專利名稱：：水分散性二氧化硅納米顆粒在連接生物分子方面的用途的制作方法水分散性二氧化硅納米顆粒在連接生物分子方面的用途相關專利申請的交叉引用本申請要求提交于2007年4月19日的美國臨時專利申請No.60/912,711的優(yōu)先權(quán)，該申請的全文以引用的方式并入本文。
背景技術(shù)：
：諸如活組織中的感染或癌前病變之類的臨床病癥的早期靈敏檢測對疾病的診斷和治療有著顯著的有益效果。影響臨床病癥檢測的因素包括用于捕獲、濃縮和/或純化與臨床病癥相關的生物分子的材料和方法。影響檢測和診斷的其它因素包括用于檢測極小量(例如皮克量級)所關注的生物分子的手段。用于檢測臨床病癥的現(xiàn)有技術(shù)通常耗時并且涉及相當多的操作來獲得合適的樣品。這些技術(shù)還受到生物樣品內(nèi)能使測試結(jié)果無效的許多干擾物質(zhì)的影響。因此，需要提供用以從這類抑制物質(zhì)中捕獲和純化生物分子的材料和方法。用于檢測臨床病癥的現(xiàn)有技術(shù)的靈敏性和特異性受到非特異性物質(zhì)的捕獲的影響，非特異性物質(zhì)的捕獲通常會妨礙對小量生物分子的檢測。因此，當濃縮和檢測所關注的生物分子的存在時，需要用來減少非特異性物質(zhì)的捕獲的材料和方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及官能化二氧化硅納米顆粒的用途。這種納米顆粒是水分散性的，這使得它們能(例如)用于水性生物樣品。本發(fā)明涉及具有官能化表面的固體載體材料的用途，用于連接生物分子，優(yōu)選用于捕獲耙生物分析物。在一個實施例中，本發(fā)明提供了捕獲靶生物分析物的方法。該方法涉及提供水分散性納米顆粒，每個納米顆粒包括具有通過不可逆共價鍵連接至表面的官能團的二氧化硅表面，其中官能團包括用于連接生物分子的生物分子結(jié)合基團；數(shù)量足以為納米顆粒提供水分散性的水分散性基團；和不同于水分散性基團的屏蔽基團，其中結(jié)合的屏蔽基團不包括酰胺基團和/或脲基團；在有效使生物分子共價結(jié)合(優(yōu)選通過不可逆共價鍵結(jié)合)至一個或多個生物分子結(jié)合基團的條件下，使水分散性納米顆粒與生物分子接觸，其中生物分子是耙分析物的捕獲劑；以及使其上共價結(jié)合有生物分子捕獲劑的水分散性納米顆粒與懷疑含有靶分析物的樣品接觸；前提條件是，生物分子結(jié)合基團不包括碳原子少于6個的脂族胺和/或馬來酰亞胺基團，當水分散性基團和/或屏蔽基團包括含聚(環(huán)氧烷)的基團時，其能夠共價結(jié)合至生物分子。對于某些實施例而言，生物分子捕獲劑是抗體，其中二氧化硅納米顆粒包含多種不同特異性的抗體。對于某些實施例而言，靶生物分析物是微生物，例如細菌(如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))。二氧化硅納米顆粒包含通過不可逆共價鍵結(jié)合至表面的水分散性基團。水分散性基團有助于納米顆粒在水性生物環(huán)境中分散。優(yōu)選的是，水分散性基團包括羧酸基團、磺酸基團、膦酸基團、它們的鹽或它們的組合。二氧化硅納米顆粒還包含通過不可逆共價鍵結(jié)合至表面的屏蔽基團。對于某些實施例而言，屏蔽基團包括含聚(環(huán)氧垸)的基團，優(yōu)選含聚(環(huán)氧乙垸)的基團。對于某些實施例而言，屏蔽基團包括含聚(環(huán)氧烷)的基團、含乙二醇醚的基團、含聚(環(huán)氧乙烷)醚的基團、含乙二醇乳酸酯的基團，含糖的基團、含多元醇的基團、含冠醚的基團、含低聚縮水甘油基的基團、含羥基丙烯酰胺的基團、含有機磺酸根的基9團、含有機羧酸根的基團或它們的組合。雖然屏蔽基團與水分散性基團可以是相同或相似的化學類別，但它們是不同的基團，因為納米顆粒包含這兩種類型的基團。生物分子結(jié)合基團可以包括許多種基團，包括選自以下基團的官能團胺、肼、羥基、砜、醛、醇、環(huán)氧烷、鹵素、N-氧琥珀酰亞胺、丙烯酸酯、丙烯酰胺、具有吸電子基團的aJ-烯屬或炔屬不飽和基團、羧酸根、酯、酐、碳酸根、草酸根、氮丙啶、環(huán)氧基團、N-取代的馬來酰亞胺、二氫唑酮以及它們的組合。對于某些實施例而言，生物分子結(jié)合基團包括選自以下基團的官能團乙烯砜、環(huán)氧基團、丙烯酸酯、胺以及它們的組合。對于某些實施例而言，生物分子結(jié)合基團包括a,0-烯屬不飽和基團和吸電子基團，其可以包括羰基、酮基、酯基、酰胺基、-S02-、-SO-、-CO-CO-、-CO-COOR、磺酰胺基、鹵素、三氟甲基、磺酰胺基、鹵素、馬來酰亞胺基、馬來酸基、或它們的組合。在某些實施例中，生物分子結(jié)合基團是丙烯酸酯或a,e不飽和酮。對于某些實施例而言，生物分子結(jié)合基團可以包括芳族(即芳基)非叔胺基和/或芳基肼基團，使得當它們具有共價結(jié)合至其上的醛官能化生物分子時，化學式為-Ar-NK:(H)-生物分子或-Ar-NH-N-C(H)-生物分子，其中Ar是芳基。對于某些實施例而言，其上共價結(jié)合有生物分子的生物分子結(jié)合基團包括通過胺官能基團共價結(jié)合至納米顆粒表面的含生物素的基團。對于某些實施例而言，固體載體材料還包含連接至表面的報告基團(優(yōu)選通過共價鍵連接，更優(yōu)選通過不可逆共價鍵連接)。對于某在一個實施例中，本發(fā)明提供了將生物分子連接至納米顆粒的方法。該方法涉及提供各自具有表面的二氧化硅納米顆粒；提供具有水分散性基團和表面結(jié)合基團的水分散性化合物；提供具有生物分子結(jié)合基團和表面結(jié)合基團的生物分子結(jié)合化合物；提供具有屏蔽基團和表面結(jié)合基團的屏蔽化合物，其中屏蔽化合物不同于水分散性化合物；通過表面結(jié)合基團與表面之間的不可逆共價鍵將多個生物分子結(jié)合基團、水分散性基團和屏蔽基團共價結(jié)合至多個二氧化硅納米顆粒表面；其中結(jié)合的屏蔽基團不包括酰胺基團和/或脲基團；以及在有效使生物分子共價結(jié)合(優(yōu)選通過不可逆共價鍵結(jié)合)至一個或多個生物分子結(jié)合基團的條件下，使水分散性納米顆粒與生物分子接觸；前提條件是，生物分子結(jié)合基團不包括碳原子少于6個的脂族胺和/或馬來酰亞胺基團，當水分散性基團和/或屏蔽基團包括含聚(環(huán)氧烷)的基團時，其能夠與生物分子共價結(jié)合。該方法可以還包括提供包含報告基團(如熒光基團)和表面結(jié)合基團的報告分子；以及將多個報告基團通過表面結(jié)合基團(優(yōu)選通過不可逆共價鍵)共價結(jié)合至多個二氧化硅納米顆粒表面。對于某些實施例而言，在報告分子結(jié)合至固體載體材料表面之前將屏蔽化合物共價結(jié)合至固體載體材料表面。定義"生物分子結(jié)合基團"是與生物分子反應從而形成共價鍵的官能團。本發(fā)明上下文中的"不可逆共價鍵"或"不可逆共價結(jié)合"表示在生理條件下不可逆的共價鍵。這不包括在生理條件下處于平衡的鍵(例如金-硫鍵)，該在生理條件下處于平衡的鍵將允許連接的基團從一個顆粒遷移至另一個顆粒。而且，任何含-SH或-S-S-的外來物質(zhì)都能通過金-硫鍵置換金顆粒上的取代基。因此，表面組成模式可能會被中斷。"納米顆粒"在本文中定義為納米尺寸的顆粒，優(yōu)選具有不大于200納米(nm)的平均粒度。如本文所用，"粒度"和"粒徑"具有相同的含義，并且用來指顆粒(或其團聚物)的最大尺寸。在本文中，"團聚"指顆粒之間的弱締合，它們可以因電荷或極性而保持在一起并且可以分解成更小的單位。"水分散性納米顆粒"是其上共價結(jié)合有足以為納米顆粒提供水分散性的量的水分散性基團的納米顆粒。在本文中，"水分散性"表示顆粒的形式為單個的顆粒而非團聚物。"水分散性基團"是能夠提供親水表面從而減少(優(yōu)選防止)納米顆粒在水性生物環(huán)境中的過度團聚和沉淀的單價基團。某些水分散性基團也可以起屏蔽基團的作用(如含聚(環(huán)氧乙垸)的基團)。"屏蔽基團"是能夠減少(優(yōu)選防止)除所關注的生物分子以外的生物分子的非特異性結(jié)合的單價基團。出現(xiàn)在說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語"包含"及其變型不具有限制性含義。單詞"優(yōu)選的"和"優(yōu)選地"指在某些情況下可提供某些有益效果的本發(fā)明實施例。然而，在相同或另外的情況下，其它實施例也可以是優(yōu)選的。此外，詳述一個或多個優(yōu)選的實施例并不意味著其它的實施例是不適用的，不意味著將其它的實施例排除在本發(fā)明的范圍之外。如本文中所用，"一"、"一個"、"所述(該)"、"至少一種(個)"以及"一種或多種(一個或多個)"可互換使用。因此，例如，包含"一種"生物分子結(jié)合基團的納米顆?？梢员唤忉尀楸硎驹摷{米顆粒包含"一種或多種"生物分子結(jié)合基團。類似地，捕獲"一種"靶分析物的方法可以被解釋為表示該方法可以涉及捕獲"一種或多種"靶分析物。術(shù)語"和/或"表示所列元素中的一者或全部或任意兩個或多個所列元素的組合(例如，預防和/或治療痛苦表示預防、治療痛苦，或者既治療又預防進一步的痛苦)。如本文所用，術(shù)語"或"通常采用其包括"和/或"在內(nèi)的意思，除非文中明確地指出不是這樣。另外，在本文中，由端點表述的數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)所包含的所有數(shù)值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。本發(fā)明的上述
發(fā)明內(nèi)容不旨在描述本發(fā)明的每個公開的實施例或每一種實施方式。以下描述更具體地舉例說明了示例性實施例。在整個專利申請的若干處，通過列舉的實例提供指導，可以采用這些實例的不同組合。在每一種情況下，所列舉的實例均僅用作一個代表性群組，而不應該被解釋為排他的列舉。具體實施例方式本發(fā)明涉及官能化二氧化硅納米顆粒。這種顆粒是水分散性的，這(例如)使得它們能用于水性生物樣品。本發(fā)明的水分散性官能化納米顆粒可用于設計和制造需要水分散性顆粒作為連接和固定生物分子的接合劑的裝置。另外，本發(fā)明的官能化納米顆粒可用于納米級電子裝置、多功能催化劑、化學傳感器和許多生物學應用，例如生物傳感器、生物測定等等。本發(fā)明的納米顆粒包含通過不可逆共價鍵共價結(jié)合至表面的生物分子結(jié)合基團。這種生物分子結(jié)合基團可優(yōu)選用于使所關注的生物分子(如耙生物分析物)選擇性地連接至表面。可以通過本文其他地方所描述的多種技術(shù)實現(xiàn)選擇性的連接。例如，某些實施例涉及使諸如特異性抗體或蛋白質(zhì)之類的生物分子捕獲劑共價結(jié)合至二氧化硅納米顆粒，這種二氧化硅納米顆粒可用于靶生物分析物(例如細菌)的特異性生物識別。水分散性由水分散性基團與納米顆粒的二氧化硅表面的共價結(jié)合產(chǎn)生。納米顆粒還包含共價結(jié)合至二氧化硅表面的屏蔽基團。屏蔽基團用于減少(優(yōu)選防止)除所關注的生物分子(如生物分子捕獲劑和/或靶生物分析物)以外的生物分子的非特異性結(jié)合。通過減少或防止非特異性結(jié)合，屏蔽基團有助于提高(例如)在生物識別中使用納米顆粒的檢測的靈敏性、準確性和可重復性。這種水分散性基團和屏蔽基團是通過不可逆共價鍵共價結(jié)合至二氧化硅表面。一般來講，可取的是使二氧化硅納米顆粒具有高覆蓋率的反應性硅垸醇，以降低團聚和非特異性結(jié)合的傾向。通?？扇〉氖?，使大部分硅烷醇位點與水分散性基團和/或屏蔽基團和/或生物分子結(jié)合基團反應。因為本發(fā)明的合適的納米顆粒通常具有非常大數(shù)目的可用硅垸醇位點(例如，5nm的顆粒可具有270個可用硅烷醇基團，20nm的顆粒具有3200個可用硅垸醇基團，90nm的顆粒具有50,000個可用硅垸醇基團)，即使屏蔽基團和/或水分散性基團具有高覆蓋百分比也不會妨礙可用的大量生物分子結(jié)合基團的連接。納米顆粒上的反應基團是能夠與結(jié)合至表面的化合物(化學式為A-L-B的生物分子結(jié)合化合物、化學式為A-L-Sh的屏蔽化合物、化學式為A-L-WD的親水化合物(如水分散性化合物)和化學式為A-L-Rp的報告化合物，如下文討論)中的表面結(jié)合基團A(見下文)反應的互補基團?？梢圆捎帽砻娣磻鶊F(即納米顆粒表面上的反應基團)與表面結(jié)合基團A的任何合適組合，只要表面反應基團不會與(生物分子結(jié)合化合物的)生物分子結(jié)合基團B反應即可，生物分子結(jié)合基團B是能夠與生物分子相互作用(通常通過共價鍵相互作用)的基團。在上面的化學式中，L表示有機連接基或化學鍵。有機連接基L可以是直鏈或支鏈的亞垸基、亞芳基或亞垸基與亞芳基的組合，可任選地包含雜原子(包括S、O、N、P或其混合物)。L基團的例子包括含環(huán)氧乙烷的低聚物或聚合物基團、含乙撐亞胺的低聚物或聚合物基團，以及含環(huán)硫乙烷的低聚物或聚合物基團。雖然L基團可以包括(例如)二價的含環(huán)氧乙垸的低聚物或聚合物基團，該基團也可以為固體載體材料提供屏蔽和/或親水特性，但本文中提到的屏蔽基團和親水基團是單獨的并且截然不同的單價基團。這意味著，屏蔽基團和親水基團是端基，而不是另一基團(特別是生物分子結(jié)合基團)的二價連接基。因此，如果通過二價的含環(huán)氧乙垸的低聚物使生物分子結(jié)合基團B連接至表面上，則本發(fā)明的納米顆粒優(yōu)選包含單獨的并且截然不同的屏蔽基團，該屏蔽基團可以包括單價的含環(huán)氧乙垸的低聚物(即，沒有活性端基的基團)。