專利名稱：：HIV-1p24抗原吖啶酯化學發(fā)光免疫分析檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于臨床血液檢測分析方法
技術領域：
，具體涉及一種用于臨床和實驗室檢測HIV-1p24抗原的方法。該方法靈敏度高、檢測范圍寬、搡作簡便，在新生兒HIV-1感染的診斷、HIV-1感染者病情發(fā)展的監(jiān)測、耐藥性監(jiān)測、抗病毒治療效果的評價等方面有重要應用。技術背景HIV-1(Humanimmunodeficiencyvirus)病毒感染人體之后,在宿主細胞和病毒中會產(chǎn)生一些HIV感染的標志性物質(NielT.Constantine，HollyZink.HIVtestingtechnologiesaftertwodecadesofevolution.IndianJMedRes121.2005:519-524),通過這些標志物我們可以進行病毒檢驗、監(jiān)測病毒在體內(nèi)的復制情況、了解感染后病情的發(fā)展、并實時掌握人體的免疫系統(tǒng)狀況。病毒感染后，這些標志物隨著病毒侵染過程，p24抗原作為標志物之一，在病毒診斷方面受到了人們的廣泛關注。通常來講HIV-1的核酸(RNA)檢測是靈敏性和特異性的方法，但是在實際應用方面，核酸檢驗具有很多不便于推廣的因素。核酸檢測同其它檢驗方法相比，所需的實驗費用比較昂貴，所需的實驗儀器和實驗條件也比較苛刻。另外，核酸檢驗的操作復雜，為了增加檢驗結果的可靠性，就要求實驗操作人員有比較高的專業(yè)操作水平。同時，核酸實驗整體耗時較長。而從全球艾滋病毒感染者的分布情況來看(■IDS,WHO.AIDSepidemicupdate2006.)，大部分的感染者都分布在經(jīng)濟不發(fā)達的地區(qū)，如非洲等，這就為HIV-l的RNA4企測在不發(fā)達地區(qū)的推廣造成了不便。為了解決這一方面的問題人們在其它檢驗方法上估支了4艮多嘗試，如全淋巴細胞計數(shù)、紅細胞檢測、血清白蛋白檢測、p24抗原檢測、抗p24抗體檢測等，試圖以此來替代核酸檢測方法進行艾滋病的相關檢測，其中HIV-1p24抗原檢測方法的研究最為廣泛。在新生兒HIV-l診斷、HIV-l感染者病情發(fā)展的監(jiān)測、抗病毒治療效果的檢驗等方面都具有4艮好的效果，并同核酸;險測方法具有4艮好的相關性，有望替代核酸才企測在廣大不發(fā)達地區(qū)廣泛推廣。常用的HIV-1p24抗原;險測方法為酶聯(lián)免疫分析法(Enzymelinkedimmuno-sorbentassay,ELISA),并多采用雙抗夾心法進行檢測，檢測的靈敏度在3.5-10pg/ml，檢測寬度在2-3個數(shù)量級。為了提高檢測靈敏度，使HIV-1p24抗原檢測方法能在檢測靈敏性和特異性方面不斷接近核酸檢測的水平，在過去的二十幾年時間里人們在普通ELISA基礎上做了各種改進，其中最為成功的方法有ELASTELISA方法和IPCR(Immunepolymerasechainreaction)-ELISA方法等。Ledergerberetal在文獻中報道，應用ELASTELISA方法(Perkin-ElmerLifeSciences,Boston,MA)進行HIV-1型p24抗原的檢測，其才全測限可以達到0.5pg/ml。JanetM.Barletta應用免疫PCR方法同ELISA方法(Zeptomertrix，Buffalo,NY)結合，檢測低限可以達到1000個p24抗原分子。但/人實際應用中來分析以上兩種方法第一種方法所應用的》丈大體系主要是生物素-鏈親和素放大系統(tǒng)，這種體系常會在血清樣品檢驗中出現(xiàn)非特異性的反應，同時引入放大系統(tǒng)后操作步驟增加，反應時間也會延長，為了減少非特異性反應洗滌次數(shù)也要增加；第二種體系中引入的免疫PCR反應，在反應時間和操作步驟上增加難度之外，在核酸標記反應上也為實驗體系的操作上增加了不便?；瘜W發(fā)光免疫分析方法其原理與酶聯(lián)免疫方法相似，是把化學發(fā)光物質與免疫學反應結合起來，用光反應表現(xiàn)被測的免疫成分濃度。即把高靈敏的光反應與特異性的免疫學反應相結合，用發(fā)光強度來對抗原、抗體等物質進行定量分析的方法。其中化學發(fā)光是伴隨化學反應過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質在進行化學反應時吸收了反應過程中所產(chǎn)生的化學能，使反應產(chǎn)物從分子狀態(tài)激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)。