專利名稱：：過氧化物酶抗體板式熒光酶免法及其應(yīng)用的制作方法過氧化物酶抗體板式熒光酶免法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)超微量檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，是以多孔板做載體制備固相抗原酵標(biāo)板，用于定量檢測人甲狀腺過氧化物酶(hTPO)抗體熒光酶免法(FEIA)的建立及臨床應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自身免疫性甲狀腺病(AITD)是一類多發(fā)病，主要包括橋本甲狀腺炎(HT)、Gmves病(GD)、產(chǎn)后甲狀腺炎(PPTD)等。其發(fā)病受遺傳背景、環(huán)境條件和免疫系統(tǒng)等多種因素的影響，表現(xiàn)為甲狀腺功能異常，且伴有多種甲狀腺自身抗體的生成，如甲狀腺過氧化物酶抗體(hTPOAb)、促甲狀腺素受體抗體(TRAb)、甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)等。hTPO及hTPOAb在AITD，特別是HT發(fā)病過程中起著重要作用。hTPO是一種含有血紅素輔基的膜結(jié)合糖蛋白，位于甲狀腺細胞頂緣的細胞膜上，在甲狀腺激素生物合成過程中，催化甲狀腺球蛋白中的酪氨酸殘基的碘化反應(yīng)及碘化酪氨酸殘基的偶聯(lián)，最終生成甲狀腺激素，是甲狀腺激素合成過程中不可缺少的酶。當(dāng)甲狀腺發(fā)生病變，濾泡細胞結(jié)構(gòu)受到破壞時，hTPO則由甲狀腺細胞頂部向外周血溢漏，導(dǎo)致甲狀腺內(nèi)浸潤的B淋巴細胞產(chǎn)生針對甲狀腺組織成分的抗體，其中包括hTPOAb，該抗體是一種抑制性自身免疫抗體，產(chǎn)生后可與hTPO結(jié)合并抑制hTPO的活性，使甲狀腺激素合成受阻，進而激素合成量減少，導(dǎo)致甲狀腺功能異常?；颊哐逯谐霈F(xiàn)高水平的hTPOAb是早期診斷AITD特別是HT的一個特異性指標(biāo)，也是評估AITD臨床診斷、治療及預(yù)后的重要依據(jù)。我國hTPOAb的測定開始于20世紀(jì)80年代，但多停留在定性測定的水平，甲狀腺微粒體抗體(TMAb)的放射免疫分析仍是目前國內(nèi)較普遍的檢測方法，但由于該法測定的是TMAb，并非是純的hTPOAb，所以TMAb檢測的特異性和敏感度均低于hTPOAb的檢測。近十余年開始引進國外定量hTPOAb試劑盒應(yīng)用于臨床，現(xiàn)用的商品試劑盒有以表面多孔的塑料微顆粒為固相載體的熒光酶免疫分析或以聚苯烯塑料珠或固相磁顆粒為載體的化學(xué)發(fā)光免疫分析。而本發(fā)明是以多孔位塑料板為固相載體的熒光酶免疫分析，板材來源容易、成本低、易推廣；所建方法特異、靈敏、穩(wěn)定，測定數(shù)值經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)，準(zhǔn)確度良好，適合臨床需要和推廣。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于將hTPO蛋白做抗原包被于酶標(biāo)板上制備固相酶標(biāo)板，以此建立板式固相定量檢測hTPOAbFEIA的方法。本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的方案是設(shè)計一種過氧化物酶抗體板式熒光酶免法并應(yīng)用于臨床。過氧化物酶抗體板式熒光酶免法，其特征在于用人甲狀腺過氧化物酶(hTPO)蛋白做抗原包被多孔板，用含l-5。/。BSA的PBST封閉；然后再以多孔板做載體依次加入抗hTPO第一抗體或標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)第二抗體、熒光底物和終止液，最后在熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀上測定熒光強度。本發(fā)明過氧化物酶抗體板式熒光酶免法，用于臨床鑒別自身免疫性和非自身免疫性甲狀腺病，以及診斷慢性淋巴細胞性甲狀腺炎。本發(fā)明建立的定量檢測抗hTPOFEIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線是用本室自制的抗hTPO陽性血清做標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)中國藥品生物制品檢定所提供的國家hTPOAb標(biāo)準(zhǔn)品多次校準(zhǔn)后確定的。