專利名稱：：檢測氟苯尼考及氟苯尼考胺的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種檢測氟苯尼考及氟苯尼考胺的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術：
：氟苯尼考(Florfenicol，F(xiàn)F,化學結構式如圖l)是一種新型氯霉素類廣譜抗生素，主要用于治療魚、豬、牛及家禽的細菌性疾病。氟苯尼考在安全性和有效性方面比氯霉素和甲砜霉素有明顯的優(yōu)勢，已在養(yǎng)殖業(yè)中大規(guī)模使用，在獸醫(yī)臨床上具有良好的應用前景。但是，氟苯尼考在畜禽生產(chǎn)上的大量應用也導致其在畜禽產(chǎn)品中殘留，危害公眾健康。氟苯尼考在動物體內最終代謝為氟苯尼考胺，在檢測氟苯尼考殘留時將氟苯尼考和氟苯尼考胺作為殘留標識物。我國、歐盟及美國均規(guī)定了動物組織中氟苯尼考和氟苯尼考胺的最大殘留限量。動物組織中氯霉素類藥物的殘留檢測主要采用氣相色譜法、氣相色譜一質譜法、酶聯(lián)免疫法等，大多數(shù)方法為單一藥物的檢測。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測氟苯尼考和氟苯尼考胺的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測氟苯尼考和氟苯尼考胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括氟苯尼考胺特異性抗體及包被原和酶標記物；所述包被原為氟苯尼考胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標記物為酶標抗抗體或酶標氟苯尼考胺半抗原；當所述包被原為氟苯尼考胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時，所述酶標記物為酶標抗抗體；當所述包被原抗抗體時，所述酶標記物為酶標氟苯尼考胺半抗原；所述氟苯尼考胺半抗原是將氟苯尼考胺和對羧基苯甲醛通過縮合反應得到的。所述氟苯尼考胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物通過碳化二亞胺(EDC)法得到。所述酶標記物的標記酶可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選為辣根過氧化物酶。辣根過氧化物酶標記抗抗體可采用現(xiàn)有技術中的多種方法如戊二醛法或過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶交聯(lián)在抗抗體上；辣根過氧化物酶標記抗抗體可以通過戊二醛法將氟苯尼考胺半抗原與辣根過氧化物酶偶聯(lián)得到。所述氟苯尼考胺特異性抗體為氟苯尼考胺多克隆抗體，是以氟苯尼考胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述載體蛋白可為鼠血清白蛋白、兔血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白。為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括氟苯尼考胺標準溶液、顯色液、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復溶液、包被緩沖液、封閉液。所述氟苯尼考胺標準品溶液含有六個濃度梯度；所用的氟苯尼考胺藥物稀釋液為0.1%牛血清白蛋白的0.03-0.06mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質量百分所述濃縮洗滌液為pH7.4、0.02M的含有0.05%疊氮鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質量百分含量。當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為12mol/L硫酸或鹽酸溶液；當標記酶為堿性磷酸酯酶時，顯色劑為硝基磷酸鹽緩沖液(4-硝基酚磷酸鹽緩沖液)，終止液為12mol/L氫氧化鈉溶液。所述濃縮復溶液可為含有0.1%牛血清白蛋白的0.03-0.06mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質量百分含量。所述包被緩沖液可為pH值為9.6的0.01-0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；所述封閉液可為含有0.01%疊氮化鈉和10%牛血清白蛋白的磷酸鹽溶液；所述百分含量為質量百分含量。本發(fā)明所提供的檢測氟苯尼考和氟苯尼考胺的方法，包括以下步驟1)樣品前處理稱取2g動物組織勻漿物置離心管中，加入10ml三氯乙酸-PBS緩沖液，混勻；室溫以3000g以上的速度離心5min;取上清液，加入與上清液等體積的0.02M的PBS緩沖液，混勻，取樣進行分析。2)利用權利要求l一9中任一所述的檢測氟苯尼考和氟苯尼考胺的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣品；3)檢測數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的殘留量。本發(fā)明試劑盒的主要內容物采用了方便使用的工作液形式，工作液保存性及穩(wěn)定性好；利用本發(fā)明試劑盒檢測氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的殘留量的方法，可用于檢測動物組織如雞肉、豬肉、雞肝、豬肝、魚、奸等樣品中氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的殘留量，具有樣品前處理過程簡單、操作簡便、費用低廉、特異性高、靈敏度高、精確度高等特點，能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩査。因此本發(fā)明檢測方法及其專用試劑盒將在動物源性食品中氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的殘留檢測中發(fā)揮重要作用。