專利名稱：一種微量,快速和精確檢測人紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用免疫血液學(xué)原理快速、準(zhǔn)確地檢測人紅細(xì)胞血型抗原和血清中存在的抗體的方法，具體地說是一種微量，快速和精確檢測人紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的方法。
背景技術(shù)：
在1901年Kaul Landsteiner證明，當(dāng)人群之間相互輸血時，由于紅細(xì)胞的血型不同可以引起被輸血者有發(fā)燒，黃疸，他因此把血型分成A，B，和0型，而且在實際應(yīng)用中也說明在血型之間相符的人群間輸血是不會有輸血反應(yīng)的。1902年A. Decastrello和A. Sturli 發(fā)現(xiàn)了 AB血型。1940年由Levine和Stetson發(fā)現(xiàn)了 Rh血型，這是根據(jù)紅細(xì)胞膜是否存在這種抗原而把血型分為Rh陽性(也稱為D+)為含有這種抗原，Rh陰性(也稱為D-)為不含有這種抗原。現(xiàn)在已經(jīng)清楚，98%以上的中國人為Rh陽性，而白種人僅有70%為Rh陽性。檢測紅細(xì)胞膜表面的抗原和血清中的抗體來自于血液免疫學(xué)的發(fā)展，隨著科學(xué)家可以分離這種抗體和抗原，并利用這些抗體和抗原去檢測相應(yīng)紅細(xì)胞膜表面的抗原和血清中的抗體，從而現(xiàn)已明確在A型紅細(xì)胞抗原的人都有B型抗體在血漿里，B型紅細(xì)胞抗原的人都有A型抗體在血漿里，而0型紅細(xì)胞抗原的人都有A，B型抗體在血漿里，AB型紅細(xì)胞抗原的人都無A，B，抗體存在血漿里。在1950 年 Watkins and Morgan (Nature 180 1038-1040，1957)首先分析了紅細(xì)胞膜的抗原結(jié)構(gòu)并純化了許多抗原，發(fā)現(xiàn)了紅細(xì)胞膜表面含有更多的抗原系統(tǒng)，同時，利用這些已知的抗原也檢測出在血漿中存在著更多的抗體，而在1980年以后單克隆抗體的發(fā)明更進(jìn)一步的加速了紅細(xì)胞抗原的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展。許多紅細(xì)胞抗原的單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)，促進(jìn)了更多抗原的發(fā)現(xiàn)也加速了這些抗原和抗體在臨床上的應(yīng)用。市場上可利用的單克隆或多克隆抗體大都用來測定紅細(xì)胞的表面抗原，像A，B和 D，而常用的方法就是紅細(xì)胞凝聚實驗。即紅細(xì)胞抗原和相應(yīng)，已知的抗體結(jié)合后會產(chǎn)生紅細(xì)胞聚集反應(yīng)，這種方法稱為正向紅細(xì)胞配型，而采用相應(yīng)，已知的紅細(xì)胞抗原和未知的抗體結(jié)合后產(chǎn)生紅細(xì)胞聚集反應(yīng)，這種方法稱為反向紅細(xì)胞配型，為了更精確的配型，臨床上都同時采用這二種方法去檢測紅細(xì)胞血型。在常規(guī)的紅細(xì)胞配型實驗中，待檢測紅細(xì)胞和已知抗體，或待檢測血清和已知紅細(xì)胞抗原，分別在玻璃片，試管，凝膠，檢查板混合，通常用于對A，B, 0紅細(xì)胞抗原的測定， 而對D型抗原則采用oomb’ s方法，即在待檢測紅細(xì)胞和抗D抗原抗體混合以后，還需加抗人免疫球蛋白抗體，然后才會出現(xiàn)凝結(jié)反應(yīng)，這也稱為間接紅細(xì)胞凝結(jié)實驗。在1980年后興起的單克隆抗體技術(shù)，加速了這些抗原的鑒定和發(fā)展，由于這些抗體的精確反應(yīng)以及來源穩(wěn)定，現(xiàn)在已經(jīng)替代了大部分在臨床上應(yīng)用的多克隆抗體，但其價格上也比多克隆抗體為貴。應(yīng)用玻璃片的方法簡單，快速，但消耗試劑多而且不是很精確； 消耗時間，效率低下；試管方法精確，但費時，費試劑，效率低，結(jié)果不能保存；凝膠方法精確，結(jié)果能保存，但費時，費試劑，效率低；檢查板方法結(jié)果能保存，快速，可以方便自動化操作，效率高但費試劑，結(jié)果不能保存，操作麻煩，無直觀性而且有時會出現(xiàn)誤差，而需人工復(fù)查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的及所要解決的技術(shù)問題是提供一種微量，快速和精確檢測人紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的方法。