當電子從激發(fā)態(tài)的最低振動能級回到基態(tài)的各個振動能級時產(chǎn)生輻射，多余的能量以光子的形式釋放出來，這一現(xiàn)象稱為化學發(fā)光(吳建民.臨床化學自動化免疫分析.科學出版社，2000)?；瘜W發(fā)光免疫分析方法自身具有靈敏度很高的靈敏性(C.Dodeigne,LThunus,R.Lejeime.ChemiluminescenceasDiagnosticTool.Talanta2000,51:415-439)，由于不需要外來光源，避免了瑞利散射和拉曼散射等噪音，因而本底低且具有比熒光法更高的信噪比，其靈敏度比酶聯(lián)免疫分析或放射性免疫分析方法高1至2個數(shù)量級;另外化學發(fā)光試劑本身也有檢測線性范圍寬的優(yōu)點A.C.Calokerinos,N.T.Deftereos，W.R.G.Baeyens.ChemiluminescenceinDrugAssay.JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis.1995，13:1063-1071.),可達6-7個lt量級。吖啶酯類化合物作為一種常用的化學發(fā)光試劑，在化學發(fā)光免疫分析體系的研究中得到了廣泛的關注。它具有靈敏度高、容易標記到蛋白、多肽和小分子上的優(yōu)點。而且由于吖啶酯或吖咬磺酰胺類化合物在有11202的稀堿溶液中即能發(fā)生化學發(fā)光，無需催化過程，也不需要增強劑，從而降低了背景發(fā)光，提高了信噪比，干擾作用少，因此是化學發(fā)光免疫分析的理想的發(fā)光底物。例如，美國CibaCorning公司研制的ACS-180免疫分析試劑盒體系就是采用二曱基吖啶酯直接標記的，靈敏度可達10—15g/l。用來進行固相免疫學反應的吖啶酯類化合物可以選擇4-(2-琥珀酰亞氨基羧基)苯基-10-曱基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸鹽(AcridiniumC2NHSEster)等，目前已臨床用于曱狀腺功能、生殖生理、腫瘤標志物、藥物監(jiān)測及心血管等多個項目得到應用。但還未見有吖咬酯化學發(fā)光免疫分析檢測方法用于HIV-lp24抗原4企測的才艮道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、檢測范圍寬、簡單、快捷，便于自動化的HIV-1p24抗原吖啶酯化學發(fā)光免疫分析檢測方法。本發(fā)明采用雙抗夾心的方法，以激發(fā)劑激發(fā)標記于抗HIV-1p24抗體上的吖咬酯發(fā)光，進行HIV-1p24抗原的定性和定量分析，具體步驟如下(1)用抗HIV-1p24抗體對固相載體進行包被；(2)處理HIV-1樣品，即解離HIV-1樣品，分離HIV-1p24抗原；(3)將步驟(2)中處理后的HIV-1樣品和吖啶酯類化合物標記的抗HIV-1p24配對抗體加入步驟(1)中的反應體系進行免疫反應；(4)將激發(fā)劑1和激發(fā)劑2加入步驟(3)中的反應體系，進行化學發(fā)光反應；(5)檢測步驟(4)中化學發(fā)光反應產(chǎn)生的光子數(shù)，進行定性或/和定量分析。其中，步驟(1)中的抗HIV-1p24抗體可以對各種各樣的固相載體進行包被，如聚苯乙烯乳膠、聚苯乙烯塑料制品、聚氯乙烯塑料制品、脂質體、免疫磁性微珠等。步驟(2)中所述的HIV-1樣品為任意來源的HIV-1p卩4抗原。任意來源是指，HIV-1艾滋病毒感染者的血液、以HIV-l病毒侵染細胞后得到的細胞培養(yǎng)產(chǎn)物、以原核生物或真核生物為表達載體根據(jù)基因工程而得到的p24重組抗原。其中，血液需要通過物理方法離心得到血清。細胞培養(yǎng)產(chǎn)物需要物理方法、化學方法和生物方法使其裂解，離心取其上清。重組抗原需要通過物理方法、化學方法和生物方法使其純化。血液來源和細胞培養(yǎng)物來源的p24抗原，以游離的p24抗原分子和p24抗原及其抗體的復合物的一種或任意組合的形式存在，需要預先進行加熱解離或酸性解離以使抗原從抗原抗體復合物中解離出來。步驟(2)中所述的HIV-1樣品包含任意類型的HIV-1型病毒。任意類型是指M亞群和O亞群的一種或任意組合。所述的M亞群中包括A、B(B')、C、D、E、F、G、H、I和J等10個亞型。步驟(4)中所述的激發(fā)劑1為過氧化氫和硝酸的混合液，其中過氧化氫的濃度為0.05-0.1M,硝酸的濃度為0.1-0.5M;所述的激發(fā)劑2為曲拉通100和氯氧化鈉的混合液，其中曲拉通100的濃度為0.1-0.5M,氫氧化鈉的質量分數(shù)為2-5%;過氧化氫和氫氧化鈉主要為吖啶酯類化合物提供堿性的發(fā)光環(huán)境；優(yōu)選加入激發(fā)劑1,0.5-1秒鐘后再加入激發(fā)劑2。