專利名稱：納米磁性粒子層析試紙檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測技術領域的方法，具體地說，涉及的是一種納米磁性粒 子層析試紙檢測方法。
背景技術：
近年來，納米粒子以其獨特的物理、化學性質引起廣泛的關注。特別是磁性 納米粒子，由于其特有的超順磁性和大大超越其它材料的比表面積，在醫(yī)學和生 物學領域有著極其廣泛的用途(Anal Bioanal Chem. 2006 384(3): 593 - 600)。 磁性納米粒子的超順磁性使得其可在人為施加的磁場下進行操控；功能化的磁性 納米粒子可與大量的生物學分子或其他功能化材料進行偶聯(lián)或修飾而用于細胞 分離、自動化核酸提取、基因靶向、藥物遞送、磁共振現(xiàn)象以及高熱治療。其中， 當與抗體進行偶聯(lián)時，磁性納米粒子可用于超靈敏免疫學實驗或是微量物質的恢 復。因而，磁性納米粒子成為生物和醫(yī)學研究領域不可或缺的材料之一。
免疫層析試驗是繼免疫滲濾實驗之后發(fā)展起來的另一種膜固相免疫測定，以 硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢 向另一端滲移，如層析一般。移動過程中被分析物與固定于膜上某一區(qū)域的受體 (抗原或抗體)結合而被捕獲，無關分析物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過標記 物的顯色來判定試驗結果。如今，免疫層析實驗與酶聯(lián)免疫吸附試驗已成為醫(yī)學 檢驗中最為普遍的兩種分析方法。與酶聯(lián)免疫吸附試驗相比，免疫層析實驗具有 簡單(只有一步操作)、靈活(可單人份或少量樣品檢測)和快速(15分鐘左右
即可得到結果)等優(yōu)點。
然而，由于免疫層析實驗固有的限制，存在如下幾個缺點-
1. 目前常見的基于膠體金或者膠體硒免疫層析實驗靈敏度較之酶聯(lián)免疫吸 附試驗要低。
2. 由于其體積和吸水材料的限制，免疫層析實驗的上樣量有限，因此在某 些樣本如唾液、尿液中耙分析物較少時會出現(xiàn)因檢測樣本量限制待檢分析物少而 檢出率較低的情況。3.制備工藝較為復雜。傳統(tǒng)的工藝包括檢測標記物的制備，樣品墊與檢測 標記物墊的預處理，檢測標記物噴墊干燥固化，抗原或抗體在硝酸纖維素膜上的 固化，樣品墊、檢測標記物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊的四層搭接粘貼，工序多 且繁復。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種納米磁性粒子層析試紙檢測 方法，使其結合了納米磁性粒子和免疫層析法兩者優(yōu)點，既能在大樣本中富集微 量待檢物又能進行快速檢測，提高了層析法的檢出率和特異性，且制備工藝簡單， 省時省力。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟 第一步，合成黑色磁性納米粒子；
第二步，對第一步所得到的黑色磁性納米粒子表面進行羥基、氨基、羧基或 巰基修飾后偶聯(lián)抗原或抗體并凍干保存?zhèn)溆茫?br> 第三步，在試紙的底襯上依次搭接粘貼檢測反應部分和吸水部分，制備層析 試紙條，檢測反應部分上面包被有與待檢項目相關的抗原或抗體作為檢測線，同 時包被有與偶聯(lián)于磁性納米粒子上的抗原或抗體相對應的特異性反應物如單克 隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、抗原等作為參考線；