該方法指明了檢測人紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的保存反應(yīng)結(jié)果及供以后復(fù)查的途徑，并指出了在提高和保證了血液制品的安全應(yīng)用的前提下制備成各種各樣的紅細(xì)胞配型微量板提供給臨床應(yīng)用的途徑。為此，本發(fā)明解決所述問題的技術(shù)方案是一種微量，快速和精確檢測人體紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的方法，包括如下步驟選微型配型板步驟，其板型為30，60，72或其它孔微型配型板，用以測定紅細(xì)胞抗原和血清抗體；遴選抗體步驟，在所述微型版中的抗紅細(xì)胞抗原抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，可以是液狀抗體，也可以是干燥粉狀抗體；遴選紅細(xì)胞步驟，在所述微型版中的紅細(xì)胞可以是新鮮紅細(xì)胞，也可以是冰凍紅細(xì)胞，也可以是冷凍干燥紅細(xì)胞，也可以是紅細(xì)胞膜；分別進(jìn)行制備正向紅細(xì)胞凝結(jié)及反向紅細(xì)胞配型檢測盒的步驟，其中，所述制備正向紅細(xì)胞凝結(jié)檢測盒的步驟包括用于檢測每個人血清內(nèi)的、包括A，B，0 ;Rh等抗原系統(tǒng)、 P，麗S，Kel 1，Luthern, Kel 1，Duffy和Kidd等紅細(xì)胞系統(tǒng)，以及任何其它有關(guān)的紅細(xì)胞系統(tǒng)的檢測方法，即在所述微型版中的每個孔內(nèi)加入1微升或以上的已知單克隆或多克隆抗紅細(xì)胞抗原的抗體，制備成用于檢測每個人的紅細(xì)胞表型抗原抗體檢測盒；所述制備反向紅細(xì)胞配型檢測盒是指為用于測定紅細(xì)胞抗原而在所述微型配型板預(yù)先放入孔內(nèi)1微升或以上的已知單克隆或多克隆抗紅細(xì)胞抗原的抗體用于檢測紅細(xì)胞抗原，制備成用于檢測每個人的紅細(xì)胞表型抗原抗體檢測盒；直接反應(yīng)或間接反應(yīng)檢測人血清內(nèi)的抗紅細(xì)胞抗體或紅細(xì)胞抗原系統(tǒng)的步驟，其中，直接反應(yīng)是觀察抗體和抗原直接的免疫反應(yīng)引起的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象；間接反應(yīng)是將抗體和抗原在攝氏37度，四度孵育一定時間15、30分鐘以后，洗去多余的抗體和抗原，加入第二抗體，像抗人體免疫球蛋白，從而產(chǎn)生的間接的免疫反應(yīng)的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，用于鑒定相應(yīng)的抗體或抗原；檢測人體血清內(nèi)的抗紅細(xì)胞抗體或紅細(xì)胞抗原系統(tǒng)的免疫反應(yīng)步驟，通過外加各種試劑去加強(qiáng)免疫反應(yīng)，其中，可采用白蛋白，聚多糖等去增強(qiáng)免疫反應(yīng)；檢測抗體和抗原免疫反應(yīng)引起的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象的步驟，可以通過放大鏡或顯微鏡，判斷分析紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，判斷血清抗體或抗原；篩選血液中存在的抗紅細(xì)胞抗原的抗體的步驟，即先用1微升紅細(xì)胞和血清反應(yīng)，如若有紅細(xì)胞聚集反應(yīng)，然后再進(jìn)一步檢測具體的抗紅細(xì)胞抗體。優(yōu)選的，所述檢測抗體和抗原免疫反應(yīng)引起的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象的步驟，包括采取所述微型血型檢測板的數(shù)據(jù)且將所采集的數(shù)據(jù)與計算機(jī)實時連接的步驟，通過計算機(jī)分析紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，判斷血清抗體或抗原，也可把紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象保存在計算機(jī)內(nèi)供以后分析或也可與分光光度計機(jī)相連接，結(jié)合著計算機(jī)，成為半自動化或自動化分析紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，判斷血清抗體或抗原。
