專利名稱：紅細(xì)胞攜帶的抗原以及抗紅細(xì)胞抗體的檢測(cè)的制作方法
紅細(xì)胞攜帶的抗原以及抗紅細(xì)胞抗體的檢測(cè)
本發(fā)明利用了紅細(xì)胞上抗原性分子的存在，來(lái)鑒定由紅細(xì)胞和其它細(xì)胞群二者攜
帶的抗原性分子。 如今，輸血是靜脈內(nèi)供給從供血者獲得的血紅細(xì)胞濃縮物(血細(xì)胞濃縮物)制劑。在輸血時(shí)，主要的風(fēng)險(xiǎn)與抗體及其紅細(xì)胞抗原在接受者(被輸血的個(gè)體)體內(nèi)再結(jié)合的可能性有關(guān)。事實(shí)上，在紅細(xì)胞、也被稱為血紅細(xì)胞的表面，存在有能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)別并能夠引發(fā)免疫應(yīng)答、使血紅細(xì)胞溶血的膜抗原，特別是血型(或系統(tǒng))抗原。這種免疫反應(yīng)的結(jié)果，其范圍可以從沒(méi)有臨床征兆的無(wú)效輸血，到輕微臨床反應(yīng)(焦慮、顫抖)，嚴(yán)重臨床反應(yīng)(休克、血紅蛋白尿(haemoglobi皿rea)、腎機(jī)能不全)或?qū)е滤劳龅膭×遗R床反應(yīng)(休克、彌散性靜脈內(nèi)溶血)。 如果接受者不具有任何針對(duì)供體紅細(xì)胞抗原的循環(huán)系統(tǒng)抗體，則供體的血紅細(xì)胞被稱為是與接受者的血液相容的。 除了血型抗原之外，在法國(guó)人群中，已經(jīng)在15%的個(gè)體中檢測(cè)到紅細(xì)胞上存在的HLA抗原決定簇(de Villartay等，Tissue Antigens, 1985， 26 (1) : 12-9)。盡管紅細(xì)胞上HLA抗原決定簇的這種量與其它細(xì)胞類型相比較低，但就輸血風(fēng)險(xiǎn)來(lái)說(shuō)仍是重要的(Everett等，Transplantation, 1987， vol. 44， no. 1， pp. 123—129)。 本發(fā)明人最初關(guān)注于輸血風(fēng)險(xiǎn)，隨后意識(shí)到，除了血型抗原分子之外，任何抗原性分子都可以利用它們?cè)诩t細(xì)胞上的偶然出現(xiàn)，容易地被檢測(cè)到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于鑒定個(gè)體的紅細(xì)胞攜帶的多種抗原性分子，和/或用于鑒定生物樣品中多個(gè)針對(duì)紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子的抗體的體外方法，所述由紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子由紅細(xì)胞和至少一種其它細(xì)胞群二者都攜帶的、血型分子之外的抗原性分子組成，所述方法包括 a)通過(guò)下列步驟鑒定個(gè)體的紅細(xì)胞攜帶的多種抗原性分子 (i)在允許紅細(xì)胞與抗體結(jié)合并且不產(chǎn)生凝集的條件下，將所述含有紅細(xì)胞的樣
品，在單一測(cè)試容器或在幾個(gè)分離的測(cè)試容器中，與多組可辨別的珠子相接觸，每組可辨別
的珠子帶有給定的、特異性針對(duì)紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子的抗體，抗體在一組珠子與另一
組珠子之間不同，所述紅細(xì)胞在與所述的多組珠子進(jìn)行接觸之前或之后被標(biāo)記， (ii)除去不與所述抗體結(jié)合的紅細(xì)胞，以及 (iii)鑒定與標(biāo)記的紅細(xì)胞結(jié)合的珠子組，從而鑒定到由所檢測(cè)的紅細(xì)胞攜帶的抗原； 禾P/或 b)通過(guò)下述步驟鑒定生物樣品中針對(duì)紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子的多種抗體，
(iv)在允許樣品中存在的抗體或活化的血清補(bǔ)體級(jí)份與紅細(xì)胞或紅細(xì)胞膜片段結(jié)合，并且不產(chǎn)生凝集的條件下，將所述樣品，在單一測(cè)試容器或在幾個(gè)分離的測(cè)試容器中，與多組可辨別的珠子相接觸，每組可辨別的珠子攜帶有表型已知的(1)紅細(xì)胞或(2)紅
4細(xì)胞膜片段，所述已知表型在一組珠子與另一組珠子之間不同， (v)除去不與所述紅細(xì)胞或所述紅細(xì)胞膜片段結(jié)合的抗體或活化的血清補(bǔ)體級(jí)份， (vi)對(duì)結(jié)合的抗體和/或結(jié)合的活化血清補(bǔ)體級(jí)份進(jìn)行標(biāo)記，以及 (vii)鑒定與標(biāo)記的抗體或標(biāo)記的活化血清補(bǔ)體級(jí)份結(jié)合的珠子組，從而鑒定存
在的、針對(duì)紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子的抗體。 本發(fā)明還提供了一組用于執(zhí)行這種方法的反應(yīng)物，包含可辨別的珠子組，每個(gè)珠子帶有至少一種可以被檢測(cè)的具體物理參數(shù)，并且珠子屬于至少兩種不同的組，一組帶有特異性針對(duì)紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子的捕獲抗體，另一組攜帶(1)紅細(xì)胞或(2)紅細(xì)胞膜片段。 發(fā)明詳述
定義 在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)"紅細(xì)胞(erythrocyte)"或"血紅細(xì)胞(redblood cell)"沒(méi)有差別，用于表示同樣的血細(xì)胞。 術(shù)語(yǔ)"多重"是指在單一容器中，使用單一信號(hào)讀取系統(tǒng)，對(duì)單一樣品的幾種不同抗原_抗體類型的反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行分析。 術(shù)語(yǔ)"單式"是指抗原_抗體類型的反應(yīng)在幾個(gè)獨(dú)立的容器中進(jìn)行分析。但是，優(yōu)選情況下，分析同時(shí)進(jìn)行，并優(yōu)選使用單一信號(hào)讀取系統(tǒng)。 表述"紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子"是指紅細(xì)胞攜帶的任何抗原性分子，包括由紅細(xì)胞和至少一種其它細(xì)胞群二者攜帶的抗原性分子。血型分子被排除在外。術(shù)語(yǔ)"血型抗原"是指下列系統(tǒng)的任何抗原具有抗原A、抗原B和同時(shí)表達(dá)的抗原A和B或抗原H的ABO系統(tǒng)，具有抗原D、E、e和C或c的Rhesus系統(tǒng)，具有抗原K或k的Kell系統(tǒng)，Duffy系統(tǒng)(Fya、 Fyb) ， Kidd系統(tǒng)(Jka、 Jkb)，或其它在實(shí)踐中不太經(jīng)常研究但也存在的系統(tǒng)，例如MNS、 Lewis系統(tǒng)等。 攜帶目標(biāo)抗原性分子的細(xì)胞群可以是血細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)，血小板包括在內(nèi)。
