專利名稱：一種使用gapdh基因分析arhgdib基因表達(dá)量的rt-pcr技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用GAPDH基因mRNA為內(nèi)參，對(duì)ARHGDIB基因進(jìn)行相對(duì)定量的實(shí) 時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，并形成相應(yīng)試劑盒，屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組圖譜的完成，人們開始進(jìn)入后基因組時(shí)代，重點(diǎn)也轉(zhuǎn)向了研究各 基因在生命中的作用，包括基因在生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳、疾病、外型體征等方面的作用。其中，對(duì) 于RhoGDP dissociation inhibitor (GDI) beta基因(ARHGDIB基因)表達(dá)的研究也越來越 多。 基因表達(dá)的檢測(cè)有幾種方法。經(jīng)典的方法是根據(jù)在細(xì)胞或生物體中所觀察到的生 物化學(xué)或表型的變化來決定某一特定基因是否表達(dá)。隨著大分子分離技術(shù)的進(jìn)步使得特異 的基因產(chǎn)物或蛋白分子的識(shí)別和分離成為可能。隨著重組DNA技術(shù)的運(yùn)用，現(xiàn)在有可能檢 測(cè)、分析任何基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。目前有好幾種方法廣泛應(yīng)用于研究特定RNA分子。這些方 法包括RT-PCR、原位雜交、NORTHERN凝膠分析、打點(diǎn)或印跡打點(diǎn)、S-1核酸酶分析、RNA酶保 護(hù)研究以及基因芯片等。 熒光探針PCR技術(shù)是今年興起并得到快速發(fā)展的技術(shù)，是將同時(shí)帶有關(guān)聯(lián)的熒光 發(fā)光基團(tuán)(能量供體)和淬滅基團(tuán)(能量受體)的熒光探針結(jié)合PCR技術(shù)而產(chǎn)生的一種 新的檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)，且不易發(fā)生產(chǎn)物污染等特點(diǎn)，包括Taqman探針技 術(shù)、分子信標(biāo)(Beacan探針)等，由于該技術(shù)操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快，且各方面性能都有優(yōu) 勢(shì)，目前在臨床、研究等核酸檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。 GAPDH (Human glyceraldehyde_3-phosphate dehydrogenase)基因?yàn)槌Ｓ玫目醇?基因，在人體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況較為穩(wěn)定，已被廣泛用于基因表達(dá)的研究，利用A ACt值的 方法能對(duì)其他基因的表達(dá)情況進(jìn)行相對(duì)定量分析。公式為F = 2—AAet。
本發(fā)明將RT-PCR與熒光探針技術(shù)結(jié)合，通過廣泛篩選和優(yōu)化檢測(cè)引物和探針，同 時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的GAPDH基因和ARHGDIB基因mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡(jiǎn)便的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達(dá)量 的RT-PCR技術(shù)。 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種一步法RT-PCR同時(shí)檢測(cè)GAPDH基因mRNA和 ARHGDIB基因mRNA的技術(shù)。 根據(jù)GeneBank序列號(hào)為NC_000012的基因序列為模板，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物及特異性 探針，檢測(cè)長(zhǎng)度為139bp的目標(biāo)mRNA，其引物探針序列分別為
引物1 :5—-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3— (Seq No. 1)
引物2 :5— -GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3— (Seq No. 2)
4
探針1 :5—-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3— (Seq No. 3)
或探針2 :5—-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3— (Seq No. 4) 設(shè)計(jì)的探針跨越了 NCJ)00012基因序列中第111098-111743位核苷酸的內(nèi)含子，
分別與其兩端的外顯子特異性匹配，這樣可非常有效的避免基因組DNA對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影
響，同時(shí)也省去了使用DNA酶對(duì)樣本進(jìn)行消化用以去除DNA干擾的步驟。 根據(jù)GeneBank序列號(hào)為NW_925295的基因序列為模板，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物及特異性
