專利名稱：利用電阻抗傳感技術(shù)分析細胞遷移的方法及其專用裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析細胞遷移的方法及其專用裝置，特別涉及利用電阻抗傳感 技術(shù)分析細胞遷移的方法及其專用裝置。
背景技術(shù)：
細胞遷移是一種細胞的運動現(xiàn)象，是細胞在化學(xué)信號或其他因素的影響下在空 間上發(fā)生的位置轉(zhuǎn)移。在包括胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、免疫應(yīng)答以及腫瘤轉(zhuǎn)移在內(nèi)的 眾多生理和病理過程中，細胞遷移都扮演著極為重要的角色。在腫瘤治療過程中， 腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡率增高的重要因素，而腫瘤轉(zhuǎn)移則與腫瘤細胞的遷移有著 極為密切的聯(lián)系，為了攻克腫瘤，在抗腫瘤藥物篩選和藥物研發(fā)中人們也把目光投 向了對腫瘤細胞遷移有抑制作用的抗轉(zhuǎn)移類藥物。這些都說明對于細胞遷移的分析 無論對于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)研究還是對于藥物工業(yè)等現(xiàn)代化生物技術(shù) 領(lǐng)域來說都具有重要的意義。而傳統(tǒng)的對細胞遷移進行檢測的方法，例如愈傷分析， 通常需要在體外培養(yǎng)的單層細胞上形成物理刮痕，然后利用顯微鏡對細胞遷移過程 進行光學(xué)觀察。這些方法往往依賴于繁重的手工勞動，而且實驗重復(fù)性低，依賴于 定性觀察，難以進行定量測量。因而，難以滿足現(xiàn)代生物學(xué)研究以及現(xiàn)代生物技術(shù) 產(chǎn)業(yè)對細胞遷移測量的需要。這成為擺在諸多科研工作者面前的一個難題。
自組裝單分子層技術(shù)是一種利用某些分子的自組裝特性在基底(例如玻璃、硅、 金等)表面自動形成整齊排列的分子層結(jié)構(gòu)的技術(shù)，依據(jù)用途以及基底類型的不同， 有各種不同的單分子層。
細胞電阻抗傳感技術(shù)是一種能夠?qū)毎?形態(tài)學(xué)"變化進行實時、定量、無 需標記以及無創(chuàng)傷檢測的自動化電測量技術(shù)。這種技術(shù)的原理是在絕緣基底上加工 微電極或微電極陣列，并在基底上進行細胞培養(yǎng)，當在電極上施加微弱的交流電信 號時，由于細胞的絕緣性質(zhì)，其會對電場造成一定的阻礙作用，通過對這種阻礙作 用(阻抗)的測量，可以間接測量細胞的生物學(xué)行為。例如，當有細胞在培養(yǎng)環(huán)境 中貼附、增殖或者其形態(tài)發(fā)生一定的變化時，其與基底之間的黏附狀態(tài)發(fā)生變化時， 其對電場的阻礙作用也會發(fā)生變化。通過對阻抗的測量就可以將細胞的這種變化動
態(tài)地測量出來。細胞電阻抗傳感技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于進行細胞增殖(cdl proliferation),胞微運動(cell micromotion)，細胞屏障功能研究 (cell barrier fimction)，細胞趨化現(xiàn)象研究(chemotactic cell motility)，細胞凋亡 (cell apoptosis)，細胞愈傷分析(wound-healing assay)，體外細胞毒性分析(in vitro cell cytotoxicity)以及細胞對外界物理或化學(xué)刺激的響應(yīng)(cell response to physical and chemical changes )等相關(guān)石開究。