本發(fā)明方法中采用吖啶酯類化合物標記配對抗體。主要通過化學反應將一種分子共價連接到另一種分子上，參與偶聯(lián)反應的兩種物質分別稱為標記物和被標記物。化學標記的目的是使被標記物保持自身的性質(如免疫學性質)且又具有標記物的某些性質(如發(fā)光性質)。吖啶酯類化合物通過化學反應使吖啶酯通過共價鍵與被標記的蛋白、多肽或核酸的氣基結合。本發(fā)明所涉及的硝酸和曲拉通100為吖啶酯類化合物發(fā)光的激發(fā)劑、增強劑，使吖啶酯類化合物在激發(fā)劑的作用下瞬時即可發(fā)光，同以往酶聯(lián)免疫分析反應相比大大縮短了#:作的時間。本發(fā)明所涉及的吖啶酯類化合物的激發(fā)劑以即時加樣即時檢測的方法進行檢測，發(fā)光即可檢測光子數(shù)，不需要加入終止試劑、信號放大體系等額外反應，也減少了操作步驟。普通的化學發(fā)光免疫分析方法的自動化程度已經(jīng)很高，目前國內(nèi)外的全自動化學發(fā)光儀已經(jīng)很多，如CibaCorning公司的ACS:180、PerkinElmer公司的MulUlabelCounterVICTOR1420等。本發(fā)明方法采用的即時加入激發(fā)劑的方法對于自動化操作、減少人為操作誤差、提高檢測靈敏度都很有幫助。與現(xiàn)有技術相比較，本發(fā)明具有以下有益效果1)靈敏度較高，可達到O.5pg/ml，達到國際先進水平。2)檢測范圍較寬，可達到5-6個數(shù)量級，對較高濃度的樣品無需稀釋即可檢測。3)操作簡便，反應時間短，吖啶酯類化合物在激發(fā)劑作用下兩秒內(nèi)即可發(fā)光。4)有利于反應體系的自動化操作。圖1、吖啶酯化學發(fā)光免疫分析HIV-1p24抗原的胡克效應。圖2、吖啶酯化學發(fā)光免疫分析HIV-1p24抗原標準曲線擬合。以下結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步說明。具體實施方式材料和試劑吖"定酉旨(AcridiniumC2NHSEster)購自Assaydesigns公司；固相載體(白色96微孔板ImmunoMaxiSorp)購自Nunc公司;包被緩沖液Na2C03-NaHC030.05MpH9.5洗滌緩沖液Na2HP04-NaH2P040.01MNaCl0.9%pH7.4封閉緩沖液Na2HP04-NaH2P040.05MNaCl0.9%BSA1%PH7.4分析緩沖液Na2HP04-NaH2P040.05MNaCl0.9%200.05%BSA0.5%pH7.0激發(fā)劑1:HN030.1MH2020.08M激發(fā)劑2:TritonX-1002%NaOH0.2MHIV-1樣品HIV-1p24重組抗原(病毒所提供)；HIV-lp24抗原國家參考品(購自中國藥品生物制品;險定所)包括20支HIV-lp24抗原陰性參考品，編號為Nl-N20;10支HIV-1p24抗原陽性參考品，編號為Pl-P10;IO支線性靈敏度參考品，編號為L1-L10;HIV-lp24抗原檢測精密度參考品,編號為AgCV;陰性對照人血清(VironostikaHIV-1Antigen,bioMerieuxInc.,Durham,NC);陽性對照重組p24抗原(VironostikaHIV-lAntigen,bioMerieuxInc.,Durham,NC)。實施例1)用包被緩沖液將包被用抗p24抗體稀釋至6pg/ml后，于白色96微孔板中，每孔加入100p1,4。C封閉16個小時；2)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入300pl洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次；3)每孔加入封閉緩沖液300p1,37。C恒溫震蕩1個小時；4)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入300jul洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次，晾千后4。