紅細(xì)胞和其它細(xì)胞群攜帶的目標(biāo)抗原性分子的例子，包括HLA系統(tǒng)的分子，特別是HLA B-27、 CD55和/或CD29 (Terpos等，MedicalScience Monit. 2008， 14276-280)。其它目標(biāo)抗原性分子的例子包括紅細(xì)胞衰老標(biāo)志物，例如磷酯酰絲氨酸(PS)。
包括了在生理或非生理?xiàng)l件下可以在紅細(xì)胞表面上、以及其它細(xì)胞類型或細(xì)胞群的表面上發(fā)現(xiàn)的紅細(xì)胞抗原。也包括了由紅細(xì)胞抗原引起的免疫反應(yīng)導(dǎo)致的出現(xiàn)在紅細(xì)胞表面上的抗原。在這種情況下，表述"紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子"包括由體內(nèi)致敏的紅細(xì)胞攜帶的血清補(bǔ)體級(jí)份的抗體或元件。未在生理?xiàng)l件下發(fā)現(xiàn)的抗原性分子包括例如個(gè)體吸收的化學(xué)制品或藥物，或其降解產(chǎn)物。 還包括了吸附在紅細(xì)胞上但源自于其它細(xì)胞群的抗原性分子。 術(shù)語(yǔ)"紅細(xì)胞攜帶的"是指膜表達(dá)、吸附或細(xì)胞間表達(dá)，通過(guò)處理或利用紅細(xì)胞的
生理過(guò)程(例如在紅細(xì)胞衰老過(guò)程中)使抗原性分子變得可進(jìn)入紅細(xì)胞。 表述"針對(duì)紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子的抗體"或"抗紅細(xì)胞抗體"是指任何與紅細(xì)
胞和至少一種其它細(xì)胞群攜帶的抗原特異性結(jié)合的抗體。術(shù)語(yǔ)"結(jié)合的抗體和/或結(jié)合的
血清補(bǔ)體級(jí)份的標(biāo)記"被理解為是指對(duì)可逆結(jié)合于或直接嵌入到紅細(xì)胞膜中的抗體或(可選地活化的)血清補(bǔ)體級(jí)份的標(biāo)記。 術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"是指任何具有紅細(xì)胞攜帶的多種抗原性分子的動(dòng)物。對(duì)于動(dòng)物來(lái)說(shuō)，可以提到的有例如狗，到目前為止已經(jīng)在其中鑒定到8種不同的血型，以及貓，有三種。當(dāng)然，術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"也指人類，包括胎兒階段的人類。 術(shù)語(yǔ)"生物樣品"是指無(wú)論是生理性還是病理性地可能含有紅細(xì)胞或抗紅細(xì)胞抗體的體液或組織活體樣品的任何級(jí)份。因此，對(duì)于生物樣品來(lái)說(shuō)，可以提到的是血液樣品，特別是全血樣品或血細(xì)胞顆粒樣品(或血袋)，或任何其它血液制劑，但是也包括含有血液的唾液、汗液、淚液、乳液或尿液。也可以使用血漿或血清樣品用于抗體篩選。在用于檢測(cè)抗原性分子的方式(a)中使用的樣品，可以與用于檢測(cè)抗體的樣品相同或不同。當(dāng)樣品相同時(shí)，方式(a)和方式(b)可以在同一個(gè)容器中同時(shí)進(jìn)行。生物樣品可以不經(jīng)過(guò)預(yù)處理。
術(shù)語(yǔ)"抗體"是指任何完整抗體或抗體的功能性片段，它含有或由至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)組成，使得所述抗體與抗原性化合物的至少一個(gè)抗原決定簇結(jié)合。抗體片段的例子，可以提到的是Fab、 Fab'和F(ab' ) 2片段，以及scFv鏈(單鏈可變片段)、dsFv鏈(雙鏈可變片段)等。這些功能性片段具體來(lái)說(shuō)可以通過(guò)遺傳工程獲得。 術(shù)語(yǔ)"捕獲抗體"是指與固相連接的抗體或抗體的一部分，它能夠通過(guò)親和性結(jié)合留住生物樣品中存在的抗原性化合物的至少一個(gè)抗原決定簇。 用作檢測(cè)工具的抗體可以是多克隆或單克隆抗體?？捎糜诒景l(fā)明的情況中的單克隆抗體或多克隆抗體的生產(chǎn)，是在常規(guī)技術(shù)下進(jìn)行的。 單克隆抗體可以按照Kmiler和Milstein描述的淋巴細(xì)胞融合和雜交瘤培養(yǎng)的常規(guī)方法(Nature, 256， p. 495-497 (1975))來(lái)獲得。其它用于制備單克隆抗體的方法也是已知的(Harlow等主編《抗體實(shí)驗(yàn)指南》，Antibodies A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory (1988))?？梢酝ㄟ^(guò)免疫哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔或甚至人類等)并通過(guò)使用產(chǎn)生雜交瘤的淋巴細(xì)胞融合技術(shù)(K6hler和Milstein， 1975，同上)，來(lái)制備單克隆抗體。 還存在著這種常規(guī)技術(shù)的可替代技術(shù)。例如，可以通過(guò)表達(dá)從雜交瘤克隆的核酸來(lái)生產(chǎn)單克隆抗體?？贵w也可以通過(guò)噬菌體展示技術(shù)，通過(guò)將抗體cDNAs導(dǎo)入載體、典型為絲狀噬菌體(例如用于大腸桿菌的fUSE5， Scott等，(Science, 249，卯.386-390 (1990)))來(lái)生產(chǎn)。后者構(gòu)成了文庫(kù)，并在其表面上具有scFv片段。構(gòu)建這些抗體文庫(kù)的方案描述在Marks等(1991) (J. Mol. Biol. ， 222， pp. 581—597， (1991))中。 多克隆抗體可以按照常用的方案，從用本性優(yōu)選為肽的抗原免疫的動(dòng)物的血清獲得。 —般來(lái)說(shuō)，多肽、特別是重組多肽，或寡肽，可以用作例如免疫原。根據(jù)常規(guī)的方案，按照Denoit等描述的步驟[PNAS USA， 79，卯.917-921 (1982)]，將兔用相當(dāng)于lmg的月太