2004年Keese等報到了一種利用強烈細胞電穿孔形成沒有細胞的空白區(qū)域，配 合細胞電阻抗傳感技術(shù)進行細胞遷移分析的方法(Keese 2004)。在該方法中， 金屬電極被加工在用于細胞培養(yǎng)的絕緣基底上，將待分析的細胞接種于絕緣基底上 并進行細胞培養(yǎng)，待細胞長滿基底(當然，也長滿電極)，在電極上施加幅值較大 的電脈沖，使得電極區(qū)域的細胞由于強烈的不可逆細胞電穿孔而被殺死，造成電極 區(qū)域出現(xiàn)沒有細胞的空白區(qū)域，此時細胞開始由電極周圍向電極表面區(qū)域遷移，用 細胞電阻抗傳感技術(shù)實時監(jiān)測細胞在電極上的遷移狀況，便可以檢測細胞遷移進 程。這種方法將細胞遷移的檢測過程高度自動化地完成了，這是其優(yōu)點，但是強烈 的細胞電穿孔會對電極周圍細胞的活性造成不良影響，另外，電極區(qū)域也會殘留細 胞死亡后留下的殘骸，這些都有可能影響細胞遷移的檢測結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用電阻抗傳感技術(shù)分析細胞遷移的方法及其專用 裝置。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)實時、連續(xù)測量細胞在自然培養(yǎng)狀態(tài)下的遷移速率。
本發(fā)明所提供的利用電阻抗傳感技術(shù)分析細胞遷移的方法，包括如下步驟
1) 處理設(shè)有至少一對電極的絕緣基底，使所述電極上形成自組裝單分子層， 該單分子層能夠阻止細胞在電極表面的貼附，在所述電極上施加電信號后該分子層 能夠被解離；
2) 培養(yǎng)待檢測細胞，使待檢測細胞長滿除覆蓋有自組裝單分子層的所述電極 外的區(qū)域；
3) 在所述電極上施加電信號，使得電極上修飾的自組裝單分子層解離；
4) 利用電阻抗傳感方法對待測細胞在電極上的遷移情況進行檢測。
其中，所述電極為金屬單電極和/或金屬電極陣列；所述金屬為金或鉑；所述 自組裝單分子層由巰基化合物形成，如HS(CH2)u(0CH2CH2)60H。所述電信號是直流信 號、 一種頻率的交流信號或多種頻率交流信號；所述待測細胞為腫瘤細胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用所述方法分析細胞遷移的專用裝置。本發(fā)明提供的用所述方法分析細胞遷移的專用裝置，包括一個阻抗測量系統(tǒng)和 至少一個細胞遷移組件，所述細胞遷移組件包括用于培養(yǎng)細胞的腔體、固設(shè)于所述 腔體中的電極器件；所述電極器件包括絕緣基底和加工于所述絕緣基底上的電極； 所述至少一個細胞遷移組件通過所述電極器件與所述一個阻抗測量系統(tǒng)電連接，其 中，所述電極上自組裝有單分子層，該單分子層能夠阻止細胞在電極表面的貼附， 所述電極上施加電信號后該分子層能夠被解離。
所述電極為金屬單電極和/或金屬電極陣列；所述金屬為金或鉑；所述自組裝 單分子層由聚乙醇巰基化合物形成，如HS(CH2)n(0CH2CH2)e0H;所述電信號是直流信 號、 一種頻率的交流信號或多種頻率交流信號；所述待測細胞為腫瘤細胞。
本發(fā)明所述的方法、所述的裝置可在藥物篩選或藥物評價中的應(yīng)用。
具體可按照如下方法進行
a、 在所述裝置的腔體中接種并培養(yǎng)待測細胞，加入待測化合物；
b、 測量細胞遷移的速率；
c、 評估待測化合物對待測細胞遷移速率的影響。