含二氧化硅的納米顆粒根據(jù)本發(fā)明進行表面改性的納米顆粒包括納米尺寸的二氧化硅。術(shù)語"納米尺寸"優(yōu)選指表征為平均粒度(或?qū)τ谇蛐晤w粒而言為平均粒徑)不大于200nm(在表面改性之前)的顆粒。更優(yōu)選的是，平均粒度不大于150納米(在表面改性之前)，甚至更優(yōu)選不大于120nm(在表面改性之前)，并且甚至更優(yōu)選不大于100nm(在表面改性之前)。優(yōu)選的是，在表面改性之前，二氧化硅納米顆粒的平均粒度為至少5nm，更優(yōu)選為至少10nm?？梢圆捎猛干潆娮语@微鏡測量納米顆粒的平均粒度。在本發(fā)明的實踐中，可以采用任何合適的技術(shù)確定粒度。優(yōu)選的是，粒度指數(shù)均粒徑并且用采用透射電子顯微鏡或掃描電子顯微鏡的儀器測量。測量粒度的另一種方法是測量重均粒度的動態(tài)光散射法。發(fā)現(xiàn)適用的這類儀器的一個例子是可得自加利福尼亞州富勒頓的貝克曼庫爾特公司(BeckmanCoulterInc.,Fullerton,CA)的N4PLUSSUB-MICRONPARTICLEANALYZER(N4PLUS亞微米顆粒分析儀)。另外優(yōu)選的是，納米顆粒的尺寸相對均勻。尺寸均勻的納米顆粒通?？商峁┲貜托愿玫慕Y(jié)果。優(yōu)選的是，納米顆粒的尺寸偏差小于平均粒度的25%。在本文中，二氧化硅納米顆粒是水分散性的，以減少(優(yōu)選防止)顆粒在水性環(huán)境中的過度團聚和沉淀。納米顆粒聚集可導致不期望的沉淀、膠凝作用或粘度的顯著增加。然而，當納米顆粒在水性緩沖液中時少量的團聚是容許的，只要團聚體(即團聚顆粒)的平均尺寸不大于200nm即可。因此，納米顆粒在本文中優(yōu)選指膠態(tài)納米顆粒，因為它們可以是單獨的顆?；蛩鼈兊男F聚物。納米顆粒的表面積優(yōu)選為至少10m々克，更優(yōu)選為至少20m克，甚至更優(yōu)選為至少25m"克。納米顆粒優(yōu)選具有大于600mV克的表面積。本發(fā)明的納米顆?？梢允嵌嗫椎幕驘o孔的。它們可以基本上只包括二氧化硅，或者它們可以是復合納米顆粒，例如芯殼納米顆粒。芯殼納米顆?？梢园ㄒ环N類型的氧化物(如氧化鐵)芯或金屬(如金或銀)芯和沉積在該芯上的二氧化硅殼。二氧化硅是最優(yōu)選的納米顆粒，特別是衍生自硅酸鹽(例如堿金屬硅酸鹽或硅酸銨)的二氧化硅納米顆粒。可以以溶膠而非粉末的形式提供未改性的納米顆粒。優(yōu)選的溶膠通常含有分散于流體介質(zhì)中的15重量％至50重量％的膠態(tài)二氧化硅顆粒。用于膠態(tài)顆粒的合適流體介質(zhì)的代表性實例包括水、水性醇溶液、低級肪族醇、乙二醇、N，N-二甲基乙酰胺、甲酰胺或它們的組合。優(yōu)選的流體介質(zhì)是水性的，例如水和可任選的一種或多種醇。當膠態(tài)顆粒分散于水性流體中時，由于每個顆粒表面上產(chǎn)生了相同的電荷而可以使顆粒穩(wěn)定。相同的電荷往往會促進分散而不是團聚或聚集，因為帶同種電荷的顆粒相互排斥。水性介質(zhì)中的無機二氧化硅溶膠是本領域中所熟知的，并且可以商購獲得。水或水-醇溶液中的二氧化硅溶膠可以諸如LUDOX(由特拉華州威爾明頓市(Wilmington，DE)的杜邦公司(E丄duPontdeNemoursandCo.,Inc.)制造)、NYACOL(可得自Nyacol公司(Ashland，MA))或NALCO(由NalcoChemicalCo.(OakBrook,IL)制造)之類的商品名商購獲得。一種可用的二氧化硅溶膠為NALCO2327，其可作為平均粒度為20納米、pH值為9.5并且固體含量為40重量％的二氧化硅溶膠獲得。另外的合適的膠態(tài)二氧化硅的實例在美國專利No.5,126,394中有描述。為了平衡膠體的表面電荷，本發(fā)明中使用的溶膠通常包含抗衡陽離子。根據(jù)pH值及所用膠體類型，膠體上的表面電荷可以是負電荷或正電荷。因此，陽離子或陰離子都可用作抗衡離子。適合用作帶負電荷的膠體的抗衡離子的陽離子的實例包括Na+、K+、Li+、諸如NR/之類的季銨陽離子(其中每個R可以為任意的單價部分，但優(yōu)選為H或諸如CH3-之類的低級烷基)、這些離子的組合等等。可用多種方法對納米顆粒表面進行改性，包括(例如)向納米顆粒添加表面改性劑(如為粉末或膠態(tài)分散體形式)并使表面改性劑與納米顆粒反應。其它可用的表面改性方法在(例如)U.S.2,801,185(Iler)、U.S.5，648，407(Goetz等人)和U.S.4,522,958(Das等人)中有描述。垸氧基硅垸、硅烷醇和氯硅烷特別適用于對含二氧化硅的表面進行改性。這些垸氧基硅烷、硅烷醇和氯硅垸可以是單官能的、雙官能的或三官能的。生物分子結(jié)合基團生物分子結(jié)合基團的功能是將一種或多種生物分子連接(優(yōu)選共價結(jié)合)至二氧化硅納米顆粒。優(yōu)選的是，生物分子結(jié)合基團對特定的生物分子具有特異性親和力，但是包含具有用于多種不同生物分子的多個結(jié)合位點的生物分子結(jié)合基團是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在任一顆粒上包含用于多種不同生物分子的多個生物分子結(jié)合基團也在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢酝ㄟ^多種方法中的任意一種將生物分子(特別是抗體)共價結(jié)合至二氧化硅納米顆粒。例如，可以將戊二醛、醛-席夫堿、N-羥基琥珀酰亞胺、二氫唑酮、溴化氰、馬來酸酐等用作連接化學試劑?？梢杂媚芙Y(jié)合至生物分子的多種化學基團對生物分子結(jié)合基團進行官能化。這種基團通常是由化學式A-L-B表示的生物分子結(jié)合化合物提供。生物分子結(jié)合基團B可以是能夠與任何所關注的生物分子反應并形成共價鍵(優(yōu)選為不可逆共價鍵)的任何可用的官能團。許多種這類基團是已知且可用的。一般來講，基團B將不同于基團A(表面結(jié)合基團)。在該化學式中，L可以是化學鍵或多種有機連接基的任意一種。有機連接基L可以是直鏈或支鏈的亞烷基、亞芳基或亞烷基與亞芳基的組合，可任選地包含雜原子。對于某些實施例而言，L基團不包括二價的含環(huán)氧垸的低聚物或聚合物基團。對于某些實施例而言，如果L基團確實包括二價的含環(huán)氧垸的低聚物或聚合物基團，該基團可以為納米顆粒提供屏蔽和/或水分散特性，則它們不是唯一存在于納米顆粒上的屏蔽和/或水分散性基團。這種反應基團B的非限制性實例包括選自由以下基團組成的組的那些胺(特別是伯胺，但也可以使用仲胺，它們可以是芳族和/或脂族的)、肼、羥基(-OH)、砜、醛、醇(-OR)、環(huán)氧垸(例如環(huán)氧乙烷)、鹵素(Cl、Br、I、F)、N-氧琥珀酰亞胺、丙烯酸酯、丙烯酰胺、具有吸電子基團的a，e-烯屬或炔屬不飽和基團(如a,e-不飽和酮)、羧酸根、酯、酐、碳酸根、草酸根、氮丙啶、環(huán)氧基團、N-取代的馬來酰亞胺、二氫唑酮以及它們的組合。下面示出了這些連接有L連接基的B基團的某些實例，其中B基團包括醛和羥基、鹵素、酯、肼(脂族或芳族的)和N-氧琥珀酰亞胺<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>X=I,Br,Cl,F:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>X=CH2,O，S,NH，NR(11=烷基)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>n=0-10X=CH2，0,S,NH,NR(R=烷基)對于某些實施例而言，生物分子結(jié)合基團不包括碳原子少于6個的脂族胺和/或馬來酰亞胺基團，當水分散性基團和/或屏蔽基團包括含(環(huán)氧垸)的基團時，其能共價結(jié)合至生物分子?；蛘?，本發(fā)明的納米顆粒不包括用于生物分子結(jié)合的短鏈脂族胺和/或馬來酰亞胺基團以及作為屏蔽基團和/或水分散性基團的含聚(環(huán)氧垸)的基團。在此背景下，"短鏈"表示長度少于6個碳，優(yōu)選少于7個碳，更優(yōu)選少于8個碳，甚至更優(yōu)選少于9個碳。優(yōu)選的是，當本發(fā)明的納米顆粒包含用于生物分子結(jié)合的胺和/或馬來酰亞胺基團時，屏蔽基團和/或水分散性基團完全不包含聚(環(huán)氧垸)基團。對于某些實施例而言，乙烯砜、環(huán)氧基團、丙烯酸酯和胺是優(yōu)選的，因為它們可允許直接連接而無需復雜的化學反應(如對于例如羧酸根來說是需要的)。以下是帶有L連接基的優(yōu)選的B基團的代表，其中B基團包括乙烯砜、環(huán)氧基團、丙烯酸酯和胺基團-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>n=0-15X=NH,NR,S,On=0-15X=CH2，O,Sn=0-15X=CH2,0，NH,觀SNH2n=0-10X=CH2，O,S，NH,NR(R=烷基)可以使用多種組合的生物分子結(jié)合基團。它們可以在相同的顆粒上或者在不同的顆粒上。特別優(yōu)選的生物分子結(jié)合基團是具有抗水解性的那些。與生物分子反應的抗水解官能團包括丙烯酸酯、a，e-不飽和酮、N-磺酰基羧酰亞胺衍生物、?；酋０?、N-磺酰氨基羰基、氟化酯、開環(huán)二氫唑酮、磺酰氟、環(huán)氧碳酸(三角酸(delticacid)、方酸(squaricacid)、克酮酸和玫棕酸)、三聚氟氰、乙烯砜、全氟苯酚以及它們的多種組合。烷氧基硅垸或氯硅烷，它們可以是單官能的、雙官能的或三官能的。例如，二氧化硅納米顆粒表面上的硅垸醇基團與生物分子結(jié)合化合物的至少一種硅垸醇、垸氧基硅垸或氯硅烷基團反應，形成官能化納米顆粒。用于使生物分子結(jié)合化合物與二氧化硅納米顆粒反應的示例性條件在"實例"部分中描述。a,e-烯屬或炔屬不飽基團對于某些實施例而言，生物分子結(jié)合基團包括具有吸電子基團的a,e-烯屬或炔屬不飽和基團。吸電子基團的非限制性實例包括羰基、酮、酯、酰胺、-S02-、-SO-、-CO-CO-、-CO-COOR、磺酰胺、鹵素、三氟甲基、磺酰胺、鹵素、馬來酰亞胺、馬來酸基、或它們的組合。對于某些實施例而言，吸電子基團是酮、酯或酰胺。生物分子結(jié)合基團可以由化學式A-L-B表示的生物分子結(jié)合化合物提供。生物分子結(jié)合基團B是ci,e-烯屬或炔屬不飽和基團。一般來講，基團B不同于基團A(表面結(jié)合基團)。在該化學式中，L可以是化學鍵或多種有機連接基的任意一種，使得某些優(yōu)選的基團L-B(或僅B)具有如下結(jié)構(gòu)X=CH2，0,NH，觀S或<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>在某些實施例中，生物分子結(jié)合基團是丙烯酸酯或a,0-不飽和酮。在寬泛的pH范圍內(nèi)，丙烯酸酯和a,P不飽和酮在水中顯示具有期望的穩(wěn)定特性，并且還顯示具有與伯胺的高反應性，不可逆地形成邁克爾(Michael)加成加合物。當具有氨基的生物分子通過碳-氮鍵共價結(jié)合至生物分子結(jié)合基團時，產(chǎn)生邁克爾加成加合物，該碳-氮鍵涉及生物分子的氨基和ci位具有羰基單元的a，6-烯屬不飽和基團的P位置。下面的方案I表示丙烯酸酯化合物(其是生物分子結(jié)合化合物的實例)的例子，在某些優(yōu)選的實施例中，丙烯酸酯化合物是用于與固體載體材料表面反應并使固體載體表面改性的起始材料。這種化合物的化學式為A-L-B，其中A是—Si(OR)3，B是丙烯酸酯基團<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>所需水平的所關注的生物分子(多肽，例如抗體，優(yōu)選為IgG抗體)的連接。胺和/或肼基對于某些實施例而言，生物分子結(jié)合基團包括胺和/或肼。胺和/或肼可以是芳族的、脂族的或其組合。胺可以是伯胺或仲胺，但優(yōu)選為伯胺，更優(yōu)選的伯胺是親水性的胺，包括聚(環(huán)氧乙烷)胺和聚亞胺。對于某些實施例而言，生物分子結(jié)合基團包括芳基胺和/或芳基肼。胺可以是伯胺或仲胺(即非叔胺)，但優(yōu)選為伯胺。在這種實施例中，生物分子結(jié)合基團可以由通過化學式A-L-B表示的生物分子結(jié)合化合物提供，其中生物分子結(jié)合基團B是芳基非叔胺和/或芳基肼基團。一般來講，基團B將不同于基團A(表面結(jié)合基團)。在該化學式中，L可以是化學鍵或多種有機連接基的任意一種，使得某些優(yōu)選的基團L-B(或僅B)具有如下結(jié)構(gòu)n=0-10X=CH2，O，S,NH，NR(R=烷基)和NHNH2n=0-10X=CH2，O,S,NH,NR(R-垸基)對于某些實施例而言，B基團包括芳基胺和/或芳基肼，并且通過席夫堿機制與具有游離羰基的生物分子反應，從而形成化學式-Ar-N-C(H)-生物分子鍵合或-Ar-NHN-C(H)-生物分子鍵合，其中Ar是芳基，其可以是未取代的或者是經(jīng)取代的。芳基可以包含單個芳環(huán)或多個芳環(huán)，其可以包含或者可以不包含雜原子(特別是S、N、0)。實例包括萘、蒽、嵌二萘和聯(lián)苯。如果芳基是經(jīng)取代的，則取代基(如羥基、羧基、甲氧基、甲基、氨基)應該不會在空間上干擾或電子干擾作為生物分子結(jié)合基團的芳基胺基和/或芳基肼基的功能。應該使芳基的尺寸與水分散性基團的數(shù)目和類型相平衡，以避免納米顆粒的過度團聚。如果需要，芳基可以被親水基團取代，以有助于納米顆粒的分散。對于該實施例，生物分子是醛官能化的生物分子。如果生物分子是抗體，則其為經(jīng)氧化的抗體。