專利名稱：乳品抗生素快速檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
奶牛由于經(jīng)常擠奶極易發(fā)生乳腺炎等疾病，注射抗生素是目前最直接有效 的治療手段。而給病牛注射藥物后，分泌的牛奶中會(huì)有大量的抗生素殘留。即 使在停藥后，牛奶中的抗生素含量仍會(huì)在一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)超標(biāo)。如果長期飲用 抗生素超標(biāo)的奶，會(huì)使正常人被動(dòng)接受、積累抗生素，造成人體生理紊亂，對(duì) 抗生素產(chǎn)生耐藥性。歐美各國多年前即立法禁止抗生素殘留超限量的牛奶上市， 抗生素含量達(dá)標(biāo)已成為通用的國際化的原料奶收購標(biāo)準(zhǔn)。
目前乳品中抗生素殘留的檢測(cè)方法大致分為三類生物測(cè)定法、理化分析 法和免疫法。分別介紹如下
1.微生物檢測(cè)法
微生物檢測(cè)法是應(yīng)用較廣泛的方法，其測(cè)定原理是根據(jù)抗生素對(duì)微生物的 生理機(jī)能、代謝的抑制作用,來定性或定量確定樣品中抗微生物藥物殘留，如
Delvotest法、紙片法(PD)、 TTC法、拭子法(STOP)等。Delvotest法和TTC 法是牛奶中藥物殘留檢測(cè)的兩種常用的微生物檢測(cè)法。
Delvotest法其原理是在牛奶樣品中加入嗜熱芽胞菌，在64。C條件下培養(yǎng) 2.5 3小時(shí)后會(huì)產(chǎn)酸，酸引起指示劑BCP(溴甲酚紫)變?yōu)辄S色。若牛奶樣品中不 含抗生素,培養(yǎng)后樣品呈黃色；如樣品中含有抗生素，嗜熱芽胞菌生長受到抑制 而無法產(chǎn)酸，指示劑將不變色。
TTC法即氯化三苯基四氮唑法(tripheyetetrazolium chloride),是目前我國 食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢査牛奶中抗生素殘留的檢測(cè)方法(GB5409—85)。其原理是 嗜熱鏈球菌在牛奶中生長時(shí)會(huì)將無色的2， 3， 5 —氯化三苯基四氮唑(2， 3， 5-Triphenyltetrazolium Chloride, TTC)還原為紅色的三苯甲瓚。當(dāng)牛奶中存在 抗生素等抗菌物質(zhì)時(shí)，會(huì)抑制嗜熱鏈球菌的生長，TTC則無法被還原。
微生物檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是，設(shè)備、試劑成本低；可以檢測(cè)廣譜的抗生素。 缺點(diǎn)是1.時(shí)間長，通常需要等待3小時(shí)以上；2.顯色狀態(tài)判斷通過肉眼辨別， 易產(chǎn)生誤差，無法做出準(zhǔn)確判斷；3.操作復(fù)雜，要求操作人員需有一定專業(yè)知 識(shí)且實(shí)驗(yàn)過程中要求嚴(yán)格遵守操作規(guī)程；4.檢測(cè)容易受干擾，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假 陽性或假陰性。2. 理化檢測(cè)法
理化檢測(cè)方法是利用抗生素分子中的基團(tuán)所具有的特殊反應(yīng)或性質(zhì)來測(cè)定 其含量，包括高效液相色譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法等等，其中以高效液相色
譜(HPLC)法最為常用。
高效液相色譜(HPLC):是目前廣泛應(yīng)用的一種理化檢測(cè)方法，利用抗生