自制的抗hTPO標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別約為200、100、50、25、6、2IU/ml。本發(fā)明的積極效果1、將hTPO蛋白做抗原包被在固相載體多孔板上，進而用此成功地建立了定量檢測抗hTPOFEIA。2、建立的板式固相定量檢測抗hTPOFEIA是把酶聯(lián)免疫分析ELISA與熒光檢測技術(shù)結(jié)合起來，具有高度的敏感性和特異性，操作方便，可以同時進行大量標(biāo)本的檢測，并可在熒光分析儀上迅速讀出結(jié)果。而且多孔位塑料板來源方便，價格低廉，易于臨床推廣應(yīng)用。3、建立的板式固相定量檢測抗hTPOFEIA已用于臨床檢測自身免疫性甲狀腺病，特別對慢性淋巴細胞性甲狀腺炎具有重要的特異的診斷價值，對鑒別自身免疫性和非自身免疫性甲狀腺病也有重要的臨床意義。圖l為抗hTPO標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2為hTPO與hTPOAb和TGAb結(jié)合反應(yīng)曲線圖3為平行實驗曲線圖；圖4為相關(guān)性檢測曲線圖5為FEIA檢測5種甲狀腺病患者血清hTPOAb陽性率曲線圖。以下結(jié)合本發(fā)明的實施例參照附圖進行詳細敘述。具體實施方式本發(fā)明過氧化物酶抗體板式熒光酶免法用人甲狀腺過氧化物酶(hTPO)蛋白做抗原包被多孔板，用含l-5MBSA的PBST封閉；然后再以多孔板做載體依次加入抗hTPO第一抗體、酶標(biāo)第二抗體、熒光底物和終止液，最后在熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀上測定熒光強度。所述多孔板抗原包被是在多孔板上每孔加100ng-2pg/100nlhTPO，4。C過夜，然后漂洗，再用含1-5%BSA的PBST封閉液封閉，每孔加100pl，25-37。C溫育l小時，再漂洗，完成。所述多孔板是各種不同數(shù)量孔位的多孔塑料板。所述加入抗hTPO第一抗體是用稀釋液1:50-1:200稀釋的人血清標(biāo)本或已知量標(biāo)準(zhǔn)物在多孔板上每孔加10(^1，25-37'C溫育l小時，漂洗。所述加入酶標(biāo)第二抗體是在多孔板上每孔加1:5000-1:20000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgGlOOpl，25-37'C溫育l小時，漂洗，而后再用蒸餾水漂洗。所述加入熒光底物是用0.01-0.05MpH7.8-10.0的Tris-HCL緩沖液l:2-l:15稀釋的四甲基磷酸傘形酮(4-MUP)10(Hd，25-37。C溫育l小時；最后，在多孔板上每孔加0.05-0.15MEDTA終止液50-100nl，25-37。C溫育l-20分鐘。所述漂洗是用PBST200-300pl漂洗l-3次。本發(fā)明在具體實施中還可以有以下方式。一、固相抗原酶標(biāo)板的制備1.包被抗原將hTPO用包被緩沖液(O.Ol5MNa2C03，0.035MNaHC03，pH9.6，0.02%NaN3)稀釋至100ng/10(Hi1-2^/100^1,每孔加10(^1,空白孔加包被緩沖液10(^1，4°(:過夜。2.固相載體的選擇將HT病人血清進行1:100，1:400及1:800的稀釋，每樣均做6孔，在NUNC透明板條，Costar透明板條，Thermo黑色板條及國產(chǎn)透明板條中進行測定篩選。結(jié)果見表l。表l.同一hTPOAb陽性標(biāo)本在不同固相載體上的測定結(jié)果(RFU)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>結(jié)果表明，各種塑料板的板質(zhì)在抗原固相化及精密度的基本條件上均可滿足本實驗的要求即均可使用，但相同稀釋度的血清在國產(chǎn)透明酶標(biāo)板上所達到的熒光強度最大，且變異系數(shù)可到2.8%，精密度較好，可以達到理想的測量結(jié)果，此外與其他板條比較，國產(chǎn)透明酶標(biāo)板價格便宜，來源方便，故首選作本技術(shù)的固相載體。