第四步，利用第二步所制備的偶聯(lián)有抗原或抗體的黑色磁性納米粒子對待檢 樣本進行處理，再用第三步得到的試紙條檢測處理后的待檢樣本。
所述合成黑色磁性納米粒子可以采用共沉淀法或高溫分解法實現(xiàn)，為現(xiàn)有常 用方法。
所述對黑色磁性納米粒子表面進行羥基、氨基、羧基或巰基修飾后偶聯(lián)抗原 或抗體，具體為加入檸檬酸鈉對其表面進行羧基化修飾或者利用正硅酸乙酯水
解在納米磁性粒子表面包覆一層二氧化硅，然后加入硅垸偶聯(lián)劑分別對表面進行 氨基化、巰基化。
所述硅垸偶聯(lián)劑，如(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTS)、 N-[3-(三甲氧基 硅基)丙基]-l，2-乙二胺(AEAPS)、 3-巰丙基三乙氧基硅烷(MPS)等。
所述的黑色磁性納米粒子與抗原或抗體偶聯(lián)的方法，具體為將表面羥基、 氨基、羧基或巰基的磁性納米粒子通過化學反應與抗原或抗體共價結合在一起。 所述制備層析試紙條，具體為將檢測目的物相應的抗體或者抗原以百得(Bio-Dot)點樣儀噴到硝酸纖維素膜上形成線性檢測帶，同時也將與偶聯(lián)于磁 性納米粒子上的抗原或抗體相對應的特異性反應物如單克隆抗體、多克隆抗體、 單鏈抗體、抗原等噴到硝酸纖維素膜的吸水部分端作為參考帶，以中性蛋白封閉、 干燥。然后在固相底襯上相互疊加粘貼固化有檢測帶和參考帶的硝酸纖維素膜和 玻璃纖維紙或濾紙或吸水紙。
所述第四步，具體為將待檢樣本如血清、血漿、唾液、尿液等用兩倍濃縮 的pH 7. 0 7. 4的緩沖液如磷酸鹽緩沖液等按1:1比例稀釋后重懸凍干的納米磁 性粒子，或用兩倍濃縮的pH 7. 0 7. 4的緩沖液如磷酸鹽緩沖液等先重懸納米磁 性粒子，再與待檢樣本按照l: 1的比例混合，37度反應15 20分鐘后用磁鐵 將納米磁性粒子富集于反應管的一處，棄去反應液，以含0. 05% Tween 20的PBS 緩沖液洗滌納米磁性粒子一次，再用lml pH 7. 0 7. 4的PBS緩沖液重懸納米磁 性粒子，層析試紙條的檢測線端插入此重懸液中，液面不超過MAX線，在毛細作 用下，重懸液從檢測線段向吸水紙端不斷滲移，如重懸液中含有被納米磁性粒子 捕獲的特異性抗原或者抗體，在此滲移過程中將被固定在硝酸纖維素膜上的相應 抗原或者抗體捕獲，形成肉眼可分辨的黑色檢測帶，而不管重懸液中是否有與檢 測線上所固化的抗原或抗體相匹配的抗體或抗原，偶聯(lián)有抗原或抗體的納米磁性 粒子都將被固化于參考線上的針對偶聯(lián)于納米磁性粒子上的抗原或抗體的對應 物所捕獲形成肉眼可見的黑色參考帶。
本發(fā)明優(yōu)點在于(1)能夠富集大樣本中的微量待檢物，不受起始樣本量的 限制；(2)操作容易；(3)檢測時間遠少于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗；(4)檢出 率及特異性遠優(yōu)于傳統(tǒng)的免疫層析實驗；(5)采用磁性納米粒子對樣本進行處理 后既可富集樣本中的靶分子又可大大減少因樣本粘滯度以及樣本中的其它干擾 因素對層析反應帶來的影響；(6)本發(fā)明所用的層析試紙條制備工藝較之傳統(tǒng)的 免疫層析試紙條更為簡單，無需樣品墊和檢測標記物墊，成本更低，裝配更簡便， 因此能夠大大促進臨床應用，特別是大樣本微量待檢物條件下如唾液、尿液等的 檢測分析。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下 進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限 于下述的實施例。實施例1