優(yōu)選的是，游離羰基是來自抗體的Fc區(qū)域。氧化抗體的示例性條件在"實例"部分中描述。通過席夫堿機制將生物分子(例如經(jīng)氧化的抗體)固定至芳基胺的實例在下面的方案II中示出。抗體固定:取向控制通過化學式A-L-B表示的生物分子結(jié)合化合物(即，能夠提供具有芳基胺和/或芳基肼基團的生物分子結(jié)合基團的化合物)的例子包括4-氨基苯基三甲氧基硅垸。本領域的普通技術(shù)人員將會認識到，許多種其它生物分子結(jié)合化合物可用于本發(fā)明，用作可用于用生物分子結(jié)合基團使固體載體材料官能化的化合物。優(yōu)選的是，使足量的生物分子結(jié)合化合物與固體載體材料反應，以提供所需水平的所關注的生物分子(經(jīng)氧化的多肽，例如經(jīng)氧化的抗體，優(yōu)選IgG抗體)的連接。具有含生物素的基團的伯胺對于某些實施例而言，生物分子結(jié)合基團包括脂族伯胺和/或芳族伯胺，并且其上共價結(jié)合有生物分子的生物分子結(jié)合基團包括通過胺官能基團共價結(jié)合至納米顆粒表面的含生物素基團。優(yōu)選的是，含胺的生物分子結(jié)合基團是芳族胺。如果它們是脂族胺，則它們具有的碳原子不少于6個，特別是當水分散性基團和/或屏蔽基團包括含聚(環(huán)氧烷)的基團時?；蛘?，本發(fā)明的納米顆粒不包括用于生物分子結(jié)合的短鏈脂族胺基團以及作為屏蔽基團和/或水分散性基團的含聚(環(huán)氧烷)的基團。在此背景下"短鏈"表示長度少于6個碳、優(yōu)選少于7個碳、更優(yōu)選少于8個碳、甚至更優(yōu)選少于9個碳。優(yōu)選的是，當本發(fā)明的納米顆粒包含用于生物分子結(jié)合的脂族胺基團時，屏蔽基團和/或水分散性基團完全不包括聚(環(huán)氧垸)基團。因此，對于某些優(yōu)選的實施例而言，生物分子是生物素，從而形成如方案III所示的生物素化的酰胺。其可用于捕獲靶生物分析物(如抗體)。方案HI可以通過(+)-生物素-N-羥基-琥珀酰亞胺酯化合物與脂族伯胺和/或芳族伯胺(生物分子結(jié)合基團)的反應形成這種其上結(jié)合有生物素的含胺基團，其中胺官能團通過連接基L結(jié)合至表面。作為另外一種選擇，(+)-生物素-N-羥基-琥珀酰亞胺酯化合物與胺的反應可以在與二氧化硅納米顆粒表面結(jié)合之前進行。生物素也稱為維生素11或順式-六氫-2-氧-111-噻吩并-[3,4]-咪唑-4-戊酸，它是對包括細菌和酵母在內(nèi)的大多數(shù)生物體至關重要的基本維生素。生物素的分子量為244道爾頓，遠低于其結(jié)合配體親和素和鏈霉親和素。生物素也是丙酮酸羧化酶、轉(zhuǎn)羧基酶、乙酰輔酶A羧化酶和e-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶(它們一起羧化許多種類型的底物)的酶輔因子?？梢允褂蒙锼匮苌飦磉B接至二氧化硅納米顆粒上的胺，例如生物素的N-羥基琥珀酰亞胺酯(稱為NHS-生物素)、生物素的N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯(稱為磺基-NHS-生物素)、磺基琥珀酰亞胺基-6-[生物素酰氨基]己酸酯(稱為磺基-NHS-LC-生物素)、磺基琥珀酰亞胺基-6-[生物素酰氨基]-6-己酰氨基己酸酯(稱為磺基-1^18七(:丄(:-生物素)和N-羥基琥珀酰亞胺PEGu-生物素或N-羥基琥珀酰亞胺PEG4-生物素(稱為NHS-PEOu-生物素或磺基-NHS-PE04-生物素)。因此，采用這種命名時，生物素或生物素衍生物為生物分子，而生物分子結(jié)合基團是胺。含生物素的化合物(如生物素或生物素的衍生物)與親和素或鏈霉親和素形成化學鍵合，其復合物能夠結(jié)合至可以是耙28分析物或者可以對靶分析物(如細菌)具有特異性的抗體。已發(fā)現(xiàn)基于親和素-生物素親和性的技術(shù)在生物學及生物技術(shù)的諸多領域中具有廣泛的應用性。親和素與生物素之間的親和力常數(shù)非常高(解離常數(shù)Kd大約為1(T15M，參見Green,Biochem.J.，89，599(1963))，并且當生物素與許多種生物分子偶聯(lián)時也不會顯著減小。已經(jīng)確定了許多化學試劑用來使生物分子與生物素偶聯(lián)，使生物分子的活性或其它所需特性的損失最小或可忽略不計。生物素-親和素技術(shù)的綜述可見于"ApplicationsofAvidin-BiotinTechnologytoAffinity-BasedSeparation"(Bayer等人)，《色譜法雜志》第3-11頁(1990)。鏈霉親和素及其官能化同系物親和素是具有四個相同亞單元的四聚體蛋白。鏈霉親和素是由放線細菌屬鏈霉菌親和素(Streptomycesavidinii)分泌。鏈霉親和素或親和素的單體包含一個水溶性維生素生.物素的高親和力結(jié)合位點，并且鏈霉親和素或親和素四聚體與四個生物素分子結(jié)合。鏈霉親和素和親和素都顯示出與生物素的極為牢固的且高度特異性的結(jié)合，這是一種已知為最強的蛋白質(zhì)與配體之間的非共價相互作用，摩爾解離常數(shù)為10"摩爾(M)(Green,《蛋白質(zhì)化學進展》，第29巻，第85-133頁，1975年)，配體解離的tl/2為89天(Green,NM，《蛋白質(zhì)化學進展》，第29巻，第85-133頁，1975年)。親和素-生物素鍵合在血清和循環(huán)中是穩(wěn)定的(Wei等人，Experientia,第27巻，第366-368頁，1970年)。一旦形成，親和素-生物素復合物不會受大多數(shù)極端pH值、有機溶劑以及變性條件的影響。將生物素與鏈霉親和素分離需要諸如8M胍、1.5的pH值或12rC下高壓滅菌10分鐘(min)之類的條件。水分散性基團水分散性基團是單價基團，該單價基團能夠為納米顆粒表面提供親水特性，從而減少(并且優(yōu)選防止)納米顆粒在生物環(huán)境中使用的水性緩沖溶液中過度團聚和沉淀(但是當納米顆粒處于水性環(huán)境中時，少量的團聚是可容許的，只要團聚物的平均尺寸優(yōu)選不大于200nm)。述及單價，其表示水分散性基團沒有能與所關注的生物分子反應或固定所關注的生物分子的端基。因此，水分散性基團是單獨的并且不同于生物分子結(jié)合基團。也就是說，納米顆粒表面包含提供親水特性的單價基團，即使同樣的部分可以形成生物分子結(jié)合基團與固體載體材料表面的連接基。優(yōu)選的是，水分散性納米顆粒在水性緩沖溶液中是貯存穩(wěn)定性的。提及貯存穩(wěn)定性，其意指在高于20'C的溫度下，在至少l年的周期內(nèi)，水分散性納米顆粒的水性分散體在處于緩沖液中時不會脫乳化和/或凝結(jié)或團聚。如本文所用，術(shù)語"水分散性化合物"描述的是能與固體載體材料表面反應以用水分散性基團對其進行改性的化合物。它可以用化學式A-L-WD表示，其中A是表面結(jié)合基團，該表面結(jié)合基團可以與本文所述的其它表面結(jié)合基團相同或不同，WD表示水分散性基團，L表示有機連接基或化學鍵。有機連接基L可以是直鏈或支鏈的亞烷基、亞芳基或亞垸基與亞芳基的組合，可任選地包含雜原子。水分散性基團是親水基團或好水性基團。它們通常包括(例如)非離子基團、陰離子基團、陽離子基團、當分散在水中時能夠形成陰離子基團或陽離子基團的基團(如鹽或酸)或它們的混合物。非離子水分散性基團的實例包括聚(環(huán)氧烷)基團和含多羥基的基團(包括含糖的基團)。優(yōu)選的非離子水分散性基團是聚(環(huán)氧烷)基團(優(yōu)選為大分子單體)，該聚(環(huán)氧垸)基團是單價的，并且具有至少一個-(3112-(:112-0-(重復)單元，并且可以具有-CH(Ri)-CH2-0-重復單元，使得大分子單體總共具有至少一個，優(yōu)選至少五個-CH2-CH2-0-(重復)單元，并且-CH2-CH2-0-重復單元與-CH(R"-CH2-0-重復單元的比例為至少2:1。因此，聚(環(huán)氧烷)基團中可以包含少量的環(huán)氧丙烷，盡管其不是所需的。陰離子或陰離子形成基團可以是有助于表面的陰離子化的任何合適基團。例如，合適的基團包括羧酸根基團(-C(V基團，包括聚羧酸根)、硫酸根基團(-S(V基團，包括聚硫酸根)、磺酸根基團(-so3—基團，包括聚磺酸根)、磷酸根基團(-P(V基團，包括聚磷酸根)、膦酸根基團(-P(V基團，包括聚膦酸根)和類似的基團以及它們的酸。陽離子基團或陽離子形成基團可以是有助于表面的陽離子化的任何合適基團。例如，合適的基團包括季銨鹽、膦鹽和锍鹽。在某些實施例中，優(yōu)選的水分散性基團包括羧酸基團、磺酸基團、膦酸基團或它們的組合。水分散性基團在二氧化硅納米顆粒表面上的連接明顯意味著其分散體的穩(wěn)定性不需要諸如表面活性劑之類的外部乳化劑。然而如果需要，在包括官能化納米顆粒的組合物中也可以使用陰離子和陽離子水分散性化合物，用作外部乳化劑并協(xié)助納米顆粒的分散?？梢杂没瘜W式為A-L-WD的水分散性化合物提供水分散性基團。水分散性化合物的合適的表面結(jié)合基團A在本文標題為"含二氧化硅的納米顆粒"的部分中描述。實例包括硅垸醇、烷氧基硅烷或氯硅烷。一些優(yōu)選的水分散性化合物包括如下化合物以及其它的己知化合物。本領域的普通技術(shù)人員將會認識到，許多種其它水分散性化合物可用于本發(fā)明，用作外部乳化劑或用作可用于用水分散性基團使二氧化硅納米顆粒改性的化合物。用于使這種化合物與二氧化硅納米顆粒反應的示例性條件在"實例"部分中描述。優(yōu)選的是，使足量的水分散性化合物與二氧化硅納米顆粒反應，以提供所需水平的水分散度，而不會干擾生物分子結(jié)合基團的連接。優(yōu)選的是，所需水平的水分散度要使得外部乳化劑對于制備保存穩(wěn)定性分散體來說是不必要的。屏蔽基團"屏蔽基團"是單價基團，該單價基團能夠減少(并且優(yōu)選防止)除靶生物分析物(如另一種所關注的生物分子)以外的生物分子的非特異性結(jié)合。述及單價，其意指屏蔽基團不具有可以與所關注的生物分子反應或可以固定所關注生物分子的端基。下面描述的某些親水基團也可以用作屏蔽基團(如，含聚(環(huán)氧乙烷)的基團、含多羥基的基團、磺酸基團)。屏蔽基團獨立于并且不同于生物分子結(jié)合基團。也就是說，在某些實施例中，固體載體材料包含提供屏蔽特性的單價基團，即使同樣的部分可以形成生物分子結(jié)合基團與固體載體材料表面的連接基。如本文所用，術(shù)語"屏蔽化合物"描述的是能與固體載體材料表面反應以用屏蔽基團對其進行改性的化合物。它可以用化學式A-L-Sh表示，其中A是表面結(jié)合基團，該表面結(jié)合基團可以與本文所述的其它表面結(jié)合基團相同或不同，Sh表示屏蔽基團，L表示有機連接基或化學鍵。有機連接基L可以是直鏈或支鏈的亞烷基、亞芳基或亞烷基與亞芳基的組合，可任選地包含雜原子。屏蔽基團用于阻斷非靶分析物/生物分子和生物大分子材料結(jié)合至固體載體材料表面，并允許固體載體材料被用于結(jié)合、分離或固定特定的生物分子。對屏蔽基團的主要要求是，它不能與所關注的生物分子(例如捕獲劑或靶生物分析物)結(jié)合。屏蔽基團通常包括(例如)非離子基團(如含聚(環(huán)氧垸)的基團，優(yōu)選含聚(環(huán)氧乙烷)的基團、含乙二醇醚的基團、含聚(環(huán)氧乙烷)醚的基團、含乙二醇乳酸酯的基團、含糖的基團、含多元醇的基團、含冠醚的基團、含低聚縮水甘油醚的基團(包括甲基醚和羥乙基醚)，含羥基酰胺的基團)、陰離子基團(如上述作為水分散性基團的磺酸根和羧酸根基團)以及當分散于水中時能夠形成陰離子基團的基團(如鹽或酸)。根據(jù)需要，可以使用這種基團的各種混合物或組合。優(yōu)選的是，屏蔽基團是長度受到很好地限定的未帶電荷的水溶性聚合分子。過長的聚合物可能會有阻斷生物分子結(jié)合基團上的結(jié)合位點的效應，并因而優(yōu)選對它們的聚合物長度進行控制。優(yōu)選的屏蔽基團包括(但不限于)含聚(環(huán)氧烷)的基團(優(yōu)選分子量低至88的短鏈低聚物，如果包括至少兩個不同的部分，則具有無規(guī)的或嵌段的結(jié)構(gòu)分布)、含乙二醇醚的基團、含聚(環(huán)氧乙烷)醚的基團、含乙二醇乳酸酯的基團、含糖的基團、含多元醇的基團、含冠醚的基團、含低聚縮水甘油醚的基團(包括甲基醚和羥乙基醚)、含羥基酰胺的基團(包括丙烯酰胺的低聚物和聚合物)、含有機磺酸根的基團、含有機羧酸根的基團或它們的組合。優(yōu)選的屏蔽基團是含聚(環(huán)氧乙烷)的基團(優(yōu)選為大分子單體)，該含聚(環(huán)氧乙垸)的基團是單價的，并且具有至少一個-CH2-CH2-0-(重復)單元，并且可以具有-0:11(^)《112-0-(重復)單元，使得大分子單體總共具有至少一個，優(yōu)選至少五個-CH2-CH2-0(重復)單元，并且《112-(:112-0-單元與^11(111)-(:112-0-單元的比例為至少2:1(優(yōu)選為至少3:1)。如果含聚(環(huán)氧乙垸)的基團還包含-CH(R"-CH2-0-基團，則R1為(CVO0烷基，其可以是直鏈的或支鏈的。因此，聚(環(huán)氧垸)基團中可以包含少量的環(huán)氧丙垸(如，0.2毫摩爾/克納米顆粒)，盡管不是所需的。優(yōu)選的是，含聚(環(huán)氧乙烷)的基團的分子量為至少100克/摩爾，更優(yōu)選為至少500克/摩爾。通常優(yōu)選的是，它們的鏈長受限，使得它們小于低聚物的纏結(jié)分子量。術(shù)語"纏結(jié)分子量"用于指連接至表面的屏蔽基團時意指最低分子量，超過該最低分子量則用作屏蔽基團的聚合物分子顯示出纏結(jié)。