優(yōu)選的，所述的配型板可以供臨床或血庫應(yīng)用，其中，所述正向紅細(xì)胞配型板的應(yīng)用方式是，在所述配型板中加入1微升單克隆或多克隆抗體和5微升礦物油放于深低溫冰箱存放，并以干冰保存運(yùn)輸給臨床或血庫應(yīng)用，而所述的反向紅細(xì)胞配型板的應(yīng)用方式是， 在所述配型板中加入1微升新鮮紅細(xì)胞或紅細(xì)胞膜蛋白和5微升礦物油放于深低溫冰箱存放，并以干冰保存運(yùn)輸給臨床或血庫應(yīng)用。優(yōu)選的，所述方法還包括采用微量血量判斷血型抗原或抗體的步驟，其步驟是，檢測者可以通過靜脈，也可以從末梢血管收集全血，經(jīng)離心后分離出血清和紅細(xì)胞，紅細(xì)胞用正常生理鹽水稀釋到到3%，取出1微升稀釋的紅細(xì)胞加入到所述微型配型板的孔中， 再離心30秒到1分鐘，離心速度在300到lOOOrpm，然后用吹風(fēng)或搖晃打散離心后的紅細(xì)胞，由此可從所述微型配型板直接用顯微鏡觀察結(jié)果，并根據(jù)紅細(xì)胞凝聚的程度，將其凝聚結(jié)果打分，從0加號到4個加號；0加號為沒有紅細(xì)胞凝聚，為陰性反應(yīng)，不存在相應(yīng)的抗原，而4個加號為強(qiáng)陽性，存在相應(yīng)的抗原。優(yōu)選的，所述方法還包括適用于需Coom’ s反應(yīng)的間接反應(yīng)正向配型檢測某些紅細(xì)胞抗原的步驟，其步驟是，針對Rh系統(tǒng)，將抗原(紅細(xì)胞)和抗體(微型孔中的抗體)混合后，在37度孵育15到30分鐘，然后離心，離心后的紅細(xì)胞加入正常生理鹽水洗滌紅細(xì)胞 3次，然后加入1微升抗免疫球蛋白抗體，離心30秒到1分鐘，離心速度在300到lOOOrpm， 然后用吹風(fēng)或搖晃打散離心后的紅細(xì)胞，此后微型配型板可以直接用顯微鏡觀察結(jié)果；根據(jù)紅細(xì)胞凝聚的程度，可以把凝聚結(jié)果打分，從0加號到4個加號。0加號為沒有紅細(xì)胞凝聚，為陰性反應(yīng)，不存在相應(yīng)的抗原，而4個加號為強(qiáng)陽性，存在相應(yīng)的抗原。優(yōu)選的，所述方法還包括利用所述的微型配型板進(jìn)行交叉配型的步驟，即采用微型配型板，在每一個微型孔內(nèi)加入1微升已知需輸血病人的紅細(xì)胞新鮮紅細(xì)胞和需用血的血漿1微升混合，也可用在每一個微型孔內(nèi)加入1微升已知需輸血病人的血漿和需用血的紅細(xì)胞1微升混合，從而發(fā)生免疫反應(yīng)，最后篩選病人可用的輸血來源。優(yōu)選的，所述微型血型檢測板的數(shù)據(jù)且將所采集的數(shù)據(jù)與計算機(jī)實時連接的步驟還包括將所述的微型血型檢測板與至少一臺顯微鏡、低速離心機(jī)相連接或與帶有光電比色機(jī)的自動化檢測系統(tǒng)相連接，由所述光電比色機(jī)通過所述自動化檢測系統(tǒng)自動報告微型血型檢測板的微型孔中紅細(xì)胞的凝集程度，并可將凝聚結(jié)果根據(jù)透光度記分，從O加號到4個加號，0加號為沒有紅細(xì)胞凝聚，為陰性反應(yīng)，而4個加號為強(qiáng)陽性；或者通過所述配型板、 顯微鏡、光電比色機(jī)、電腦與打印機(jī)的連接，完成血型配型的自動化過程步驟。優(yōu)選的，所述完成血型配型的自動化過程步驟還包括利用電腦分析解決復(fù)雜的紅細(xì)胞凝聚反應(yīng)的分析、出具血型配型正向和反向配型的分析和報告、檢測個體含有血型抗體的分析和判斷、從所述配型板的配型孔的紅細(xì)胞凝聚反應(yīng)中找出特定存在個體血液中的抗紅細(xì)胞抗體，并通過配型板的加樣，由所述電腦輸入待檢人的名字和號碼，并經(jīng)電腦自動報告血型配型結(jié)果并儲存待檢人的血型信息以及所述配型板上各孔的反應(yīng)結(jié)果及紅細(xì)胞凝聚情況，或者通過有線、無線、網(wǎng)絡(luò)的傳輸方式遠(yuǎn)程輸送配型信息到其它需要此信息的單位。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的積極效果是利用免疫血液學(xué)原理，在微量檢測板上配備有微量(1微升)已知的抗紅細(xì)胞抗原抗體，加入微量(1微升)未知待檢的紅細(xì)胞，檢測紅細(xì)胞膜表面抗原；或已知微量(1微升)紅細(xì)胞抗原的紅細(xì)胞，加入微量(1微升)未知待檢的血清，檢測人體血液中存在的抗紅細(xì)胞膜表面抗原抗體。它的反應(yīng)標(biāo)識為紅細(xì)胞聚集，有聚集的為陽性反應(yīng)，無聚集的為陰性反應(yīng)，結(jié)合著離心機(jī)，分光光度計，顯微鏡和電腦程序，可以快速，準(zhǔn)確和自動化的檢測紅細(xì)胞的抗原以及在血清中的抗體。本方法不但可用于A，B，0血型系統(tǒng)，而且也可用于Mi，JK, MNs, Fy等系統(tǒng)的紅細(xì)胞抗原檢測，除了采用各種不同的單克隆抗體外，所采用的紅細(xì)胞可以是新鮮采取的，也可是冰凍紅細(xì)胞，也可以是紅細(xì)胞膜，常檢測的紅細(xì)胞 C，-c,-E, -e, -K，-k，-Lea, -Leb, -JKa, -JKb, -Fya, -Fyb, -Pl,-Μ, -N，-S，and-s，并可制備成各種各樣的相應(yīng)的紅細(xì)胞配型微量板提供給臨床應(yīng)用。