素分子中的基團(tuán)所具有的特殊反應(yīng)來測(cè)定其含量。它引入了氣相色譜理論，在 技術(shù)上采用了高壓泵，高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了分離速度快、效 率高和操作自動(dòng)化。幾乎所有的化合物包括高極性/離子型待測(cè)物和大分子物
質(zhì)，均可用HPLC進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)過程一般要經(jīng)過樣品的提取、脫蛋白、離心、 層析柱凈化、衍生化等步驟，能檢測(cè)抗生素的具體含量，敏感性較高。
其它用于乳品抗生素殘留檢測(cè)的理化法還包括氣相色譜法(GC)、高效薄層 色譜(HPTLC)、超臨界流體色譜(SFC)和毛細(xì)管區(qū)域電泳法(CZE)等。這些方法 盡管在殘留檢測(cè)中不常用，但因其各自特有的性能，能彌補(bǔ)常用方法中不足之 處。如GC有許多高靈敏、通用性或?qū)Ｒ恍詮?qiáng)的檢測(cè)器供選用，如氫焰離子化檢 測(cè)器(FID)、氯磷檢測(cè)器(NPD)等，檢測(cè)限可達(dá)嗎/kg級(jí)；HPTLC的斑點(diǎn)原位掃 描定量、定性和高效分離材料(O3 10,)改變了常規(guī)TLC在靈敏度和重現(xiàn)性方 面的不足，但保持了TLC的簡(jiǎn)便、快速和樣品容量大的優(yōu)點(diǎn)，可使用正相或反 相板，分辨率幾乎與HPLC相當(dāng)，在抗生素殘留的快速篩選性檢5測(cè)方面應(yīng)用 廣泛；SFC可彌補(bǔ)GC和HPLC的不足，方便地連接各種靈敏的檢測(cè)器(MS， ECD 等)；CZE是90年代以來研究最活躍的分析技術(shù)之一，兼有高壓電泳的高速、 高分辨和HPLC靈活、高效的優(yōu)點(diǎn)。
理化法的優(yōu)點(diǎn)是能進(jìn)行定性、定量和藥物鑒定，敏感性較高。缺點(diǎn)是但檢 測(cè)程序復(fù)雜，費(fèi)用較高，需購買昂貴的檢測(cè)設(shè)備，不適合小型檢驗(yàn)室。
3. 免疫法
免疫測(cè)定法(immunoassays， IAs)可分為酶聯(lián)免疫法(EIA)、放免法(RIA)
等，是利用抗體與抗原之間特異性的免疫反應(yīng)進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。目前在乳 品抗生素檢測(cè)領(lǐng)域較為常見的免疫檢測(cè)法有ELISA法和金標(biāo)層析法等。
ELISA法在包被有抗體的96孔板上加入樣品和酶標(biāo)抗原，樣品中含有的 抗生素(抗原)與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)板上有限的抗體結(jié)合位點(diǎn)。樣品中的抗原含量 越高，與抗體結(jié)合的量就越多，而酶標(biāo)抗原的結(jié)合量就越低，即樣品中抗原含 量與結(jié)合的酶標(biāo)抗體含量成反比。加入顯色液，顯色深淺與樣品中抗原含量成 反比。ELISA法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度高，可精確定量。
4金標(biāo)層析法在包被有抗體的膜上加入樣品和金標(biāo)抗原，樣品中含有的抗 生素(抗原)與酶標(biāo)抗原利用毛細(xì)作用通過膜上的抗體并被捕獲。樣品中的抗 原含量越高，與抗體結(jié)合的量就越多，而金標(biāo)抗原的結(jié)合量就越低，抗體位置 的顯色就越淺，即顯色深淺與樣品中抗原含量成反比。金標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)速 度快，通常幾分鐘即可出結(jié)果。但通常只能定性判斷，同時(shí)在靈敏度方面存在 欠缺。