測定聚合物纏結(jié)分子量的方法是已知的，參見(例如)Friedrich等人，ProgressandTrendsinRheologyV，ProceedingsoftheEuropeanRheologyConference,5th，Portoroz，Slovenia,Sep.6-ll，1998(1998)，387(流變學的進展和趨勢，第五屆歐洲流變學會議論文集，1998年，9月6-11日，斯洛文尼亞)，編輯Emri,I，出版商Steinkopff,Darmstadt(德國)。優(yōu)選的是，這種聚合物基團的分子量不大于10,000克每摩爾(克/摩爾)。雖然無意于提出這種優(yōu)選性的機理，但據(jù)信短鏈屏蔽基團相對于長聚合物鏈是更合適的，以避免阻斷生物分子結(jié)合基團的結(jié)合位點。有理由預期短鏈屏蔽基團將允許靶分析物和/或捕獲劑可觸及生物分子結(jié)合位點。較長鏈的屏蔽基團可能會阻斷生物分子結(jié)合基團，防止發(fā)生任何結(jié)合。表面上的屏蔽基團的表面密度和特性將取決于所需的整個系統(tǒng)和方法的效率，考慮多種因素，例如起始物質(zhì)的成本、生物分子結(jié)合基團的表面密度和特性、水分散性基團(如果包括的話)的表面密度和特性、合成的難易性、靶分析物和/或捕獲劑在所關注樣品中的群體密度以及所需檢測系統(tǒng)的靈敏性(如信噪比)。例如，含聚(環(huán)氧乙垸)的基團與含胺的生物分子結(jié)合基團的比率是至少0.15:1以防止膠凝作用(對于納米粒子而言)；然而對于低的非特異性結(jié)合，含聚(環(huán)氧乙烷)的基團與含胺的生物分子結(jié)合基團的比率是至少2:1。屏蔽化合物的合適的表面結(jié)合基團A在本文標題為"含二氧化硅的納米顆粒"的部分中描述。實例包括硅垸醇、垸氧基硅烷或氯硅烷。屏蔽化合物的例子包括聚(環(huán)氧乙烷)三甲氧基硅垸、(OH)3Si(CH2)3OCH2CH(OH)CH2S03H和羧乙基硅烷三醇鈉鹽。本領域的普通技術(shù)人員將會認識到，許多種其它屏蔽化合物可用于本發(fā)明，用作可用于用屏蔽基團使固體載體材料改性的化合物。用于使這種化合物與二氧化硅納米顆粒反應的示例性條件在"實例"部分中描述。35優(yōu)選的是，使足量的屏蔽化合物與固體載體材料反應，以提供所需水平的非特異性結(jié)合，而不會干擾生物分子結(jié)合基團的連接。報告基團所關注的生物分子通常通過利用提供可檢測信號的報告基團(即信號基團)檢測。這些報告基團通常直接連接至固體載體材料表面(優(yōu)選通過共價鍵連接，并且更優(yōu)選通過不可逆共價鍵連接)。生物分子可以通過這樣定量首先測定樣品中報告基團的量，然后用將樣品與之比較的一組標準品計算所存在的生物分子量。這種報告基團的實例包括發(fā)光基團，包括光致發(fā)光基團，特別是熒光基團。熒光報告基團的實例包括香豆素、熒光素、熒光素衍生物、羅丹明和羅丹明衍生物。發(fā)光報告基團的實例包括金剛垸基環(huán)氧乙垸衍生物。顯色報告基團的實例包括硫化酞、硫化酞衍生物和吲哚酚化合物以及它們的衍生物?？筛鶕?jù)需要使用報告基團的組合。如果將顆粒用作固體載體材料，則可以使用具有不同報告基團的顆粒的組合。例如，混合物中的一種類型的顆?？砂ㄓ脽晒馑貥擞浀木哂刑禺愋?a"的抗體，而另一種類型的顆?？砂ㄓ萌舻っ鳂擞浀木哂刑禺愋?b"的抗體。因此，人們可以使用單個測定法來檢測多種抗原。雖然大多數(shù)報告基團被設計成直接共價結(jié)合至固體載體表面，但是也可以通過另一個分子(如親和素)將報告基團非共價地連接至固體載體表面。也可以通過離子或疏水相互作用來連接熒光基團(如羧基熒光素和氨基熒光素)。優(yōu)選的是，熒光報告基團是熒光素，例如衍生自三乙氧基甲硅垸基取代的熒光素染料的熒光素?？梢允褂脠蟾婊衔?A-L-Rp)將報告基團連接至固體載體材料表面，其中Rp為是報告基團，A是表面結(jié)合基團，而L是有機連接基或化學鍵。有機連接基L可以是直鏈或支鏈的亞垸基、亞芳基或亞烷基與亞芳基的組合，可任選地包含雜原子。報告化合物(A-L-Rp)的合適的表面結(jié)合基團A在本文標題為"含二氧化硅的納米顆粒"的部分中描述。實例包括硅垸醇、垸氧基硅烷或氯硅烷。報告化合物的一個實例是三乙氧基甲硅烷基取代的熒光素。本領域的普通技術(shù)人員將會認識到，許多種其它報告化合物可用于本發(fā)明，用作可用于用報告基團使固體載體材料改性的化合物。用于使這種化合物與二氧化硅納米顆粒反應的示例性條件在"實例"部分中描述。優(yōu)選的是，使足量的報告化合物與固體載體材料反應，以提供所需水平的標記。如果報告基團是疏水的，則將報告基團連接至納米顆粒而不是抗體和/或其它生物分子是特別有利的。例如，當連接至納米顆粒、特別是連接至被水分散性基團部分覆蓋的納米顆粒時，相對疏水的熒光染料分子可以很好地分散于水性介質(zhì)中。納米顆?？梢詼p小熒光染料-染料的相互作用，從而減少猝滅和提高熒光強度。納米顆粒還能夠連接許多染料分子，與將染料連接至抗體或其它生物分子的常規(guī)途經(jīng)相比，這可以提高信號強度。生物分子生物分子可以是天然存在于活體中的任何化合物，以及這類天然存在的化合物的衍生物或片段。生物分子主要由碳和氫組成，除此之外還有氮、氧、磷和硫。有時整合有其他元素，但不是很普遍。生物分子包括(但不限于)蛋白質(zhì)、抗體、多肽、碳水化合物、多糖、類脂、脂肪酸、類固醇、前列腺素、前列環(huán)素、維生素、輔因子、細胞因子和核酸(包括DNA、RNA、核苷、核苷酸、嘌呤和嘧啶)、由活體產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，包括(例如)抗生素和毒素。生物分子還可以包括天然存在的生物分子的衍生物，例如已經(jīng)用化學試劑修飾(如用過碘酸鈉氧化)的蛋白質(zhì)或抗體。生物分子還可以包括交聯(lián)的天然存在的生物分子或天然存在的生物分子與化學物質(zhì)的交聯(lián)產(chǎn)物。因此，如本文所用，術(shù)語"生物分子"包括(但不限于)未經(jīng)修飾的分子和經(jīng)修飾的分子兩者(如，糖基化蛋白、經(jīng)氧化的抗體)及其片段(如蛋白質(zhì)片段)。生物分子片段可以包括(例如)因化學處理、酶處理或照射處理而水解產(chǎn)生的那些片段。在某些實施例中，生物分子可以與一個或多個生物分子結(jié)合基團共價結(jié)合。在某些實施例中，生物分子在連接至生物分子結(jié)合基團之前包括醛基或者可以被修飾成包括醛基。用于氧化抗體的示例性條件在"實例"部分中公開。生物分子可以包括完整的生物體(如病毒、細菌)或細胞或組織或生物體內(nèi)的分子。"所關注的生物分子"可以是可用于"捕獲"其他生物分子的"捕獲劑"(如用于捕獲蛋白質(zhì)的抗體)或者是靶生物分析物中的生物分子。作為另外一種選擇，"所關注的生物分子"可以是"靶分析物"(即"靶生物分析物")或在用于檢測和/或分析的靶分析物(如細菌或其他所關注的生物分子)內(nèi)。抗體(如經(jīng)氧化的抗體)或其它生物分子(如經(jīng)氧化的生物分子)的連接通常在溫和的條件下進行，并且可以在寬的pH值范圍下進行，優(yōu)選pH值為4-11，更優(yōu)選pH值為6-10，最優(yōu)選pH值為7-9。用于連接抗體(如經(jīng)氧化的抗體)或其它生物分子(如經(jīng)氧化的生物分子)的優(yōu)選溫度是室溫。另外，可以采用較低或較高的溫度，但不能釆用使生物分子變性的溫度。該化學適用于所有類型的生物介質(zhì)、堿性緩沖液和甚至弱酸性緩沖液，以及包含諸如DMSO或乙腈之類的溶劑的混合溶劑。捕獲劑可以直接實現(xiàn)靶生物分析物的選擇性連接或者可以通過捕獲劑來實現(xiàn)，例如抗原-抗體結(jié)合(在這里靶生物分析物本身包含與固定在檢測表面上的抗體結(jié)合的抗原)。捕獲劑包括對靶生物分析物具有高親和力，并且優(yōu)選對靶分析物具有特異性的物質(zhì)(如分子、分子的基團)。捕獲劑包括例如抗體及其片段(Fab、Fab'、Fc)、多肽、核酸配體、DNA、RNA、低聚核苷酸、蛋白質(zhì)、抗體、碳水化合物、多糖、類脂、脂肪酸、類固醇、維生素、細胞因子、凝集素、輔因子和受體(如噬菌體受體)。捕獲劑還可以包括天然存在的生物分子的衍生物，例如已經(jīng)用化學試劑修飾的蛋白質(zhì)或抗體。這些也可以包括交聯(lián)的天然存在的生物分子或天然存在的生物分子與化學物質(zhì)的交聯(lián)產(chǎn)物。適用于本發(fā)明的優(yōu)選生物分子捕獲劑包括多肽，包括抗體、抗體綴合物以及諸如親和素、鏈霉親和素和凝聚因子之類的蛋白質(zhì)。特別優(yōu)選的生物分子捕獲劑是抗體。術(shù)語"抗體"意在包括來自脊椎動物(如哺乳類物種)的任何同種型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的整個抗體，以及它們的片段，其也與外源化合物(如蛋白質(zhì))發(fā)生特異性反應?？贵w可以是單克隆的、多克隆的或它們的組合?？梢杂贸Ｒ?guī)技術(shù)使抗體片段化并且以與整個抗體相同的方式篩選片段的實用性。因此，該術(shù)語包括溶蛋白性裂解或重組制備的抗體分子部分的片段，該片段能夠選擇性地與某些蛋白質(zhì)反應。這種蛋白水解片段和/或重組片段的非限制性實例包括Fab、F(ab')2、Fv和包含通過肽接頭連接的VL和/或VH結(jié)構(gòu)域的單鏈抗體(scFv)?？梢怨矁r或非共價的方式連接scFv，形成具有兩個或更多個結(jié)合位點的抗體?？梢杂帽绢I域技術(shù)人員已知的任何可檢測部分標記抗體。在某些方面，與希望測量的被分析物結(jié)合的抗體(一抗)未被標記，而是通過結(jié)合特異性結(jié)合一抗的經(jīng)標記的二抗或其他試劑來間接檢測。多種金黃色葡萄球菌抗體是本領域中已知的。例如，金黃色葡萄球菌抗體可從Sigma-Aldrich和AccurateChemical公司商購獲得。此外，諸如單克隆抗體Mab12-9之類的其它金黃色葡萄球菌抗體在美國專利No.6,979,446中有描述。在某些優(yōu)選的實施例中，抗體選自本文中描述的那些(如，選自由MAb-76、MAb-107、親和純化的RxClf40、親和純化的GxClf40、MAb12-9組成的組)、它們的片段以及它們的組合。這些抗體也在如下專利中有公開提交于2006年11月22日標題為"ANTIBODYWITHPROTEINASELECTIVITY(具有蛋白質(zhì)選擇性的抗體)"的美國專利申請序列No.11/562,759、提交于2006年11月22日標題為"ANTIBODYWITHPROTEINASELECTIVITY(具有蛋白質(zhì)選擇性的抗體)"的美國專利申請序列No.11/562,747，以及提交于2006年11月22日標題為"SPECIFICANTIBODYSELECTIONBYSELECTIVEELUTIONCONDITIONS(通過選擇性洗脫條件對特異性抗體的選擇)"的美國專利申請序列No.60/867,089。優(yōu)選的抗體是單克隆抗體。特別優(yōu)選的是結(jié)合至金黃色葡萄球菌(本文中也稱為"S.aureus"或"StaphA")的蛋白A的單克隆抗體。更具體地講，在一個實施例中，合適的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段是顯示出由雜交瘤細胞系358A76.1產(chǎn)生的單克隆抗體76的免疫結(jié)合特性的那些。鼠單克隆抗體76是鼠IgG2A，從蛋白A免疫的小鼠中分離的K抗體。根據(jù)布達佩斯條約，產(chǎn)生單克隆抗體76的雜交瘤358A76.1于2006年10月18日存放在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)存放處(10801UniversityBoulevard,Manassas，VA20110-2209)，并獲得專利保藏號PTA-7938(本文中也稱為登記號PTA-7938)。雜交瘤358A76.1產(chǎn)生在本文中稱為"Mab76"的抗體。Mab76在本文中也稱為"Mab76"、"Mab-76"、"MAb-76"、"單克隆76"、"單克隆抗體76"、"76"、"M76"或"M76"，它們在本文中均可互換使用，指由雜交瘤細胞系358A76.1產(chǎn)生的免疫球蛋白，該雜交瘤細胞系358A76.1于2006年10月18日存放在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，并指定登記號為PTA-7938。在另一個實施例中，合適的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段是顯示出雜交瘤細胞系358A107.2所產(chǎn)生的單克隆抗體107的免疫結(jié)合特性的那些。鼠單克隆抗體107是鼠IgG2A，從蛋白A免疫的小鼠中分離.的k抗體。根據(jù)布達佩斯條約，產(chǎn)生單克隆抗體107的雜交瘤358A107.2于2006年10月18日存放在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)存放處(10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209)，并且獲得專利保藏號PTA-7937(本文中也稱為登記號PTA-7937)。雜交瘤358A107.2產(chǎn)生一種在本文中稱為"Mab107"的抗體。