專利名稱：蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于各種蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑，所述各種蛋白質(zhì)待用于例如 臨床診斷試劑、臨床診斷設備、生物芯片等。
背景技術(shù)：
通常將牛血清白蛋白(BSA)添加到用作臨床診斷試劑的蛋白質(zhì)(比 如標記的抗體、標記的抗原、酶、第一抗體和原始抗原(primary antigen))中以保持所述蛋白質(zhì)在溶液狀態(tài)下的活性。然而，即使當加 入BSA時，所述蛋白質(zhì)的活性仍然降低。而且，當使用源自活生物體 的穩(wěn)定劑時，則存在由BSE所代表的生物污染問題。因此，需要開發(fā) 一種由化學合成得到的高效蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。已經(jīng)提出的由化學合成得到的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑包括JP-A-10-45794中 具有磷酰膽堿的聚合物、JP-A-10-279594中的脂肪酸酯比如作為代表的 三酰基甘油的膜、JP-A-11-69973中的由甘油所代表的多元醇、以及 JP-A-7-255477中含有葡萄糖苷衍生物作為單體單元的聚合物。然而， 這些穩(wěn)定劑在保持蛋白活性的作用方面是不足的。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種由化學合成得到的高效蛋白質(zhì)穩(wěn)定 劑，所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑用于維持待用作臨床診斷劑的標記的抗體等的活 性。本發(fā)明的此目的和其它目的通過包含共聚物的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑實現(xiàn)， 所述共聚物包含由下式(1)所表示的重復單元(A):3<formula>formula see original document page 4</formula>其中W和W各自獨立地表示氫原子或者具有1 ~ 8個碳原子的取代 或未取代的烷基，并且1^和112可彼此相連以形成環(huán)結(jié)構(gòu)；和由下式(2)所表示的重復單元(B):<formula>formula see original document page 4</formula>其中RS表示氫原子或曱基，I^表示苯基或由-C02RS所表示的基團， 其中RS表示具有1 ~ 12個碳原子的取代或未取代的烷基、脂環(huán)族烴基、 或芳族烴基。
具體實施方式
為解決此問題，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種具有特定組成的共聚物，該共 聚物具有高效的蛋白質(zhì)穩(wěn)定作用并因此完成了本發(fā)明。在上述蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑中，所述重復單元(A)可以是如下的單元， 其中在式(l)中，Ri是氫原子或甲基，W是選自氫原子、甲基和羥乙 基中的至少一個基團。在上述蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑中，所述重復單元(B)可以是源自在水中溶 解度小于20%的至少一種單體的結(jié)構(gòu)。在上述蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑中，上述重復單元(B)可以是如下的單元， 其中在式(2)中，W是氫原子或甲基，114是由-<:02議5所表示的基團， RS是選自甲基、乙基、和甲氧基乙基中的至少一個基團。根據(jù)上述蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，可通過包含含有由式(1)所表示的重復單元(A)和由式(2)所表示的重復單元(B)的共聚物而得到高效的 蛋白質(zhì)穩(wěn)定作用。以下將詳細描述根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。 1.蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑 1.1.蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的組成根據(jù)本實施方案，蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑包含共聚物，所述共聚物包含由下式(1)所表示的重復單元(A):其中Ri和I^各自獨立地表示氫原子或者具有l(wèi) 8個碳原子的取代 或未取代的烷基，并且1^和112可彼此相連以形成環(huán)結(jié)構(gòu)；和由下式(2)所表示的重復單元(B):其中R3表示氫原子或甲基，R4表示苯基或由-C02R5所表示的基團， 其中RS表示具有1 ~ 12個碳原子的取代或未取代的烷基、脂環(huán)族烴基、 或芳族烴基。根據(jù)本實施方案，所述蛋白穩(wěn)定劑可包含上述共聚物作為所述蛋白 質(zhì)穩(wěn)定劑的一部分，或者所述蛋白穩(wěn)定劑可僅由上述共聚物組成。1丄1重復單元(A)在上述共聚物中，由式(1)所表示的重復單元(A)是有助于表現(xiàn) 出高效蛋白質(zhì)穩(wěn)定作用的主體。