探針，檢測(cè)長(zhǎng)度為131bp的內(nèi)參(GAPDH基因)mRNA，其引物探針序列分別為 引物3 :5—-TCAAGATCATCAGCAATGCCT-3— (Seq No. 5) 引物4 :5—-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3— (Seq No. 6)探針3 :5—-ACTGTGGTCATGAGTCCTTCCACGA-3— (Seq No. 7) 或者上述弓I物序列的互補(bǔ)序列，或者上述序列同源性大于75 %的序列。 計(jì)的探針跨越了 NW_925295基因序列中第2104-2193位核苷酸的內(nèi)含子，分別與
其兩端的外顯子特異性匹配，這樣可非常有效的避免基因組DNA對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影B向，同時(shí)
也省去了使用DNA酶對(duì)樣本進(jìn)行消化用以去除DNA干擾的步驟。 上述試劑盒的探針(探針1、探針2和探針3)，其5—端的熒光發(fā)光基團(tuán)可為FAM、 TET、 J0E、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Fluorescein、 Rhodamine、 Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine6G、 Oregon Green 488、 Oregon Green 500、 Oregon Green 514、 Texas Red、 TAMRA、 Inosine、 HEX、 FITC、 Acridine orange或ROX中任意一種；3—端熒光淬滅基團(tuán)可為 DABCYL、 DABSYL、 Eclipse、 TAMRA、 BHQ-l、 BHQ_2、 BHQ-3或MGB基團(tuán)中的任意一種。
本發(fā)明提供的使用GAPDH基因mRNA分析ARHGDIB基因相對(duì)表達(dá)量的RT-PCR試劑 盒是使用一步法RT-PCR的技術(shù)，使操作更為簡(jiǎn)便、快速。使用表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定的GAPDH基 因與目標(biāo)基因同時(shí)檢測(cè)，能對(duì)標(biāo)本中的ARHGDIB基因mRNA進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行定量分析。
本發(fā)明提供的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達(dá)量的RT-PCR技術(shù)形成的試 劑盒，使用2個(gè)人工合成的RNA序列作為RNA陽性對(duì)照品，序列為
模板1 :7
(139bp)(Seq No. 8)
模板2
(Seq No.9) 其中，ARHGDIB基因mRNA檢測(cè)體系使用模板1作為陽性對(duì)照品，GAPDH基因mRNA 檢測(cè)體系使用模板2作為陽性對(duì)照品。 本發(fā)明提供的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達(dá)量的RT-PCR技術(shù)形成的試 劑盒組成為 組成成分(20人份/盒)體積
反應(yīng)緩沖液A 380 ill 反應(yīng)緩沖液B 380 ill 混合酶 60 ill RNA陽性對(duì)照品A 30
RNA陽性對(duì)照品B 30
DEPC水 1ml 其中，反應(yīng)緩沖液的組分(終濃度)包括50mM Tris-HCl(PH 8. 3)、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2，而且ARHGDIB基因mRNA檢測(cè)體系(反應(yīng)緩沖液A)含200nM引物1、 200nM引物2和200nM探針l，GAPDH基因mRNA檢測(cè)體系(反應(yīng)緩沖液B)含200nM引物3、 200nM引物4和200nM探針3，其中，兩條探針的5—端標(biāo)記的發(fā)光基團(tuán)均為FAM，在3—端標(biāo) 記的淬滅基團(tuán)均為Eclipse?；旌厦傅慕M成成份(終濃度)包括0. 5U AMV酶、0. 5U RNase Inhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。
本發(fā)明提供的試劑盒操作步驟如下
PCR反應(yīng)液的配制 A管按每人份反應(yīng)緩沖液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22u1/ 管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補(bǔ)充DEPC水，使反應(yīng)總體積為
30ul ; B管按每人份反應(yīng)緩沖液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22u1/ 管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補(bǔ)充DEPC水，使反應(yīng)總體積為
30ul ; RNA陽性對(duì)照品直接取8ul ， A管使用RNA陽性對(duì)照品A， B管使用RNA陽性對(duì)照品 B，按如下程序進(jìn)行一步法RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)5分鐘，然后95t:保溫5分 鐘，再按94°C 20秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集熒光)。