圖1為氟苯尼考化學結構式。圖2為氟苯尼考胺半抗原合成技術路線。圖3為以氟苯尼考胺半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為包被原的試劑盒的氟苯尼考胺標準曲線圖。圖4為以羊抗兔抗抗體為包被原的試劑盒的氟苯尼考胺標準曲線圖。具體實施例方式下述實施例的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。述實施例中各試劑盒的檢測原理如下當在酶標板微孔條上預包被氟苯尼考胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時，加入樣本溶液或標準品溶液后，再加入氟苯尼考胺抗體溶液，樣本中殘留的氟苯尼考及氟苯尼考胺或氟苯尼考胺標準品與酶標板上包被的氟苯尼考胺偶聯(lián)抗原競爭氟苯尼考胺抗體，加入酶標記抗抗體進行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與樣本中氟苯尼考及氟苯尼考胺的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中氟苯尼考及氟苯尼考胺的殘留量。同時也可根據(jù)酶標板上顏色的深淺，與系列濃度氟苯尼考胺標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留量的濃度范圍。當在微孔條上預包被抗抗體時，加入氟苯尼考胺抗體孵育后，加入樣本溶液或標準品溶液，再加入酶標記氟苯尼考胺抗原溶液，樣本中殘留的氟苯尼考及氟苯尼考胺或氟苯尼考胺標準品與酶標記氟苯尼考胺抗原競爭氟苯尼考胺特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光度值與樣本中氟苯尼考及氟苯尼考胺的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中氟苯尼考及氟苯尼考胺的殘留量。同時也可根據(jù)酶標板上的顏色深淺，與系列濃度氟苯尼考胺標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留量的濃度范圍。實施例1、以氟苯尼考胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備及其檢測方法一、以氟苯尼考胺半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有包被原(氟苯尼考胺半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物)的酶標板；(2)辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗抗體工作液:酶標二抗稀釋液為含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，羊抗兔抗抗體稀釋濃度為1:500;所述百分含量為質量百分含量。(3)氟苯尼考胺標準品溶液共6瓶，濃度分別為0iag/L，0.5pg/L，1.5|ig/L，4.5|ig/L，22.5叫/L，112.5貼/L(溶劑為含有0.1%牛血清白蛋白的0.06mol/L的磷酸鹽緩沖液)。(4)底物顯色液底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲，8ml/瓶，l瓶；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺，8ml/瓶，1瓶。(5)氟苯尼考胺抗體工作液抗體稀釋液為含有2.5%(質量百分含量)酪蛋白和0.03%。(質量含量)的疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液，抗體工作液稀釋濃度為l:1000。(6)濃縮洗滌液含有0.05%(質量百分含量)疊氮鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液(0.02M、pH7.4)。50ml/瓶，1瓶。(7)終止液2mol/L硫酸，8ml/瓶，1瓶。(8)濃縮復溶液含有0.1%(質量百分含量)牛血清白蛋白的0.03-0.06mol/L磷酸鹽緩沖液。400ml/瓶，1瓶。(9)包被緩沖液pH值為9.6的0.01-0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。(10)封閉液含有0.01%(質量百分含量)疊氮化鈉和10%(質量百分含量)牛血清白蛋白的磷酸鹽溶液。其中，包被有氟苯尼考胺半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物的酶標板、氟苯尼考胺抗體工作液、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗抗體工作液的制備方法如下1、酶標板的制備(1)氟苯尼考胺半抗原的合成將氟苯尼考胺通過對羧基苯甲醛法得到氟苯尼考胺半抗原。具體步驟為將氟苯尼考胺和對羧基苯甲醛按l:1(摩爾比)比例混合攪拌反應，室溫下反應過夜。(圖2)。(2)包被原的制備采用碳化二亞胺(EDC)法將氟苯尼考胺半抗原和卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原。a、取氟苯尼考胺半抗原5mg溶于0.5ml水中，得到I液；b、取卵清蛋白20mg，用2.7ml水溶解；再向其中加入25mgEDC，活化反應30min，得到II液；c、將I液加到II液后攪拌反應過夜，得到包被原。(3)酶標板的制備用包被緩沖液將包被原(即氟苯尼考胺半抗原和卵清蛋白偶聯(lián)物)稀釋成0.06-0.1嗎/ml，每孔加入100pl，37。C溫育2h或4"C過夜，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150^1封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。2、氟苯尼考胺多克隆抗體的制備(1)免疫原合成將氟苯尼考胺半抗原和血藍蛋白通過碳化二亞胺法偶聯(lián)得到免疫原。