專利名稱：檢測(cè)水產(chǎn)品食物過(guò)敏的免疫膠體金層析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食物過(guò)敏的檢測(cè)方法，特別是涉及一種檢測(cè)水產(chǎn)品食 物過(guò)敏的免疫膠體金層析方法，該方法主要是針對(duì)曱殼類原肌球蛋白
(TM)和魚類小清蛋白(Par)食物過(guò)敏的免疫膠體金層析檢測(cè)。
背景技術(shù)：
食物過(guò)敏醫(yī)學(xué)上也稱變態(tài)反應(yīng)。引起食物過(guò)敏反應(yīng)的物質(zhì)叫做食 物過(guò)敏原，如魚、蝦、蟹、牛奶、蛋類等。其反應(yīng)機(jī)理為過(guò)敏原進(jìn)入 機(jī)體以后，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生正?；蜻^(guò)度免疫應(yīng)答，即超壽丈反應(yīng)。當(dāng)再 次接觸相同過(guò)敏原時(shí)多個(gè)IgE分子和抗體結(jié)合，引起IgE的Fc端結(jié) 構(gòu)改變，導(dǎo)致細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、5-羥色胺、白三烯等生物呼吸 活性物質(zhì)并作用于效應(yīng)器官，表現(xiàn)為平滑肌收縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張、通 透性增加、皮膚過(guò)壽丈、呼吸道過(guò)敏、造血系統(tǒng)過(guò)敏甚至過(guò)敏性休克(趙 俊芳，等.食物過(guò)敏原檢測(cè)及其應(yīng)用前景.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007， 8: 948-950 )。
近年來(lái)食物過(guò)敏問(wèn)題已引起廣大消費(fèi)者、食品生產(chǎn)者和科學(xué)研究 者的普遍關(guān)注。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，全球約有2%-2. 5%的成人受到食 物過(guò)敏疾病的困擾，嬰幼兒的發(fā)病率更高，達(dá)到4%-6%,兒童約為 2°/。-3%。在聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織公布的全球八大類過(guò)敏食物中，魚類和曱 殼類水產(chǎn)品是其中重要的兩大類，其主要過(guò)敏原分別為曱殼類原肌球蛋白(TM)和魚類小清蛋白(Par) (Food and Agriculture Organization. Report of the FAO technical consultation on food allergies. Rome, Italy. 1995.)。
對(duì)于食物過(guò)敏目前無(wú)特別的治療方法，嚴(yán)格避免接觸過(guò)敏食物是 最有效的方法。常用的檢測(cè)過(guò)敏原方法有體內(nèi)過(guò)敏原點(diǎn)刺試驗(yàn)、體外 檢測(cè)特異性IgE (RAST抑制實(shí)驗(yàn)和EAST抑制實(shí)驗(yàn))、雙盲食物激發(fā) 試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。這些方法中，體內(nèi)過(guò)敏原點(diǎn)刺試驗(yàn)易出 現(xiàn)假陽(yáng)性；RAST抑制實(shí)驗(yàn)和EAST抑制實(shí)驗(yàn)的不足是對(duì)人體血清的依 賴性，血清是很難保證一致的，因此該方法難以標(biāo)準(zhǔn)化；雙盲食物激 發(fā)試驗(yàn)易受其它因素影響，實(shí)踐中也不易操作，實(shí)驗(yàn)劑量、安慰劑及 雙盲控制等環(huán)節(jié)還有待完善；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)步驟多、時(shí)間長(zhǎng)(趙 俊芳，等.食物過(guò)敏原檢測(cè)及其應(yīng)用前景.中華沖全驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007, 8: 948-950 )。