采用比較Ct值的相對(duì)定量法，即通過標(biāo)本的兩管檢測(cè)Ct值與正常對(duì)照品的兩管 檢測(cè)Ct值的A A Ct值，根據(jù)F = 2—A Aet公式計(jì)算ARHGDIB基因相對(duì)GAPDH基因的表達(dá)量。
傳統(tǒng)的RT-PCR使用兩步法擴(kuò)增，時(shí)間長(zhǎng)，操作相對(duì)復(fù)雜，且因多了一個(gè)步驟而易 發(fā)生污染，所以本發(fā)明提供的試劑盒采用一步法RT-PCR技術(shù)，將RT步驟與PCR步驟一步完 成，無須開管進(jìn)行二次加樣，將少了污染的機(jī)會(huì)。由于反應(yīng)體系中RT步驟是使用特異性引 物進(jìn)行延伸，與傳統(tǒng)的隨機(jī)引物法相比，逆轉(zhuǎn)錄需要的時(shí)間更短，通?？稍?. 5小時(shí)內(nèi)完成 全部RT-PCR反應(yīng)，并且由于試劑盒使用熱穩(wěn)定性較強(qiáng)的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，可在5(TC進(jìn)行RT反 應(yīng)，產(chǎn)品的特異性非常高。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)GeneBank中的人類基因組12號(hào)染色體ARHGDIB基因相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)和分 析，設(shè)計(jì)和制備引物與探針(設(shè)計(jì)模板GeneBank序列號(hào)為NCJ)00012):
引物1 :5—-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3— (Seq No. 1) 引物2 :5—-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3— (Seq No. 2) 探針1 :5—-FAM-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-Eclipse-3— (Seq No. 3)
設(shè)計(jì)并制備人工合成RNA序列
(Seq No. 8) 根據(jù)GeneBank中的人類基因組12號(hào)染色體GAPDH基因相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)和分
6析，設(shè)計(jì)和制備引物與探針(設(shè)計(jì)模板GeneBank序列號(hào)為NW—925295):
引物3 :5—-TCAAGATCATCAGCAATGCCT-3— (Seq No. 5) 引物4 :5—-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3— (Seq No. 6) 探針3 :5—-FAMACTGTGGTCATGAGTCCTTCCACGAEclipse-3— (Seq No. 7)
設(shè)計(jì)并制備人工合成RNA序列
No. 9) 將人工合成的兩條RNA序列用DEPC處理過的水溶解并稀釋至適當(dāng)濃度，分別作為 ARHGDIB和GAPDH基因mRNA的陽性對(duì)照品。 按如下配方配制反應(yīng)緩沖液A(終濃度)50mM Tris-HC1(PH 8. 3)、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM弓|物2禾P 200nM探針1。 按如下配方配制反應(yīng)緩沖液B(終濃度):50mM Tris-HC1(PH 8. 3)、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2、200nM引物3、200nM弓|物4禾P 200nM探針3。 按如下配方配制混合酶(終濃度):0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0. lmg/ ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。
試劑盒組成為
組成成分(20人份





反應(yīng)緩沖液A 反應(yīng)緩沖液B 混合酶
RNA陽性對(duì)照品A RNA陽性對(duì)照品B DEPC水
盒) 380 ii 1 380 ii 1 60 ii 1 30 ii 1 30 ii 1 lml
體積
本發(fā)明提供的試劑盒未提供mRNA提取試劑，用戶可根據(jù)自身要求使用傳統(tǒng)的 酚_氯仿提取方法或購買商業(yè)化的RNA提取試劑盒。
檢測(cè)步驟
PCR反應(yīng)液的配制 A管按每人份反應(yīng)緩沖液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22ul/ 管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補(bǔ)充DEPC水，使反應(yīng)總體積為
30ul ; B管按每人份反應(yīng)緩沖液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22u1/ 管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補(bǔ)充DEPC水，使反應(yīng)總體積為
30ul ; RNA陽性對(duì)照品直接取8ul ， A管使用RNA陽性對(duì)照品A， B管使用RNA陽性對(duì)照品 B，按如下程序進(jìn)行一步法RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)5分鐘，然后95t:保溫5分 鐘，再按94°C 20秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集熒光)。