免疫原的制備過程取氟苯尼考胺半抗原10mg溶于lml水中，得到I液；取血藍蛋白50mg溶于5ml水中，再向其中加入EDC25mg活化反應30min，得到II液；將I液加到II液后攪拌反應過夜，得到免疫原。(2)多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以氟苯尼考胺與血藍蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1.0mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3周用相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測定血清抗體效價，心臟采血，用硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。3、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗抗體工作液的制備羊抗兔抗抗體的制備過程以山羊作為免疫動物，以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫，得到羊抗兔抗抗體。酶標羊抗兔抗抗體制備采用戊二醛法或過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶交聯(lián)在抗抗體上。二、用步驟一所述試劑盒檢測樣品中殘留的氟苯尼考胺和氟苯尼考方法如下(一)樣品前處理樣品為雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、魚、蝦等組織樣本。稱取除去脂肪的粉碎動物組織樣本2g，加入10ml三氯乙酸-PBS緩沖液充分渦動混合，振蕩lmin,以3000g以上的速度室溫離心5min，取上清液200^1加入200^10.02M的PBS緩沖液混勻后取進行實驗分析。(二)檢測向包被有氟苯尼考胺半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物的酶標板微孔中加入氟苯尼考胺標準品溶液或樣本溶液50pl，再加入氟苯尼考胺抗體工作液50pl，用蓋板膜封板，37。C恒溫箱中反應30min;倒出孔中液體，每孔加入250W洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復操作共洗板5次，用吸水紙拍干；每孔加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗抗體工作液100pl，37。C恒溫箱中反應30min，倒出孔中液體，重復洗滌步驟;每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，輕輕振蕩混勻，37。C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入2mol/L終止液硫酸50^1，輕輕振蕩混勻，用酶標儀，測定每孔吸光度值。(三)結果分析所獲得的每個濃度標準品溶液或樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個標準(0標準)的吸光度值(Bo)再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值(％)=-^-xioo%B0公式中B為標準品溶液或樣本溶液的平均吸光度值，Bo為0pg/L標準品溶液的平均吸光度值。以氟苯尼考胺標準品濃度(|ig/L)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖，如圖3所示。相對應每一個樣品中氟苯尼考胺的濃度可以從標準曲線上讀出。用同樣的方法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應每一個樣品的濃度，則可從標準曲線上讀出樣本中氟苯尼考及氟苯尼考胺的殘留量。本發(fā)明中檢測結果的分析也可以采用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。本發(fā)明中檢測結果的分析還可以利用計算機專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個檢測過程只需1.5小時可以完成。實施例2、以羊抗兔抗抗體為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備及其檢測方法一、以羊抗兔抗抗體為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有羊抗兔抗抗體的酶標板；(2)辣根過氧化物酶標記的氟苯尼考胺半抗原工作液用雙蒸水將辣根過氧化物酶標記的氟苯尼考胺半抗原稀釋為0.1mol/L，12ml/瓶，1瓶。(3)氟苯尼考胺標準品溶液共6瓶，濃度分別為0pg/L，0.5|iig/L，1.5pg/L，4.5pg/L，22.5嗎/L，112.5嗎/L(溶劑為含有0.1。/。牛血清白蛋白的0.06mol/L的磷酸鹽緩沖液)。(4)底物顯色液底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化氫，8ml/瓶，l瓶；底物顯色液B液為鄰苯二胺，8ml/瓶，1瓶。(5)氟苯尼考胺抗體工作液抗體稀釋液為含有2.5%(質量百分含量)酪蛋白和0.0396。(質量含量)的疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液，抗體稀釋后的濃度為1:1000。(6)濃縮洗滌液含有0.05%(質量百分含量)疊氮鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液(0.02M、pH7.4)。50ml/瓶，1瓶。(7)終止液2mol/L鹽酸，8ml/瓶，1瓶。(8)濃縮復溶液含有0.1%(質量百分含量)牛血清白蛋白的0.030.06mol/L磷酸鹽緩沖液。400ml/瓶，1瓶。(9)包被緩沖液pH值為9.6的0.01-0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。