C保存；5)分別將濃度為80、40、20、10、5pg/ml的五個陽性對照樣品加入孔中，每個濃度2個復孔，每孔加入100)n1,將陰性對照樣品分別加入4個孔中，每孔加入100pl，將HIV-1p24抗原國家參考品40個樣品(N1-N20、PI-P10和L1-L10)各加入1孔，每孔加入lOOjil,將AgCV樣品分別加入4個孔中，每孔加入100|ul，3rc恒溫振蕩1個小時；6)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入30(^1洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次；7)用分析緩沖液對吖啶酯標記的抗p24抗體進行1:200倍稀釋后，每孔加入lG0iil;8)將HIV-1樣品和吖啶酯標記的抗HIV-lp24抗體充分混合后，于37。C恒溫振蕩1個小時；9)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入30(^1洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次；10)將50|il激發(fā)劑1和50pl激發(fā)劑2,分別通過多功能分析儀即時力口入孔中，兩試劑加入時間相隔1秒；11)加入激發(fā)劑后立即檢測發(fā)光值，檢測結果如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表lHIV-1p24抗原國家參考品檢測結果評價標準20支HIV-1p24抗原陰性參考品不得出現(xiàn)陽性反應(20/20)。IO支HIV-Ip24抗原陽性參考品不得出現(xiàn)陰性反應(10/10)。10支線性靈敏度參考品對HIV-1p24抗原檢測試劑，最低檢出量不得高于1.25U/ml(至少檢測出LI-L5),進行p24定量測定時，LI-L5共5個樣品測定值統(tǒng)計分析后線性關系系數(shù)(R值)必須>0.95。精密度測定統(tǒng)計分析后CV《15%。結合評價標準可知本發(fā)明方法檢測結果符合HIV-lp24抗原國家參考品標準的要求。相應參數(shù)的確定1、分析靈每文度將HIV-lp24重組抗原用分析緩沖液進行梯度稀釋，分別得到0,0.05pg/ml,0.1pg/ml，0.2pg/ml，0.5pg/ml,1pg/ml,2pg/ml，5pg/ml,10pg/ml,20pg/ml,50pg/ml,100pg/ml，200pg/ml,500pg/ml等濃度梯度，每個濃度3個復孔，每孔加入100pU。0標準和各樣品作10次批內(nèi)重復測定，求每組的均值(M)、標準差(SD)和變異系數(shù)(cvy。)。反應所應用的吖。定酯標記抗體為1:1000倍稀釋。激發(fā)劑1和2均為多功能分析儀即時加樣、即時檢測。將各濃度梯度所得(M-3SD)x值與陰性對照的(M+3SD)NC值進行比較，選取(M-3SD)X>(M+3SD)NC時的最小濃度值為該體系的檢測限，經(jīng)比較本發(fā)明方法的檢測限為0.5pg/ml。2、檢測寬度2.1胡克效應將HIV-lp24重組抗原用分析緩沖液進行梯度稀釋，分別得到0,lng/ml，5ng/ml,10ng/ml，20ng/ml,50ng/ml，100ng/ml,200ng/ml，500ng/ml，lOOOng/ml,2000ng/ml，5000ng/ml等濃度梯度,每個濃度3個復孔，每孔加入10(^1。0標準和各樣品4次批內(nèi)重復測定，求每組的均值。反應所應用的吖啶酯標記抗體為1:100倍稀釋。激發(fā)劑1和2均為多功能分析儀即時加樣、即時檢測。100ng/ml的濃度梯度所對應的發(fā)光值最高。當被;險測的HIV-lp24抗原濃度大于100ng/ml時，其發(fā)光值不^f旦沒有升高反而急劇下降，呈明顯的鉤狀，如圖1所示。2.2檢測寬度將HIV-lp24重組抗原用分析緩沖液進行梯度稀釋，分別得到0，10pg/ml，20pg/ml,50pg/ml,100pg/ml,200pg/ml，500pg/ml，lng/ml，2ng/ml，5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,lOOng/ml等14個濃度的樣品，每個濃度2個復孔，每孔加入10(^1。0標準和各樣品作4次批內(nèi)重復測定，求每組的變異系數(shù)。反應所應用的吖啶酯標記抗體為1:1000倍稀釋。激發(fā)劑1和2均為多功能分析儀即時加樣、即時檢測。在所選的濃度范圍內(nèi)，各個梯度的變異系數(shù)均小于20%,故此將100ng/ml作為檢測范圍的上限。對于檢測范圍的下限，通常選取功能靈敏度，本發(fā)明方法的功能靈敏度為0.5pg/ml,由此得出本發(fā)明HIV-1p24吖。定酯化學發(fā)光免疫分析方法檢驗的線性范圍是0.5pg/ml-100ng/ml,共6個數(shù)量級。