而利用這種方法制備的微量檢測板試劑盒在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用，可大大提高臨床紅細(xì)胞配型的安全性，高效率，準(zhǔn)確度并降低了檢測費用，促進(jìn)了臨床血液應(yīng)用的發(fā)展。同時，本發(fā)明涉及的方法還能保存反應(yīng)結(jié)果供以后的復(fù)查，并可以用電腦程序分析檢測結(jié)果，以聯(lián)網(wǎng)的方式發(fā)送檢測結(jié)果。


圖1是實施本發(fā)明檢測方法的流程示意圖。
具體實施例方式參見圖1，本發(fā)明描述的是采用微量配型板去檢測紅細(xì)胞的抗原或血清中相應(yīng)的抗體。本發(fā)明的目的就是用來檢測每個人的紅細(xì)胞抗原，像ABO ； 1 ，P，MNS，Ke 11，Luthern， Kell, Duffy和Kidd等紅細(xì)胞系統(tǒng)，以及任何其它有關(guān)的紅細(xì)胞系統(tǒng)中的抗原。其中，紅細(xì)胞抗原檢測的正向配型本發(fā)明的方法之一是直接測定紅細(xì)胞的表面抗原。成熟的紅細(xì)胞膜表面都含有大量的抗原，這些抗原分別分由不同的蛋白或糖原組成， 形成各種抗原族。在人類目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)23個抗原族。ABO抗原族是最重要的血型抗原族，是輸血能否相合最重要的因素。Mi血型抗原族具有強(qiáng)烈的免疫抗原性，極易在Mi陰性的病人產(chǎn)生抗Mi抗體而引起輸血的免疫反應(yīng)。在正常人群中，血型為A的人，其紅細(xì)胞含有A抗原，而其血液中含有B抗原抗體；血型為B的人，其紅細(xì)胞含有B抗原，而其血液中含有A抗原抗體；血型為AB的人，其紅細(xì)胞含有AB抗原，而其血液中不含有ABO抗原族抗體；血型為0的人，其紅細(xì)胞不含ABO抗原族抗原，而其血液中含有抗A和抗B抗原抗體。ABO和1 抗原族是紅細(xì)胞血型抗原中最重要的的血型抗原族，是能否用于輸血的最重要的因素。來自于小鼠的單克隆抗體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。在本發(fā)明中，我們既可采用來自于人體的多克隆抗體，但在大多數(shù)情況下，我們采用的是單克隆抗體，用于對ABO和 Mi血型抗原族進(jìn)行紅細(xì)胞抗原檢測的正向配型。像檢測ABO和Mi抗原族一樣，該發(fā)明采用來自于小鼠的單克隆抗體既可采用來自于人體的多克隆抗體也采用是單克隆抗體，對除了 ABO和Mi血型抗原族以外的紅細(xì)胞抗原進(jìn)行正向配型檢測，這些抗原有P，麗S，Kell, Luthern，Kell，Duffy和Kidd等紅細(xì)胞系統(tǒng)，以及任何其它有關(guān)的紅細(xì)胞系統(tǒng)中的抗原。這也稱為紅細(xì)胞血型抗原的抗原表型檢測(Wionotype)。本發(fā)明的檢測方法就是，采用微型配型板，在每一個微型孔內(nèi)加1微升抗紅細(xì)胞抗體，像抗A，B, D，P，MNS, Kel 1，Luthern，Kel 1，Duffy和Kidd等紅細(xì)胞系統(tǒng)的抗體，以及任何其它有關(guān)的紅細(xì)胞系統(tǒng)中的抗原的抗體，并覆蓋一定含量的礦物油，以避免抗體蒸發(fā)， 未知的新鮮紅細(xì)胞加入微量孔內(nèi)，從而發(fā)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致紅細(xì)胞聚集，從已知加入的抗體可以決定相應(yīng)的紅細(xì)胞抗原?？梢酝ㄟ^靜脈，也可以從末梢血管，像手指，耳垂收集全血，離心后分離血清和紅細(xì)胞，紅細(xì)胞用正常生理鹽水稀釋到到3%。取出1微升稀釋的紅細(xì)胞加入到微型配型板的孔中，離心30秒到1分鐘，離心速度在300到lOOOrpm，然后用吹風(fēng)或搖晃打散離心后的紅細(xì)胞，此后微型配型板可以直接用顯微鏡觀察結(jié)果。根據(jù)紅細(xì)胞凝聚的程度，可以把凝聚結(jié)果打分，從0加號到4個加號。0加號為沒有紅細(xì)胞凝聚，為陰性反應(yīng)，不存在相應(yīng)的抗原，而4個加號為強(qiáng)陽性，存在相應(yīng)的抗原。