Mab107在本文中也稱為"Mabl07"、"Mab-107"、"MAb-107"、"單克隆107"、"單克隆抗體107"、"107"、"M107"或"M107"，它們在本文中均可互換使用，指由雜交瘤細胞系產(chǎn)生的免疫球蛋白，該雜交瘤細胞系于2006年IO月18日存放在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，并指定登記號為PTA-7937。合適的單克隆抗體也是抑制單克隆抗體MAb-76與金黃色葡萄球菌的蛋白A結(jié)合的那些。本發(fā)明包括結(jié)合至由單克隆抗體MAb-76識別的金黃色葡萄球菌的蛋白A的相同表位的單克隆抗體。用于確定單克隆抗體是否抑制單克隆抗體MAb-76與金黃色葡萄球菌的蛋白A結(jié)合的方法，以及用于確定單克隆抗體是否結(jié)合至由單克隆抗體MAb-76識別的金黃色葡萄球菌的蛋白A的相同表位的方法是免疫學領域的技術(shù)人員所熟知的。合適的單克隆抗體也是抑制單克隆抗體MAb-107與金黃色葡萄球菌的蛋白A結(jié)合的那些。本發(fā)明包括結(jié)合至由單克隆抗體MAb-107識別的金黃色葡萄球菌蛋白A的相同表位的單克隆抗體。用于確定單克隆抗體是否抑制單克隆抗體MAb-107與金黃色葡萄球菌蛋白A結(jié)合的方法，以及用于確定單克隆抗體是否結(jié)合至由單克隆抗體MAb-107識別的金黃色葡萄球菌蛋白A的相同表位的方法是免疫學領域的技術(shù)人員所熟知的。合適的單克隆抗體是由這種雜交瘤的后代或衍生物產(chǎn)生的那些以及由等同或類似的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。本發(fā)明中還包括多種抗體片段，也稱為抗原結(jié)合片段，其僅包括完整抗體的部分，通常包括完整抗體的抗原結(jié)合位點，因此保留了結(jié)合抗原的能力?？贵w片段的例子包括(例如)由蛋白分解消化和/或還原二硫鍵產(chǎn)生的Fab、Fab'、Fd、Fd'、Fv、dAB和F(ab')2片段以及由Fab表達庫產(chǎn)生的片段?？梢酝ㄟ^本領域中熟知的技術(shù)產(chǎn)生這種抗體片段?？捎糜诒景l(fā)明的單克隆抗體包括(但不限于)人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、單鏈Fvs(scFv)、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙鏈抗體、由Fab表達庫產(chǎn)生的線性抗體片段、包括VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段、細胞內(nèi)產(chǎn)生的抗體(即細胞內(nèi)抗體)以及它們的結(jié)合抗原的抗體片段?？捎糜诒景l(fā)明的單克隆抗體可以是任意同種型的。可用于本發(fā)明的單克隆抗體可以是(例如)鼠IgM、IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgD或IgE?？捎糜诒景l(fā)明的單克隆抗體可以是(例如)人IgM、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD或IgE。在一些實施例中，單克隆抗體可以是鼠IgG2a、IgGl或IgG3。對于本發(fā)明，給定的重鏈可以搭配k或入形式的輕鏈?？捎糜诒景l(fā)明的單克隆抗體可以由動物(包括(但不限于)人、小鼠、大鼠、兔、倉鼠、山羊、馬、雞或火雞)產(chǎn)生、通過化學合成產(chǎn)生或通過重組表達產(chǎn)生。可用于本發(fā)明的單克隆抗體可以通過本領域己知用于純化免疫球蛋白分子的任何方法進行純化，例如通過色譜法(如，離子交換色譜法、親和色譜法和分子篩柱色譜法(sizingcolumnchromatography))、離心法、差別溶解法(differentialsolubility)或通過用于純化蛋白質(zhì)的任何其他標準技術(shù)進行純化。合適的抗體還包括高親合力的抗-金黃色葡萄球菌凝聚因子蛋白的多克隆抗體制劑，該多克隆抗體制劑可以優(yōu)選至少1皮克每毫升(pg/mL)，更優(yōu)選最多100pg/mL的濃度檢測金黃色葡萄球菌重組凝聚因子(rClf40)蛋白。合適的抗體還包括高親合力的抗-金黃色葡萄球菌凝聚因子蛋白的多克隆抗體制劑，與金黃色葡萄球菌凝聚因子蛋白抗血清相比較，該多克隆抗體制劑表現(xiàn)出增強了至少4倍的檢測靈敏度。在某些實施例中，高親合力的抗-金黃色葡萄球菌凝聚因子蛋白的多克隆抗體制劑是可用的，其中高親合力的抗金黃色葡萄球菌凝聚因子蛋白的多克隆抗體制劑的制備方法包括從用金黃色葡萄球菌的重組凝聚因子(rClf40)蛋白免疫的動物中獲取抗血清；將抗血清結(jié)合至金黃色葡萄球菌凝聚因子(Clf40)蛋白親和柱；用具有0.5摩爾每升(M)的鹽且pH為4的洗滌緩沖液洗滌該柱；以及用pH為2的洗脫緩沖液將高親合力的抗金黃色葡萄球菌凝聚因子蛋白的多克隆抗體制劑從該柱中洗脫出來。在本文中，來自兔和山羊的高親合力的抗-金黃色葡萄球菌凝聚因子的多克隆抗體制劑分別稱為親和純化的RxClf40和親和純化的GxClf40。在一些實施例中，高親合力的抗-金黃色葡萄球菌凝聚因子蛋白的多克隆抗體制劑的獲取方法還可以包括在將抗血清結(jié)合至金黃色葡萄球菌凝聚因子(Clf40)蛋白親和柱之前，使抗血清中IgG類抗體富集。這種富集可以將非免疫球蛋白從制劑中除去和/或使樣品內(nèi)富集IgG類抗體。如本文所用，抗血清指來自免疫宿主動物的已移除凝固蛋白和紅細胞(RBC)的血液。靶抗原的抗血清可以通過免疫多種宿主動物中的任何一種獲得?？梢允褂枚喾N免疫方法中的任何一種?？贵w親合力是多克隆抗體制劑的功能性親和力的量度。親合力是多種抗體/抗原相互作用的復合親和力。也就是說，親合力是抗原/抗體結(jié)合的表觀親和力，而不是真實親和力。盡管大多數(shù)抗血清中存在親和力異質(zhì)性，但人們可以通過限定平均親和力(KG)來表征這種群體。捕獲劑在表面上的表面覆蓋率和填充率可影響靶生物分析物檢測的靈敏性。將捕獲劑連接至表面的固定化學可在填充捕獲劑、保持Jf獲劑活性方面起作用，并且還可以有助于表面的可再生性和壽命?？梢允褂迷诒疚闹衅渌胤矫枋龅亩喾N固定方法來與表面連接，以實現(xiàn)高收率、高活性、高壽命和高穩(wěn)定性的目標。除了結(jié)合捕獲劑并使其依然保持活性的化學之外，存在著其他的與本發(fā)明結(jié)合使用的任何捕獲劑的表面特性或者固定化學需要考慮并且可能會與臨床或環(huán)境診斷應用相關。固定化學應該優(yōu)選對結(jié)合至表面的耙標的檢測造成有限的干擾或無干擾。例如，捕獲劑或固定化學應該不會干擾(如破壞)與表面結(jié)合的熒光染料的熒光發(fā)射。固定化學還可以決定抗體或蛋白質(zhì)如何結(jié)合至表面，從而決定捕獲劑活性位點的取向。固定化學可優(yōu)選提供可重復的特性以從本發(fā)明表面獲得可重復的數(shù)據(jù)和靈敏度?？梢詫⑸镉H和力配對體(例如抗原/半抗原、抗體/抗體的抗原結(jié)合片段或互補核酸、生物受體/配體(白介素-4及其受體)用于連接捕獲劑。將這種生物分子配對體中的一者共價連接至結(jié)合生物分子的試劑。這些生物分子形成用于靶生物分析物的"捕獲劑"的部分。例如，當將抗體連接至表面時，生物素和親和素和/或鏈霉親和素之間形成的強的鍵是特別有用的。優(yōu)選的是，鏈霉親和素可以用作將抗體連接至表面的手段。鏈霉親和素是分離自阿維丁鏈霉菌(Streptomycesavklinii)的四聚體蛋白，其可牢固地結(jié)合至維生素生物素。可以通過多種化學將諸如鏈霉親和素之類的蛋白質(zhì)連接至表面?？梢詫⑸锼氐难苌铮缟锼氐腘-羥基琥珀酰亞胺酯(稱為NHS-生物素)、生物素的N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯(稱為磺基-NHS-生物素)、磺基琥珀酰亞胺基-6-[生物素酰氨基]己酸酯(稱為磺基-NHS-LC-生物素)、磺基琥珀酰亞胺基-6-[生物素酰氨基]-6-己酰氨基己酸酯(稱為磺基-NHS-LC-LC-生物素)，以及N-羥基琥珀酰亞胺PEG『生物素和N-羥基琥珀酰亞胺PEG4-生物素(稱為NHS-PEOu-生物素或磺基-NHS-PE04-生物素)用于將生物素在第一位氨基酸基團處連接至生物分子，例如抗體。這些生物素化的生物分子隨后可以被連接至其上連接有鏈霉親和素的表面。靶生物分析物"靶生物分析物"包括(例如)組織、細胞或其內(nèi)的生物分子或由其衍生的生物分子(如生物體特異性抗原、酶或其他蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、毒素或朊病毒、細胞壁成分或片段、鞭毛、菌毛、核酸、抗體)。如本文所用，術(shù)語"組織"指源自動物或植物的多細胞聚集體或器官，并且包括活細胞和壞死細胞兩者、結(jié)締組織和間質(zhì)液。"細胞"指所有活生物體的基本結(jié)構(gòu)和功能單元，活生物體包括動物、植物和單細胞微生物。如本文所用，術(shù)語"微生物"指通常歸類為細菌、病毒、酵母、絲狀真菌和原生動物的原核或真核生物體。如本文所用，術(shù)語"原核生物體"包括被認為是細菌的所有形式的微生物，包括球菌、桿菌、螺旋菌、原生質(zhì)球、原生質(zhì)體、孢子等。特別關注的微生物(即微生物體)包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、原生動物、支原體、酵母、病毒，甚至包括脂包膜病毒。特別相關的生物體包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)或葡萄球菌屬(Staphylococcus)物種、鏈球菌屬(Streptococcus)物種、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種、腸球菌屬(Enterococcus)物種、埃希菌屬(Esherichia)45物種、芽孢桿菌屬(Bacillus)物種、李斯特菌屬(Listeria)物種、弧菌屬(Vibrio)物種，以及皰疹病毒、曲霉菌屬(Aspergillus)物種、鐮孢菌屬(Fusarium)物種，以及念珠菌屬(Candida)物種的成員。特別的毒性生物體包括金黃色葡萄球菌(包括抗性株，例如耐甲氧西林(Methicillin)金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐萬古霉素(Vancomycin)金黃色葡萄球菌(VRSA)、萬古霉素中度耐性-金黃色葡萄球菌(VISA)、表皮葡萄球菌(S,Epidermidis)、月巿炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、無乳鏈球菌(S.Agalactiae)、釀膿鏈球菌(S.Pyogenes)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、耐萬古霉素腸球菌(Enterococcus)(VRE)、炭疽桿菌(Bacillusanthracis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、溶淀粉芽胞桿菌(Bacillusamylolyticus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacmuscereus)、凝結(jié)芽胞桿菌(Bacilluscoagulans)、膠質(zhì)芽胞桿菌(Bacillusmacerans)、巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)、多粘芽胞桿菌(Bacilluspolymyxa)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophillus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergillusniger)、煙曲霉(A.fumigatus)、棒曲霉(A.clavatus)、茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、厚孢鐮刀菌(F.chlamydosporum)、單核細胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、霍亂弧菌(Vibriocholera)、副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)、豬霍亂沙門菌(Salmonellacholerasuis)、傷寒沙門菌(S.typhi)、鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、光滑念珠菌(C.glabrata)、克魯斯念珠菌(C.kmsei)、鏈球菌A、鏈球菌B、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、木糖氧化產(chǎn)堿菌亞種反硝化產(chǎn)堿菌(Alcaligenesxylosoxydanssubsp.denitrificans)、少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)多種藥物耐受的革蘭氏陰性桿菌(Gramnegativerod)(MDR)。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌是所關注的。特別關注的是革蘭氏陽性菌，如金黃色葡萄球菌。