乙肝表面抗體檢測
a) 稱取2. 51 g(O. 0093 mol)FeCl3*6H20和1.25 g(0.0045 mol)FeS04*7H20 溶于600 ml去離子水中，在室溫氮氣保護下，向上述溶液中逐點加入24 ml濃 度為1.5mol/l的氨水得到黑色沉淀。借助磁分離用去離子水洗滌5次，將納米 磁性粒子分散在12 ml的0.3 M的擰檬酸鈉溶液中反應30分鐘。
或者采用高溫分解法，稱取0. 706 g (0. 002 mol)乙酰丙酮合鐵(Fe (acac) 3) 溶解在10 ral 二節(jié)醚和10 ml油胺110度脫水1小時，快速加熱到300度反應2 小時，冷卻后加入50 ml乙醇，加入0. 015 mol的檸檬酸鈉溶液中反應30分鐘。
b) 取1 ml的濃度為0. 25rnM的納米磁性粒子加入2. 5 ml磷酸鹽緩沖溶液(pH 6. 0)，再加入125 mg的l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和 125 mg的N-羥基丁二酰亞胺(NHS)反應30分鐘，最后加入300 u g的葡萄球 菌A蛋白(SPA)。
c) 先將硝酸纖維素膜用戊二醛溶液處理30分鐘后37度烘干；再將以pH7. 6 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液將基因工程乙肝表面抗原稀釋為lmg/ml以百得
(Bio-Dot)點樣儀噴到0. 7cm寬7cm長的硝酸纖維素膜MAX線端距末端上2cm 處形成線性檢測帶，同時也將O. lmg/ml抗葡萄球菌A蛋白(SPA)單克隆抗體噴 到硝酸纖維素膜的吸水部分端距檢測帶6mm處作為參考帶，以中性蛋白封閉、37 度干燥。然后在固相底襯上相互疊加粘貼硝酸纖維素膜和玻璃纖維紙或濾紙或吸 水紙，最后在距硝酸纖維素膜MAX線端的末端lcm處用塑料紙標記出MAX線，為 插入樣本溶液中液面不可超過的指示線。
d) 將待檢樣本如血清、血漿、唾液等用兩倍濃縮的pH7.0 7.4的緩沖液如 磷酸鹽緩沖液等按l: 1比例稀釋后重懸凍干的納米磁性粒子，或用兩倍濃縮的 pH 7. 0 7. 4的緩沖液如磷酸鹽緩沖液等先重懸納米磁性粒子，再與待檢樣本按 1: 1比例混合，37度反應20 30分鐘后用磁鐵將納米磁性粒子富集于反應管的 一處，棄去反應液，以含0.05WTween20的PBS緩沖液洗滌納米磁性粒子一次， 再用lml pH 7. 0 7. 4的PBS緩沖液重懸納米磁性粒子，層析試紙條的檢測線端 插入此重懸液中，液面不超過MAX線，在毛細作用下，重懸液從檢測線段向吸水 紙端不斷滲移，如重懸液中含有被納米磁性粒子捕獲的乙肝表面抗體，在此滲移 過程中將被固定在硝酸纖維素膜上的乙肝表面抗原捕獲，形成肉眼可分辨的陽性黑色檢測帶；而不管重懸液中是否有乙肝表面抗體，偶聯(lián)有葡萄球菌A蛋白的納 米磁性粒子都將被固化于參考線上的抗葡萄球菌A蛋白單克隆抗體所捕獲形成 肉眼可見的黑色參考帶；如試紙條失效則在參考帶不會出現(xiàn)黑色條帶。
實施例2
乙肝表面抗原檢測
a) 稱取2. 51 g(O. 0093 mol)FeCl3'6H20禾口 1.25 g(0.0045 mol)FeSCWH20 溶于600 ml去離子水中，在室溫氮氣保護下，向上述溶液中逐點加入24 ml濃 度為1.5mol/l的氨水得到黑色沉淀，借助磁分離用去離子水洗滌5次，得到納 米磁性粒子。