在式(l)中，由1^或112所表示的具有1~8個碳原子的取代或未 取代烷基的實例包括直鏈或支鏈的取代或未取代的烷基。所述取代的烷 基可以被比如羥基的官能團取代。此外，W和112可彼此連接以形成環(huán) 結(jié)構(gòu)。例如，在式(l)中，優(yōu)選Ri是氫原子或甲基，W是選自氫原子、 甲基、和羥乙基的至少一個基團。1.1.2.重復單元(B)在上述共聚物中，由式(2)所表示的重復單元(B)使所述共聚物 的親水/疏水平衡移動到疏水側(cè)，以有助于表現(xiàn)出更高效的蛋白質(zhì)穩(wěn)定 作用。在式(2 )中，由RS所表示的具有1 ~ 12個碳原子的取代或未取代 烷基的實例包括直鏈或支鏈的取代或未取代烷基。所述取代的烷基可以 被比如烷氧基的官能團取代。此外，在式(2)中，由RS所表示的脂環(huán)族烴基的實例包括異水片 基和環(huán)己基。由R"所表示的芳族烴基的實例包括千基。例如，在式(2)中，優(yōu)選113是氫原子或甲基，R"是由-C02R5所 表示的基團，R5是選自甲基、乙基、和曱氧基乙基的至少一個基團。此外，優(yōu)選所述重復單元(B)是源自在水中溶解度小于20%的至 少一個單體的結(jié)構(gòu)。此外，上述共聚物可包含重復單元(A)的一種或多種和重復單元 (B)的一種或多種。在此方面，上述共聚物可包含除所述重復單元(A) 和重復單元(B)以外的其它重復單元(C)。1.2.蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的制備以下將描述待用于制備上述共聚物的單體的組成。1.2.1.單體(a)單體(a)是用于形成重復單元(A)的組分。優(yōu)選單體(a)是選 自丙烯酰胺和丙烯酰胺的N-取代單體的至少一種單體。丙烯酰胺的N-取代單體的實例包括N,N-二曱基丙烯酰胺、N,N-二 乙基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、N-羥乙基丙烯酰胺、丙烯?；鶈徇?、 雙丙酮丙烯酰胺等。更優(yōu)選單體(a)是選自丙烯酰胺、N-羥乙基丙烯酰胺、和N，N-二 甲基丙烯酰胺中的至少一種。進一步優(yōu)選單體(a)是N,N-二甲基丙烯 酰胺。1.2.2單體(b )單體(b)是用于形成重復單元(B)的成分。單體(b)是在水中 溶解度小于20%的至少一種單體。單體(b)的實例包括(曱基)丙烯酸曱氧基乙酯、(甲基)丙烯酸曱酯、 (甲基)丙烯酸乙酯、(曱基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯 酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸月桂酯、(曱基)丙烯酸環(huán)己酯、(甲基)丙烯 酸異冰片酯、(曱基)丙烯酸千酯、苯乙烯等。更優(yōu)選單體(b)是選自曱 基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯和丙烯酸甲氧基乙酯中的至少一種。在本發(fā)明中，"在水中溶解度小于20%的單體"是這樣的單體，其 中在加入所述單體并攪拌以得到在25n在水中20。/。的單體濃度后，可 視覺確定單體從所述水相中分離出來。1.2.3單體的組成和聚合單體(c)是形成另一重復單元(C)的成分。通過使1%~10%重 量的作為其它單體(c)的陰離子單體(尤其是苯乙烯磺酸、異戊二烯 磺酸、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸等)與單體(a)和單體(b)共聚 而制備共聚物，在所述共聚物用作免疫診斷試劑稀釋劑的情況下，有時 得到對非特異性分析物的信號抑制作用。用于制備為根據(jù)本實施方案的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的所述共聚物的單體的組成優(yōu)選為30% ~ 99%重量的單體(a )、 1% ~ 70。/。重量的單體(b )、 以及0% ~ 49。/。重量的其它單體(c);更優(yōu)選40% ~ 95。/。重量的單體(a )， 5% ~ 60%重量的單體(b )，以及0% ~ 20%重量的其它單體(c )。所述單體可在作為工業(yè)原料得到的單體純化之后或未純化而用于 共聚反應中?？赏ㄟ^已知的聚合方法比如自由基聚合、陰離子聚合、或陽離子聚 合進行聚合。考慮到制備的容易性，可優(yōu)選自由基聚合。此外，也可通過將所述單體與已知溶劑、引發(fā)劑、鏈轉(zhuǎn)移劑等一起 攪拌并加熱,實現(xiàn)所述聚合。聚合時間通常為30分鐘至24小時，聚合溫度為約o~i20x:。1.3.蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的物理性質(zhì)和用途根據(jù)本實施方案的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(共聚物)的數(shù)均分子量通常為 1000 ~ 1000000，優(yōu)選2000 ~ 100000，更優(yōu)選3000 ~ 50000。此外，根 據(jù)本實施方案的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(共聚物)的分子量分布作為重均分子量 /數(shù)均分子量通常為1.5 ~ 3。包含于根據(jù)本實施方案的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑中的共聚物是可溶于水的。 