免疫膠體金層析技術(shù)是2Q世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種將免疫技 術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合的快速免疫分析方法。其原理是以條狀纖維 層析材料為固相，借助毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，同時(shí)使 樣品中的待測(cè)物與層析材料上的受體(如抗體或抗原)發(fā)生高特異、 高親和性的免疫反應(yīng)，層析過(guò)程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材 料的一定區(qū)域(檢測(cè)帶)，通過(guò)酶促顯色反應(yīng)或直接使用可目測(cè)的著 色標(biāo)記物，5-10 min內(nèi)便可得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。它不需進(jìn)行結(jié)合 標(biāo)記物與游離標(biāo)記物的分離，省去了繁瑣的加樣、洗滌步驟。因而這 種分析技術(shù)操作簡(jiǎn)單快速，分析結(jié)果清楚，易于判斷，無(wú)需儀器設(shè)備， 成本低，可在市場(chǎng)、醫(yī)院、家庭、辦公場(chǎng)所甚至野外進(jìn)行各種現(xiàn)場(chǎng)快 速檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果也可長(zhǎng)期保存(吳剛，等。膠體金免疫層析技術(shù) 在食品檢測(cè)中的應(yīng)用。食品工業(yè)科技,2007， 12: 216-218),但目
前尚無(wú)曱殼類原肌球蛋白(TM)和魚類小清蛋白(Par)食物過(guò)敏的 免疫膠體金層析檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)水產(chǎn)品食物過(guò)敏的免疫膠體金 層析方法。該方法利用動(dòng)物抗體的免疫膠體金層析才企測(cè)水產(chǎn)品食物過(guò) 敏原TM和Par ，以及利用天然水產(chǎn)過(guò)敏原的免疫膠體金層析檢測(cè)人 體血清中TM和Par抗體，從而達(dá)到快速、靈每丈檢出水產(chǎn)品食物過(guò)敏 的目的。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是 本發(fā)明是一種檢測(cè)水產(chǎn)品食物過(guò)敏的免疫膠體金層析方法，其具 體步驟如下
(1) 制備膠體金吸取O. 5-2. 0 mL氯金酸加到50-200 mL超純 水中，加熱至沸騰后，迅速加入2-5 mL 1 %檸檬酸三鈉，加熱煮沸 5-10 min,獲得透明、酒紅色的膠體金溶液；
(2) 膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)邊攪拌邊逐滴加入蛋白溶液(過(guò)敏原抗 體或過(guò)敏原)至膠體金溶液中，蛋白質(zhì)終濃度約為5-15ng/mL，繼續(xù) 攪拌0.5-1 h;邊攪拌邊逐滴加入100-300 10 %牛血清白蛋白
(BSA),繼續(xù)攪拌10-15 min,靜置過(guò)夜；取已標(biāo)記蛋白質(zhì)的膠體 金溶液于5000 g， 4 。C下離心10-15 min;取上清液于17000 g， 4 。C 下離心30-45 min;吸出上清液，沉淀溶于1-3 mL磷酸緩沖液中， 制得膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)，現(xiàn)用或4 。C保存?zhèn)溆谩?br> (3) 免疫膠體金層析檢測(cè)依次將玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、吸 水紙貼在底板上組成免疫金試紙條；分別在免疫金試紙條的硝酸纖維
膜的4企測(cè)區(qū)滴加l-3 iuL膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)(抗體或抗原)和對(duì)照 區(qū)滴加l-3 pL葡萄球菌A蛋白，膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)濃度為0.5-5 mg/mL,烘干；在金標(biāo)區(qū)滴加10-20 膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)(抗體或 抗原)，膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)濃度為0.5-5 mg/mL;在玻璃纖維區(qū)滴 加20-200 待沖企樣品反應(yīng)5-10 mi n,若檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)都出現(xiàn)紅 色斑點(diǎn)，樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；若檢測(cè)區(qū)無(wú)顯色而對(duì)照區(qū)出現(xiàn)紅色斑 點(diǎn)，樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性；若對(duì)照區(qū)不顯色，樣品檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。