同理，本發(fā)明的檢測方法也適用于需Coom’ s反應(yīng)的間接反應(yīng)正向配型檢測莫些紅細(xì)胞抗原，像Mi系統(tǒng)，就是在抗原(紅細(xì)胞)和抗體(微型孔中的抗體)混合后，在37 度孵育15到30分鐘，然后離心，離心后的紅細(xì)胞加入正常生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，然后加入1微升抗免疫球蛋白抗體，離心30秒到1分鐘，離心速度在300到lOOOrpm，然后用吹風(fēng)或搖晃打散離心后的紅細(xì)胞，此后微型配型板可以直接用顯微鏡觀察結(jié)果。根據(jù)紅細(xì)胞凝聚的程度，可以把凝聚結(jié)果打分，從0加號到4個加號。0加號為沒有紅細(xì)胞凝聚，為陰性反應(yīng)，不存在相應(yīng)的抗原，而4個加號為強(qiáng)陽性，存在相應(yīng)的抗原。所采用的微型板是30，60 或72孔板，每個孔含有1到2微升抗已知紅細(xì)胞抗原的單克隆或多克隆抗體，覆蓋有5微升礦物油，儲存在負(fù)20到負(fù)70度冰箱保存，采用干冰運(yùn)輸給臨床應(yīng)用。血清抗體檢測的反向配型，本發(fā)明的方法也可用于直接測定血清中抗紅細(xì)胞表面抗原的抗體。成熟的紅細(xì)胞膜表面都含有大量的抗原，這些抗原分別分由為不同的蛋白或糖原組成，形成各種抗原族。在人類目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)23個抗原族。ABO抗原族是最重要的血型抗原族，是輸血能否相合最重要的因素。Mi血型抗原族具有強(qiáng)烈的免疫抗原性，極易在Mi陰性的病人產(chǎn)生抗1 抗體而引起輸血的免疫反應(yīng)。所采用的微型板是30，60或72 孔板，每個孔含有1到2微升已知紅細(xì)胞抗原的新鮮紅細(xì)胞或冰凍紅細(xì)胞，也可為提純的紅細(xì)胞膜，覆蓋有5微升礦物油，儲存在負(fù)20到負(fù)70度冰箱保存，采用干冰運(yùn)輸給臨床應(yīng)用。 在正常人群中，血型為A的人，其紅細(xì)胞含有A抗原，而其血液中含有B抗原抗體；血型為B 的人，其紅細(xì)胞含有B抗原，而其血液中含有A抗原抗體；血型為AB的人，其紅細(xì)胞含有AB 抗原，而其血液中不含有ABO抗原族抗體；血型為0的人，其紅細(xì)胞不含ABO抗原族抗原，而其血液中含有抗A和抗B抗原抗體。通過檢測血清中存在的抗體也可反向鑒定個人的ABO 系統(tǒng)血型。像檢測ABO系統(tǒng)抗體一樣，該發(fā)明采用來自于含有各種紅細(xì)胞表型(Wienotype) 的已知紅細(xì)胞抗原的新鮮紅細(xì)胞或冰凍紅細(xì)胞檢測Μι，P，MNS, Kel 1，Luthern, Kell, Duffy 和Kidd等紅細(xì)胞系統(tǒng)的血清內(nèi)存在的抗體，常用來對出現(xiàn)輸血反應(yīng)的多次輸血病人抗體的篩選。其中，本發(fā)明的檢測方法就采用微型配型板，在每一個微型孔內(nèi)加1微升已知紅細(xì)胞抗原的新鮮紅細(xì)胞或冰凍紅細(xì)胞，每孔中所含抗原的表型是不同的，并覆蓋一定含量的礦物油，以避免液體蒸發(fā)，待測未知的血清加入微量孔內(nèi)，從而發(fā)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致紅細(xì)胞聚集，從聚集的已知紅細(xì)胞抗原不同微型孔中用計算機(jī)排比組合計算出血清中存在的抗紅細(xì)胞抗體。本方法可以通過靜脈，也可以從末梢血管，像手指，耳垂收集全血，離心后分離血清和紅細(xì)胞，取出血清，每孔加入1微升血清到微型配型板，離心30秒到1分鐘，離心速度在300到IOOOrpm，然后用吹風(fēng)或搖晃打散離心后的紅細(xì)胞，此后微型配型板可以直接用顯微鏡觀察結(jié)果。根據(jù)紅細(xì)胞凝聚的程度，可以把凝聚結(jié)果打分，從0加號到4個加號。0加號為沒有紅細(xì)胞凝聚，為陰性反應(yīng)，不存在相應(yīng)的抗體，而4個加號為強(qiáng)陽性，存在相應(yīng)的抗體。本發(fā)明的檢測方法也適用于需Coom’ s反應(yīng)的間接反應(yīng)反向配型檢測血清中莫些抗紅細(xì)胞抗原的抗體，像詘，P，MNS, Kel 1，Luthern, Kel 1，Duffy和Kidd系統(tǒng)，就是在抗原 (血清)和抗體(微型孔中的紅細(xì)胞)混合后，在37度孵育15到30分鐘，然后離心，離心后的紅細(xì)胞加入正常生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，然后加入1微升抗免疫球蛋白抗體，離心30 秒到1分鐘，離心速度在300到IOOOrpm，然后用吹風(fēng)或搖晃打散離心后的紅細(xì)胞，此后微型配型板可以直接用顯微鏡觀察結(jié)果。根據(jù)紅細(xì)胞凝聚的程度，可以把凝聚結(jié)果打分，從0加號到4個加號。