免疫原進(jìn)行免疫。
珠子 珠子通常由對(duì)生物樣品的成分惰性的聚合物構(gòu)成；它們是固態(tài)的，在樣品中不溶解。使用的聚合物可以是聚酯、聚醚、聚烯烴、聚酰胺、多糖、聚氨基甲酸酯或纖維素。也可以使用粘合劑為顆粒提供完整性和結(jié)構(gòu)。 可以將功能基團(tuán)與這些聚合物摻和在一起，以便允許連接或結(jié)合生物學(xué)重要的大分子(蛋白、脂類、碳水化合物、核酸)。這些本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的功能基團(tuán)，可以 是酰胺(_NH2)或銨官能團(tuán)(-朋3+或-服3+)、醇官能團(tuán)(-0H)、羧酸官能團(tuán)(-COOH)或異氰酸 酯官能團(tuán)(-NCO)。最常用于將COOH官能團(tuán)導(dǎo)入聚烯烴的單體是丙烯酸或甲基丙烯酸。
反應(yīng)物與顆粒表面的連接可以通過(guò)靜電吸引、親和相互作用、疏水相互作用或共 價(jià)結(jié)合來(lái)進(jìn)行。共價(jià)結(jié)合是優(yōu)選的。 本發(fā)明中使用的珠子是形狀大約為球形的顆粒，其尺寸可以在0. 5 ii m到40 ii m之 間，ifc選在4 ii m至lj 9 ii m之間，更亍尤選在5 y m至lj 8 y m之間。 這里使用的珠子是"可辨別的"，因?yàn)樗鼈兙哂胁煌臉?biāo)志物，使得可以通過(guò)適合 的檢測(cè)器將它們彼此區(qū)分開(kāi)。因此，每組珠子具有不同的生理化學(xué)性質(zhì)(尺寸、密度、粒度、 粗糙度、吸光度、熒光、順磁性成分)，使得可以利用適合的檢測(cè)器或工具，例如流式細(xì)胞儀 將它們彼此區(qū)分開(kāi)。 對(duì)于用于將顆粒彼此區(qū)分開(kāi)的差異性參數(shù)來(lái)說(shuō)，具體來(lái)說(shuō)可以通過(guò)選擇不重疊的 尺寸范圍來(lái)使用顆粒的尺寸。 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可辨別的顆粒發(fā)射熒光信號(hào)。事實(shí)上，摻入了各種不 同熒光標(biāo)記物的珠子，可以通過(guò)它們的熒光光譜來(lái)區(qū)分。為此，珠子可以被一種或多種具 有各種適合濃度的染料(例如熒光、發(fā)光染料等)浸漬，或者用放射性同位素、酶等類型的
標(biāo)記物浸漬(Venkatasubbarao S.，"微陣列-現(xiàn)狀與展望，，，《Microarrays-Statusand
prospects》Trends in Biotechnology Dec 2004， 22 (12) :630_637 ;Morgan等，"細(xì)胞 測(cè)量珠陣列適用于生物學(xué)各領(lǐng)域的多元化分析平臺(tái)"，Cytometric bead array :a multiplexed assay platform with即plications in various areas of biology》，Clin. Immunol. (2004) 100:252-266)。光的散射或發(fā)射，或其組合，也可用于區(qū)分顆粒。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，可辨別的珠子發(fā)射發(fā)光或熒光信號(hào)。 使用的珠子可以是超順磁性、磁性或可磁化的。對(duì)于可用于本發(fā)明的珠子來(lái)說(shuō)，可 以具體提到的是在US 6，872，578中描述的珠子。根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，使用的珠子是 熒光和超順磁性的。這些生理化學(xué)性質(zhì)，可以使在與生物樣品反應(yīng)過(guò)程中將這些微粒捕獲 的級(jí)份與沒(méi)有結(jié)合的級(jí)份分離開(kāi)，成為可能。這種分離可以通過(guò)尤其是離心、過(guò)濾或磁化來(lái) 進(jìn)行。通過(guò)磁化進(jìn)行分離是優(yōu)選的，為此，可以使用含有順磁性、鐵磁性、亞鐵磁性和變磁性 成分的珠子。順磁性成分是優(yōu)選的，例如鐵、鈷、鎳或金屬氧化物例如Mn203、 Cr20或Fe304。 磁性成分的含量可以在2%到50% (以重量計(jì))之間，優(yōu)選在3%到25%之間。
可以通過(guò)任何適合的技術(shù)將抗體連接到珠子上。它們可以通過(guò)直接共價(jià)鍵，或者 非共價(jià)地、特別是通過(guò)被動(dòng)吸附或通過(guò)親和進(jìn)行連接。直接共價(jià)連接可以通過(guò)活化珠子表 面上存在的羧基，包括經(jīng)例如羥基琥珀酰亞胺或碳二亞胺鍵合來(lái)進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案 中，首先通過(guò)共價(jià)鍵將抗免疫球蛋白抗體連接到珠子上，然后將珠子與待連接的抗體相接 觸。 紅細(xì)胞或紅細(xì)胞膜片段可以通過(guò)聚L-賴氨酸利用非共價(jià)鍵合、或利用任何類型 的配體例如染料類型的聚陽(yáng)離子進(jìn)行連接。紅細(xì)胞或紅細(xì)胞膜片段也可以通過(guò)共價(jià)鍵合、 特別是使用高碘酸鈉連接到珠子上。 令人吃驚地注意到，血紅細(xì)胞或膜片段的連接，無(wú)論是共價(jià)的還是非共價(jià)的，都不 損害珠子通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)方法可以被辨別的性質(zhì)。
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珠子可以通過(guò)檢測(cè)器例如流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)量，例如在Luminex的專利申請(qǐng)WO 97/14028中描述的流式細(xì)胞儀。因此，將珠子的帶有反應(yīng)物(抗體或紅細(xì)胞或紅細(xì)胞膜) 的亞組暴露于生物樣品，每個(gè)亞組具有一種或多種分類參數(shù)，使得能夠?qū)⒁粋€(gè)亞組的珠子 與另一個(gè)亞組的珠子區(qū)分開(kāi)。然后將這樣的暴露于樣品的珠子經(jīng)過(guò)檢測(cè)區(qū)(例如流式細(xì)胞 儀)，在那里收集與分類參數(shù)相關(guān)的數(shù)據(jù)(例如熒光發(fā)射強(qiáng)度)，優(yōu)選也收集與反應(yīng)物和目 標(biāo)被分析物之間(即根據(jù)本發(fā)明的方法中的(a)為珠子與紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子之間， 或根據(jù)(b)為珠子與抗體之間)形成的復(fù)合物的存在或不存在相關(guān)的數(shù)據(jù)。