本發(fā)明利用自組裝技術(shù)在電極上形成致密的單分子層，阻止細胞在電極上的貼 附和生長，最終形成沒有細胞貼附的電極區(qū)域，當在電極上施加一定強度的電脈沖 時，這種單分子層便會解離并離開電極，細胞從而可以從絕緣基底向電極遷移，當 細胞在電極上遷移時可以阻礙電極之間的電流流動，引發(fā)測量的阻抗發(fā)生變化，這 種阻抗的變化可以實時反映細胞遷移的進程，從而可以對細胞遷移過程進行實時、 定量的分析。由于這種電阻抗測量的方法具有高通量和高度自動化的特征，具有實 時性和定量性的優(yōu)勢，所以測量可以全自動進行，無需人工干預(yù)，并且具有易于在 微型全分析系統(tǒng)中集成等諸多優(yōu)勢。


圖l為用于細胞遷移自動化分析裝置的示意圖。其中，A為測量電極，B為參 比電極，C為細胞培養(yǎng)腔體，D和E分別為用于將參比電極/測量電極與阻抗測量系 統(tǒng)連接的端口， F為絕緣基底，G為阻抗測量系統(tǒng)。
圖2為用于實現(xiàn)高通量細胞遷移自動化分析裝置的示意圖。 圖3為利用細胞遷移分析裝置分析鼠成纖維細胞系NIH/3T3細胞的遷移 (A)為利用細胞遷移分析裝置測得的阻抗曲線；(B)為在圖(A)曲線的B點 時拍攝的顯微鏡照片；(C)為在圖(A)曲線的C點時拍攝的顯微鏡照片；(D)為在圖(A)曲線的D點時拍攝的顯微鏡照片；(E)為在圖(A)曲線的E點時拍攝的 顯微鏡照片。
圖4為利用細胞遷移分析裝置分析秋水仙素抑制人宮頸癌CasKi細胞遷移 (A)為利用細胞遷移分析裝置測得的阻抗曲線；(B)為利用公式1計算得到 的遷移的平均速率。
具體實施例方式
實施例l、制備用于細胞遷移分析的裝置
用于分析細胞遷移的裝置的示意圖如圖l所示，包括用于培養(yǎng)細胞的腔體C、 固設(shè)于所述腔體C中的電極器件和與所述電極器件電連接的阻抗測量系統(tǒng)G。所述 電極器件由絕緣基底F以及加工在絕緣基底F上的微電極陣列A、單電極B、接點D 和E構(gòu)成。其中，微電極陣列A為測量電極，單電極B為參比電極。阻抗測量系統(tǒng) G通過接點D和E與電極器件相連。阻抗測量系統(tǒng)G為能夠?qū)﹄姌O之間阻抗的模數(shù) 進行測量的儀器，例如安捷倫公司的阻抗分析儀(HP 4284A precision LCRmeter)。
該細胞遷移分析的裝置可用如下方法制備用微加工技術(shù)在絕緣基底上加工出 金屬電極陣列，將帶有金屬電極陣列的絕緣基底鑲嵌于能夠進行體外細胞培養(yǎng)的腔 體底部，并使巰基化合物在電極上形成自組裝單分子層，該單分子層能夠阻止細胞 在其表面的貼附。當在測量電極上施加特定的電信號(如用幅值為1.5V的直流電 信號施加于測量電極上30秒；測量電極作為陰極，插入培養(yǎng)細胞腔體的鉑絲作為 陽極)后該單分子層能夠被解離，最后將測量電極和參比電極與阻抗測量系統(tǒng)相連，
構(gòu)成完整的細胞遷移測量裝置。具體的制備方法如下
首先，將用于加工細胞遷移分析裝置的玻璃基片用濃硫酸/雙氧水(體積比3:
1)清洗干凈。然后，用微加工工藝中的光刻技術(shù)按照圖l所示的電極結(jié)構(gòu)進行光 刻，形成圖1中所示的電極圖形。接下來，利用微加工工藝中的磁控濺射技術(shù)按照 圖1中電極結(jié)構(gòu)的圖案將金濺射在玻璃基片上，形成能夠進行阻抗傳感測量的微電 極陣列，將帶有微電極陣列的玻璃基片鑲嵌于能夠進行體外細胞培養(yǎng)的腔體底部，
然后在細胞培養(yǎng)腔體中加入1.5 ramol/L的HS(CH2)u(0CH2CH2)e0H (sigma-aldrich， 675105)對微電極陣列進行浸泡，時間為6個小時，溫度為室溫， (HS(CH2)u(0CH2CH2)60H與金電極表面結(jié)合而形成致密的自組裝單分子層，這種單分 子層能夠阻止細胞的貼附。最后將金電極與阻抗測量系統(tǒng)相連，構(gòu)成完整的細胞遷 移分析裝置。本實施例中應(yīng)用的是一對電極，但也可以是多對電極，如二對、三對，電極之 間可以組合，例如兩對電極時， 一共四個電極，可以兩兩連接，構(gòu)成參比電極和測 量電極。再如三對電極時， 一共六個電極，可以任選三個電極相互連接構(gòu)成測量電 極，其余三連接后構(gòu)成參比電極。