(10)封閉液含有0.01%(質量百分含量)疊氮化鈉和10%(質量百分含量)牛血清白蛋白的磷酸鹽溶液。其中，包被有羊抗兔抗抗體的酶標板、氟苯尼考胺抗體工作液、辣根過氧化物酶標記的氟苯尼考胺半抗原工作液的制備方法如下1、酶標板的制備(1)羊抗兔抗抗體包被原的制備以山羊作為免疫動物，以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫，得到羊抗兔抗抗體。(2)包被有羊抗兔抗抗體的酶標板制備方法用包被緩沖液將包被原(即羊抗兔抗抗體)稀釋成0.06-0.1pg/ml，每孔加入100^1，37i:溫育2h或4t過夜，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150pl封閉液，37'C溫育2h，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。2、氟苯尼考胺多克隆抗體的制備(1)氟苯尼考胺半抗原的合成將氟苯尼考胺通過對羧基苯甲醛法得到氟苯尼考胺半抗原。具體步驟為將氟苯尼考胺和對羧基苯甲醛按l:1(摩爾比)比例混合攪拌反應，室溫下反應過夜。(2)免疫原合成將氟苯尼考胺半抗原和血藍蛋白通過碳化二亞胺法偶聯(lián)得到免疫原。免疫原的制備過程取氟苯尼考胺半抗原10mg溶于lml水中，得到I液；取血藍蛋白50mg溶于5ml水中，再向其中加入EDC25mg活化反應30min，得到II液；將I液加到II液后攪拌反應過夜，得到免疫原。(3)多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以氟苯尼考胺與血藍蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1.0mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3周用相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測定血清抗體效價，心臟采血，用硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。3、辣根過氧化物酶標記的氟苯尼考胺半抗原工作液的制備將氟苯尼考胺半抗原與辣根過氧化物酶采用戊二醛法偶聯(lián)得到的。二、用步驟一所述試劑盒檢測樣品中殘留的氟苯尼考胺和氟苯尼考方法如下(一)樣品前處理樣品前處理的具體步驟同實施例1中的樣品前處理步驟。(二)檢測向包被有羊抗兔抗抗體的酶標板微孔中加入氟苯尼考胺特異性抗體工作液50|il，37"C反應30min，倒出孔中液體，每孔加入稀釋后的洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復操作共洗板5次，用吸水紙拍干。再加入系列標準品溶液50jLil和10(^1酶標記氟苯尼考胺抗原或樣品溶液50nl和10(^1酶標記氟苯尼考胺抗原到每個微孔中，用蓋板膜封板后置37"C環(huán)境中反應30min。取出酶標板，將孔內液體甩干，加入稀釋后的洗滌液250^1到每個板孔中，洗板4一5次，每次間隔10秒，用吸水紙拍干。每孔加入底物顯色液A液過氧化氫50pl，底物顯色液B液鄰苯二胺5(^1，輕輕振蕩混勻，37。C恒溫箱避光顯色1530min。每孔加入終止液5(^1，輕輕振蕩混勻，用酶標儀波長設定在450nm處，測定每孔吸光度值(OD值)。(三)結果分析結果分析的方法同實施例1中的結果分析方法，該試劑盒的標準曲線圖，如圖4所示。本發(fā)明中檢測結果的分析也可以采用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。本發(fā)明中檢測結果的分析還可以利用計算機專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個檢測過程只需1.5小時可以完成。實施例3、試劑盒靈敏度、準確度和保存期試驗(一)試劑盒靈敏度實驗對零標準(含有0.iy。牛血清白蛋白的0.06mol/L的磷酸鹽緩沖液)進行20次檢測，測定結果的平均值加上3倍標準差作為試劑盒的最低檢測限。表l零標準測定結果統(tǒng)計表(pg/L)樣品號測定值10.220.330.440.20.360.1780.20.1樣品號測定值90.0100.1110.3120.3130.2140.215160.20.3樣品號測定值170.2180.3190.0200.2平均值0.2標準差0.1最低檢測限0.5由表1可知，試劑盒的最低檢測限為0.5iig/L。(二)標準品精密度試驗從實施例l中所述的l批試劑盒(Ol批)、實施例2中所述的3、6批試劑盒(03、06批)三批試劑盒中每批抽取10個試劑盒，從每個試劑盒的酶聯(lián)板中各抽出20個微孔，測定4.5pg/L標準品溶液的吸光度值(OD值)，計算變異系數(shù)。結果如表2所示，表明變異系數(shù)范圍在4.1%15.2%之間，符合精密度小于或等于20%的規(guī)定。表2標準可重復性試驗(CV%)1234567891001批10.56.27.84.111.614.813.88.47.25.1CV%03批5.812.913.74.85.611.410.713.15.69.306批15.210.87.95.710.58.99.712.26.78.4(三)樣本精密度試驗1、樣品精密度試驗(1)將不含氟苯尼考和氟苯尼考胺的雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、魚、蝦按照實施例l的方法進行樣品前處理后，添加氟苯尼考胺，使其終濃度為2(Hig/L。從實施例l中所述的l批試劑盒(Ol批)、實施例2中所述的3、6批試劑盒(03、06批)共三批試劑盒中每批抽取3個試劑盒，進行實驗，每個實驗重復5次，分別計算變異系數(shù)，結果如表3-8所示(各表中的數(shù)值為5次重復的平均值)。結果表明雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、魚、蝦樣本的變異系數(shù)均小于20%，符合了《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)200517號附件2試劑盒備案參考評判標準中第四點精密度和準確度的精密度標準。