結(jié)果分析與監(jiān)控 根據(jù)儀器分析的結(jié)果，在如下情況視實(shí)驗(yàn)有效對(duì)照品A和對(duì)照品B的Ct值均< 32且大于26。
根據(jù)公式F = 2—"n計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。也有部分全自動(dòng)熒光PCR擴(kuò)增儀可直接讀取△ ACt值。SEQUENCE LISTING〈110〉上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司劍軍，何懿，夏〈120> —種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達(dá)量的RT-PCR技術(shù)<160>9〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>13ccac3g朋g tccctga肪g agct<210>2〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2ggtgagccgg gtgacaacga c〈210〉3〈211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈400>3tcggatctgtcaccacagga cca〈210>4〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4tggtcctgtg gtgacagatc cga〈210>5〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列
〈400>5tcaagatcat cagcaatgcc t21〈210>6<211〉21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6agtcttctgg gtggcagtga t21〈210>7〈211>25〈212>廳〈213〉人工序列〈400>7actgtggtca tgagtccttc cacga25<210〉8〈211>139〈212>RNA〈213〉人工序列<400〉83ccac3gaag ucccug朋3g 3gcugcaggagaugaugagagucimauima60gimc朋g朋3 acgcugcugg gag肌gguccUgUggUg3C3g肌CCg朋3gccccc朋ugu120Cg皿gUC3CC CggCUC3CC139〈210>9〈211>131〈212>RNA〈213>人工序列〈400>9uc朋g肌c;au cagc朋ugcc uccugcaccscc朋cugc皿agcaccccuggcc朋gguca60ucc肌g3csm c皿uggimuc gugg朋gg3cUC3Ug3CC3Cagucc肌gccSlUC3CUgCC3120cccag朋gac u131
9
權(quán)利要求
一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達(dá)量的RT-PCR技術(shù)，其特征在于包含用于檢測(cè)ARHGDIB基因mRNA的一對(duì)特異性引物和一條特異性探針以及用于檢測(cè)GAPDH基因mRNA的一對(duì)特異性引物和一條特異性探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度分別為139bp和131bp，引物和探針序列分別為檢測(cè)ARHGDIB基因mRNA的引物和探針引物15`-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3`(Seq No.1)引物25`-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3`(Seq No.2)探針15`-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3`(Seq No.3)或探針25`-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3`(Seq No.4)檢測(cè)GAPDH基因mRNA的引物和探針引物35`-TCAAGATCATCAGCAATGCCT-3`(Seq No.5)引物45`-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3`(Seq No.6)探針35`-ACTGTGGTCATGAGTCCTTCCACGA-3`(Seq No.7)或者上述引物序列的互補(bǔ)序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達(dá)量的RT-PCR技術(shù)，其特征在于標(biāo)記探針5—端的熒光發(fā)光基團(tuán)可為FAM、 TET、 J0E、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、Fluorescein、 Rhodamine、 Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine 6G、 OregonGreen488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange或R0X中任意一種；3—端熒光淬滅基團(tuán)可為DABCYL、 DABSYL、 Eclipse、TAMRA、 BHQ-1 、 BHQ_2、 BHQ-3或MGB基團(tuán)中的任意一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達(dá)量的RT-PCR技術(shù)，其特征在于使用一步法RT-PCR熒光檢測(cè)技術(shù)，對(duì)待測(cè)標(biāo)本和正常對(duì)照品中的ARHGDIB基因mRNA和GAPDH基因mRNA同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)ARHGDIB基因的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達(dá)量的RT-PCR技術(shù)，其特征在于，可形成試劑盒，使用2個(gè)人工合成的RNA序列作為RNA陽性對(duì)照品，序列為模板1bp)(Seq No. 8)模板2 :No. 9)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達(dá)量的RT-PCR技術(shù)形成的試劑盒，其特征在于，ARHGDIB基因mRNA檢測(cè)體系使用模板1作為陽性對(duì)照品，GAPDH基因mRNA檢測(cè)體系使用模板2作為陽性對(duì)照品。