免疫分析技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，速度快、分析成本低。以使用96
孔板的ELISA為例，免疫測(cè)定法取樣量小，前處理簡(jiǎn)單、容量大，儀器化程度 低，檢測(cè)奶與GC/MS或GC/ECD相似，可方便地達(dá)到ng/ml級(jí)，分析效率則為 HPLC或GC的幾十倍以上。缺點(diǎn)是定量檢測(cè)時(shí)需要操作人員具備一定的專業(yè)知 識(shí)和技巧；同時(shí)檢測(cè)時(shí)間需要1小時(shí)以上，不能完全滿足牛奶公司收購鮮奶時(shí) 需要即時(shí)出報(bào)告的需要；而金標(biāo)層析法通常只能定性判斷，結(jié)果不夠穩(wěn)定，同 時(shí)在靈敏度方面存在欠缺。目前大部分抗生素已經(jīng)建立了免疫測(cè)定法，如磺胺 二甲基嘧啶、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素、莫能菌素等。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定的 基于酶聯(lián)免疫層析技術(shù)的乳品抗生素檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的乳品抗生素快速檢測(cè)試劑盒，包括具有層析膜、洗滌液、顯色 液和吸水紙的檢測(cè)盒以及包含有酶標(biāo)抗原的樣品管，所說的層析膜包被有抗生 素抗體的乳膠、對(duì)照抗體的乳膠；
其中，包被在層析膜上的抗生素抗體乳膠包括青霉素類抗體、頭孢菌素 類抗體、氨基糖苷類抗體、磺胺類抗體、四環(huán)素類抗體、氯霉素抗體、黃曲霉 素抗體
酶標(biāo)抗原包括青霉素類抗原、頭孢菌素類抗原、氨基糖苷類抗原、磺胺 類抗原、四環(huán)素類抗原、氯霉素抗原、黃曲霉素抗原
顯色液0.02%TMB， 1.5%PVP， 0.75%DMSO， 0.1%硫酸葡聚糖，0.015 %H202, pH5.0。
洗滌液O.OlMTris畫HCl， 0.5%NaCl， 0.1 %Tween-20， pH6.9
乳品抗生素快速檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括如下步驟
1) 取純的抗生素標(biāo)記辣根過氧化物酶，-S(TC保存待用；
2) 取上述步驟l)標(biāo)記的抗生素-辣根過氧化物酶溶液，分裝在樣品管內(nèi)，凍
干；3) 取抗生素抗體，對(duì)照抗體包被商品化乳膠，將抗體包被的乳膠用點(diǎn)樣儀 分別噴在層析膜的檢測(cè)點(diǎn)及對(duì)照點(diǎn)位置，37'C烘干1小時(shí)；
4) 取藍(lán)色染料水溶液，用點(diǎn)樣儀噴在層析膜位于檢測(cè)盒指示窗的位置，烘
干；
5) 配制洗滌液、顯色液，分別裝入檢測(cè)盒的相應(yīng)位置。其中洗滌液為300ul， 顯色液為700ul。覆蓋鋁箔后22(TC熔封；
6) 在檢測(cè)盒的吸水針內(nèi)裝入吸水棒，在檢測(cè)盒的活動(dòng)組件內(nèi)裝入層析膜； 在檢測(cè)盒底座相應(yīng)位置裝入吸水紙。最后將活動(dòng)組件與底座裝配。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)述如下
1) 采用酶聯(lián)免疫法原理，提高檢測(cè)靈敏度；
2) 采用層析方式進(jìn)行，使反應(yīng)物(包括樣品中的抗原，顯色液中的底物等) 能夠與抗體充分接觸，提高反應(yīng)效率，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度，縮短檢測(cè)時(shí) 間；