二、板式固相定量檢測hTPOAbFEIA的建立(一)板式固相FEIA原理該技術(shù)是將抗原包被在96孔聚苯乙烯板上，通過固相化的抗原吸附待測樣品中的TPOAb(第一抗體)，洗去未反應(yīng)的物質(zhì)后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體與第一抗體進行結(jié)合反應(yīng)，漂洗后，加入熒光底物4-甲基磷酸傘形酮(4-MUP)，4-MUP被堿性磷酸酶分解產(chǎn)生4-甲基傘形酮(4-MU)和磷酸，4-MU經(jīng)過355nm激發(fā)光的激發(fā)后產(chǎn)生460nm的熒光，此熒光強度與標(biāo)本中抗體的量呈正比，用FluoroskanAscentFL儀器測量得到相對熒光單位，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可以計算出樣品中TPOAb的濃度。(二)最佳條件的探索1.抗原包被量、一抗稀釋度及熒光底物稀釋度的選擇在酶標(biāo)板上按交叉連續(xù)稀釋法排列組合，抗原包被量為100ng/孔-2pg/孔不等分組包被；一抗稀釋度為l-200倍稀釋不等分組；熒光底物稀釋度為1-15倍稀釋不等分組。在不同條件下測定同一hTPOAb陽性血清和陰性血清的RFU及其比值。結(jié)果多種配比均能使RFU陽性質(zhì)控血清/RFU陰性質(zhì)控血清比值大于2.1倍以上。我們首選了抗原包被量為每孔lpg/10(Hi1，一抗稀釋度為l:100，熒光底物稀釋度為h10。2.熒光底物、終止液反應(yīng)時間的選擇將反應(yīng)體系在37'C溫箱中溫育30min-120min不等分組，觀察不同時間熒光發(fā)光強度的變化，分別測定其RFU值。與此同時，加入終止液0.05MEDTA后5min-60min不等，觀察熒光強度的變化。我們首選加入熒光底物后37。C溫育60min，再加終止液5min后在熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀上測定結(jié)果。(三)標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立1.hTPOAb標(biāo)準(zhǔn)品的制備經(jīng)過篩選，選取抗hTPO陽性血清，分裝、冷干，-3(rc避光保存，做為本室制備的標(biāo)準(zhǔn)品備用。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用國家hTP0Ab標(biāo)準(zhǔn)品對本室制備的標(biāo)準(zhǔn)品進行6次校準(zhǔn)后，確定本室自制的抗hTPO標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別約為200、100、50、25、6、2IU/ml，以抗hTPO標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以其對應(yīng)的熒光強度(RFU)為縱坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上做圖建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見圖l所示。(四)板式固相定量檢測hTPOAbFEIA操作步驟1.包被抗原:將hTPO用包被緩沖液(0.015MNa2CO3，0.035MNaHC03，pH9.6，0.02。/。NaN3)稀釋至lug/100ul,每孔加100ixl，空白孔加包被緩沖液10(Vl,4'C過夜。2.漂洗:每孔用300(^1PBST漂洗3次。3.封閉:每孔加10(Hil封閉液(含3n/。BSA的PBST),37'C溫育l小時。4.漂洗:方法同2。5.結(jié)合一抗?？准?:100稀釋(稀釋液為PBS)的待測血清10(HU;標(biāo)準(zhǔn)曲線各孔分別加已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品10(V1，37'C溫育1小時。6.漂洗:方法同2。7.結(jié)合二抗:每孔加1:20000稀釋(用含P/。BSA的PBST稀釋)的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG100nl，37。C溫育l小時。8.漂洗:方法同2再用蒸餾水漂洗3次。9.加入熒光底物每孔加1:10稀釋(用0.1MTris-HCl緩沖液pH10.0稀釋)的4-MUPlO(Hil，37。C溫育l小時。IO.終止反應(yīng)每孔加0.05MEDTA終止液50nl，37'C溫育5min后在熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀上測定RFU值。(五)方法學(xué)鑒定1.