本發(fā)明用膠體金標(biāo)記過(guò)敏原抗體或過(guò)敏原并制備免疫金試紙條， 用于檢測(cè)水產(chǎn)品食物過(guò)敏的免疫膠體金層析試劑盒。
本發(fā)明是利用兔抗鋸緣青蟹TM抗體和兔抗鰱魚Par抗體的免疫 膠體金層析技術(shù)，同時(shí)對(duì)水產(chǎn)品過(guò)敏原TM和Par進(jìn)行特異性檢測(cè)； 利用天然的壞蟹類TM和魚類Par的免疫膠體金層析技術(shù)，同時(shí)對(duì)人 體血清中TM抗體和Par抗體進(jìn)行特異性檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是只 需要層析試紙條，待檢樣品不需前處理或只需簡(jiǎn)單處理，；險(xiǎn)測(cè)結(jié)果直 接用顏色顯示，5-10 min可以判定4企樣中是否存在水產(chǎn)品過(guò)敏原或 人體血清中是否含有水產(chǎn)品過(guò)敏原抗體，因而具有操作簡(jiǎn)便、成本低、 結(jié)果清楚可保存、不受外界因素影響等特點(diǎn)，可在市場(chǎng)、醫(yī)院、家庭、 辦公場(chǎng)所和野外等進(jìn)行各種現(xiàn)場(chǎng)快速^r測(cè)。
本發(fā)明利用免疫膠體金層析技術(shù)對(duì)水產(chǎn)品食物過(guò)敏進(jìn)行檢測(cè)，該 技術(shù)既有酶免疫法的特異性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，又有點(diǎn)刺試驗(yàn)的快 速、簡(jiǎn)便檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，可快速檢出食物中是否存在水產(chǎn)品過(guò)敏原或人 體血清中是否含有水產(chǎn)品過(guò)敏原抗體。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。


圖1免疫膠體金層析試紙條示意圖2兔抗TM抗體的膠體金層析檢測(cè)對(duì)奸TM ( A )和鰱魚Par ( B ) 結(jié)果圖3兔抗TM抗體的膠體金層析檢測(cè)對(duì)蚱TM ( A )、青蟹TM酶解 液(B)和對(duì)奸TM輻照后溶液(C)結(jié)果圖4壞蟹類TM的膠體金層析檢測(cè)過(guò)敏者血清中TM抗體(A )和 Par抗體(B)結(jié)果圖5鰱魚Par的膠體金層析檢測(cè)過(guò)敏者血清中Par抗體(A)和 TM抗體(B)結(jié)果圖6膠體金層析檢測(cè)過(guò)敏者血清中TM抗體(A ) 、 Par抗體(B ) 和無(wú)過(guò)敏者血清(C)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:兔抗TM抗體的膠體金層析檢測(cè)樣品中是否含有TM
(1) 制備膠體金。吸取1. 0 mL氯金酸加到100 mL超純水中，加 熱至沸騰后，迅速加入4 mL 1 %檸檬酸三鈉，加熱煮沸8 min，獲得 透明、酒紅色的膠體金溶液。
(2) 蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記。邊攪拌邊逐滴加入兔抗TM抗體至膠 體金溶液中，蛋白質(zhì)終濃度約為8 pg/mL，繼續(xù)攪拌O. 5 h;邊攪拌 邊逐滴加入200 pL 10 %牛血清白蛋白(BSA),繼續(xù)攪拌IO min， 靜置過(guò)夜。已標(biāo)記膠體金的蛋白質(zhì)溶液于5000 g, 4 t:下離心10min; 取上清液于17000 g， 4 。C下離心30 min;吸出上清液，制得膠體金 標(biāo)記的蛋白質(zhì)，沉淀溶于2 mL磷酸緩沖液，現(xiàn)用或4 。C保存?zhèn)溆谩?br> (3)免疫膠體金層析檢測(cè)。
如圖2所示，標(biāo)號(hào)l.葡萄球菌A蛋白；2.兔抗TM抗體；3.膠 體金標(biāo)記的兔抗TM抗體。
如圖3所示，標(biāo)號(hào)l.兔抗TM抗體；2.膠體金標(biāo)記的兔抗TM 抗體。