3) 在檢測(cè)點(diǎn)旁邊設(shè)置了對(duì)照點(diǎn)，通過比較兩者的顯色深淺來判斷結(jié)果，可 實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。
在檢測(cè)盒中預(yù)裝洗漆液和顯色液可以簡(jiǎn)化操作步驟。用戶在檢測(cè)時(shí)無需手 工加液，只要按下活動(dòng)組件，即可將洗滌液和顯色液依次參與反應(yīng)；降低操作 失誤的可能性避免出現(xiàn)漏加或誤加溶液的可能性。
利用本發(fā)明可檢測(cè)包括鮮奶、酸奶、可溶于水的乳制品、其它含乳水溶液等。


圖1是乳品抗生素快速檢測(cè)試劑盒中檢測(cè)盒的俯視圖； 1.加樣孔；2.讀數(shù)窗；3.對(duì)照點(diǎn)；4.檢測(cè)點(diǎn)；5.指示窗；6.按鈕
圖2是乳品抗生素快速檢測(cè)試劑盒中檢測(cè)盒的側(cè)視圖(初始狀態(tài))； 1.加樣孔；2.讀數(shù)窗；3.對(duì)照點(diǎn)；4.檢測(cè)點(diǎn)；5.指示窗；6.按鈕；7.層析膜; 8.吸水棒l; 9.吸水棒2; 10.吸水針；11.活動(dòng)組件；12.底座；13.吸水紙； 14.洗滌液；15.顯色液；16.鋁箔
圖3是乳品抗生素快速檢測(cè)試劑盒中檢測(cè)盒的側(cè)視圖(顯色狀態(tài))。
具體實(shí)施例方式
以下舉例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
參照附圖，乳品抗生素快速檢測(cè)試劑盒，包括具有層析膜7、洗滌液14、 顯色液15和吸水紙13的檢測(cè)盒以及包含有酶標(biāo)抗原的樣品管，所說的層析膜包被有抗生素抗體的乳膠、對(duì)照抗體的乳膠；
其中，包被在層析膜上的抗生素抗體乳膠包括青霉素類抗體、頭孢菌素 類抗體、氨基糖苷類抗體、磺胺類抗體、四環(huán)素類抗體、氯霉素抗體、黃曲霉 素抗體
酶標(biāo)抗原包括青霉素類抗原、頭孢菌素類抗原、氨基糖苷類抗原、磺胺 類抗原、四環(huán)素類抗原、氯霉素抗原、黃曲霉素抗原
顯色液0.02%TMB， 1.5%PVP， 0.75%DMSO， 0.1%硫酸葡聚糖，0.015 %H202， pH5.0。
洗滌液O.OlMTris-HCl， 0.5%NaCl， 0.1 %Tween-20, pH6.9
實(shí)施例1.乳品e-內(nèi)酰胺快速檢測(cè)試劑盒的制備
1. 取純的青霉素5mg，加200ul0.01MPBS(pH7.2)溶解。加入4mg辣根過 氧化物酶(HRP)及1.5mg環(huán)已基碳二亞胺，37匸反應(yīng)2小時(shí)。將反應(yīng)產(chǎn)物對(duì) 0.01MPBS(pH7.2)透析3次，去除游離的青霉素。-80°。保存待用；
2. 取上述青霉素-HRP溶液，加含10X海藻糖的0.01MPBS(pH7.2)稀釋至 約2ug/ml，再加入一定數(shù)量的鼠抗BSA-HRP，混合均勻，分裝在樣品管內(nèi)，凍 干；
3. 取100ul乳膠，加入900ul 0.1M pH 6.2 NaH2P04溶液、新配制的 20mg/ml的EDC，加入青霉素抗體和對(duì)照抗體進(jìn)行包被，將包被好的乳膠用點(diǎn) 樣儀分別噴在層析膜的檢測(cè)點(diǎn)及對(duì)照點(diǎn)位置，37"C烘干1小時(shí)；
4. 取0.01%藍(lán)色染料水溶液，用點(diǎn)樣儀噴在層析膜位于檢測(cè)盒指示窗的位 置，烘干；
5. 配制洗滌液(O.OlMTris-HCl， 0.5%NaCl， 0.1 %Tween-20， pH6.9)及顯 色液(含0.02XTMB， 1.5%PVP， 0.75%DMSO， 0.1%硫酸葡聚糖，0.015%H2O2， pH5.0)，分別裝入檢測(cè)試劑盒的相應(yīng)位置。其中洗滌液為300ul，顯色液為700ul。 覆蓋鋁箔后22(TC熔封；