標(biāo)記 被可檢測(cè)地標(biāo)記的紅細(xì)胞可以通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的任何技術(shù)進(jìn)行 標(biāo)記。它們可以用例如熒光化合物進(jìn)行標(biāo)記，例如插入到這些細(xì)胞的膜中的熒光團(tuán)。它們 也可以使用本身用熒光標(biāo)記物官能化的配體進(jìn)行標(biāo)記，該配體能夠識(shí)別紅細(xì)胞表面上的結(jié) 構(gòu)。這些配體可以是例如抗體或動(dòng)物或植物的凝集素。這些類型的標(biāo)記可以在測(cè)試前進(jìn)行， 也可以不進(jìn)行。 在抗體鑒定的情況下，被標(biāo)記的是抗體，或者可選地是(可選地活化的)血清補(bǔ)體 級(jí)份。任何標(biāo)記技術(shù)都是可能的。標(biāo)記的類型也可以是混合的。 根據(jù)具體實(shí)施方案，將抗體與帶有熒光、發(fā)光或放射性標(biāo)記物的抗人類免疫球蛋 白抗體進(jìn)行接觸。 根據(jù)另一個(gè)具體的、可選地累積的實(shí)施方案，將活化血清級(jí)份與特異性識(shí)別活化 血清補(bǔ)體級(jí)份的抗體進(jìn)行接觸，所述抗體帶有例如熒光、發(fā)光或放射性標(biāo)記物。這樣的抗體 可以是單克隆的或多克隆的，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。
未結(jié)合反應(yīng)物的除去: 在進(jìn)行分析步驟之前，在與反應(yīng)物進(jìn)行接觸和溫育期間沒(méi)有被結(jié)合的反應(yīng)物，應(yīng) 該被除去。希望除去盡可能多的未結(jié)合的反應(yīng)物，以便降低背景噪音，從而獲得良好的測(cè)試 特異性，但是太劇烈的條件可能降低所述測(cè)試的靈敏度。因此，殘余存在的未結(jié)合反應(yīng)物一 般是可忍受的。用于在方法的靈敏度與特異性之間獲得可接受的折衷的條件，可以由本技 術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員通過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)容易地確定。 除去未結(jié)合的反應(yīng)物可以利用本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的任何技術(shù)來(lái)進(jìn)行，例
如利用重復(fù)的離心步驟進(jìn)行洗滌，或利用珠子的超順磁性性質(zhì)和使用磁體。
優(yōu)選實(shí)施方案 正如上面定義的，本發(fā)明的方法使得鑒定抗原、或者也鑒定結(jié)合的抗體或活化血 清補(bǔ)體級(jí)份，成為可能。也可以使用幾種類型的鑒定的組合。因此，抗原的鑒定和抗體的鑒 定，可以同時(shí)或分別進(jìn)行?？贵w的鑒定可以通過(guò)揭示抗體和活化血清補(bǔ)體級(jí)份二者來(lái)進(jìn)行。
容器可以是任何固體容器，例如試管、微孔板的孔或任何允許在自動(dòng)化系統(tǒng)中進(jìn) 行反應(yīng)的容器。離心容器不是必需的。 反應(yīng)物和目標(biāo)被分析物的混合，在允許紅細(xì)胞攜帶的抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié) 合、并且不凝集的條件(特別是pH、溫度、離子強(qiáng)度等)下進(jìn)行。具體來(lái)說(shuō)，基本上不存在凝 集，使得使用流式細(xì)胞儀成為可能。為了避免任何凝集反應(yīng)，調(diào)整珠子的量和尺寸以及樣品 的濃度，是有利的。凝集反應(yīng)滿足數(shù)學(xué)定律，具體來(lái)說(shuō)它們已經(jīng)在H. E. Hart， Bulletin of mathematical biology,vol 42，17—36，K. C. Chak，Bulletin ofmathematical biology,vol42,37-56禾P C. DeLisi， Journal of TheoreticalBiology, 1974， vol 45， 555-575頁(yè)中描述
過(guò)了。這些定律涉及幾個(gè)參數(shù)，例如具體為反應(yīng)物的尺寸以及它們的數(shù)量比率。因此，本技
術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員可以通過(guò)使用與他們所用的反應(yīng)物有關(guān)的數(shù)學(xué)定律來(lái)選擇反應(yīng)條件，使
得基本上不發(fā)生凝集。例如，當(dāng)使用紅細(xì)胞和與紅細(xì)胞的尺寸相似、即大約7 m的珠子時(shí)，
本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將選擇紅細(xì)胞數(shù)量與珠子數(shù)量的比率在30到150之間。 有利情況下，優(yōu)選提供血紅蛋白的化學(xué)或酶法降解步驟，例如溶血作用，該步驟優(yōu)
選在連接之后，并在抗原或抗體鑒定之前。 溶血可以以各種不同方式進(jìn)行。例如，可以將混合物在低克分子滲透壓濃度 介質(zhì)中溫育。術(shù)語(yǔ)"低克分子滲透壓濃度介質(zhì)" 一般是指克分子滲透壓濃度小于或等于 100mosmol/L的介質(zhì)。對(duì)于適合的低克分子滲透壓濃度介質(zhì)來(lái)說(shuō)，可以提到的是濃度為 40mM或以下的氯化銨溶液，或蒸餾水。溶血也可以通過(guò)超聲來(lái)進(jìn)行。
應(yīng)用 本方法使得以多重格式進(jìn)行紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子的鑒定，成為可能。 此外，方法使得例如通過(guò)分析熒光信號(hào)來(lái)定量確定樣品中位于紅細(xì)胞表面上的抗