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達(dá)量的RT-PCR技術(shù)形成的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒組成為組成成分(20人份/盒) 體積反應(yīng)緩沖液A 380 ill反應(yīng)緩沖液B 380 ill混合酶 60 ii 1RNA陽性對(duì)照品A 30 illRNA陽性對(duì)照品B 30 illDEPC水 1ml其中，反應(yīng)緩沖液的組分(終濃度)包括50mM Tris-HCl (Ph 8. 3) 、50mM KCl、300uMdNTP、3mM MgCl2，而且ARHGDIB基因mRNA檢測(cè)體系(反應(yīng)緩沖液A)含200nM引物1、200nM弓|物2禾P 200nM探針1， GAPDH基因mRNA檢測(cè)體系(反應(yīng)緩沖液B)含200nM引物3、200nM引物4和200nM探針3，其中，兩條探針的5—端標(biāo)記的發(fā)光基團(tuán)均為FAM，在3—端標(biāo)記的淬滅基團(tuán)均為Eclipse?；旌厦傅慕M成成份(終濃度)包括0. 5U AMV酶、0. 5URNaselnhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0. 05U UNG酶。RNA陽性對(duì)照品A和RNA陽性對(duì)照品B分別為適當(dāng)濃度的模板1和模板2。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達(dá)量的RT-PCR技術(shù)形成的試劑盒，其特征在于，操作步驟如下PCR反應(yīng)液的配制A管按每人份反應(yīng)緩沖液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22ul/管分裝到O. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補(bǔ)充DEPC水，使反應(yīng)總體積為30ul ;B管按每人份反應(yīng)緩沖液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22ul/管分裝到O. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補(bǔ)充DEPC水，使反應(yīng)總體積為30ul ;RNA陽性對(duì)照品直接取8ul，A管使用RNA陽性對(duì)照品A，B管使用RNA陽性對(duì)照品B，按如下程序進(jìn)行一步法RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)5分鐘，然后95"C保溫5分鐘，再按94°C 20秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集FAM通道熒光)。結(jié)果分析，根據(jù)標(biāo)本的兩管檢測(cè)Ct值與正常對(duì)照品的兩管檢測(cè)Ct值的A ACt值，對(duì)ARHGDIB進(jìn)行相對(duì)定量分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表達(dá)量的RT-PCR技術(shù)。本發(fā)明分別根據(jù)人的ARHGDIB基因mRNA和GAPDH基因mRNA設(shè)計(jì)并篩選到最佳PCR檢測(cè)方案，能同時(shí)對(duì)標(biāo)本中的兩個(gè)基因的mRNA進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)兩個(gè)基因的mRNA檢測(cè)Ct值與正常對(duì)照兩個(gè)基因的mRNA檢測(cè)Ct值的ΔΔCt值，可分析ARHGDIB基因與看家基因-GAPDH基因之間的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)本發(fā)明提供相應(yīng)的一步RT-PCR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明還提供人工合成的兩種RNA，減少假陰性的發(fā)生率；本發(fā)明檢測(cè)速度快，能排除基因組DNA的干擾，特異性強(qiáng)，且靈敏度高，可用于ARHGDIB基因表達(dá)方面的研究和臨床。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101760522SQ20081020164
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者何劍軍, 夏懿 申請(qǐng)人:上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司;上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司