6. 在檢測(cè)盒的吸水針內(nèi)裝入吸水棒，在檢測(cè)盒的活動(dòng)組件內(nèi)裝入層析膜； 在檢測(cè)盒底座相應(yīng)位置裝入吸水紙。最后將活動(dòng)組件與底座裝配。
本發(fā)明采用層析膜作為固相載體，將特異性抗體包被的乳膠顆粒固定在層 析膜表面。酶標(biāo)記物以凍干形式保存在樣品管中，而反應(yīng)所需的洗滌液和顯色 液則已經(jīng)預(yù)裝在檢測(cè)盒內(nèi)，按下檢測(cè)盒一側(cè)的按鈕，洗滌液和顯色液即可通過 毛細(xì)作用自動(dòng)流過反應(yīng)區(qū)，完成洗滌和顯色步驟。顯色后，讀數(shù)窗出現(xiàn)2個(gè)斑 點(diǎn)(檢測(cè)點(diǎn)和對(duì)照點(diǎn))通過比較兩者顏色的深淺即可判斷結(jié)果。既可通過目測(cè)直接判斷結(jié)果，也可以利用儀器讀取顯色深淺，得到半定量的數(shù)值。
本發(fā)明的一個(gè)特征是檢測(cè)盒內(nèi)已經(jīng)預(yù)裝了反應(yīng)所需體積的洗滌液和顯色 液。反應(yīng)時(shí)，首先將一定體積的待測(cè)物(如牛奶)加入樣品管中，其中凍干的 酶標(biāo)記物溶解，與牛奶混合均勻。然后將混合樣品加入檢測(cè)試劑盒的加樣孔1
內(nèi)，樣品滲入層析膜7并利用毛細(xì)作用進(jìn)行擴(kuò)散，通過包被有抗體的對(duì)照點(diǎn)3 和檢測(cè)點(diǎn)4的檢測(cè)區(qū)。牛奶中的待測(cè)抗原與酶標(biāo)抗生素抗原競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)點(diǎn)位置抗 體上有限的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)對(duì)照點(diǎn)上的抗體(或抗原)捕獲對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)物。當(dāng) 樣品到達(dá)指示窗5時(shí)，按下按鈕6，活動(dòng)組件一側(cè)下降，吸水棒8， 9刺破鋁箔 16，同時(shí)加樣孔一端的層析膜與吸水紙13接觸。鋁箔下方預(yù)裝的洗滌液14和 顯色液15依次通過吸水針10到達(dá)層析膜7并沿著層析膜向吸水紙一端運(yùn)動(dòng)并 最終被吸收。洗滌液將未被抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原等物質(zhì)從膜上洗去，然后顯色 液通過檢測(cè)區(qū)并與結(jié)合在對(duì)照點(diǎn)3和檢測(cè)點(diǎn)4上的酶發(fā)生反應(yīng)，顯色液中的TMB 被氧化呈藍(lán)色。
實(shí)施例2.利用快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)牛奶中日-內(nèi)酰胺的操作步驟
1. 加400ul牛奶樣品至樣品管中，搖勻；
2. 將含有牛奶的樣品管和檢測(cè)盒一起置于45"C 5分鐘；
3. 將樣品管內(nèi)的牛奶倒入檢測(cè)盒的加樣孔內(nèi)；
4. 當(dāng)溶液擴(kuò)散至指示窗、染料斑點(diǎn)出現(xiàn)移動(dòng)時(shí)按下活動(dòng)組件一端的按鈕；
5. 等待4分鐘后，通過目測(cè)或讀數(shù)儀判斷結(jié)果。
