置。連續(xù)運輸1.5hr后，即刻從營養(yǎng)干預組別的運輸箱中隨機抽取8只小鼠采樣測定指標，作為TIO組，其余小鼠隨機編入TI24、TI48、TI72各個實驗組。與此同時，即刻從運輸對照組別的運輸箱中隨機抽取8只小鼠采樣測定指標，作為TRO組，其余小鼠隨機編入TR24、TR48、TR72各個實驗組。于運輸結束后24hr、48hr、72hr，分別對TI24和TR24、TI48和TR48、TI72和TR72逐組配對采樣測定。空白對照C組飼養(yǎng)管理及采樣處理與各實驗組相同。各組采樣均于11:3012:30進行，對每只小鼠采樣處理控制在3min內完成。3)血糖(GLU)測定、外周血白細胞(WBC)計數、激素和細胞因子測定以及統(tǒng)計學處理同實施例2結果顯示，TIO組的GLU比空白對照組(C組)極顯著降低(P<0.01)，TI24、TI48、TI723組的GLU和C組比較差異不顯著(P>0.05)。TIO組和TI24組的WBC比空白對照組(C組)極顯著減少(P<0.01)，TI48組以及TI72組的WBC和C組比較差異不顯著(P>0.05)。表12是營養(yǎng)干預小鼠GLU和WBC的變化?；謴瓦m應時間/hrGLU/mmol丄-WBC/10y'L-TI0TI24TI48TI72C02448727.04±0.688.46±0.668.69±0.478.96±0.658.84±0.443.66±0.8213.48±2.24"15.46±1.7117.71±2.9917.08±1.84其中和C組比較，"P<0.01;n=8TR0組和TR24組的GLU比空白對照組(C組)極顯著降低(PO.Ol)，TR48組、TR72組的GLU和C組比較差異不顯著(P>0.05)。TR0組、TR24組的WBC均比空白對照組(C組)極顯著減少(PO.Ol)，TR48組的WBC比C組顯著減少(P<0.05)，TR72組的WBC和C組比較差異不顯著(P>0.05)。表13是運輸對照小鼠GLU和WBC的變化。表13_<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注和C組比較，*戶<0.05，"P<0.01;n=8與空白對照組(C組)比較，TIO組血清CORT、P-EP含量極顯著減少(PO.Ol)，血清IL-2含量顯著減少(P<0.05)。TI24、TI48、TI723組的血清CORT、e-EP、IL-2含量和C組的差異均不顯著(P>0.05)。表14是營養(yǎng)干預小鼠血清CORT、e-EP、IL-2含量的變化。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>其中和C組比較，PO.05,P<0.01;n=8與空白對照組(C組)比較，TR0組血清CORT、e-EP、IL-2含量，以及TR24組血清e-EP含量均極顯著減少(PO.Ol)，TR24組血清IL-2含量顯著減少(P0.05)。TR24組的血清CORT含量，以及TR48組和TR72組血清CORT、e-EP、IL-2的含量均和C組無顯著差異(P〉0.05)。表15運輸對照小鼠血清CORT、e-EP、IL-2含量的變化。表15注和C組比較，'PO.05，'P<0.01;n=8實驗證實，凝膠狀營養(yǎng)補充劑能夠減輕短途運輸應激對動物代謝和免疫功能的不利影響，促使其較快恢復至正常水平，具有較好的抗短途運輸應激作用。恢復適應時間/hrCORT/畫l.L-1卩-EP/ng.L"IL-2/ng.L"<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>權利要求1、一種實驗動物短途運輸應激評價和干預方法，其特征是包括下述步驟1)使實驗動物分別經歷不同運輸時間；2)使實驗動物經歷1.5hr運輸時間到達實驗室后分別恢復不同時間；或，運輸時進行干預，到達實驗室后分別恢復不同時間；3)測定所述實驗動物的生長代謝、神經內分泌和免疫功能指標，與未經歷運輸的對照組比較，觀察分析短途運輸應激對實驗動物的影響；或與未接受干預的運輸對照組比較，觀察分析所述干預對緩解實驗動物短途運輸應激的作用；4)遴選評價的技術指標，建立評價技術指標體系，提出健康適應期及確定干預效果。2、按權利要求1所述的實驗動物短途運輸應激評價和干預方法，其特征是所述的實驗動物是實驗大鼠或小鼠。3、按權利要求1所述的實驗動物短途運輸應激評價和干預方法，其特征是所述的步驟l)的運輸時間是0.5hr、lhr或1.5hr。4、按權利要求1所述的實驗動物短途運輸應激評價和干預方法，其特征是所述的步驟2)的恢復的不同時間是24hr、48hr、72hr或96hr。5、按權利要求1所述的實驗動物短途運輸應激評價和干預方法，其特征是所述的步驟2)的干預是營養(yǎng)補充劑的干預。6、按權利要求1所述的實驗動物短途運輸應激評價和干預方法，其特征是所述的步驟4)所述的技術指標體系包括能量代謝標志物GLU、免疫功能執(zhí)行者WBC、HPA軸終末效應激素CORT、神經內分泌-免疫網絡雙向調控因子p-EP和免疫功能調節(jié)關鍵細胞因子IL-2。7、按權利要求1所述的實驗動物短途運輸應激評價和干預方法，其特征是所述的步驟4)所述的健康適應期為實驗動物在經歷1.5hr以內短途運輸后的健康適應期至少為72hr。8、按權利要求5所述的實驗動物短途運輸應激評價和干預方法，其特征是所述的營養(yǎng)補充劑為凝膠狀營養(yǎng)補充劑。全文摘要本發(fā)明屬實驗動物領域，涉及一種實驗動物短途運輸應激評價和干預方法。本發(fā)明通過觀察短途運輸應激對實驗動物的影響，建立了短途運輸應激評價的包括能量代謝標志物GLU、免疫功能執(zhí)行者WBC、HPA軸終末效應激素CORT等的技術指標體系，確定了短途運輸應激后的健康適應期至少為72hr，并提供了減輕短途運輸應激不良反應的營養(yǎng)補充劑干預措施。本發(fā)明能為實驗動物短途運輸科學化和標準化提供實驗依據，避免短途運輸應激對實驗動物健康和福利的損害及其背景性干擾，解決生產和使用銜接中的實際問題，保證生物醫(yī)藥科學研究和產品檢定的科學性及有效性。文檔編號G01N33/48GK101324553SQ200810040250公開日2008年12月17日申請日期2008年7月4日優(yōu)先權日2008年7月4日發(fā)明者斐楊,櫻胡申請人:復旦大學