在本發(fā)明中，"可溶于水的"指當在25C下將所述共聚物加入水中并混 合以得到1%的聚合物固體含量時，所述共聚物視覺上澄清可溶的狀態(tài)。通過將本實施方案的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑加入到蛋白質(zhì)溶液中可以長時 間保持蛋白質(zhì)活性，所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑作為待用作臨床診斷試劑的標記 抗體、標記抗原、酶、第一抗體、和原始抗原的穩(wěn)定劑；血漿制品中所 包含蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑；待用于清洗隱形眼鏡的酶等的穩(wěn)定劑。另外，根 據(jù)本實施方案的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑具有抑制涂覆容器、裝置等對蛋白質(zhì)的非 特異性吸附的作用，以及通過用作免疫診斷試劑的稀釋劑而具有抑制非 特異性分析物的信號的作用。2.實施例雖然以下將參考實施例更詳細地描述本發(fā)明，但本發(fā)明并非局限于此。2.1實施例1在將卯g作為單體(a)的二甲基丙烯酰胺、10g作為單體(b)的 甲基丙烯酸甲酯、和4g作為鏈轉(zhuǎn)移劑的鹽酸半胱胺與900g水混合后， 將所得混合物置于配備有攪拌器的可分離的燒瓶中。在向混合物中通入 氮氣的情況下，將混合物的溫度升高至70t:。在加入182，2，-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽后，繼續(xù)聚合2小時。在將溫度升高至80r并進行 老化3小時后，將混合物冷卻至室溫。通過透析和進一步的凍干，純化 所得共聚物溶液，得到82g本實施例的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-l)。通過GPC測得所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-l)的數(shù)均分子量是5000，其 重均分子量是10000。用1%蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-l)的水溶液將辣根過氧化物酶標記的小鼠 IgG抗體(由Millipore生產(chǎn)的AP124P)稀釋100000倍，并以TMB (3,3，，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺/過氧化氫水溶液/硫酸顯色，然后測量在450 rnn的吸光度(在貯存前測量吸光度)。還用1%的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-l) 的水溶液將辣根過氧化物酶標記的小鼠IgG抗體(由Millipore生產(chǎn)的 AP124P)稀釋100000倍，然后將其在4n下貯存10天。此后，以同樣 方式測量吸光度(在貯存后測量吸光度)。結(jié)果，當將貯存前蛋白質(zhì)穩(wěn) 定劑(S-l)的吸光度視為100%時，發(fā)現(xiàn)貯存后的吸光度(其為蛋白質(zhì) 活性保持率的指標)是89%。2.2.實施例2除了使用50gN-羥乙基丙烯酰胺作為單體(a)、 50g丙烯酸甲氧基 乙酯作為單體(b)、以及2g鹽酸半胱胺作為鏈轉(zhuǎn)移劑代替實施例1中 使用的卯g二甲基丙烯酰胺作為單體(a)、 10g甲基丙烯酸曱酯作為單 體(b)、和4g鹽酸半胱胺作為鏈轉(zhuǎn)移劑以外，按照與實施例l中相同 的方式得到蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-2)。通過GPC測得所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-2)的數(shù)均分子量是5800，其 重均分子量是11000。另外，除了使用蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-2)代替蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-l)以 外，以如實施例1中同樣的方式作為貯存前和貯存后吸光度測量的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)相對于貯存前的吸光度(100%)貯存后的吸光度為83%。 2.3實施例3除了使用50g丙烯酰胺作為單體(a)、 50g丙烯酸甲氧基乙酯作為 單體(b )、以及8 g鹽酸半胱胺作為鏈轉(zhuǎn)移劑代替實施例1中使用的卯 g二甲基丙烯酰胺作為單體(a)、 10g甲基丙烯酸甲酯作為單體(b)、 以及4g鹽酸半胱胺作為鏈轉(zhuǎn)移劑以外，按照與實施例1中相同的方式 得到蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-3)。通過GPC測得所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-3)的數(shù)均分子量是4800,其 重均分子量是9600。另外，除了使用蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-3)代替蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-l)以 外，以如實施例1中同樣的方式作為貯存前和貯存后吸光度測量的結(jié)果， 發(fā)現(xiàn)相對于貯存前的吸光度(100%) j^存后的吸光度為81%。