本發(fā)明所述方法可以進行高通量測量，如附圖2所示，阻抗測量系統(tǒng)與多個 細胞遷移組件連接即得到高通量的細胞遷移分析的裝置。
實施例2、利用細胞遷移分析裝置分析鼠成纖維細胞系NIH/3T3細胞的遷移 在細胞遷移分析裝置的細胞培養(yǎng)腔體中接種鼠成纖維細胞系NIH/3T3細胞，并 在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行細胞培養(yǎng)，約24小時后，待細胞在絕緣基底上長滿后，在電 極上施加一個直流脈沖，金電極做負極，插入溶液的鉑絲做正極，電壓幅值為0.8V， 時間約為30秒，單分子層可以從電極上去除。此時細胞開始向金電極上遷移，實 時測量電極間的阻抗(用于阻抗測量所施加的交流電頻率為40kHz，電極間的電壓 在微伏特量級)，隨著細胞在電極上的遷移，阻抗信號逐漸變大，約6個小時后阻 抗信號達到飽和值。細胞開始遷移到細胞長滿整個電極所需要的時間T可以從阻抗 曲線獲得。細胞開始遷移到細胞長滿整個電極所需要的時間T為從施加直流脈沖電 信號開始到阻抗曲線飽和為止所需的時間。根據(jù)公式1對細胞遷移的平均速率(ASO 進行計算。
AS = /PXT—1 (1) 其中，/ 為測量電極(圖1A)的半徑。
對HIH-3T3細胞的遷移進行分析的實驗結(jié)果如圖2所示。實驗獨立重復(fù)3次。其 中圖2 (A)為利用細胞遷移分析裝置測得的阻抗曲線；(B)為在圖(A)曲線的B 點時拍攝的顯微鏡照片，用自組裝單分子層技術(shù)所形成的細胞圖案，可以看出圓形 的金電極上沒有細胞貼附，而絕緣基底上已經(jīng)布滿了細胞，形成細胞單層。這有力 地驗證了本發(fā)明用自組裝單分子層技術(shù)形成"創(chuàng)傷"的實驗結(jié)果。(C)為在圖(A) 曲線的C點時拍攝的顯微鏡照片；(D)為在圖(A)曲線的D點時拍攝的顯微鏡照片;
(E)為在圖(A)曲線的E點時拍攝的顯微鏡照片。這些顯微鏡照片驗證了阻抗曲 線測量的結(jié)果，即細胞在電極上遷移得越遠，阻抗越大。在圖2 (A)中的E點所示 位置，阻抗基本飽和，因而從圖2 (A)中的B點到E點的時間間隔即為NIH-3T3細胞 開始遷移到細胞長滿整個電極所需要的時間T (這里T約為6小時)，用電極的半徑
(200 Wn)和時間T根據(jù)公式1便可以計算細胞遷移的平均速率A5^: 33.33 Wn/h。實施例3、利用細胞遷移分析裝置分析秋水仙素抑制人宮頸癌CasKi細胞遷移 在細胞遷移分析裝置的細胞培養(yǎng)腔體中接種人宮頸癌CasKi細胞(ATCC， Manassas, VA)，并在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行細胞培養(yǎng)約24小時，待細胞在絕緣基底 上長滿后，在電極上施加一個直流脈沖，電極做負極，插入溶液的鉑絲做正極，電 壓幅值約為0.8V，時間約為30秒，單分子層可以從電極上去除，此時在細胞培養(yǎng) 基中加入濃度分別為O. 1 MM、 0.2 HM和O. 4 pM的秋水仙素(sigma-aldrich， 675105)，并進行阻抗測量。實驗結(jié)果如圖3所示。實驗獨立重復(fù)了3次。其中圖 3 (A)為測得的阻抗曲線，可以明顯觀察到相比于對照(未加秋水仙素)，加入秋 水仙素的細胞遷移速度明顯減慢，并且秋水仙素濃度越高，抑制效果就越發(fā)明顯， 呈現(xiàn)出秋水仙素濃度依賴性的特征。圖3 (B)為根據(jù)公式1計算得到的遷移平均速 率。
上述實驗結(jié)果表明本發(fā)明用自組裝單分子層技術(shù)與細胞電阻抗傳感技術(shù)相結(jié) 合而制備的細胞遷移分析裝置能夠?qū)毎w移過程進行定量、實時和自動化的分 析。本發(fā)明的細胞遷移分析裝置和方法能對待測化合物進行藥物篩選和評價。