0加號為沒有紅細(xì)胞凝聚，為陰性反應(yīng)，不存在相應(yīng)的抗體，而4個加號為強(qiáng)陽性，存在相應(yīng)的抗體。在這個微型版內(nèi)都含有陰性和陽性對照以保證檢測的可靠性。所采用的微型板是30，60或72孔板，每個孔含有1到2微升已知紅細(xì)胞抗原的新鮮或冰凍紅細(xì)胞，覆蓋有5微升礦物油，儲存在負(fù)20到負(fù)70度冰箱保存，采用干冰運(yùn)輸給臨床應(yīng)用。與此同時本發(fā)明設(shè)計了電腦軟件和相應(yīng)的自動化檢測方法，微型血型檢測吧板可根據(jù)臨床的不同需要，配備有不同的設(shè)備和軟件。對一個小型醫(yī)院或血庫，每天的用血量不大，僅僅配備一臺顯微鏡和低速離心機(jī)就能完成血型配型任務(wù)。對一個中性型以上醫(yī)院或血庫，每天的用血量較大，不僅僅需配備顯微鏡和低速離心機(jī)，而且應(yīng)該形成自動化檢測， 這包括微型配型板和光電比色機(jī)相連，機(jī)器能夠通過比色原理，自動報告微型孔中紅細(xì)胞的凝集程度，可以把凝聚結(jié)果根據(jù)透光度記分，從0加號到4個加號。0加號為沒有紅細(xì)胞凝聚，為陰性反應(yīng)，而4個加號為強(qiáng)陽性。電腦的發(fā)展加速了血型配型的自動化發(fā)展，配型板，顯微鏡，光電比色機(jī)，電腦和打印機(jī)的聯(lián)合，完成了血型配型的自動化過程，通過配型板的加樣，電腦輸入待檢人的名字和號碼，，電腦可以自動報告血型配型結(jié)果，儲存待檢人的血型信息，儲存微型版上各孔反應(yīng)結(jié)果，紅細(xì)胞凝聚情況，而且還可遠(yuǎn)程輸送配型信息到其它需要此信息的單位。電腦的發(fā)展不但加速了血型配型的自動化發(fā)展而且可以利用電腦分析解決復(fù)雜的紅細(xì)胞凝聚反應(yīng)的分析，小到血型配型正向和反向配型的分析和報告，大到檢測個體含有血型抗體的分析和判斷，從幾十種，甚至上百種配型孔中的紅細(xì)胞凝聚反應(yīng)中找出特定存在個體血液中的抗紅細(xì)胞抗體，大大的節(jié)省了配型時間，增強(qiáng)了配型的準(zhǔn)確性。根據(jù)以上說明還有如下實施例例一，微型板檢測紅細(xì)胞A，B，0和1 抗原。在本例中，30，60，或72孔的微型板檢測里含抗A，抗B和抗D抗體，或A，B，0紅細(xì)胞，加入待檢人的紅細(xì)胞和血清，檢測紅細(xì)胞A，B和D抗原和抗體，表一是配型板各孔包括的抗體和紅細(xì)胞。表一紅細(xì)胞I-A，-B, -D抗原，抗體檢測板2 3 450
A
B
陽性對照陽性對陽性對陰性對陰性對陰性對Anti-昭 y s ΝΛ昭 >、、、昭 >、、·>昭 /、、、昭 >、、人AAnti-BAnti-DAnti-AAnti-BAnti-DAnti-AAnti-BAnti-DAl CellB CellA,B Cell
權(quán)利要求
1.一種微量，快速和精確檢測人體紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的方法，其特征在于，包括如下步驟選微型配型板步驟，其板型為30，60，72或其它孔微型配型板，用以測定紅細(xì)胞抗原和血清抗體；遴選抗體步驟，在所述微型版中的抗紅細(xì)胞抗原抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，可以是液狀抗體，也可以是干燥粉狀抗體；遴選紅細(xì)胞步驟，在所述微型版中的紅細(xì)胞可以是新鮮紅細(xì)胞，也可以是冰凍紅細(xì)胞，也可以是冷凍干燥紅細(xì)胞，也可以是紅細(xì)胞膜；分別進(jìn)行制備正向紅細(xì)胞凝結(jié)及反向紅細(xì)胞配型檢測盒的步驟，其中，所述制備正向紅細(xì)胞凝結(jié)檢測盒的步驟包括用于檢測每個人血清內(nèi)的、包括A，B, 0 ；Rh等抗原系統(tǒng)、P， MNS, Ke 11, Luthern,Kell, Duffy和Kidd等紅細(xì)胞系統(tǒng)，以及任何其它有關(guān)的紅細(xì)胞系統(tǒng)的檢測方法，即在所述微型版中的每個孔內(nèi)加入1微升或以上的已知單克隆或多克隆抗紅細(xì)胞抗原的抗體，制備成用于檢測每個人的紅細(xì)胞表型抗原抗體檢測盒；所述制備反向紅細(xì)胞配型檢測盒是指為用于測定紅細(xì)胞抗原而在所述微型配型板預(yù)先放入孔內(nèi)1微升或以上的已知單克隆或多克隆抗紅細(xì)胞抗原的抗體用于檢測紅細(xì)胞抗原，制備成用于檢測每個人的紅細(xì)胞表型抗原抗體檢測盒；直接反應(yīng)或間接反應(yīng)檢測人血清內(nèi)的抗紅細(xì)胞抗體或紅細(xì)胞抗原系統(tǒng)的步驟，其中， 