3、標準曲線擬合將HIV-lp24重組抗原用分析緩沖液進行梯度稀釋，分別得到0，0.1pg/ml,0.2pg/ml，0.5pg/ml,1pg/ml,2pg/ml,5pg/ml，10pg/ml,20pg/ml，50pg/ml，100pg/ml,200pg/ml，500pg/ml，lng/ml,2ng/ml,5ng/ml,lOng/ml,20ng/ml，50ng/ml,lOOng/ml等20個濃度的樣品，每個濃度4個復孔，每孔加入100nl，求每個濃度的光子數(shù)均值。反應所應用的吖啶酯標記抗體為1:1000倍稀釋。激發(fā)劑1和2均為多功能分析儀即時加樣，即時檢測。通過曲線擬合得到曲線，如圖2所示，得出擬合方程為四參數(shù)logistic曲線形式CPS/CPSmax為不同濃度p24抗原所對應的吖啶酯發(fā)光值與此次檢測中最高發(fā)光值之間的比值；四個參數(shù)<3、6分別為0.9953、0.04764，c為2,934，d為1.209，W為0.9990，具有非常好得統(tǒng)計學意義。HIV-1p24吖啶酯化學發(fā)光免疫分析方法的功能靈敏度為0.5pg/ml，比普通的ELISA方法低1-2個數(shù)量級；分析靈敏度為0.5pg/ml;線性范圍在0.5pg/ml-100ng/ml，比普通的ELISA方法高1-2個數(shù)量級。權利要求1.一種HIV-1p24抗原吖啶酯化學發(fā)光免疫分析檢測方法，具體步驟如下(1)用抗HIV-1p24抗體對固相載體進行包被；(2)處理HIV-1樣品；(3)將步驟(2)中處理后的HIV-1樣品和吖啶酯類化合物標記的抗HIV-1p24配對抗體加入步驟(1)中的反應體系進行免疫反應；(4)將激發(fā)劑1和激發(fā)劑2加入步驟(3)中的反應體系，進行化學發(fā)光反應；(5)檢測步驟(4)中化學發(fā)光反應產(chǎn)生的光子數(shù)，進行定性或/和定量分析。2、根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(l)中所述的固相載體為聚苯乙烯乳膠、聚苯乙烯塑料制品、聚氯乙烯塑料制品、脂質體或免疫磁性微珠。3、根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的HIV-1樣品選自血清、血漿、HIV-1細胞培養(yǎng)物裂解上清或HIV-lp24重組抗原的一種或多種。4、根據(jù)權利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的HIV-1樣品包含的HIV-1型病毒為M亞群和0亞群的一種或任意組合。5、根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的M亞群中包括A、B、B'、C、D、E、F、G、H、I和J亞型。6、根據(jù)權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的激發(fā)劑1為過氧化氫和硝酸的混合液，其中過氧化氫的濃度為0.05-0.1M，硝酸的濃度為0.1-0.5M。7、根據(jù)權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的激發(fā)劑2為曲拉通100和氫氧化鈉的混合液，其中曲拉通100的濃度為0.1-0.5M，氬氧化鈉的質量分數(shù)為2-5%。8、根據(jù)權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(4)中加入激發(fā)劑1，0.5-1秒鐘后再加入激發(fā)劑2。全文摘要HIV-1p24抗原吖啶酯化學發(fā)光免疫分析檢測方法屬于臨床血液檢測分析方法
技術領域：
?，F(xiàn)有HIV-1p24抗原檢測方法存在靈敏度不高且操作繁瑣等問題。本發(fā)明以吖啶酯類化合物標記抗HIV-1p24抗體，通過雙抗夾心的方法進行p24抗原抗體間的免疫結合；以激發(fā)劑過氧化氫、硝酸、曲拉通100和氫氧化鈉，激發(fā)吖啶酯類化合物進行化學發(fā)光反應；檢測光子數(shù)，進行定性或/和定量分析。本發(fā)明具有與普通的ELISA檢測方法具有很好的相關性，在P≤0.01情況下，相關系數(shù)為0.951；靈敏度高、檢測限為0.5pg/ml，檢測范圍廣、5-6個數(shù)量級；反應時間短，操作更為簡便等優(yōu)點。文檔編號G01N21/76GK101281196SQ200810111678公開日2008年10月8日申請日期2008年5月16日優(yōu)先權日2008年5月16日發(fā)明者娟馮,毅曾,鐘儒剛,馬雪梅申請人:北京工業(yè)大學