權(quán)利要求
1、利用電阻抗傳感技術(shù)分析細胞遷移的方法，包括如下步驟1)加工形成含有至少一對電極的絕緣基底，使所述電極上形成自組裝單分子層，該單分子層能夠阻止細胞在電極表面的貼附，所述電極上施加電信號后該分子層能夠被解離；2)培養(yǎng)待檢測細胞，使待檢測細胞長滿除覆蓋有自組裝單分子層的所述電極外的區(qū)域；3)在所述電極上施加電信號，使得電極上修飾的自組裝單分子層解離；4)利用電阻抗傳感方法對待測細胞在電極上的遷移情況進行檢測。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述電極為金屬單電極和/或金屬 電極陣列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述金屬為金或鉑。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述自組裝單分子層由聚乙醇巰 基化合物形成，如HS (CH2) (OCH2CH2) 60H。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述電信號是直流信號、一 種頻率的交流信號或多種頻率交流信號；所述待測細胞為腫瘤細胞。
6、 一種用于細胞遷移分析的裝置，包括一個阻抗測量系統(tǒng)和至少一個細胞遷移 組件，所述細胞遷移組件包括用于培養(yǎng)細胞的腔體、固設(shè)于所述腔體中的電極器件； 所述電極器件包括絕緣基底和加工于所述絕緣基底上的電極；所述至少一個細胞遷移 組件通過所述電極器件與所述一個阻抗測量系統(tǒng)電連接，其特征在于所述電極上自 組裝有單分子層，該單分子層能夠阻止細胞在電極表面的貼附，所述電極上施加電信 號后該分子層能夠被解離。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于所述電極為金屬單電極和/或金屬 電極陣列。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的裝置，其特征在于所述金屬為金或鉑；所述自組裝單分子層由聚乙醇巰基化合物形成，如HS(CH2) (0CH2CH2)60H。
9、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的裝置，其特征在于所述電信號是直流信號、一 種頻率的交流信號或多種頻率交流信號；所述待測細胞為腫瘤細胞。
10、 權(quán)利要求1至5中任一所述的方法或權(quán)利要求6至9中任一所述的裝置在藥 物篩選或藥物評價中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用電阻抗傳感技術(shù)分析細胞遷移的方法及其專用裝置。該方法包括如下步驟1)處理設(shè)有至少一對電極的絕緣基底，使所述電極上形成自組裝單分子層，該單分子層能夠阻止細胞在電極表面的貼附，所述電極上施加電信號后該分子層能夠被解離；2)培養(yǎng)待檢測細胞，使待檢測細胞長滿除覆蓋有自組裝單分子層的所述電極外的區(qū)域；3)在所述電極上施加電信號，使得電極上修飾的自組裝單分子層解離；4)利用電阻抗傳感方法對待測細胞在電極上的遷移情況進行檢測。本發(fā)明還公開了分析細胞遷移的專用裝置。該方法和裝置具有實時性和定量性，可在藥物篩選或評價中應(yīng)用。
文檔編號G01N33/48GK101556273SQ20081010352
公開日2009年10月14日 申請日期2008年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月8日
發(fā)明者璟 朱, 磊 王, 京 程, 橙 鄧 申請人:博奧生物有限公司;清華大學(xué)