依次將玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、吸水紙貼在底板上組成免疫金試紙 條。在免疫金試紙條的硝酸纖維膜的檢測(cè)區(qū)固定1 兔抗TM抗體， 對(duì)照區(qū)固定l jliL葡萄球菌A蛋白溶液，在金標(biāo)區(qū)加入12 pL膠體金 標(biāo)記的兔抗TM抗體，對(duì)食品樣品中是否含有TM進(jìn)行檢測(cè)。從圖2中 的紙條A可以看出，待檢樣品為對(duì)蟲下TM溶液，膜條上的檢測(cè)區(qū)出現(xiàn) 紅色斑點(diǎn)；圖2中的紙條B中加入的待檢樣品為鰱魚Par溶液，檢測(cè) 區(qū)不顯色，表明樣品中不含有TM。為了進(jìn)一步—瞼證兔抗TM抗體膠體 金層析法的特異性，分別4全測(cè)了對(duì)壞TM、青蟹TM酶解液和對(duì)蚱TM 經(jīng)10kGy輻照后溶液，如圖3所示，對(duì)蟲下TM溶液的檢測(cè)區(qū)出現(xiàn)紅色 斑點(diǎn)(圖3中的紙條A)，而另兩種溶液的;f企測(cè)區(qū)均無(wú)顯色(圖3中 的紙條B和圖3中的紙條C),表明這兩種溶液中的TM均已降解。
實(shí)施例2:奸蟹類TM的膠體金層析檢測(cè)過(guò)每丈者血清中是否含有 TM抗體
如圖4所示，標(biāo)號(hào)l.對(duì)蚱TM; 2.青蟹TM; 3.膠體金標(biāo)記的 對(duì)奸TM。
免疫膠體金層析試紙條的制備參照實(shí)施例1(其中膠體金標(biāo)記的 蛋白質(zhì)由實(shí)施例1的兔抗TM抗體換為本實(shí)施例中的奸蟹類TM)。在 免疫金試紙條的硝酸纖維膜上的兩個(gè)檢測(cè)區(qū)分別固定1 pL對(duì)奸TM 和青蟹TM，金標(biāo)區(qū)加入12 ^L膠體金標(biāo)記的對(duì)蝦TM,對(duì)人體血清樣 品中是否含有TM抗體進(jìn)行檢測(cè)。從圖4中的紙條A可以看出，待檢
樣品為TM過(guò)每丈者血清，結(jié)果兩個(gè)檢測(cè)區(qū)均出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)；圖4中的 紙條B中加入的待^r樣品為Par過(guò)敏者血清，結(jié)果兩個(gè)4全測(cè)區(qū)均不顯 色，表明樣品中不含有TM抗體。
實(shí)施例3:鰱魚Par的膠體金層析檢測(cè)過(guò)敏者血清中是否含有Par
抗體
如圖5所示，標(biāo)號(hào)1.鰱魚Par; 2.鯽魚Par; 3.月交體金標(biāo)記 的鰱魚Par。
免疫膠體金層析試紙條的制備參照實(shí)施例1(其中膠體金標(biāo)記的 蛋白質(zhì)由實(shí)施例1的兔抗TM抗體換為本實(shí)施例中的鰱魚Par)。在 硝酸纖維膜上的兩個(gè)檢測(cè)區(qū)分別固定1 piL鰱魚Par和鯽魚Par,金 標(biāo)區(qū)加入12 ^L膠體金標(biāo)記的鰱魚Par，對(duì)人體血清樣品中是否含有 Par抗體進(jìn)行4企測(cè)。從圖5中的紙條A可以看出，待才企樣品為Par過(guò) 敏者血清，結(jié)果兩個(gè)檢測(cè)區(qū)均出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)；圖5中的紙條B中加入 的待檢樣品為TM過(guò)敏者血清，結(jié)果兩個(gè)檢測(cè)區(qū)均不顯色，表明樣品 中不含有Par抗體。
實(shí)施例4:膠體金層析同時(shí)檢測(cè)過(guò)敏者血清中是否含有TM抗體 和Par抗體
如圖6所示，標(biāo)號(hào)1.鰱魚Par; 2.對(duì)奸TM; 3.月交體金標(biāo)記的 葡萄球菌A蛋白。
免疫膠體金層析試紙條的制備參照實(shí)施例1(其中膠體金標(biāo)記的 蛋白質(zhì)由實(shí)施例1的兔抗TM抗體換為本實(shí)施例中的對(duì)蚱TM和鰱魚 Par)。在免疫金試紙條硝酸纖維膜上的兩個(gè)檢測(cè)區(qū)分別固定1 pL 對(duì)蝦TM和鰱魚Par，金標(biāo)區(qū)加入12 jiL膠體金標(biāo)記的葡萄球菌A蛋 白，對(duì)人體血清樣品中是否含有TM抗體和Par抗體同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。 從圖6-A可以看出，待檢樣品為TM過(guò)敏者血清，膜條上對(duì)壞TM固定
處出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，鰱魚Par固定處不顯色；圖6-B中加入的待4企樣品 為Par過(guò)敏者血清，膜條上鰱魚Par固定處出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，對(duì)蝦TM 固定處不顯色；圖6-C中加入的待枱二樣品為無(wú)過(guò)每丈者血清，膜條上對(duì) 奸TM和鰱魚Par固定處均不顯色。