或者采用高溫分解法，稱取0. 706 g(0.002 mol)乙酰丙酮合鐵(Fe (acac) 3) 溶解在10 ml 二芐醚和10 ml油胺110度脫水1小時，快速加熱到300度反應2 小時，冷卻后加入50 ml乙醇。
取上述兩種方法的納米磁性粒子74 mg分散在149 ml乙醇和1 ml水中超 聲分散30分鐘，加入35 W的APTS快速攪拌反應7 h，磁分離洗滌得到表面氨 基化的納米磁性粒子。
b) 取1 ml的濃度為0. 25mM的上述納米磁性粒子加入2. 5 ml磷酸鹽緩沖溶 液(pH6.0)，再加入適量戊二醛，最后加入300 yg的抗乙肝表面抗原單克隆抗 體。
c) 先將硝酸纖維素膜用戊二醛溶液處理30分鐘后37度烘干;再將以pH7. 6 0. Olmol/L的磷酸鹽緩沖液將抗乙肝表面抗原另一表位的單克隆抗體稀釋為 2mg/ml以百得(Bio-Dot)點樣儀噴到0. 7cm寬7cm長的硝酸纖維素膜MAX線端 距末端上2cm處形成線性檢測帶，同時也將0. lrag/ml葡萄球菌A蛋白(SPA)噴 到硝酸纖維素膜的吸水部分端距檢測帶6腿處作為參考帶，以中性蛋白封閉、37 度干燥。然后在固相底襯上相互疊加粘貼硝酸纖維素膜和玻璃纖維紙或濾紙或吸 水紙。最后在距硝酸纖維素膜MAX線端的末端1cm處用塑料紙標記出MAX線，為 插入樣本溶液中液面不可超過的指示線。
d) 將待檢樣本如血清、血漿、唾液等用兩倍濃縮的pH 7. 0 7. 4的緩沖液如 磷酸鹽緩沖液等按l: 1比例稀釋后重懸凍干的納米磁性粒子，或用兩倍濃縮的 pH 7.0 7.4的磷酸鹽緩沖液先重懸納米磁性粒子，再與待檢樣本按1: 1比例混合，37度反應15 20分鐘后用磁鐵將納米磁性粒子富集于反應管的一處，棄 去反應液，以含0. 05% Tween 20的PBS緩沖液洗滌納米磁性粒子一次，再用lml pH 7. 0 7. 4的PBS緩沖液重懸納米磁性粒子，層析試紙條的檢測線端插入此重 懸液中，液面不超過MAX線，在毛細作用下，重懸液從檢測線段向吸水紙端不斷 滲移，如重懸液中含有被納米磁性粒子捕獲的乙肝表面抗原，在此滲移過程中將 被固定在硝酸纖維素膜上的抗乙肝表面抗原另一表位的單克隆抗體捕獲，形成肉 眼可分辨的陽性黑色檢測帶；而不管重懸液中是否有乙肝表面抗原，偶聯(lián)有抗乙 肝表面抗原單克隆抗體的納米磁性粒子都將被固化于參考線上的抗葡萄球菌A 蛋白單克隆抗體所捕獲形成肉眼可見的黑色參考帶；如試紙條失效則在參考帶不 會出現(xiàn)黑色條帶。
權利要求
1. 一種納米磁性粒子層析試紙檢測方法，其特征在于包括如下步驟第一步，合成黑色磁性納米粒子；第二步，對第一步所得到的黑色磁性納米粒子表面進行羥基、氨基、羧基或巰基修飾后偶聯(lián)抗原或抗體并凍干保存?zhèn)溆?；第三步，在試紙的底襯上依次搭接粘貼檢測反應部分和吸水部分，制備層析試紙條，檢測反應部分上面包被有與待檢項目相關的抗原或抗體作為檢測線，同時包被有與偶聯(lián)于磁性納米粒子上的抗原或抗體相對應的特異性反應物作為參考線；第四步，利用第二步所制備的偶聯(lián)有抗原或抗體的黑色磁性納米粒子對待檢樣本進行處理，再用第三步得到的試紙條檢測處理后的待檢樣本。
2. 根據(jù)權利要求1所述的納米磁性粒子層析試紙檢測方法，其特征是，所 述合成黑色磁性納米粒子采用共沉淀法或高溫分解法實現(xiàn)。