特異性包被hTPO抗原，分別將含高濃度甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)和hTPOAb的血清進行一系列稀釋后作為一抗進行測定，觀察其與抗原的交叉結(jié)合反應(yīng)情況。結(jié)果顯示hTPO與hTPOAb特異性結(jié)合，hTPO與TGAb無交叉結(jié)合反應(yīng)，結(jié)果見圖3所示。2.精密度(1)批內(nèi)變異一次實驗中分別測定同一陽性質(zhì)控血清和陰性質(zhì)控血清各6樣，計算批內(nèi)變異(CV。/。)分別為5.14%和19.36%。(2)批間變異同一陽性質(zhì)控血清和陰性質(zhì)控血清，兩個月內(nèi)連續(xù)測定6次，計算批間0/%值分別為6.72%、17.90%。3.準(zhǔn)確度加入已知濃度的hTPOAb，濃度分別為100IU/m1，25IU/ml及3IU/ml,用本法檢測，分別計算高、中、低濃度樣品的回收率，平均回收率為98%。結(jié)果見表2。表2血清hTPOAb回收率的測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4.健全性將hTPOAb陽性血清分別進行兩次對倍稀釋，用測得的三個濃度值繪成一條稀釋曲線，該曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線呈平行關(guān)系。如圖3所示。5.相關(guān)性分別用本法和定量hTPOAb微粒酶聯(lián)免疫分析商品試劑盒檢測61例甲狀腺病患者血清，對檢測結(jié)果進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明兩種檢測方法呈顯著正相關(guān)(r=0.80，P<0.01)。如圖4所示(橫坐標(biāo)為本法檢測hTPOAb的濃度，縱坐標(biāo)為商品hTPOAb試劑盒檢測hTPOAb的濃度)。三、板式固相定量檢測hTPOAbFEIA的初步臨床應(yīng)用(臨床檢測796例分析)(一)人血清hTPOAb陽性切線值的確定檢測262例健康男性(年齡20-30歲)血清hTPOAb濃度，結(jié)果顯示hTPOAb為正偏態(tài)分布(PO.Ol)。因此，結(jié)果以百分位數(shù)表示，正常人群血清hTPOAb濃度中位數(shù)為3IU/ml，以濃度高于P95即5IU/ml為陽性切線值。(二)各種甲狀腺病患者血清hTPOAb的測定1.病例來源病例均來自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院門診患者，全部根據(jù)患者臨床癥狀、體征和實驗室檢查等資料確診。其中慢性淋巴細胞性甲狀腺炎(HT)患者多數(shù)有甲減臨床表現(xiàn)，甲狀腺腫大質(zhì)韌，血清甲狀腺激素顯示低功能狀態(tài)，TMAb和TGAb強陽性，4例有病理證實；Graves，病(GD)初診患者甲狀腺彌漫性腫大，血清FT3、FT4水平高于正常,sTSH低于正常且未經(jīng)治療，GD復(fù)診患者為經(jīng)過治療，絕大多數(shù)血清FT3、FT4已降至正常的GD確診病人。HT患者166例，(男22例，女144例，年齡13-71歲，平均43.3歲)；GD初診68例，(男18例，女50例，年齡ll-72歲，平均42.7歲)；GD復(fù)診202例，(男70例，女132例，年齡14-75歲，平均45.6歲)；單純性甲狀腺腫43例，(男3例，女40例，年齡13-65歲，平均36.1歲)；腺瘤17例，(男2例，女15例，年齡27-60歲，平均40.2歲)；亞急性甲狀腺炎38例，(男10例，女28例，年齡18-42歲，平均33.9歲)。2.檢測結(jié)果以中位數(shù)和四分位間距表示，率的比較用^檢驗。結(jié)果見表3。表3五種甲狀腺病患者血清hTPOAb檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注*表示11丁與其他各組之間分別比較的7值，弁表示HT與其他各組之間分別比較的P值。檢測結(jié)果表明GD初診和復(fù)診兩組之間的陽性率(32.35。/。vs31.68。/c)并無統(tǒng)計學(xué)差異(PX).05)，所以將其合并進行分析，其陽性率為31.85%。應(yīng)用板式固相定量檢測hTPOAbFEIA檢測HT、GD、單純性甲狀腺腫、腺瘤和亞急性甲狀腺炎5種患者血清，陽性檢出率分別為89.76%、31.85%、0、11.76%和26.32%,其中HT的陽性檢出率最高，HT與其他各組之間有顯著性差異，P均<0.01。