直接反應(yīng)是觀察抗體和抗原直接的免疫反應(yīng)引起的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象；間接反應(yīng)是將抗體和抗原在攝氏37度，四度孵育一定時間15、30分鐘以后，洗去多余的抗體和抗原，加入第二抗體，像抗人體免疫球蛋白，從而產(chǎn)生的間接的免疫反應(yīng)的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，用于鑒定相應(yīng)的抗體或抗原；檢測人體血清內(nèi)的抗紅細(xì)胞抗體或紅細(xì)胞抗原系統(tǒng)的免疫反應(yīng)步驟，通過外加各種試劑去加強(qiáng)免疫反應(yīng)，其中，可采用白蛋白，聚多糖等去增強(qiáng)免疫反應(yīng)；檢測抗體和抗原免疫反應(yīng)引起的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象的步驟，可以通過放大鏡或顯微鏡， 判斷分析紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，判斷血清抗體或抗原；篩選血液中存在的抗紅細(xì)胞抗原的抗體的步驟，即先用1微升紅細(xì)胞和血清反應(yīng)，如若有紅細(xì)胞聚集反應(yīng)，然后再進(jìn)一步檢測具體的抗紅細(xì)胞抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微量，快速和精確檢測人體紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的方法，其特征在于，所述檢測抗體和抗原免疫反應(yīng)引起的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象的步驟，包括采取所述微型血型檢測板的數(shù)據(jù)且將所采集的數(shù)據(jù)與計算機(jī)實時連接的步驟，通過計算機(jī)分析紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，判斷血清抗體或抗原，也可把紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象保存在計算機(jī)內(nèi)供以后分析或也可與分光光度計機(jī)相連接，結(jié)合著計算機(jī)，成為半自動化或自動化分析紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，判斷血清抗體或抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微量，快速和精確檢測人體紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的方法，其特征在于，所述的配型板可以供臨床或血庫應(yīng)用，其中，所述正向紅細(xì)胞配型板的應(yīng)用方式是，在所述配型板中加入1微升單克隆或多克隆抗體和5微升礦物油放于深低溫冰箱存放，并以干冰保存運(yùn)輸給臨床或血庫應(yīng)用，而所述的反向紅細(xì)胞配型板的應(yīng)用方式是，在所述配型板中加入1微升新鮮紅細(xì)胞或紅細(xì)胞膜蛋白和5微升礦物油放于深低溫冰箱存放，并以干冰保存運(yùn)輸給臨床或血庫應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微量，快速和精確檢測人體紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的方法，其特征在于，所述方法還包括采用微量血量判斷血型抗原或抗體的步驟，其步驟是， 檢測者可以通過靜脈，也可以從末梢血管收集全血，經(jīng)離心后分離出血清和紅細(xì)胞，紅細(xì)胞用正常生理鹽水稀釋到到3%，取出1微升稀釋的紅細(xì)胞加入到所述微型配型板的孔中，再離心30秒到1分鐘，離心速度在300到lOOOrpm，然后用吹風(fēng)或搖晃打散離心后的紅細(xì)胞，由此可從所述微型配型板直接用顯微鏡觀察結(jié)果，并根據(jù)紅細(xì)胞凝聚的程度，將其凝聚結(jié)果打分，從0加號到4個加號；0加號為沒有紅細(xì)胞凝聚，為陰性反應(yīng)，不存在相應(yīng)的抗原，而4個加號為強(qiáng)陽性，存在相應(yīng)的抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微量，快速和精確檢測人體紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的方法，其特征在于，所述方法還包括適用于需Coom’ s反應(yīng)的間接反應(yīng)正向配型檢測某些紅細(xì)胞抗原的步驟，其步驟是，針對Rh系統(tǒng)，將抗原(紅細(xì)胞)和抗體(微型孔中的抗體)混合后，在37度孵育15到30分鐘，然后離心，離心后的紅細(xì)胞加入正常生理鹽水洗滌紅細(xì)胞 3次，然后加入1微升抗免疫球蛋白抗體，離心30秒到1分鐘，離心速度在300到lOOOrpm， 然后用吹風(fēng)或搖晃打散離心后的紅細(xì)胞，此后微型配型板可以直接用顯微鏡觀察結(jié)果；根據(jù)紅細(xì)胞凝聚的程度，可以把凝聚結(jié)果打分，從0加號到4個加號。