通常，這些可以通過檢測細菌的細胞壁成分特性(例如細胞壁蛋白)的存在而得以檢測。另外，特別關注的有耐抗生素微生物，包括MRSA、VRSA、VISA、VRE和MDR。通常，這些可以通過另外檢測內(nèi)部細胞成分(例如膜蛋白)的存在而得以檢測?？梢苑治龅米匀魏蝸碓吹臏y試樣品中的所關注的這類微生物或其他微生物類型，這些來源是例如生理流體，如血液、唾液、眼晶狀體流體、滑膜液、腦脊髓液、膿液、汗液、滲出物、尿液、粘液、哺乳期乳液等。此外，測試樣品可來自身體部位，如傷口、皮膚、鼻孔、頭皮、指/趾甲等。本領域描述了用于檢測微生物(例如金黃色葡萄球菌)的多種患者取樣技術(shù)。這些取樣技術(shù)也適用于本發(fā)明的方法。通常通過擦拭患者的鼻孔來獲取樣品。特別優(yōu)選的取樣技術(shù)包括用無菌拭子或取樣裝置拭抹受試者(如患者)的前鼻孔。例如，用一個拭子為每個受試者取樣，即兩個鼻孔使用一個拭子。取樣可以(例如)通過這樣實現(xiàn)將干的或用合適溶液預潤濕的拭子(例如可以商品名"Pure-Wraps"從Puritan(EastGrinstead，UK)商購獲得的拭子)插入受試者鼻孔的前端，將拭子沿鼻孔粘膜表面旋轉(zhuǎn)兩個完整的轉(zhuǎn)。然后，通常將拭子直接培養(yǎng)或用合適的溶液進行提取，該溶液通常包括任選與緩沖液混合的水以及至少一種表面活性劑。除了生理溶液以外，其他測試樣品可包括其他液體以及溶解于液體介質(zhì)中的固體。所關注的樣品可包括加工料流、水、土壤、植物或其他植被、空氣、表面(如被污染表面)等?？梢宰寽y試樣品(如液體)接受預先處理，例如稀釋粘稠流體?？梢宰寽y試樣品(如液體)在注射進樣品口之前接受其他處理方法，例如濃縮、過濾、離心、蒸餾、透析、稀釋、過濾、使天然組分滅活、添加試劑、化學處理等。本發(fā)明的方法可以不僅涉及檢測生物分子(如微生物或其生物分子)的存在，而且還優(yōu)選涉及鑒定所述生物分子。在某些實施例中，檢測生物分子的存在包括定量該生物分子。制備方法和使用方法可以多種方式制備本發(fā)明的納米顆粒。通常，可以在有效使基團連接(優(yōu)選共價結(jié)合，更優(yōu)選不可逆地共價結(jié)合，如本文所定義)至納米顆粒的二氧化硅表面的條件下，使含表面結(jié)合基團(如二氧化硅結(jié)合基團)和所需的生物分子結(jié)合基團、水分散性基團、屏蔽基團和/或報告基團的化合物與納米顆粒接觸。示例性的這種條件在"實例"部分中進行了詳細說明。典型的添加順序涉及首先連接屏蔽基團。雖然據(jù)信添加順序不是關鍵性的，但可能會存在某些情況先加入生物分子結(jié)合基團可能會防止或影響結(jié)合屏蔽基團。然后使用改性的納米顆粒來連接生物分子。這在有效使一種或多種生物分子通過生物分子結(jié)合基團連接至表面的條件下進行?？贵w或其它生物分子的連接通常在溫和的條件下進行，并且可以在寬的pH值范圍內(nèi)發(fā)生，優(yōu)選pH值為4-11，更優(yōu)選pH值為6-10，最優(yōu)選pH值為7-9。用于連接抗體或其它生物分子的優(yōu)選溫度是室溫。另外，可以采用較低或較高的溫度，但不能采用使生物分子變性的溫度。該化學適用于所有類型的生物介質(zhì)、堿性緩沖液和甚至弱酸性緩沖液，以及包含諸如DMSO或乙腈之類的溶劑的混合溶劑。示例性的這種條件在"實例"部分中進行了詳細說明。生物分子可以是所需的靶分析物、可以在靶分析物內(nèi)、可以是耙分析物的部分，或者它可以是用于靶分析物的捕獲劑(優(yōu)選對特定靶分析物具有特異性)，靶分析物在隨后的步驟中被捕獲。生物分子與生物分子結(jié)合基團之間的相互作用可以是共價的(優(yōu)選為如本文所定義的不可逆共價)，捕獲劑與靶分析物之間的相互作用不需要是共價48的。應當理解，包括將生物分子(無論其為捕獲劑還是靶分析物)連接至納米顆粒的本發(fā)明方法通常不是涉及在捕獲這類生物分子后將該生物分子從表面洗脫出來的色譜法。實例通過以下實例進一步說明本發(fā)明的目標及優(yōu)點，但在這些實例中列舉的具體材料及其量以及其它的條件和細節(jié)不應被理解為對本發(fā)明的不當限制。除非另外指明，否則實例中的所有份數(shù)、百分比、比例等均按重量計。除非另外指明，否則所使用的溶劑和其它試劑均得自密蘇里州圣路易斯的西格瑪-奧爾德里奇化學公司(Sigma-AldrichChemicalCompany,St丄ouis，MO)或馬薩諸塞州瓦德希爾的阿法埃莎公司(AlfaAesar，WardHill,MA)。除非另外指明，否則所有水溶液均用MILLI-Q純化水(Millipore，Billerica，MA)制備。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)由10mM磷酸鈉中的0.9。/0(w/v)的NaCl組成，pH值為7.4。PBS/吐溫由含0.05。/。(w/v)的吐溫20的PBS組成。金黃色葡萄球菌株6538得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。多克隆(兔)抗金黃色葡萄球菌IgG抗體可購自AccurateChemical&ScientificCorporation公司(Westbury，NY)。熒光素綴合的山羊抗兔抗體F(ab')2IgG片段(H+L)可以商品名AffiniPure購自JacksonImmunoResearch(WestGrove，PA)。實例1制備用芳基胺生物分子結(jié)合基團和聚(環(huán)氧乙烷)屏蔽基團(但未用不同的水分散性基團)改性的二氧化硅納米顆粒按如下一般工序制備連接有4-氨基苯基硅垸的二氧化硅納米顆49粒。用46.6g變性乙醇稀釋水中固體含量為40.88%的NALCO2327二氧化硅(73.4克(g)，得自伊利諾斯州內(nèi)珀維爾的NalcoCo.)樣品。向反應容器中添加聚(環(huán)氧乙烷)三甲氧基硅垸(3.0g，SILQUESTA-1230,得自康涅狄格州威爾頓的GESilicones公司，分子量為500)，導致比率為每克納米二氧化硅為0.2毫摩爾(mmol)聚(環(huán)氧乙烷)三甲氧基硅烷。將該混合物在80'C下于密封的反應容器中反應16小時(hr)，以形成PEG改性的二氧化硅。將該混合物樣品(1.5g)與0.3毫摩爾的4-氨基苯基三甲氧基硅烷(APS)反應。用乙醇稀釋APS至10%或1%，并以所需量加入至PEG改性的二氧化硅等分試樣中。在乙醇中稀釋是為了確保準確地將少量硅烷加入反應物中。將反應物置于密封的反應容器中并在80'C下反應16小時。該反應后，將額外的A-1230聚(環(huán)氧乙垸)三甲氧基硅烷物料加入反應容器中。調(diào)節(jié)A-1230聚(環(huán)氧乙垸)三甲氧基的載荷，以便總硅烷載荷(A-1230+APS)為每克納米二氧化硅為0.62mmo1硅烷。將反應容器重新密封并置于80°C的烘箱中16小時。接下來，將反應混合物置于SPECTRA/POR2透析膜(截留分子量為12-14,000的分子多孔膜管，得自SpectrumLaboratories,Inc.(RanchoDominguez，CA))中。將該膜置于具有連續(xù)流動的去離子水的容器中16小時。實例2抗體的氧化以及與芳基胺和PEG改性的二氧化硅納米顆粒(無不同的水分散性基團)的連接多克隆(兔)抗-金黃色葡萄球菌IgG抗體可購自AccurateChemical&ScientificCorporation公司(Westbury，NY)。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)由10毫摩爾(mM)磷酸鈉中的0.9%(重量/體積(w/v))NaCl組成，pH值為7.4。PBS/吐溫由含0.05。/。(w/v)吐溫20的PBS(密蘇里州圣路易斯的西格瑪奧德里奇化學公司)組成。將兔抗體IgG(抗金黃色葡萄球菌，0.5毫升(mL)，4.8mg/mL)與2.5mL緩沖溶液(pH=5，0.02摩爾每升(M)的醋酸鈉和0.15M的NaCl)混合，并將抗體溶液穿過Econo-10DG脫鹽柱(Pierce化學公司(Rockford，IL))進行緩沖液更換。棄去來自該柱的三毫升(3mL)最初的洗脫液。然后將接下來的7個0.5-mL的級分(各自檢測為對抗體陽性)合并在一起。在暗處實施高碘酸試劑的制備和抗體的氧化，以便使光暴露最小化。將Nal04溶液(0.01M)加入抗體溶液中。允許抗體氧化反應在室溫下進行30分鐘(min)。反應后加入乙二醇(20體積％)以淬滅反應。通過以10，000轉(zhuǎn)每分鐘(rpm)離心并棄去上清液來除去未反應的乙二醇和不期望的氧化副產(chǎn)物，例如甲醛。首先用lmL純化水通過以5000rpm旋轉(zhuǎn)30分鐘來洗滌CENRICON過濾裝置(Millipore公司)，然后將過濾器倒置并以1000rpm旋轉(zhuǎn)來除去剩余的水。然后施加最多l(xiāng).lmL氧化液并以5000rpm離心40分鐘。加入一毫升(lmL)25mM的磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)以進一步洗滌掉未反應的乙二醇和不期望的氧化副產(chǎn)物，然后將樣品以5000rpm旋轉(zhuǎn)40分鐘。將經(jīng)氧化的抗體轉(zhuǎn)移至埃彭道夫管中。在4'C下使4-氨基苯基三甲氧基硅烷和濃度為1013及1014個顆粒/mL的上述PEG-連接的二氧化硅納米顆粒與經(jīng)氧化的抗體(50微克(嗎))反應過夜。將所得顆粒以13，000rpm旋轉(zhuǎn)30分鐘，然后將顆粒用PBS+0.05。/。吐溫20洗滌兩次，以移除未反應的抗體。實例3牛物素與芳基胺和PEG改性的二氧化硅納米顆粒(但未用不同的水分散性基團改性)的連接將一毫升實例1中4.68重量％的20nm尺寸的二氧化硅納米顆粒樣品置于小瓶中，該二氧化硅納米顆粒樣品覆蓋有0.3毫摩爾的4-氨基苯基三乙氧基硅烷并且覆蓋有PEG硅烷A123。向該溶液中添加溶解于1.2gTHF/2-甲氧基丙醇混合溶劑(體積比為2:1)中的1.2mg(+)-生物素-N-羥基-琥珀酰亞胺酯。隨后將含生物素的溶液加入至二氧化硅分散51溶液中?；旌系娜芤阂廊怀吻?，將其在室溫下置于超聲波浴槽中30分鐘。最后，將溶液在6(TC下加熱過夜。反應后，將反應混合物置于SPECTRA/POR2透析膜(截留分子量為12-14,000的分子多孔膜管，得自SpectrumLaboratories,Inc.)中。將該膜在具有連續(xù)流動的去離子水的容器中放置24小時。實例4生物素與用長鏈胺生物分子結(jié)合基團和聚(環(huán)氧乙烷)屏蔽基團(但未用不同的水分散性基團)改性的二氧化硅納米顆粒的連接如下制備伯胺封端的聚環(huán)氧乙烷三烷氧基硅垸將10gJEFFAMINEXTJ-501(分子量為1,000的聚環(huán)氧乙垸，具有兩個伯胺端基，得自HuntsmanChemical(SaltLakeCity，UT))置于50mL的燒杯中，并通過升溫至4(TC熔化。向熔化的聚醚二胺中加入1.08g異氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙酯樣品。使該混合物在4(TC下反應1小時，得到伯胺封端的聚環(huán)氧乙烷三烷氧基硅烷。將樣品用乙醇稀釋成50%的固體。按如下方式使聚環(huán)氧乙垸伯胺基團連接至PEG改性的二氧化硅納米顆粒將lmL8.25重量％的20nm二氧化硅納米顆粒、0.1毫摩爾伯胺封端的聚環(huán)氧乙垸三垸氧基硅烷和聚(環(huán)氧乙垸)三甲氧基硅烷(SILQUESTA-1230，得自GESilicones(Wilton,CT)，分子量為500)置于小瓶中，調(diào)節(jié)SILQUESTA-1230的載荷，以便總的硅烷載荷(A-1230+伯胺封端的聚環(huán)氧乙烷硅垸)為0.65毫摩爾硅垸/克納米二氧化硅。向該材料中加入溶解于1.2gTHF/2-甲氧基丙醇混合溶劑(比例為2:1)中的1.8mg(+)-生物素-N-羥基-琥珀酰亞胺酯。混合的溶液依然澄清，將其在室溫下置于超聲波浴槽中30分鐘。然后將溶液在60'C下加熱過夜。反應后，將反應混合物置于SPECTRA/POR2透析膜(截留分子量為12-14,000的分子多孔膜管，得自SpectrumLaboratories,Inc.)中。將該膜置于具有連續(xù)流動的去離子水的容器中24小時。實例5(比較例)生物素與短鏈胺和PEG改性的二氧化硅納米顆粒(但未用不同的水分散性基團改性)的連接以及與長鏈胺基團的比較在比較研究中，將lml8.25重量％的20nm二氧化硅納米顆粒用0.1毫摩爾3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)和聚(環(huán)氧乙烷)三甲氧基硅烷(SILQUESTA-1230，得自GESilicones(Wilton，CT)，分子量為500)(調(diào)節(jié)A-1230進料，以便總的硅烷載荷(A1230+APS)為0.65毫摩爾硅垸/克納米二氧化硅)覆蓋。向溶液中加入溶解于1.2gTHF/2-甲氧基丙醇溶劑混合物(比例為2:1)中的1.8mg(+)-生物素-N-羥基-琥珀酰亞胺酯?；旌系娜芤阂廊怀吻?，將其在室溫下置于超聲波浴槽中30分鐘。然后將該溶液在60'C下加熱15小時。這段時間過后，將反應混合物置于SPECTRA/POR2透析膜(截留分子量為12-14,000的分子多孔膜管，得自SpectrumLaboratories,Inc.(RanchoDominguez，CA)中。然后將該膜置于具有連續(xù)流動的水的容器中24小時。雖然實例4和實例5的材料不包含任何不同的水分散性基團，但讓材料經(jīng)受采用熒光強度信號的細菌檢測分析表明，實例4的材料具有高強度信號，而實例5的材料只具有中等強度信號。