如圖5所示。板式固相定量檢測hTPOAbFEIA應(yīng)用于臨床甲狀腺病患者的血清學(xué)檢査，結(jié)果顯示HT患者有很高的陽性檢出率，因此，該方法對HT具有重要的特異的診斷價值，對鑒別自身免疫性和非自身免疫性甲狀腺病也有重要的臨床意義。權(quán)利要求1、一種過氧化物酶抗體板式熒光酶免法，其特征在于用人甲狀腺過氧化物酶hTPO蛋白做抗原包被多孔板，用含1-5％BSA的PBST封閉；然后再以多孔板做載體依次加入抗hTPO第一抗體或標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)第二抗體、熒光底物和終止液，最后在熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀上測定熒光強度。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的過氧化物酶抗體板式熒光酶免法，其特征在于所述多孔板抗原包被是在多孔板上每孔加100ng-2嗎/10(^1hTPO，4'C過夜，然后漂洗，再用含1-5%BSA的PBST封閉液封閉，毎孔加IOOkiI，25-37'C溫育l小時，再漂洗，完成。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的過氧化物酶抗體板式熒光酶免法，其特征在于所述多孔板是多孔塑料板。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的過氧化物酶抗體板式熒光酶免法，其特征在于所述加入抗hTPO第一抗體是用稀釋液1:50-1:200稀釋的人血清標(biāo)本或已知量標(biāo)準(zhǔn)物在多孔板上每孔加lOO(il，25-37。C溫育l小時，漂洗。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的過氧化物酶抗體板式熒光酶免法，其特征在于所述加入酶標(biāo)第二抗體是在多孔板上每孔加1:5000-1:20000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgGIO(HU，25-37'C溫育l小時，漂洗，而后再用蒸餾水漂洗。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的過氧化物酶抗體板式熒光酶免法，其特征在于所述加入熒光底物是用0.01-0.05MpH7.8-10.0的Tris-HCL緩沖液l:2-l:15稀釋的四甲基磷酸傘形酮(4-MUP)lO(Hil，25-37。C溫育l小時；最后，在多孔板上每孔加0.05-0.15MEDTA終止液50-10(Hd，25-37。C溫育l-20分鐘。7、根據(jù)權(quán)利要求2或4、5所述的過氧化物酶抗體板式熒光酶免法，其特征在于所述漂洗是用PBST200-30(Hil漂洗l-3次。8、權(quán)利要求l所述的過氧化物酶抗體板式熒光酶免法應(yīng)用，其特征在于用于臨床鑒別自身免疫性和非自身免疫性甲狀腺病，診斷慢性淋巴細胞性甲狀腺炎。全文摘要本發(fā)明是一種過氧化物酶抗體板式熒光酶免法及其應(yīng)用。其特征在于用人甲狀腺過氧化物酶(hTPO)蛋白做抗原包被多孔板，用含1-5％BSA的PBST封閉；然后再以多孔板做載體依次加入抗hTPO第一抗體或標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)第二抗體、熒光底物和終止液，最后在熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀上測定熒光強度?？捎糜谂R床鑒別自身免疫性和非自身免疫性甲狀腺病，以及診斷慢性淋巴細胞性甲狀腺炎。本發(fā)明以多孔位塑料板為固相載體的熒光酶免疫分析，板材來源容易、成本低、易推廣；所建方法特異、靈敏、穩(wěn)定，測定數(shù)值經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)，準(zhǔn)確度良好，適合臨床需要和推廣。文檔編號G01N33/544GK101430332SQ20081015388公開日2009年5月13日申請日期2008年12月9日優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日發(fā)明者枚呂,張艷麗,方佩華,寧李,靜許申請人:天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院