原的比例，成為可能。 本發(fā)明的方法也使對(duì)抗體進(jìn)行量化成為可能。因此，獲得的結(jié)果可以是數(shù)字形式 的，可用于利用電子數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)來(lái)幫助解釋。 有利的是，方法使得在僅僅幾分鐘內(nèi)獲得完整的、可靠的結(jié)果成為可能。更具體來(lái) 說(shuō)，有可能在少于1小時(shí)、或甚至少于30分鐘內(nèi)給出完整的結(jié)果。 本發(fā)明的方法還使顯著減少所取的測(cè)試樣品體積成為可能。目前，反應(yīng)一般對(duì)于 每次測(cè)試來(lái)說(shuō)使用25 1測(cè)試樣品來(lái)進(jìn)行。為了執(zhí)行本發(fā)明的方法，例如僅僅50到100 1 就已足夠。 下面的圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明，但不對(duì)其范圍構(gòu)成限制。
圖例說(shuō)明

圖1是流程圖，顯示了抗體在1^0111^乂6珠子上的直接固定化。 圖2是流程圖，顯示了通過(guò)親和將抗體固定化在1^1^1^乂@珠子上。 圖3是流程圖，顯示了用熒光膜內(nèi)化合物標(biāo)記各種不同表型的血紅細(xì)胞。圖4是流程圖，顯示了利用聚L-賴氨酸將血紅細(xì)胞固定化在Luminex 珠子上的步驟。 圖5A到5D顯示了血紅細(xì)胞的多重表型定型。 圖6是流程圖，顯示了來(lái)自"直接Coombs陽(yáng)性"患者的血紅細(xì)胞的同時(shí)進(jìn)行的鑒
定和多重表型定型。 實(shí)施例 實(shí)施例1 :抗原鑒定 本分析的目的是利用特異的單克隆抗體，鑒定來(lái)自供體或患者的血紅細(xì)胞表面上 存在的抗原。使用熒光珠子來(lái)固定化抗血紅細(xì)胞抗體。因此抗原特異性不同的抗體可以結(jié) 合到具有不同顏色的珠子的各種不同區(qū)域。 對(duì)于紅血球來(lái)說(shuō)，它們用與Bio-Rad公司以名稱"Bioplex 200"銷售的裝置的報(bào) 告激光波長(zhǎng)相容的熒光化合物進(jìn)行標(biāo)記。
在標(biāo)記后，將血紅細(xì)胞與致敏的珠子溫育。因此有可能檢測(cè)到與珠子連接的血紅 細(xì)胞，從而確定它們的抗原特異性。
1. 1-材料與反應(yīng)物
珠子 使用的珠子由L咖inex制造(X咖inex Corp. ， Austin Texas,UnitedStates)。它 們是直徑為8ym的超順磁性珠子，由聚苯乙烯和甲基丙烯酸(C00H官能團(tuán))構(gòu)成。
在本實(shí)施例中，使用了具有各種不同的珠子區(qū)域19、21、32、34(內(nèi)標(biāo)珠子(ISB))、 71禾口98(空白珠子(BB))的熒光超順磁性珠子。 將具有珠子區(qū)域34的珠子(ISB)用羅丹明衍生物官能化，用作內(nèi)部熒光對(duì)照。這 些珠子將產(chǎn)生5000到15000RFI之間的熒光值。 將區(qū)域98的BB珠子用牛血清白蛋白飽和。這些珠子既不能結(jié)合抗原，也不能結(jié) 合抗體，因此被用于驗(yàn)證不存在非特異性結(jié)合。這些珠子應(yīng)該產(chǎn)生低于1000RFI的熒光值。
-抗人類免疫球蛋白單克隆IgG抗體，克隆125A15(Bio-Rad)。
-抗人類IgM(mu)多克隆抗體(Bio-Rad)。-抗D IgG(克隆H2D5D2F5)，抗Fya IgG(克隆5T72A13F5A93)和抗S IgM(克隆 MS94)單克隆抗體(Bio-Rad， Millipore)。
-PKH26細(xì)胞標(biāo)記試劑盒(Sigma)。-由Bio-Rad公司以名稱"ScanLiss"編號(hào)86442禾口"Stabiliss"編號(hào)86550銷售 的稀釋介質(zhì)。-以名稱"ScanGel Coombs"編號(hào)86432銷售的用于非典型抗體篩選的凝膠卡 (Bio-Rad)。-以名稱"ScanGelRhK"編號(hào)86428禾口"ScanGel Neutral"編號(hào)86430銷售的凝膠 卡(Bio-Rad)。-以名稱"ScanPanel"編號(hào)86593和"ScanCell"編號(hào)86595銷售的，用于通過(guò)凝 膠卡技術(shù)進(jìn)行非典型抗體篩選的表型確定的血紅細(xì)胞(Bio-Rad)。-保存在SAG-MAN介質(zhì)中的濃縮的表型確定的血紅細(xì)胞顆粒(EFS Nord de France)。-源自于患者樣品的直接Coombs陽(yáng)性和/或陰性的血紅細(xì)胞。
-包被液或緩沖液(10mM磷酸鈉，150mM NaCl，O. 1% (v/v)proclin)。
-牛血清白蛋白(BSA) (Mi 11 ipore)。-PBS緩沖液，pH 7. 4(7mM磷酸鈉，2. 7mM KC1， 136mMNaCl)。 1.2-流程 1. 2. 1.用血型抗體致敏珠子 抗體在珠子表面的固定化可以根據(jù)兩種不同的原理來(lái)進(jìn)行。在第一種情況下，抗 體通過(guò)共價(jià)鍵直接固定化在珠子上(圖1)。第二種方法包括通過(guò)親和非共價(jià)地進(jìn)行抗血紅 細(xì)胞抗體的固定化。在這種情況下，連接利用了在第一步中通過(guò)共價(jià)鍵與珠子連接的抗免 疫球蛋白抗體來(lái)進(jìn)行(圖2)。在顯示的實(shí)施例中選擇了這種方法。 具有珠子區(qū)域19、21和32的珠子被用于抗人類免疫球蛋白抗體的共價(jià)固定化。具 有珠子區(qū)域71的熒光珠子被用于抗人類IgM抗體的共價(jià)固定化。出現(xiàn)在珠子表面上的羧基基團(tuán)根據(jù)包括羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺的技術(shù)進(jìn)行活化。因此，蛋白可以通過(guò)它們的 胺基被固定化。 這樣制備的珠子在+4°CT，以3mg/ml的濃度儲(chǔ)存在含有10% (w/v)BSA、0. 5% (v/v)Tween 20和0. 09% (w/v)疊氮化鈉的pH7. 4的PBS中。 帶有固定化的抗人類免疫球蛋白的珠子可以用抗D IgG或抗FyalgG血型抗體致 敏。事實(shí)上，抗免疫球蛋白抗體允許IgGs通過(guò)它們的Fc片段結(jié)合。因此，血型抗體使用該 原理非共價(jià)固定化在珠子上。每個(gè)珠子區(qū)域被具有不同特異性的抗體致敏。選擇的抗免疫