2.4. 對比實施例1除了使用100g二甲基丙烯酰胺作為單體(a)、 2g鹽酸半胱胺作為 鏈轉(zhuǎn)移劑代替實施例1中使用的卯g二甲基丙烯酰胺作為單體(a)、 10 g甲基丙烯酸甲酯作為單體(b )、和4 g鹽酸半胱胺作為鏈轉(zhuǎn)移劑以外， 按照與實施例1中相同的方式得到共聚物(T-l)。通過GPC測得所述共聚物(T-l)的數(shù)均分子量是7800，其重均分 子量是16000。另外，除了使用共聚物(T-l)代替蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-l)以外，以 如實施例1中同樣的方式作為貯存前和貯存后吸光度測量的結(jié)果，發(fā)現(xiàn) 相對于貯存前的吸光度(100% )貯存后的吸光度為17%。2.5. 對比實施例2除了使用lOOgN-羥乙基丙烯酰胺作為單體(a)代替對比實施例1 中使用的100g二曱基丙烯酰胺作為單體(a)以外，按照與對比實施例 1中相同的方式得到共聚物(T-2)。通過GPC測得所述共聚物(T-2 )的數(shù)均分子量是5800，其重均分10子量是11000。另外，除了使用共聚物(T-2)代替蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-l)以外，以 如實施例1中同樣的方式作為貯存前和貯存后吸光度測量的結(jié)果，發(fā)現(xiàn) 相對于貯存前的吸光度(100% )貯存后的吸光度為24%。2.6對比實施例3除了使用100 g丙烯酰胺作為單體(a)代替對比實施例1中使用 的100g二甲基丙烯酰胺作為單體(a)以外，按照與對比實施例1中相 同的方式得到共聚物(T-3)。通過GPC測得所述共聚物(T-3 )的數(shù)均分子量是7600，其重均分 子量是15000。另外，除了使用共聚物(T-3)代替蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-l)以外，以 如實施例1中同樣的方式作為貯存前和貯存后吸光度測量的結(jié)果，發(fā)現(xiàn) 相對于貯存前的吸光度(100%)貯存后的吸光度為7%。2.7對比實施例4除了使用可商購的2-曱基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿/曱基丙烯酸丁 酯共聚物作為共聚物以外，以如對比實施例1中同樣的方式作為貯存前 和貯存后吸光度測量的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)相對于貯存前的吸光度(100%)貯 存后的吸光度為70%。2.8對比實施例5除了使用BSA代替蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(S-l)以外，以如實施例1中同 樣的方式作為貯存前和貯存后吸光度測量的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)相對于貯存前的 吸光度(100% ) ^存后的吸光度為71%。雖然已經(jīng)參考前述具體實施例對本發(fā)明進行了詳細描述，但對于本 領(lǐng)域技術(shù)人員而言很明顯在改變和修改不背離本發(fā)明的精神和范圍的 前提下可以進行各種的改變和修改。本專利申請基于在2007年6月13日提交的日本專利申請No. 2007-155978,其內(nèi)^it過引用并入本文中。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，其包含共聚物，所述共聚物包含由下式(1)所表示的重復單元(A)其中R1和R2各自獨立地表示氫原子或者具有1～8個碳原子的取代或未取代的烷基，并且R1和R2可彼此相連以形成環(huán)結(jié)構(gòu)；和由下式(2)所表示的重復單元(B)其中R3表示氫原子或甲基，R4表示苯基或由-CO2R5所表示的基團，其中R5表示具有1～12個碳原子的取代或未取代的烷基、脂環(huán)族烴基、或芳族烴基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，其中所述重復單元(A)是如 下的單元，其中在式(l)中，Ri是氫原子或曱基，W是選自氫原子、 曱基、和羥乙基中的至少一個基團。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，其中所述重復單元(B) 是源自在水中溶解度小于20%的至少一種單體的結(jié)構(gòu)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，其中所述重復單 元(B)是如下的單元，其中在式(2)中，RS是氫原子或甲基，議4是 由-C02RS所表示的基團，且RS是選自甲基、乙基、和甲氧基乙基中的 至少一個基團。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包含共聚物的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，所述共聚物包含由式(1)所表示的重復單元(A)和由式(2)所表示的重復單元(B)，其中R¹、R²、R³和R⁴如說明書中所定義。
文檔編號G01N33/68GK101324589SQ20081011128
公開日2008年12月17日 申請日期2008年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者小川俊博, 田守功二, 高本英司 申請人:Jsr株式會社