權(quán)利要求
1、一種檢測(cè)水產(chǎn)品食物過(guò)敏的免疫膠體金層析方法，其特征在于其具體步驟如下(1)制備膠體金吸取0.5-2.0mL氯金酸加到50-200mL超純水中，加熱至沸騰后，迅速加入2-5mL 1％檸檬酸三鈉，加熱煮沸5-10min，獲得透明、酒紅色的膠體金溶液；(2)膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)邊攪拌邊逐滴加入蛋白溶液至膠體金溶液中，蛋白質(zhì)終濃度約為5-15μg/mL，繼續(xù)攪拌0.5-1h；邊攪拌邊逐滴加入100-300μL 10％牛血清白蛋白(BSA)，繼續(xù)攪拌10-15min，靜置過(guò)夜；取已標(biāo)記蛋白質(zhì)的膠體金溶液于5000g，4℃下離心10-15min；取上清液于17000g，4℃下離心30-45min；吸出上清液，沉淀溶于1-3mL磷酸緩沖液中，制得膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)，現(xiàn)用或4℃保存?zhèn)溆谩?3)免疫膠體金層析檢測(cè)依次將玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、吸水紙貼在底板上組成免疫金試紙條；分別在免疫金試紙條的硝酸纖維膜的檢測(cè)區(qū)滴加1-3μL膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)和對(duì)照區(qū)滴加1-3μL葡萄球菌A蛋白，蛋白質(zhì)濃度為0.5-5mg/mL，烘干；在金標(biāo)區(qū)滴加10-20μL膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)，膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)濃度為0.5-5mg/mL；在玻璃纖維區(qū)滴加20-200μL待檢樣品反應(yīng)5-10min，若檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)都出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；若檢測(cè)區(qū)無(wú)顯色而對(duì)照區(qū)出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性；若對(duì)照區(qū)不顯色，樣品檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。
2、 根據(jù)照權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水產(chǎn)品食物過(guò)敏的免疫膠體金 層析方法，其特征在于用膠體金標(biāo)記過(guò)敏原抗體或過(guò)敏原并制備免 疫金試紙條，用于檢測(cè)水產(chǎn)品食物過(guò)敏的免疫膠體金層析試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)水產(chǎn)品食物過(guò)敏的免疫膠體金層析方法，它包括制備膠體金、蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記、免疫膠體金層析檢測(cè)等步驟。本發(fā)明是利用免疫膠體金層析技術(shù)對(duì)水產(chǎn)品食物過(guò)敏進(jìn)行檢測(cè)，該技術(shù)既有酶免疫法的特異性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，又有點(diǎn)刺試驗(yàn)的快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，可快速檢出食物中是否存在水產(chǎn)品過(guò)敏原或人體血清中是否含有水產(chǎn)品過(guò)敏原抗體。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101358981SQ20081007173
公開日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2008年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月4日
發(fā)明者劉光明, 曹敏杰, 苑 沈 申請(qǐng)人:集美大學(xué)