球蛋白對(duì)人類免疫球蛋白具有高度親和性，從而允許這種結(jié)合隨時(shí)間穩(wěn)定。 未純化的抗D和抗Fya抗體分別以30和10 y g/ml的終濃度與用80 y g/ml抗Fc
官能化的珠子一起使用。 使用血型抗體致敏在pH 7. 4的PBS中，在37t:下攪拌進(jìn)行1小時(shí)。 致敏后，將珠子洗滌幾次，然后+41:儲(chǔ)存在pH7. 4的PBS中。 帶有固定化的抗mu的珠子可以用抗S IgM致敏。事實(shí)上，抗mu允許結(jié)合IgMs。該
抗mu多克隆抗血清的親和性足以確保結(jié)合隨時(shí)間穩(wěn)定。將未純化的抗S固定化在用40 ii g/
ml抗mu官能化的珠子上。致敏在pH 7. 4的PBS中，在37。C下攪拌進(jìn)行1小時(shí)。致敏后，
將珠子洗滌幾次，然后+4°〇儲(chǔ)存在pH7. 4的PBS中。在與血紅細(xì)胞溫育之前(自身測(cè)試)，將用血型抗體致敏的珠子與對(duì)照的區(qū)域34 珠子(ISB)和對(duì)照的區(qū)域98珠子(BB)進(jìn)行混合。
1. 2. 2.血紅細(xì)胞的標(biāo)記 血紅細(xì)胞用熒光化合物的標(biāo)記可以使用各種原理來(lái)進(jìn)行。在本實(shí)施例中，血紅細(xì) 胞使用PKH26進(jìn)行標(biāo)記，PKH26是插入到血紅細(xì)胞膜中的熒光團(tuán)。因此可以按照相同的步 驟標(biāo)記各種不同表型的血紅細(xì)胞(圖3)。 PKH26是由Sigma公司銷售的熒光探針。該探針在551nm處具有最大激發(fā)，在 567nm處具有最大發(fā)射。 試劑盒包含熒光探針，該探針具有長(zhǎng)的脂族鏈，使其可以插入到細(xì)胞膜的脂質(zhì)層 中，試劑盒還包含不含鹽、緩沖液或有機(jī)溶劑的等滲水性稀釋劑。該稀釋劑能夠?qū)⒓?xì)胞存活 性、標(biāo)記物溶解性和標(biāo)記效率維持在高的水平。 用PKH26標(biāo)記血紅細(xì)胞使用制造商推薦的步驟來(lái)進(jìn)行。將這樣標(biāo)記的血紅細(xì)胞在 Stabiliss緩沖液中稀釋，在+41:下儲(chǔ)存在暗處。 通過(guò)按照凝膠技術(shù)進(jìn)行表型定型分析，驗(yàn)證了標(biāo)記的血紅細(xì)胞隨時(shí)間的質(zhì)量、存 活性和穩(wěn)定性。將標(biāo)記的血紅細(xì)胞的抗原完整性與未標(biāo)記的血紅細(xì)胞進(jìn)行比較。通過(guò)使用 來(lái)自Bio-Rad的"Bioplex 200"裝置進(jìn)行熒光測(cè)定，研究了熒光標(biāo)記本身的質(zhì)量和穩(wěn)定性。
1. 2. 3.抗體-珠子與血紅細(xì)胞溫育 為了證實(shí)根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)行血型分型的可行性并驗(yàn)證其特異性，發(fā)明人以單 一的方式進(jìn)行了反應(yīng)。在這種情況下，將用目標(biāo)抗體官能化的珠子與各種不同表型的血紅 細(xì)胞單獨(dú)進(jìn)行溫育。 在多重反應(yīng)的情況下，將不同血液樣品單獨(dú)與具有不同的珠子區(qū)域并用不同特異 性抗體致敏的珠子進(jìn)行接觸。這種類型的實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證在同樣的測(cè)試樣品中檢測(cè)幾種抗原 特異性的可能性。
將致敏的珠子與血紅細(xì)胞混合，以獲得大約50到150的血紅細(xì)胞/珠子比率。將 混合物在37t:下攪拌溫育15分鐘。 溫育后，將珠子-血紅細(xì)胞復(fù)合物用蒸餾水洗滌幾次。 1. 2. 4.使用來(lái)自Bio-Rad公司的"Bioplex 200"自動(dòng)裝置通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè) 在最后一次洗滌后以及測(cè)量之前，將復(fù)合物用185 iU "包被液體"介質(zhì)稀釋。對(duì) 于每個(gè)測(cè)試，將25iU懸浮液自動(dòng)注射到裝置中。測(cè)量通過(guò)每種區(qū)域捕獲250個(gè)珠子來(lái)進(jìn) 行。 對(duì)于每個(gè)分型/表型定型系列來(lái)說(shuō)，進(jìn)行了系統(tǒng)對(duì)照，以證實(shí)所研究的反應(yīng)的特 異性。 1. 3.單式/多重表型定型/分型實(shí)施例 本系列測(cè)試的目的是證實(shí)在單一和/或多重方式中對(duì)血紅細(xì)胞進(jìn)行表型定型/分 型的可行性。選擇D、 Fya和S抗原作為模型。用抗人類免疫球蛋白或抗mu鏈抗體致敏的 珠子被用于固定化抗D、抗Fya和抗S抗體。
1. 3. 1. RH D陽(yáng)性血紅細(xì)胞的單一表型定型 將用抗D抗體致敏的珠子與用PKH26標(biāo)記的Rh D陽(yáng)性和Rh D陰性血紅細(xì)胞進(jìn)行 溫育，使用的血紅細(xì)胞數(shù)/珠子數(shù)比率為150。 使用了兩種RH D陽(yáng)性血紅細(xì)胞和兩種RH D陰性血紅細(xì)胞。將每種樣品雙份注射 到裝置中。 RH D陽(yáng)性血紅細(xì)胞產(chǎn)生大約21000到25000RFI的強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)，而RH D陰性血紅 細(xì)胞顯示出40到400RFI之間的陰性信號(hào)。 ISB 34對(duì)照珠子給出大約6500RFI的信號(hào)，BB 98對(duì)照珠子給出低于1000RFI的 信號(hào)，證實(shí)了結(jié)果的有效性。進(jìn)行的各種不同的陰性對(duì)照顯示出15到400RFI之間的信號(hào)， 證實(shí)了反應(yīng)的特異性。RH D陽(yáng)性和RH D陰性血紅細(xì)胞事實(shí)上不與沒(méi)有抗D抗體的珠子結(jié)合。 這些結(jié)果證實(shí)了非常清楚地辨別RH D陽(yáng)性和RH D陰性血紅細(xì)胞、從而鑒定血紅 細(xì)胞表面上的D抗原的可能性。 Fya和S血紅細(xì)胞的單一表型定型可以根據(jù)同樣的原理，使用同種型G特異性或同 種型M特異性的抗體來(lái)進(jìn)行。 1. 3. 2.D、Fya和S血紅細(xì)胞的多重表型定型