3. 根據(jù)權利要求1所述的納米磁性粒子層析試紙檢測方法，其特征是，所 述對黑色磁性納米粒子表面進行羥基、氨基、羧基或巰基修飾后偶聯(lián)抗原或抗體， 具體為加入檸檬酸鈉對其表面進行羧基化修飾或者利用正硅酸乙酯水解在納米 磁性粒子表面包覆一層二氧化硅，然后加入硅烷偶聯(lián)劑分別對表面進行氨基化、 巰基化。
4. 根據(jù)權利要求3所述的納米磁性粒子層析試紙檢測方法，其特征是，所 述硅烷偶聯(lián)劑為(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-l,2-乙 二胺、3-巰丙基三乙氧基硅烷中一種。
5. 根據(jù)權利要求1所述的納米磁性粒子層析試紙檢測方法，其特征是，所 述的黑色磁性納米粒子與抗原或抗體偶聯(lián)的方法是將表面羥基、氨基、羧基或巰 基的磁性納米粒子通過化學反應與抗原或抗體共價結合在一起。
6. 根據(jù)權利要求1所述的納米磁性粒子層析試紙檢測方法，其特征是，所 述制備層析試紙條，具體為將檢測目的物相應的抗體或者抗原噴到硝酸纖維素 膜上形成線性檢測帶，同時也將與偶聯(lián)于磁性納米粒子上的抗原或抗體相對應的 特異性反應物噴到硝酸纖維素膜的吸水部分端作為參考帶，以中性蛋白封閉、干燥，然后在固相底襯上相互疊加粘貼固化有檢測帶和參考帶的硝酸纖維素膜和玻 璃纖維紙或濾紙或吸水紙。
7. 根據(jù)權利要求1所述的納米磁性粒子層析試紙檢測方法，其特征是，所 述第四步，具體為將待檢樣本用兩倍濃縮的pH7.0 7.4的緩沖液按l:l比例 稀釋后重懸凍干的納米磁性粒子，或用兩倍濃縮的pH 7. 0 7. 4的緩沖液先重懸 納米磁性粒子，再與待檢樣本按照l: 1的比例混合，37度反應15 20分鐘后 用磁鐵將納米磁性粒子富集于反應管的一處，棄去反應液，以含0.05。/。Tween20 的PBS緩沖液洗滌納米磁性粒子一次，再用lml pH 7. 0 7. 4的PBS緩沖液重懸 納米磁性粒子，層析試紙條的檢測線端插入此重懸液中，液面不超過MAX線，如 重懸液中含有被納米磁性粒子捕獲的特異性抗原或者抗體，在此滲移過程中將被 固定在硝酸纖維素膜上的相應抗原或者抗體捕獲，形成肉眼可分辨的黑色檢測 帶，而不管重懸液中是否有與檢測線上所固化的抗原或抗體相匹配的抗體或抗 原，偶聯(lián)有抗原或抗體的納米磁性粒子都將被固化于參考線上的針對偶聯(lián)于納米 磁性粒子上的抗原或抗體的對應物所捕獲形成肉眼可見的黑色參考帶。
8. 根據(jù)權利要求7所述的納米磁性粒子層析試紙檢測方法，其特征是，所 述緩沖液為PH 7. 0 7. 4的磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測技術領域的納米磁性粒子層析試紙檢測方法，先合成納米的黑色磁性納米粒子，對其表面進行羥基、氨基、羧基或巰基修飾后偶聯(lián)抗原或抗體并凍干保存?zhèn)溆茫缓笸ㄟ^在試紙的底襯上依次搭接粘貼有檢測反應部分和吸水部分制備層析試紙條。檢測反應部分上包被有抗體或抗原的檢測區(qū)，同時包被有抗相應抗體或抗原作為參考線，利用納米磁性粒子的顏色來檢測相關抗原或抗體的存在。該檢測法特異性強，檢出率高，能夠更好地滿足于快速無創(chuàng)體外診斷及針對含有微量檢測物的大樣本的檢測要求。本發(fā)明簡單新穎，操作方便、快速、簡便，便于推廣。
文檔編號G01N33/577GK101441210SQ200810207770
公開日2009年5月27日 申請日期2008年12月25日 優(yōu)先權日2008年12月25日
發(fā)明者崔大祥, 浩 楊, 涂津銘, 鵬 黃 申請人:上海交通大學