實例6制備用丙烯酸酯生物分子結(jié)合基團和PEG屏蔽基團(但未用不同的水分散性基團)改性的二氧化硅納米顆粒以及抗體與丙烯酸酯基團的連接將三羥甲基丙垸三丙烯酸酯(TMPTA，6.78克(g)，0.025摩爾(mol)，得自Sartomer公司(Exton，PA))溶解于25毫升(mL)四氫呋喃(THF)中。將THF溶液在冰浴中攪拌冷卻至5'C。向溶液中緩慢加入3-氨基丙基三乙氧基硅垸(4.44g，0.020摩爾)。添加后，將溶液在相同條件(即5'C的冰浴中)下攪拌1-2小時(hr)。在室溫下53進一步攪拌該溶液l-2小時。反應后，移除THF得到澄清的粘性液體。將反應混合物(即該澄清的粘性液體)取樣并通過iHNMR進行分析，分析表明3-氨基丙基三乙氧基硅烷消失并且存在所需的基于仲胺的邁克爾加合物(作為主要產(chǎn)物)和基于叔胺的邁克爾加合物(作為次要產(chǎn)物)的混合物。將NALCO2327二氧化硅納米顆粒(36.6g，水中固體含量為40.88%的20nm二氧化硅顆粒分散體)與聚(環(huán)氧乙烷)三甲氧基硅垸(SILQUESTA-1230，得自GESilicones(Wilton，CT)，2.99g或3.74g，分子量=500)以每克20nm尺寸的納米二氧化硅為0.40毫摩爾或0.50毫摩爾A-1230硅烷的比例混合。將混合物在80'C下于密封的反應容器中反應16小時，以形成改性的二氧化硅。將改性的二氧化硅的等分試樣(用每克二氧化硅為0.4毫摩爾的A-1230硅垸制備)與不同量(每克納米二氧化硅為0.05至0.2毫摩爾硅垸)的以上制備的丙烯酸硅烷化合物反應。將丙烯酸硅烷(在THF中稀釋至10%)以以下量加入至改性的二氧化硅的等分試樣中l(wèi)g20nm的Si02表面-覆蓋有0.1毫摩爾丙烯酸硅烷和0.4毫摩爾A1230PEG硅烷。將反應物置于密封的反應容器中，在65'C下反應20小時。之后，將反應混合物置于SPECTRA/POR2透析膜(RanchoDominguez，CA)中。將該膜置于具有連續(xù)流動的去離子水的容器中20小時。多克隆(兔)抗-金黃色葡萄球菌IgG抗體可得自Chemical&ScientificCorporation(Westbury，NY)。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)由10毫摩爾每升(mM)磷酸鈉中的0.9。/。(重量/體積(w/v))的NaCl組成，pH-7.4。PBS/吐溫20由含0.05。/。(w/v)吐溫20的PBS(密蘇里州圣路易斯的西格瑪-奧爾德里奇化學公司)組成。在4t:下將如上制備的丙烯酸酯二氧化硅納米顆粒(濃度為1013和10"個顆粒每毫升)與抗體IgG(兔多克隆抗金黃色葡萄球菌抗體，Chemical&ScientificCorporation(Westbury，NY))反應過夜。將所得顆粒以13,000轉(zhuǎn)每分鐘(rpm)旋轉(zhuǎn)30分鐘(min)，然后用PBS+0.05%吐溫20洗滌顆粒兩次以去除未反應的抗體。之后，加入2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)(作為載體蛋白)并在4'C下保持過夜。然后用PBS+吐溫20(同上)洗滌BSA處理過的固定有抗體的顆粒2次以去除多余的BSA。實例7-24制備用a.P-烯屬不飽和生物分子結(jié)合基團和屏蔽基團(但未用不同的水分散性基團)改性的二氧化硅納米顆粒按如下一般工序制備連接有其它官能團的二氧化硅納米顆粒將水中固體含量為40.0°/0的1.0克NALCO2327二氧化硅納米顆粒(20nm的二氧化硅顆粒，可得自NalcoCo.(Naperville，IL))與表1中指定量的硅垸醇#1和硅烷醇#2混合。聚(環(huán)氧乙垸)三甲氧基硅烷(分子量為500，以商品名SILQUESTA-1230獲得)可購自GESilicones(Wilton，CT)。有機硅烷磺酸基本上按照美國專利No.4，338，377的實例1中所述的工序制備。列出的所有其他物質(zhì)都可購自Gelest,Inc.(Morrisville，PA)。將上述混合物在80'C下于密封的反應容器中反應4-6小時。反應后，將所得反應混合物置于SPECTRA/POR2透析膜(截留分子量為12-14,000的分子多孔膜管，得自SpectrumLaboratories,Inc.(RanchoDominguez，CA))中。將該膜置于具有連續(xù)流動的去離子水的容器中20小時。在4'C下將如上制備的二氧化硅納米顆粒(濃度為1013和1014個顆粒每毫升)與抗體IgG小鼠單克隆抗-金黃色葡萄球菌抗體(3X1014個抗體分子，75ng抗體，得自StrategicDiagnostics,Inc.(Newark,DE))在PBS緩沖溶液(由10mM磷酸鈉中的0.9%(w/v)NaCl組成，pH=7.4)中反應過夜，得到類似的結(jié)果。將抗體-綴合的顆粒沉淀成小丸，用PBS/吐溫洗滌兩次，用2mg/mLBSA阻斷，將其離心洗滌，并再懸浮于PBS/<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>(A-1230PEG硅烷+磺化硅烷)為0.62mmol硅烷/克納米二氧化硅。有機硅垸磺酸完全按照美國專利No.4,338,377的實例1中所述的工序制備。將上述混合物在8(TC下于密封的反應容器中反應4-6小時。反應后，將所得反應混合物置于SPECTRA/POR2透析膜(截留分子量為12-14,000的分子多孔膜管，得自SpectrumLaboratories,Inc.(RanchoDominguez，CA))中。將該膜置于具有連續(xù)流動的去離子水的容器中20小時。將濃度為1X10"個顆粒/mL的PEG硅垸改性的二氧化硅納米顆粒以13,000rpm旋轉(zhuǎn)30分鐘。然后將收集的納米顆粒再懸浮于200微升(pL)PBS/吐溫中，隨后將其與IOO微克每毫升(pg/mL)的每種異硫氰酸熒光素標記的細胞色素C和異硫氰酸熒光素-標記的牛血清白蛋白(通過將FITC染料分子與蛋白質(zhì)混合物在室溫下反應2小時，之后進行標準的熒光素標記工序(來自MolecularProbes/Invitrogen(Carlsbad,CA))而獲得)混合。然后將所得混合物在4'C下孵育14小時。孵育階段過后，將顆粒通過以13,000rpm離心30分鐘分離，并將其再分散于lmLPBS/吐溫中。將該步驟重復三次。將5微升(5fiL)這種納米顆粒分散液用于制備待用顯微鏡觀察的樣品。通過Leica熒光顯微鏡獲得熒光圖像，并將其用于確定非特異性結(jié)合的程度。具有高熒光的圖像表明高的非特異性結(jié)合(低是與背景相當，即其不比背景強度高很多；高指明顯高于背景)。用未處理過的二氧化硅納米顆粒以類似的方式進行對照試驗。結(jié)果列于下表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實例35制備用熒光基團和聚(環(huán)氧乙烷)屏蔽基團(但未用生物分子結(jié)合基)改性的二氧化硅納米顆粒將365克水中固體含量為40.88%的NALCO2327二氧化硅(150g，20-納米(20-nm)氨穩(wěn)定的二氧化硅顆粒，可得自NalcoCo.(Naperville，IL))樣品加入反應容器中。將30克SILQUESTA-1230(—種分子量為500的三甲氧基硅垸官能化的聚(環(huán)氧乙烷)(PEG-硅烷)，得自GESilcones)樣品加入反應容器中。將該溶液在8(TC下加熱16小時。反應產(chǎn)物為澄清的流體分散體，并且每克20-nm粒徑的二氧化硅納米顆粒包括0.4毫摩爾(mmol)硅烷取代的聚(環(huán)氧乙垸)低聚物。將19.5毫克(mg)異硫氰酸熒光素(得自AlfaAesar(WardHill，MA)的技術(shù)等級)樣品加入小瓶中。將該染料完全溶解于0.23克(g)干二甲亞砜(DMSO)中。將0.12gDMSO中10%的3-氨基丙基三乙氧基硅垸溶液樣品加入至染料溶液中，并將其在60'C下反應60分鐘以形成硅垸官能化的熒光素染料。將新鮮制備的DMSO中的硅烷官能化的熒光素染料加入含有上述分散的PEG-改性的二氧化硅納米顆粒的水溶液(58.5g和25g的二氧化硅)中。隨后將該混合物在6(TC下加熱16小時，以形成熒光素和PEG官能化的二氧化硅納米顆粒。實例36至39熒光標記的蛋白質(zhì)與PEG官能化的二氧化硅納米顆粒的非特異性^口口對于這些實例，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)由10mM磷酸鈉中的0.9%(w/v)NaCl組成，pH=7.4。PBS/吐溫由含0.05°/。(重量/體積)吐溫20的PBS(Sigma)組成。異硫氰酸熒光素(FITC)可購自MolecularProbes/Invitrogen(Carlsbad,CA)。Nalco2327二氧化硅納米顆粒(20-nm二氧化硅顆粒)可購自NalcoCo.(Naperville，IL)。PEG硅垸(聚(環(huán)氧乙烷)三甲氧基硅烷(PEG-硅烷)，分子量為500，可以商品名SilquestA-1230獲得)可購自GESilicones(Wilton,CT)。通過如下一般工藝制備PEG-硅烷、丙烯酸酯硅垸和磺化硅烷改性的納米顆粒將水中固體含量為40.0%的Nalco2327二氧化硅納米顆粒(1克)與表3中指定量的SilquestA-1230PEG硅垸、磺化硅垸((OH)3Si(CH2)30CH2CH(OH)CH2S03H)或羧化硅烷(羧乙基硅烷三醇)以及丙烯酸酯硅烷(3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，Gelest,Inc.(Philadelphia，PA)混合。調(diào)節(jié)A-1230PEG-硅烷的量以便總硅烷載荷(A-1230PEG-硅烷+磺化硅烷+丙烯酸酯硅垸)為0.65mmol硅烷/克二氧化硅納米顆粒。將PEG-硅垸、磺化硅烷和丙烯酸酯硅垸以及二氧化硅納米顆粒的混合物在80"C下于密封的反應容器中反應4-6小時。反應后，將所得反應混合物置于SPECTRA/POR2透析膜(截留分子量為12-14,000的分子多孔膜管，得自SpectrumLaboratories,Inc.(RanchoDominguez，CA))中。將該膜置于具有連續(xù)流動的去離子水的容器中20小時。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>為了使通過反應性丙烯酸酯基團的蛋白質(zhì)結(jié)合最小化，用乙醇胺將丙烯酸酯基團淬滅。為了制備經(jīng)淬滅的顆粒，將硅烷-改性的二氧化硅納米顆粒在室溫下懸浮(以1X10"個顆粒/ml的濃度)于碳酸氫鈉緩沖液中的10mM乙醇胺(pH9.0)中2小時。將顆粒以13，000rpm旋轉(zhuǎn)30分鐘。然后將收集的納米顆粒再懸浮于200^1PBS/吐溫20中，隨后將其與100pg/ml的各種異硫氰酸熒光素-標記的細胞色素C和異硫氰酸熒光素-標記的牛血清白蛋白(通過將FITC染料分子與蛋白質(zhì)混合物在室溫下反應2小時，之后進行標準的熒光素標記工序(來自MolecularProbes/Invitrogen(Carlsbad,CA))而獲得)混合。然后將所得混合物在室溫下孵育1小時。孵育階段過后，通過使懸浮液以13，000rpm離心30分鐘來洗滌顆粒，移除上清液，并將顆粒再懸浮于lmLPBS/吐溫20中。將洗滌步驟重復三次。將100微升經(jīng)三次洗滌的再懸浮納米顆粒溶液置于微量滴定板中，用SpectraMaxM2Microplate熒光板讀數(shù)儀(MolecularDevicesCorp.(Sunnyvale，CA))測量結(jié)合至顆粒的熒光蛋白的量。以相對光單位(RLU)記錄的結(jié)果在表4中列出。表4.熒光素標記的蛋白質(zhì)與二氧化硅納米顆粒的結(jié)合<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>實例40抗體連接至丙烯酸酯化的二氧化硅納米顆粒以及細菌結(jié)合金黃色葡萄球菌菌株6538可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas,VA)。小鼠單克隆抗-金黃色葡萄球菌IgG抗體(Mab107)在提交于2006年11月22日標題為"ANTIBODYWITHPROTEINASELECTIVITY(具有蛋白質(zhì)選擇性的抗體)"的美國專利申請No.11/562,747中有描述。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)由10mM磷酸鈉中的0.9%(w/v)NaCl組成，pH值為7.4。PBS/吐溫由含0.05。/0(w/v)吐溫20的PBS(Sigma)組成。熒光素綴合的山羊抗小鼠IgG(H+L)可購自JacksonImmunoresearch(WestGrove，PA)。將如實例59-62中所述制備的丙烯酸酯二氧化硅納米顆粒以1014個顆粒每毫升的濃度懸浮于PBS/吐溫中。在該實驗中，來自實例59-62的顆粒的固體百分比分別為8.35%、8.70%、8.55%和8.17%。將顆粒懸浮液與抗金黃色葡萄球菌Mabl07IgG抗體(75嗎/30(HiL)在室溫下反應2小時。將所得顆粒以13，000轉(zhuǎn)每分鐘(rpm)旋轉(zhuǎn)30分鐘(min)，并將顆粒用PBS+0.05g/q吐溫20洗滌兩次以除去任何未綴合的抗體。金黃色葡萄球菌ATCC6538(SA6358)通過如下方式制備將培養(yǎng)物在TSB肉湯中培育過夜，將細胞在PBS/吐溫中洗滌兩次，并將細胞再懸浮于等體積的PBS/吐溫20中。