多重表型定型的原理概述在圖5A到5D中。 在這種情況下，將用抗D抗體致敏的區(qū)域19珠子，與用抗Fya抗體致敏的區(qū)域21 珠子，也與用抗S抗體致敏的區(qū)域71珠子進(jìn)行混合。 將該珠子的混合物與具有不同的D、 Fya和S表型的血紅細(xì)胞溫育D+Fya+S+/ D+Fya-S-/D-Fya+S-/D-Fya-S-/D-Fya-S+/D-Fya+S+/D+Fya-S+/D+Fya+S-。使用的血紅細(xì)胞 數(shù)/珠子數(shù)比率是50。 當(dāng)用給定抗體致敏的珠子與具有相應(yīng)抗原特異性的血紅細(xì)胞結(jié)合時(shí)，獲得了 13000到29000RFI之間的陽(yáng)性信號(hào)。 在測(cè)量到的熒光信號(hào)與用于執(zhí)行測(cè)試的血紅細(xì)胞的表型之間，觀察到了極好的關(guān)
12聯(lián)性。 當(dāng)用抗體致敏的珠子與不帶有相應(yīng)抗原的血紅細(xì)胞進(jìn)行接觸時(shí)，獲得了低于 1000RFI的信號(hào)。 此外，用沒(méi)有用抗體致敏的珠子進(jìn)行的對(duì)照，產(chǎn)生了與所用的血紅細(xì)胞無(wú)關(guān)的陰 性信號(hào)。 這些結(jié)果證明了測(cè)量到的信號(hào)是特異性的珠子-血紅細(xì)胞的結(jié)合只在包含了抗 原-抗體對(duì)的情況下才發(fā)生。 使用對(duì)照珠子ISB 34(11000RFI)和BB 98 (低于1000RFI)獲得的結(jié)果證實(shí)了分 析的有效性。 測(cè)試內(nèi)變異系數(shù)在1%到10%之間，證明了令人滿意的測(cè)試內(nèi)可重復(fù)性。 這些結(jié)果證明了根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)行血紅細(xì)胞的三參數(shù)多重表型定型的可行性。 1. 3. 3.直接Coombs陽(yáng)性(CD+)血紅細(xì)胞的多重表型定型 根據(jù)圖6中描述的原理，使用微珠的多重方法可以同時(shí)鑒定CD+的本質(zhì)并對(duì)血紅 細(xì)胞進(jìn)行表型定型。 將用抗Fc抗體致敏的區(qū)域32珠子與分別用抗D、抗Fya和抗S抗體致敏的區(qū)域 19、21和71珠子混合。在體內(nèi)用抗體致敏的CD+血紅細(xì)胞，可以與區(qū)域32珠子攜帶的抗人 類免疫球蛋白結(jié)合，從而可以鑒定CD+的特征。此外，根據(jù)血紅細(xì)胞膜上存在的特異性，這 些血紅細(xì)胞也能結(jié)合攜帶有特異性針對(duì)D、 Fya和S抗原的抗體的區(qū)域19、21和71珠子。
使用了大約40的血紅細(xì)胞數(shù)/珠子數(shù)比率來(lái)驗(yàn)證本方法。 ISB 34和BB 98對(duì)照珠子產(chǎn)生了預(yù)期的信號(hào)，即分別為大約13000RFI和低于 1000RFI ，證實(shí)了結(jié)果的有效性。 使用用抗人類免疫球蛋白抗體致敏的區(qū)域32珠子，兩種CD+血紅細(xì)胞產(chǎn)生了高于 30000RFI的陽(yáng)性信號(hào)。使用該同樣的珠子區(qū)域，兩種CD陰性血紅細(xì)胞就它們本身而言產(chǎn)生 了低于500RFI的陰性信號(hào)。這些結(jié)果證明了使用事先結(jié)合到給定珠子區(qū)域的珠子上的抗 球蛋白，利用其特異性結(jié)合鑒定CD+血紅細(xì)胞的可能性。 此外，結(jié)果還證實(shí)了 00+血紅細(xì)胞的紅細(xì)胞抗原的多重表型定型，可以與〇0+ 本性的鑒定同時(shí)進(jìn)行。事實(shí)上，一種CD+血紅細(xì)胞的表型被定型為D+Fya-S-，另一種為 D+Fya+S+。 按照常規(guī)技術(shù)，使用IgM類型的抗S抗體，驗(yàn)證了這兩個(gè)樣品的S表型。獲得的結(jié) 果與根據(jù)新技術(shù)獲得的結(jié)果完全匹配。 另一方面，對(duì)于抗Fya表型來(lái)說(shuō)，不能執(zhí)行該同樣的分析。事實(shí)上，沒(méi)有IgM類型 的用于血紅細(xì)胞表型定型的反應(yīng)物。 但是，對(duì)于被分析的CD+血紅細(xì)胞的Fya表型，觀察到了差異，這證實(shí)了結(jié)果的有 效性，并使排除非特異性結(jié)合的現(xiàn)象成為可能。 對(duì)于大多數(shù)樣品來(lái)說(shuō)，變異系數(shù)在1%到5%之間，顯示出令人滿意的測(cè)試內(nèi)可重 復(fù)性。 實(shí)施例2 :檢測(cè)磷酯酰絲氨酸， 一種紅細(xì)胞衰老的標(biāo)志物 紅細(xì)胞衰老的標(biāo)記物的證明，不僅在研究輸血中的血紅細(xì)胞群中(Cardo L J等，
13Transfus Apher Sci， 2008Apr ;38 (2) : 141-7)，而且在涉及某些血液病理學(xué)的現(xiàn)象例如地 中海盆血的研究中(Basu S等，BrJHaematol，2008Apr ;141(1) :92-9)，都具有價(jià)值。
具體來(lái)說(shuō)，紅細(xì)胞的衰老由紅細(xì)胞表面上被稱為磷酯酰絲氨酸(PS)的結(jié)構(gòu)的出 現(xiàn)所反映。 本發(fā)明的測(cè)試可以容易地進(jìn)行，以檢測(cè)血紅細(xì)胞表面上的這種分子。 為此，使用熒光珠子，通過(guò)聚L-賴氨酸(PLL)來(lái)固定化待測(cè)試的血紅細(xì)胞。 然后將這些珠子在溫育階段中與抗磷酯酰絲氨酸抗體進(jìn)行接觸。 在洗滌步驟后，通過(guò)將珠子-血紅細(xì)胞復(fù)合物與用藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗
Fc(IgG)第二抗體進(jìn)行溫育，來(lái)檢測(cè)抗磷酯酰絲氨酸與血紅細(xì)胞的結(jié)合。 進(jìn)行最后的洗滌步驟，以除去未結(jié)合的抗Fc(IgG)-PE。 然后使用BioPlex200裝置讀取珠子_血紅細(xì)胞復(fù)合物。 使用了從血袋獲得的不同年齡的血紅細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)范圍。
權(quán)利要求