目測(cè)時(shí)，當(dāng)檢測(cè)點(diǎn)顏色深于對(duì)照點(diǎn)時(shí)，提示結(jié)果為陰性，牛奶中抗生素未 超標(biāo)；當(dāng)檢測(cè)點(diǎn)顏色淺于對(duì)照點(diǎn)時(shí)，提示結(jié)果為陽性，牛奶中抗生素超標(biāo)。采 用讀數(shù)儀時(shí)，當(dāng)讀數(shù)小于1.05時(shí)，提示結(jié)果為陰性，牛奶中抗生素未超標(biāo)；當(dāng) 讀數(shù)大于1.05時(shí)，提示結(jié)果為陽性，牛奶中抗生素超標(biāo)。
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權(quán)利要求
1、乳品抗生素快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括具有層析膜、洗滌液、顯色液和吸水紙的檢測(cè)盒以及包含有酶標(biāo)抗原的樣品管，所說的層析膜包被有抗生素抗體的乳膠、對(duì)照抗體的乳膠；其中，包被在層析膜上的抗生素抗體乳膠包括青霉素類抗體、頭孢菌素類抗體、氨基糖苷類抗體、磺胺類抗體、四環(huán)素類抗體、氯霉素抗體、黃曲霉素抗體酶標(biāo)抗原包括青霉素類抗原、頭孢菌素類抗原、氨基糖苷類抗原、磺胺類抗原、四環(huán)素類抗原、氯霉素抗原、黃曲霉素抗原顯色液0. 02％TMB，1.5％PVP，0.75％DMSO，0.1％硫酸葡聚糖，0.015％H2O2，pH5.0。洗滌液0. 01MTris-HCl，0.5％NaCl，0.1％Tween-20，pH6.9。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳品抗生素快速檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟1) 取純的抗生素標(biāo)記辣根過氧化物酶，-S(TC保存待用；2) 取上述步驟l)標(biāo)記的抗生素-辣根過氧化物酶溶液，分裝在樣品管內(nèi)，凍干；3) 取抗生素抗體，對(duì)照抗體包被商品化乳膠，將抗體包被的乳膠用點(diǎn)樣儀分別噴在層析膜的檢測(cè)點(diǎn)及對(duì)照點(diǎn)位置，37'C烘干1小時(shí)；4) 取藍(lán)色染料水溶液，用點(diǎn)樣儀噴在層析膜位于檢測(cè)盒指示窗的位置，烘干；5) 配制洗滌液、顯色液，分別裝入檢測(cè)盒的相應(yīng)位置。其中洗滌液為300ul,顯色液為700ul。覆蓋鋁箔后220'C熔封；6) 在檢測(cè)盒的吸水針內(nèi)裝入吸水棒，在檢測(cè)盒的活動(dòng)組件內(nèi)裝入層析膜；在檢測(cè)盒底座相應(yīng)位置裝入吸水紙。最后將活動(dòng)組件與底座裝配。
全文摘要
本發(fā)明公開的乳品抗生素快速檢測(cè)試劑盒包括具有層析膜、洗滌液、顯色液和吸水紙的檢測(cè)盒以及包含有酶標(biāo)抗原的樣品管，其中層析膜包被有抗生素抗體的乳膠、對(duì)照抗體的乳膠。檢測(cè)盒由活動(dòng)組件與底座裝配而成。由于檢測(cè)盒自身帶有洗滌液和顯色液，因此只要加入樣品，隨后按下活動(dòng)組件就可以完成檢測(cè)，無需手工加入試劑，大大提高了檢測(cè)的便利性及可靠性，減少失誤的可能性；由于該試劑盒采用層析法進(jìn)行反應(yīng)，使反應(yīng)物能夠與抗體充分接觸，有利于提高反應(yīng)效率，提高檢測(cè)的靈敏度，縮短檢測(cè)時(shí)間。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101458252SQ20081016420
公開日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者厲永綱, 科 孫, 強(qiáng) 王, 陳宇鵬 申請(qǐng)人:杭州博日科技有限公司