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>16.518.417.918.519.45.9表5豬肉樣本可重復性試驗批號實測值(叫/kg)變異系數(shù)cv%18.217.415.317.919.18.10115.119.219.619.714.514.719.718.118.416.915.39.418.617.219.917.415.69.10318.417.219.516.117.87.215.714.918.317.6]19.410.816.019.419.718.415.311.30617.518.617.415.219.79.514.219.617.017.718.411.6表6豬肝樣本可重復性試驗批號實測值(嗎/kg)變異系數(shù)cv%15.916.318.719.219.89.80116.714.718.418.517.39.118.918.918.416.317.56.217.217.918.615.916.86.00314.217.318.319.218.711.418.219.418.917.517.44.818.919.818.615.217.49.90619.617.718,218.914.311.617.817.516.917.418.84.0表7魚樣本可重復性試驗批號實測值(嗎/kg)變異系數(shù)cv%17.918.416.315.519.89.70119.117.816.617.514.510.018.617.519.519.317.25.60318.314.817.219.518.610.2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表8奸樣本可重復性試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(2)將不含氟苯尼考和氟苯尼考胺的雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、魚、蝦按照實施例l的方法進行樣品前處理后，添加氟苯尼考(購于sigma公司，產(chǎn)品目錄號為F1427)，使其終濃度為20pg/L。從實施例l中所述的l批試劑盒(Ol批)、實施例2中所述的3、6批試劑盒(03、06批)共三批試劑盒中每批抽取3個試劑盒，進行實驗，每個實驗重復5次，分別計算變異系數(shù)，結果如表9-14所示(各表中的數(shù)值為5次重復的平均值)。結果表明雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、魚、蝦樣本的變異系數(shù)均小于20%，符合了《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)200517號附件2試劑盒備案參考評判標準中第四點精密度和準確度的精密度標準。表9雞肉樣本可重復性試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表10雞肝樣本可重復性試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表11豬肉樣本可重復性試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表12豬肝樣本可重復性試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>14.918.619.719.218.410.40618.416.418.719.620.37.915.216.914.219.417.512.2(四)樣本準確度試驗1、檢測氟苯尼考胺將不含氟苯尼考和氟苯尼考胺的雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、魚、蝦組織按照實施例l中所述的樣品前處理方法進行處理，然后向每種組織中加入氟苯尼考胺標準品溶液，使其終濃度分別為20pg/kg(L)禾P50ing/kg(L);然后用實施例l中所述的試劑盒檢測雞肉、雞肝中氟苯尼考胺，用實施例2中所述的試劑盒檢測豬肉、豬肝、魚、蝦中氟苯尼考胺，每個濃度做4個平行，分別計算準確度(準確度=實測值/添加值)。結果如表15所示，表明各樣本以20iig/kg(L)、50叫/kg(L)氟苯尼考胺添加回收率均在72.6%-99.7%之間。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>2、檢測氟苯尼考將不含氟苯尼考和氟苯尼考胺的雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、魚、蝦組織按照實施例l中所述的樣品前處理方法進行處理，然后向每種組織中加入氟苯尼考(購于sigma公司，產(chǎn)品目錄號為F1427)標準品溶液，使其終濃度分別為20ing/kg(L)和50pg/kg(L);然后用實施例l中所述的試劑盒檢測雞肉、雞肝中氟苯尼考胺，用實施例2中所述的試劑盒檢測豬肉、豬肝、魚、蟲下中氟苯尼考胺，每個濃度做4個平行，分別計算準確度(準確度=實測值/添加值)，結果如表16所示，表明各樣本以20pg/kg(L)、50pg/kg(L)氟苯尼考添加回收率均在72.9%-108.6%之間。表16試劑盒的準確度<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>(五)交叉反應率試驗選擇與氟苯尼考胺有類似結構和類似功能的4種藥物測定交叉反應率。通各種藥物的標準曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計算試劑盒對其它藥物的交叉反應率。交叉反應越大，那么此試劑盒對同類藥物的檢測的特異性就越好。交叉反應率(％)二(抑制50%氟苯尼考胺的濃度/抑制50%的氟苯尼考胺類似物濃度)x100%<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>(六)試劑盒保存期試驗試劑盒保存條件為2-8t:，保存6個月后，測定試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50%抑制濃度、氟苯尼考胺和氟苯尼考實際添加測定，結果表明試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50%抑制濃度均在正常范圍之內?？