用于鑒定個(gè)體的紅細(xì)胞攜帶的多種抗原性分子，和/或用于鑒定生物樣品中多個(gè)針對(duì)紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子的抗體的體外方法，所述由紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子由紅細(xì)胞和至少一種其它細(xì)胞群二者都攜帶的、血型分子以外的抗原性分子組成，所述方法包括a)通過(guò)下列步驟鑒定個(gè)體的紅細(xì)胞攜帶的多種抗原性分子(i)在允許紅細(xì)胞與抗體結(jié)合并且不產(chǎn)生凝集的條件下，將所述含有紅細(xì)胞的樣品，在單一測(cè)試容器或在幾個(gè)分離的測(cè)試容器中，與多組可辨別的珠子相接觸，每組可辨別的珠子帶有給定的、特異性針對(duì)紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子的抗體，所述抗體在一組珠子與另一組珠子之間不同，所述紅細(xì)胞在與所述的多組珠子進(jìn)行接觸之前或之后被標(biāo)記，(ii)除去不與所述抗體結(jié)合的紅細(xì)胞，以及(iii)鑒定與標(biāo)記的紅細(xì)胞結(jié)合的珠子組，從而鑒定由所檢測(cè)的紅細(xì)胞攜帶的抗原；和/或b)通過(guò)下述步驟鑒定生物樣品中針對(duì)紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子的多種抗體，(iv)在允許樣品中存在的抗體或活化的血清補(bǔ)體級(jí)份與紅細(xì)胞或紅細(xì)胞膜片段結(jié)合，并且不產(chǎn)生凝集的條件下，將所述樣品，在單一測(cè)試容器或在幾個(gè)分離的測(cè)試容器中，與多組可辨別的珠子相接觸，每組可辨別的珠子攜帶有表型已知的(1)紅細(xì)胞或(2)紅細(xì)胞膜片段，所述已知表型在一組珠子與另一組珠子之間不同，(v)除去不與所述紅細(xì)胞或所述紅細(xì)胞膜片段結(jié)合的抗體或活化的血清補(bǔ)體級(jí)份，(vi)對(duì)結(jié)合的抗體和/或結(jié)合的活化血清補(bǔ)體級(jí)份進(jìn)行標(biāo)記，以及(vii)鑒定與標(biāo)記的抗體或標(biāo)記的活化血清補(bǔ)體級(jí)份結(jié)合的珠子組，從而鑒定存在的、針對(duì)紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子的抗體。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中按照(a)鑒定抗原和按照(b)鑒定抗體同時(shí)并在同一個(gè)容 器中進(jìn)行。
3. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中混合物的分析通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)進(jìn)行。
4. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中還包括血紅蛋白的化學(xué)或酶法降解的步驟，例如 溶血。
5. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中可辨別的珠子是超順磁性、或磁性、或可磁化的珠子。
6. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中可辨別的珠子發(fā)射發(fā)光或熒光信號(hào)。
7. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中可檢測(cè)地標(biāo)記的紅細(xì)胞用熒光化合物標(biāo)記。
8. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中抗體(根據(jù)b)是通過(guò)與帶有熒光、發(fā)光或放射性 標(biāo)記物的抗人類球蛋白抗體相接觸來(lái)標(biāo)記的。
9. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中活化血清補(bǔ)體級(jí)份是通過(guò)與帶有熒光、發(fā)光或放 射性標(biāo)記物的抗血清補(bǔ)體級(jí)份抗體相接觸來(lái)標(biāo)記的。
10. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中生物樣品選自全血、血漿、血清、血細(xì)胞顆?；蛉?何其它血液制備物。
11. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中生物樣品源自于具有體內(nèi)被抗體致敏、或包被有 血清補(bǔ)體級(jí)份的紅細(xì)胞的個(gè)體。
12. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，還包括對(duì)鑒定到的抗體進(jìn)行定量。
13. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中抗原性分子是HLA系統(tǒng)的分子、被個(gè)體吸收的化 學(xué)產(chǎn)品或藥物，或其降解產(chǎn)物。
14. 用于執(zhí)行前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的檢測(cè)方法的反應(yīng)物組，包含可辨別的珠子組，每個(gè) 珠子帶有至少一種可以被檢測(cè)的具體物理參數(shù)，并且每個(gè)珠子屬于至少兩種不同的組，一 組帶有特異性針對(duì)紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子的捕獲抗體，另一組攜帶(1)紅細(xì)胞或(2)紅 細(xì)胞膜片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)紅細(xì)胞攜帶的多種抗原性分子和/或多種抗紅細(xì)胞抗體的方法，所述由紅細(xì)胞攜帶的抗原性分子包括不僅由紅細(xì)胞攜帶、而且由至少一種其它細(xì)胞群攜帶的血型抗原分子之外的抗原性分子，所述方法包括將樣品與可辨別的珠子進(jìn)行接觸，在可辨別珠子上連接有a)特異性針對(duì)所述抗原的抗體，或b)紅細(xì)胞或紅細(xì)胞膜片段。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101715558SQ200880019293
公開(kāi)日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2008年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日
發(fā)明者伊夫·瑞森, 埃利亞內(nèi)·里瓦蘭, 安帕魯·圣胡安, 弗雷德里克·比菲埃 申請(qǐng)人:博瑞巴斯德公司