通過在室溫下以8000rpm離心8分鐘以使細胞形成沉淀小丸來洗滌細胞，并將細胞再懸浮于PBS/吐溫20中。洗滌過的細菌的濃度為約1()S個細胞/ml，這通過在670nm處的吸收測量值估算。使?jié)舛葹閘X108CFU/ml的金黃色葡萄球菌6538細菌與固定有抗體的二氧化硅顆粒一起孵育30分鐘。通過離心洗滌混合物兩次。將熒光素綴合的山羊抗小鼠IgG(H+L)(50ng/ml)引入上述含細菌和固定有抗體的二氧化硅顆粒的培養(yǎng)懸浮液中以進行標記。將該混合溶液在室溫下另外孵育30分鐘。通過以6000rpm離心來洗滌樣品兩次，每次6分鐘(注意這些洗滌步驟的相對離心力足以使細菌細胞形成沉淀小丸，但游離的丙烯酸酯納米顆粒M)。將沉淀小丸再懸浮并通過Leica熒光顯微鏡觀察。將溶液的100ul等分試樣置于96孔平板中的各個孔中，用SpectraMaxM2Microplate熒光板讀數(shù)儀(MolecularDevicesCorp.(Sunnyvale，CA))測量相對熒光。激發(fā)波長為485nm而發(fā)射波長為525nm。未使用截止濾波器。陰性對照為洗滌過的金黃色葡萄球菌細胞懸液的等分試樣。陽性對照為洗滌過的金黃色葡萄球菌細胞懸液的等分試樣，該細胞懸液已經(jīng)如上所述與Mab107IgG抗體一起孵育，之后與熒光素-綴合的抗-小鼠IgG抗體一起孵育。結(jié)果示于表5中。對于改性的納米顆粒而言，檢測到細菌的明亮的熒光標記，這表示抗體-綴合的納米顆粒與細菌的相對高水平的結(jié)合。相反，檢測到陰性對照樣品為非常低的熒光或無熒光(相對于背景而言)，在陰性對照樣品中用緩沖液代替抗-金黃色葡萄球菌抗體。表5:抗體-綴合的納米顆粒(含水分散性基團和(可任選的)PEG)與金黃色葡萄球菌細胞的結(jié)合。結(jié)果以相對熒光單位(RFU)的形式提供。在該實驗中，空的微孔板的孔獲得大約75RFU的平均背景讀數(shù)。含PBS/吐溫的微孔板的孔獲得約554RFU的平均背景讀數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>本文引用的專利、專利文件和出版物的完整公開內(nèi)容全文以引用方式并入，就如同每個文件被單獨地并入一s樣。在不背離本發(fā)明的范圍和實質(zhì)的前提下，對本發(fā)明的多種修改和更改對于本領域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。應當理解，本發(fā)明并非意圖受本文示出的示例性實施例和實例的不當限制，這些實例和實施例僅以舉例的方式提供，本發(fā)明的范圍旨在僅受本文示出的以下權(quán)利要求書的限制。權(quán)利要求1.一種捕獲靶分析物的方法，所述方法包括提供水分散性納米顆粒，每個所述水分散性納米顆粒包括二氧化硅表面，所述二氧化硅表面具有通過不可逆共價鍵連接至所述表面的官能團，其中所述官能團包括用于連接生物分子的生物分子結(jié)合基團；數(shù)量足以為所述納米顆粒提供水分散性的水分散性基團；和不同于所述水分散性基團的屏蔽基團，其中所述結(jié)合的屏蔽基團不包括酰胺基團和/或脲基團；在有效使所述生物分子共價結(jié)合至一個或多個生物分子結(jié)合基團的條件下，使所述水分散性納米顆粒與所述生物分子接觸，其中所述生物分子是靶分析物的捕獲劑；以及使其上共價結(jié)合有所述生物分子捕獲劑的所述水分散性納米顆粒與懷疑含有靶分析物的樣品接觸；前提條件是，所述生物分子結(jié)合基團不包括碳原子少于6個的脂族胺和/或馬來酰亞胺基團，當所述水分散性基團和/或屏蔽基團包括含聚(環(huán)氧烷)的基團時，所述脂族胺和/或馬來酰亞胺基團能夠共價結(jié)合至生物分子。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述靶分析物包括微生物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述微生物包括細菌。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述細菌包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述屏蔽基團包括含聚(環(huán)氧垸)的基團、含乙二醇醚的基團、含聚(環(huán)氧乙烷)醚的基團、含乙二醇乳酸酯的基團、含糖的基團、含多元醇的基團、含冠醚的基團、含低聚縮水甘油基的基團、含羥基丙烯酰胺的基團、含有機磺酸根的基團、含有機羧酸根的基團或它們的組合。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述屏蔽基團包括含聚(環(huán)氧垸)的基團。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述含聚(環(huán)氧烷)的屏蔽基團包括含聚(環(huán)氧乙垸)的基團。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述水分散性基團包括羧酸基團、磺酸基團、膦酸基團、它們的鹽或它們的組合。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述生物分子通過不可逆共價鍵結(jié)合至一個或多個生物分子結(jié)合基團。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述納米顆粒的粒度不大于200nm。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法，其中所述生物分子結(jié)合基團包括選自如下基團的官能團胺、肼、羥基、砜、醛、醇、環(huán)氧烷、齒素、N-氧琥珀酰亞胺、丙烯酸酯、丙烯酰胺、具有吸電子基團的a，P-烯屬或炔屬不飽和基團、羧酸根、酯、酐、碳酸根、草酸根、氮丙啶、環(huán)氧基團、N-取代的馬來酰亞胺、二氫唑酮以及它們的組合。12.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其中所述生物分子結(jié)合基團包括選自如下基團的官能團乙烯砜、環(huán)氧基團、丙烯酸酯、胺或它們的組合。13.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其中所述生物分子結(jié)合基團包括a,e-烯屬不飽和基團和吸電子基團。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述吸電子基團包括羰基、酮、酯、酰胺、-S02-、-SO-、-CO-CO-、-CO-COOR、磺酰胺、鹵素、三氟甲基、磺酰胺、鹵素、馬來酰亞胺、馬來酸基、或它們的組合。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述生物分子結(jié)合基團是丙烯酸酯或a,e-不飽和酮。16.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法，其中所述生物分子結(jié)合基團包括芳族非叔胺基團和/或芳族肼基團。17.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法，其中所述生物分子是醛官能化的并且共價結(jié)合至所述生物分子結(jié)合基團，形成-Ar-N二C(H)-生物分子或-Ar-NH-NK:(H)-生物分子，其中Ar是芳基。18.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法，其中其上共價結(jié)合有生物分子的所述生物分子結(jié)合基團包括通過胺官能化基團共價結(jié)合至所述納米顆粒表面的含生物素的基團。19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項所述的方法，其中所述納米顆粒還包含連接至所述二氧化硅表面的報告基團。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述報告基團包括熒光基團。21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的方法，其中在使所述水分散性納米顆粒與生物分子接觸之前，所述方法包括氧化所述生物分子以形成醛官能化的生物分子。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述生物分子是抗體。23.根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項所述的方法，其中使所述水分散性納米顆粒與生物分子接觸包括使所述水分散性納米顆粒與多種不同特異性的抗體接觸。24.—種將生物分子連接至納米顆粒的方法，所述方法包括提供二氧化硅納米顆粒，每個所述二氧化硅納米顆粒包括表面；提供水分散性化合物，所述水分散性化合物包含水分散性基團和表面結(jié)合基團；提供生物分子結(jié)合化合物，所述生物分子結(jié)合化合物包含生物分子結(jié)合基團和表面結(jié)合基團；提供屏蔽化合物，所述屏蔽化合物包含屏蔽基團和表面結(jié)合基團，其中所述屏蔽化合物與所述水分散性化合物不同；將多個生物分子結(jié)合基團、水分散性基團和屏蔽基團通過所述表面結(jié)合基團與所述表面之間的不可逆共價結(jié)合來共價結(jié)合至多個所述二氧化硅納米顆粒的所述表面；其中所述結(jié)合的屏蔽基團不包括酰胺基團和/或脲基團；以及在有效使所述生物分子共價結(jié)合至一個或多個生物分子結(jié)合基團的條件下，使所述水分散性納米顆粒與生物分子接觸；前提條件是，所述生物分子結(jié)合基團不包括碳原子少于6個的脂族胺和/或馬來酰亞胺基團，當所述水分散性基團和/或屏蔽基團包括含聚(環(huán)氧垸)的基團時，所述脂族胺和/或馬來酰亞胺基團能夠共價結(jié)合至生物分子。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述生物分子通過不可逆共價鍵結(jié)合至一個或多個生物分子結(jié)合基團。26.根據(jù)權(quán)利要求24或權(quán)利要求25所述的方法，其中所述生物分子是靶生物分析物的捕獲劑。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述生物分子捕獲劑是抗體。28.根據(jù)權(quán)利要求24或權(quán)利要求25所述的方法，其中所述生物分子是靶生物分析物。29.根據(jù)權(quán)利要求24至28中任一項所述的方法，還包括提供報告分子，所述報告分子包含報告基團和表面結(jié)合基團；以及將多個所述報告基團通過所述表面結(jié)合基團共價結(jié)合至多個所述二氧化硅納米顆粒的所述表面。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述報告基團包括熒光基團。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中在所述報告分子結(jié)合至所述固體載體材料表面之前將所述屏蔽化合物共價結(jié)合至所述固體載體材料的表面。32.根據(jù)權(quán)利要求24至31中任一項所述的方法，其中所述生物分子結(jié)合基團包括選自如下基團的官能團胺、肼、羥基、砜、醛、醇、環(huán)氧烷、鹵素、N-氧琥珀酰亞胺、丙烯酸酯、丙烯酰胺、具有吸電子基團的a，P-烯屬或炔屬不飽和基團、羧酸根、酯、酐、碳酸根、草酸根、氮丙啶、環(huán)氧基團、N-取代的馬來酰亞胺、二氫唑酮、以及它們的組合。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述生物分子結(jié)合基團包括選自如下基團的官能團乙烯砜、環(huán)氧基團、丙烯酸酯、胺或它們的組合。34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述生物分子結(jié)合基團包括a-P烯屬不飽和基團和吸電子基團。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述吸電子基團包括酮、酯、酰胺、-S02-、國SO-、陽CO-CO-、-CO-COOR、磺酰胺、鹵素、三氟甲基、磺酰胺、鹵素、馬來酰亞胺、馬來酸基、或它們的組合。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述生物分子結(jié)合基團是丙烯酸酯或a,e-不飽和酮。37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述生物分子結(jié)合基團包括芳族非叔胺基團和/或芳族肼基團。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述生物分子是醛官能化的并且共價結(jié)合至所述生物分子結(jié)合基團，形成-Ar-^C(H)-生物分子或-Ar-NH-NKXH)-生物分子，其中Ar是芳基。全文摘要用水分散性基團、屏蔽基團和生物分子結(jié)合基團官能化的二氧化硅納米顆粒的用途。文檔編號G01N33/543GK101663581SQ200880012502公開日2010年3月3日申請日期2008年4月17日優(yōu)先權(quán)日2007年4月19日發(fā)明者威廉·J·舒爾茨,張亦帆,景乃勇,米歇爾·L·萊格特,郭春梅申請人:3M創(chuàng)新有限公司