紤]在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37'C保存的條件下放置6天，進行加速老化實驗，結果表明該試劑盒各項指標完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-2(TC冰箱冷凍5天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得出試劑盒可以在2-8"C至少可以保存6個月以上。權利要求1、一種檢測氟苯尼考和氟苯尼考胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括氟苯尼考胺特異性抗體及包被原和酶標記物；所述包被原為氟苯尼考胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標記物為酶標抗抗體或酶標氟苯尼考胺半抗原；當所述包被原為氟苯尼考胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時，所述酶標記物為酶標抗抗體；當所述包被原為抗抗體時，所述酶標記物為酶標氟苯尼考胺半抗原；所述氟苯尼考胺半抗原是將氟苯尼考胺和對羧基苯甲醛通過縮合反應得到的。2、根據(jù)權利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括氟苯尼考胺標準溶液、顯色液、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復溶液、包被緩沖液、封閉液。3、根據(jù)權利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述氟苯尼考胺特異性抗體為氟苯尼考胺多克隆抗體，是以氟苯尼考胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述載體蛋白為鼠血清白蛋白、兔血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白。4、根據(jù)權利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選為辣根過氧化物酶。5、根據(jù)權利要求1-4中任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述抗抗體為羊抗兔抗抗體。6、根據(jù)權利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為pH7.4、0.02M的含有0.05%疊氮鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質量百分含量。7、根據(jù)權利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為12mol/L硫酸或鹽酸溶液；當標記酶為堿性磷酸酯酶時，顯色劑為硝基磷酸鹽緩沖液(4-硝基酚磷酸鹽緩沖液)，終止液為12mol/L氫氧化鈉溶液。8、根據(jù)權利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮復溶液為含有0.1%牛血清白蛋白的0.03-0.06mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質量百分含量。9、根據(jù)權利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述包被緩沖液為pH值為9.6的0.01-0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；所述封閉液是含有0.01%疊氮化鈉和10%牛血清白蛋白的磷酸鹽溶液；所述百分含量為質量百分含量。10、一種檢測氟苯尼考和氟苯尼考胺的方法，包括以下步驟1)樣品前處理稱取2g動物組織勻漿物置離心管中，加入10ml三氯乙酸-PBS緩沖液，混勻；室溫以3000g以上的速度離心5min;取上清液，加入與上清液等體積的0.02M的PBS緩沖液，混勻，取樣進行分析；2)利用權利要求1_9中任一所述的檢測氟苯尼考和氟苯尼考胺的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣品。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測氟苯尼考和氟苯尼考胺的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測氟苯尼考和氟苯尼考胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括氟苯尼考胺特異性抗體及包被原和酶標記物；所述包被原為氟苯尼考胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標記物為酶標抗抗體或酶標氟苯尼考胺半抗原；當所述包被原為氟苯尼考胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時，所述酶標記物為酶標抗抗體；當所述包被原抗抗體時，所述酶標記物為酶標氟苯尼考胺半抗原；所述氟苯尼考胺半抗原是將氟苯尼考胺和對羧基苯甲醛通過縮合反應得到的。本發(fā)明的檢測方法，具有樣品前處理過程簡單、操作簡便、費用低廉、特異性高、靈敏度高、精確度高等特點，能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。文檔編號G01N33/543GK101299045SQ20081011482公開日2008年11月5日申請日期2008年6月12日優(yōu)先權日2008年6月12日發(fā)明者萬宇平,馮才偉,史為民,曹興元,李建成,江海洋,沈建忠,王戰(zhàn)輝,駱鵬杰申請人:中國農(nóng)業(yè)大學