0加號為沒有紅細(xì)胞凝聚，為陰性反應(yīng)，不存在相應(yīng)的抗原，而4個加號為強(qiáng)陽性，存在相應(yīng)的抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微量，快速和精確檢測人體紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的方法，其特征在于，所述方法還包括利用所述的微型配型板進(jìn)行交叉配型的步驟，即采用微型配型板，在每一個微型孔內(nèi)加入1微升已知需輸血病人的紅細(xì)胞新鮮紅細(xì)胞和需用血的血漿1微升混合，也可用在每一個微型孔內(nèi)加入1微升已知需輸血病人的血漿和需用血的紅細(xì)胞1微升混合，從而發(fā)生免疫反應(yīng)，最后篩選病人可用的輸血來源。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微量，快速和精確檢測人體紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的方法，其特征在于，所述微型血型檢測板的數(shù)據(jù)且將所采集的數(shù)據(jù)與計算機(jī)實時連接的步驟還包括將所述的微型血型檢測板與至少一臺顯微鏡、低速離心機(jī)相連接或與帶有光電比色機(jī)的自動化檢測系統(tǒng)相連接，由所述光電比色機(jī)通過所述自動化檢測系統(tǒng)自動報告微型血型檢測板的微型孔中紅細(xì)胞的凝集程度，并可將凝聚結(jié)果根據(jù)透光度記分，從0加號到 4個加號，0加號為沒有紅細(xì)胞凝聚，為陰性反應(yīng)，而4個加號為強(qiáng)陽性；或者通過所述配型板、顯微鏡、光電比色機(jī)、電腦與打印機(jī)的連接，完成血型配型的自動化過程步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種微量，快速和精確檢測人體紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的方法，其特征在于，所述完成血型配型的自動化過程步驟還包括利用電腦分析解決復(fù)雜的紅細(xì)胞凝聚反應(yīng)的分析、出具血型配型正向和反向配型的分析和報告、檢測個體含有血型抗體的分析和判斷、從所述配型板的配型孔的紅細(xì)胞凝聚反應(yīng)中找出特定存在個體血液中的抗紅細(xì)胞抗體，并通過配型板的加樣，由所述電腦輸入待檢人的名字和號碼，并經(jīng)電腦自動報告血型配型結(jié)果并儲存待檢人的血型信息以及所述配型板上各孔的反應(yīng)結(jié)果及紅細(xì)胞凝聚情況，或者通過有線、無線、網(wǎng)絡(luò)的傳輸方式遠(yuǎn)程輸送配型信息到其它需要此信息的單位。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微量，快速和精確檢測人紅細(xì)胞抗原和血清中抗體的方法。利用免疫血液學(xué)原理，在微量檢測板上配備有微量已知的抗紅細(xì)胞抗原抗體，加入微量未知待檢的紅細(xì)胞，檢測紅細(xì)胞膜表面抗原；或已知微量紅細(xì)胞抗原的紅細(xì)胞，加入微量未知待檢的血清，檢測人體血液中存在的抗紅細(xì)胞膜表面抗原抗體。它的反應(yīng)標(biāo)識為紅細(xì)胞聚集，有聚集的為陽性反應(yīng)，無聚集的為陰性反應(yīng)，結(jié)合著離心機(jī)，分光光度計，顯微鏡和電腦程序，可以快速，準(zhǔn)確和自動化的檢測紅細(xì)胞的抗原以及在血清中的抗體。而利用這種方法制備的微量檢測板試劑盒在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用，可大大提高臨床紅細(xì)胞配型的安全性，高效率，準(zhǔn)確度并降低了檢測費用，促進(jìn)了臨床血液應(yīng)用的發(fā)展。
文檔編號G01N33/80GK102175877SQ201010618200
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者周凝, 周勝利, 胡當(dāng)玉 申請人:周勝利